Možnosti využití elektromigračních technik při studiu vlastností mikroorganismů Anna Kubesová
Osnova Candida Kapilární elektromigrační techniky Výsledky Závěr Planární elektromigrační techniky Výsledky Závěr Pseudomonas syringae Výsledky Závěr
Candida Psilosis Candida psilosis fenotypově nerozlišitelné: C. orthopsilosis C. metapsilosis C. parapsilosis Candida parapsilosis patogen pro pacienty se sníženým imunitním systémem. Candida psilosis - Kapilární elektromigrační techniky - Planární elektromigrační techniky
Candida Psilosis biofilm
A ph gradient 3,6-4,0 Kapilární izoelektrická fokusace Katolyt: 4 x 10-2 moll -1 Na OH 0,3% (w/v) PEG 4000 1% EtOH Anolyt: 0,1 moll -1 H 3 PO 4 Vzorek: 8 x 10 7 buněk v 1 ml 15 x 10-3 moll -1 NaCl 1% (w/v) PEG 10 000 B ph gradient 3,6-4,0 Katolyt: 0,6% (w/v) PEG 4000
A ph gradient 3,8-4,0 Kapilární izoelektrická fokusace Katolyt: 2 x 10-2 moll -1 Na OH 0,1% (w/v) PEG 10 000 1% EtOH Anolyt: 0,1 moll -1 H 3 PO 4 Vzorek: krevní sérum B ph gradient 3,8-4,0 Katolyt a anolyt stejný jako u A Vzorek: 3x 10 7 buněk v 1 ml krevního sera 3% EtOH 2% (w/v) PEG 10 000
A: fosfátových pufr 1 10 2 moll 1 (ph 8,4) 0.6% (w/v) PEG 4000 3% (v/v) EtOH Kapilární zónová elektroforéza Vzorek: 8 10 7 buněk ml 1 PSS B: fosfátový pufr 1 10 2 moll 1 (ph 8,4) 0.3% (w/v) PEG 10,000 3% (v/v) EtOH Vzorek: 8 10 7 buněk ml 1 PSS s 1% (w/v) PEG 10,000
Závěr V této studii byly pomocí cief a CZE analyzovány vždy tři zástupci každého ze studovaných biofilm-pozitivních a biofilm-negativních druhů C. psilosis Navrhované kapilární elektromigrační metody dokáží rychle, spolehlivě separovat a identifikovat jednotlivé druhy C. psilosis včetně jejich biofilmových forem.
Vzorky: Vysráženo vždy 100 μg proteinu a rozpuštěno v 100 μl pufru. Dávkováno 15 μl vzorku na gel. Gel: Separační gel 4-20% T. Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250. SDS-PAGE C. orthopsilosis (FS 72, PH 94 biofilm-negativní), C. metapsilosis (PH 86, FS 58 biofilm-positivní; PH 87, PH 88 biofilm-negativní) and C. parapsilosis (BC 16, BC 11 biofilm-positivní; BC 8, BK 75 biofilm-negativní)
Vzorky: Dávkováno 15 μl vzorku lyzátu na gel. ph gradient: 3-10 Separační gel 5% T. Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250. IEF C. orthopsilosis (FS 72, PH 94 biofilm-negativní), C. metapsilosis (PH 86, FS 58 biofilm-positivní; PH 87, PH 88 biofilm-negativní) and C. parapsilosis (BC 16, BC 11 biofilm-positivní; BC 8, BK 75 biofilm-negativní)
Vzorky: Vysráženo vždy 100 μg proteinu a rozpuštěno v 200 μl rehydratačním pufru. Dávkováno 125 μl vzorku na IEF strip. Výsledky C. orthopsilosis C. metapsilosis (-) IEF: ReadyStrip IPG Strip, lineární ph gradient 3 10, délka 7 cm od firmy Bio-Rad. Napětí:150 V (50 V h, li near),600 V (600 V h, linear), 1500 V (1500 V h, linear) and 4000 V (15000 V h, rapid) SDS-PAGE Gel: Separační gel 4-20% T. Napětí 180V C. metapsilosis (+) C. parapsilosis (-) C. parapsilosis (+) Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250.
MALDI TOF MS C. orthopsilosis (FS 72 biofilm-negativní), C. metapsilosis (FS 58 biofilm-positivní; PH 88 biofilm-negativní) and C. parapsilosis (BC 16 biofilm-positivní; BK 75 biofilm-negativní)
Závěr Pomocí planárních elektromigračních technik a MALDI TOF MS vybrané kmeny studovaných biofilmpozitivních a biofilm-negativních kmenů C. "psilosis". Naše výsledky ukazují, že všechny použité techniky jsou schopny identifikovat jednotlivé druhy C. "psilosis" a především 2-DE a MALDI TOF MS dokáží identifikovat i jejich biofilmové formy.
Patovary Pseudomonas syringae Patovary Pseudomonas syringae rostlinné patogeny Plynová chromatografie nedostatečná databáze CZE, cief, IEF a MALDI TOF MS.
Kapilární izoelektrická fokusace A ph gradient 2,0-4,7 Katolyt: 4 x 10-2 moll -1 Na OH 0,1% (w/v) PEG 4000 1% EtOH Anolyt: 0,1 moll -1 H 3 PO 4 0,1% (w/v) PEG 4000 1% EtOH Vzorek: 1x 10 7 buněk v 1 ml 15 x 10-3 moll -1 NaCl 3% EtOH 2% (w/v) PEG 10 000
Identifikace plynovou chromatografií methyl esterů mastných kyselin. strain source percentage of probability by GC identification pi Pseudomonas IVIA 614.5.3 44 P. syringae 86.3 % 2.4 corrugata CFBP 5324 P. putida 82.0 % 2.4 CFBP 4901 44 P. putida 78.0 %, P. corrugata 40.3 % 2.4 CFBP 5465 44 P. corrugata 66.4 % 2.4 CFBP 6663 44 P. corrugata 63.1 %, 61.8 % 2.4 pi = 2.4, RSD = 1.1 % Pseudomonas syringae CCM 2870 P. s. syringae 71.7 % 3.1 pv. Syringae 43 CCM 2114 P. s. 94,5 % 3.1 CCM 2868 P. s. syringae 73.0 %, 73.7 % 3.1 Isol. PPBOL 1048 P. s. syringae 84.0 % 4.8 Isol. PPBOL 1049 no results 3.1 Isol. PPBOL 1050 P. s. syringae 84.0 % 3.1 Isol. PPBOL 1054 not identified 3.1 Isol. PPBOL 1055 not identified 3.1 Isol. B, PPBOL 31/08 P. viridiflava 90.7 %. P. s. syringae 84.9 % 3.1 Isol. B, PPBOL 32/08 P. s. syringae 92.0 % 3.1 pi = 3.1, RSD = 0.9 % Pseudomonas syringae LMG 5184 P. viridiflava 93.1 %, P. syringae 90.3 % 3.4 pv. persicae LMG 5078 P. syringae 35.9 % 3.4 LMG 5566 P. syringae 34.2 % 3.4 LMG 5568 P. syringae 41.0 % 3.4 LMG 5569 P. syringae 37.0 % 3.4 pi = 3.4, RSD = 0.7 % Pseudomonas syringae LMG 5071 P. s. maculicola 63.9 % 3.7 pv. maculicola pi = 3.7, RSD = 1.4 % Pseudomonas syringae IVIA 1733.3 44 P. s. tomato 74.7 % 4.0 pv. tomato CFBP 1326 P. s. syringae 92.9 %, P. viridiflava 84.3 % 4.0 CFBP 2212 44 P. viridiflava 91.2 %, P. syringae 91.1 % 4.0 CFBP 5422 44 P. viridiflava 93.6 %, P. syringae 92.5 % 4.0 CFBP 2546 P. s. tomato 86.1 % 4.0 CCM 7018 P. syringe 93.2 % 4.0 CCM 7019 P. syringae 90.1 %, P. s. tomato 66,2 % 4.0 Isol. B, PPBOL 106/08 P. syringae 92.9 %, P. s. syringae 92.9 % 4.0 pi = 4.0, RSD = 1.2 % Pseudomonas syringae CCM 2859 P. s. mori 94.6 % 4.1 pv. morsprunorum CCM 2534 P. s. morsprunorum 96.3 %, 96.9% 4.1 CCM 2860 P. syringae 95.7 %, P. s. mori 95.7 % 4.1 pi = 4.1, RSD = 1.5 % Pseudomonas syringae IVIA 1003.1a P. viridiflava 80.3 %, P. s. syringae 74.6 % 4.5 pv. mori CFBP 1642 P. viridiflava 94.1 %, P. s. syringae 88.7 % 4.5 Isol. B, PPBOL 141/08 P. viridiflava 92.8 %, P. s. syringae 92.7 % 4.5 Isol. B, PPBOL 104/08 P. syringae 95.5 %, P. s. morsprunorum 95.5 % 4.5 Isol. B, PPBOL 46/04 P. s. syringae 92.9 % 4.5 pi = 4.5, RSD = 0.8 % Pseudomonas syringae CFBP 1644 P. syringae 94.2 % 4.8 pv. lachrymans CFBP 6465 P. s. syringae 75.0 % 4.8 CFBP 6462 P. s. syringae 93.9 % 4.8 CCM 2857 no results 4.8 Isol. VURV 6017 43 no results 4.8 pi = 4.8, RSD = 1.0 %
Kapilární zónová elektroforéza Taurine-Tris pufr 1,5 10 3 moll 1 (ph 8,4) 0.1% (w/v) PEG 4000 1% (v/v) EtOH Vzorek: 8 10 7 buněk ml 1 PSS 1% (w/v) PEG 10 000
Vzorky ph gradient 3-10Barvení: Dávkovány 4 μl vzorku Separační gel 5% T Coomassie Brilliant Blue G-250 lyzátu na gel
MALDI-TOF MS spektra MALDI-TOF MS spektra proteinů Pseudomonas siringae. Jako matrice byla použita kyselina sinapová.
Závěr Všechny použité techniky jsou schopny identifikovat jednotlivé patovary Pseudomonas syringae. Zvláště doplnění výsledků plynové chromatografie o výsledky kapilární isoelektrické fokusace, může být pro analýzu patovarů bakterií velice přínosné.
Děkuji za pozornost a přeji krásné vánoční svátky.