Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 20 Zajištění kvality Laboratorní analýzy mají smysl pouze pokud vedou ke spolehlivým výsledkům. Ve vědecké terminologii je požadováno, aby výsledky byly smysluplné, správné a přesné. Smysluplné znamená: analytický problém je řešen vhodnou metodou. Představme si iontově selektivní elektrodu, se kterou dokážeme rychle a levně zjistit, že je obsah kadmia v pitné vodě o hodně menší, než je povolené legislativní maximum. V tomto případě není potřeba provádět další testy. Nicméně nastávají situace, kdy je třeba zjistit stopovou koncentraci přesně a toho musíme dosáhnout za použití sofistikovanějších přístrojů a metod, které jsou dražší, analýza časově náročná a měření musí být provedena odborným personálem. Správné (accurate) v podstatě znamená: analýzou získáme výsledky velmi blízké skutečným hodnotám. Toto konstatování není tak triviální, jak by se mohlo zdát, protože skutečná hodnota množství nebo koncentrace je z principu věci neznámá. Můžeme se pouze pokusit dobrat k malému rozdílu mezi naměřenou a skutečnou hodnotou. Správnost může být ověřována alternativními analytickými metodami a dále účastí na mezilaboratorních srovnávání.
Přesné (precise) znamená: opakované měření vzorku analýzy stejného materiálu vede k malému rozptylu výsledků (tj. mají malou standardní odchylku). Ve většině případů je vysoká přesnost dosažitelná vynaložením velkého úsilí. Vysoká přesnost ale nemá smysl, pokud analýza neposkytuje správné výsledky. Tato kapitola osvětluje některé techniky a nástroje k zajištění kvality, ale detailní úvod do problematiky v rozsahu této knihy není možný. Pro začínající manažery kvality existuje bezpočet učebnic a jiných studijních materiálů. Verifikace druhou metodou Dobrým způsobem ověření kvality kvantitativních výsledků je analýza vzorku jinou srovnávací metodou. Podstaty metod by se měly navzájem podstatně lišit (např. plynová chromatografie nebo chromatografie na tenké vrstvě vs HPLC). Nejčastějším zdrojem nesprávných výsledků je úprava vzorku, a proto je vhodné vzorek pro ověření upravit jiným způsobem. Jestliže jsou výsledky statisticky identické, můžeme předpokládat, že jsou správné. Pokud jsou výsledky rozdílné, je nezbytné důvod(y) rozdílu odhalit i za cenu časové náročnosti. Pro příklad, Urakova a spol. srovnali analýzu kyseliny chlorogenové v zelených kávových zrnech extrahované chromatografií na tenké vrstvě oxidu křemičitého (tj. adsorpční chromatografie) a pomocí reverzní HPLC. Validační parametry (LOD, LOQ, opakovatelnost a různé parametry přesnosti), výtěžnosti a kvantitativní výsledky byly naprosto shodné. Z toho je zřejmé, že obě metody vedly ke zjištění skutečné hodnoty. K analýze mohou být využity obě metody a záleží jen na preferenci laboratoře, kterou zvolí. Tento způsob verifikace je vlastně povinností pro dokončení vývoje nové analytické metody při analýze vzorků ve složité matrici. Je zřejmé, že se verifikace provádí před samotnou validací konečné vybrané metody. Validace metody Validace je procedura, která prokazuje, že vybraná metoda je schopna spolehlivým způsobem získat potřebná data s požadovanou správností. Je zřejmé, že není možné nastavit obecně platné postupy pro provádění validace. Nicméně musí být pokryty všechny, nebo alespoň některé z těchto bodů:
a) Selektivita (nebo specifita). Schopnost nalézt a kvantifikovat obsah zkoumaného analytu i v přítomnosti jiných látek. Pro chromatografické metody to znamená, že je analyt separován s dostatečným rozlišením od všech ostatních složek a může být detekován vhodným přístrojem. b) Linearita. Vlastnost kalibrační křivky. Kalibrační křivka by měla být přímka procházející počátkem. Jestliže jsou pozorovány odchylky, musí být vysvětlen jejich důvod. c) Pracovní rozsah. Dobře definovaný rozsah koncentrací, pro které je metoda validována. Interval může být užší, než je lineární dynamický rozsah metody. Analýzy, které jsou prováděny mimo pracovní rozsah nejsou validovány. d) Přesnost. Schopnost provést analýzu opakovaně s malou odchylkou výsledků. Je nezbytné rozlišovat opakovatelnost (analýza opakovaná v krátkém intervalu, na stejném instrumentu a stejnou osobou ve stejné laboratoři) a reprodukovatelnost (analýza opakovaná po delší době, na jiném přístroji, jiným analytikem a/nebo v jiné laboratoři). e) Správnost. Zajištění minimálního rozdílu mezi naměřenou a skutečnou hodnotou. (Poznámka: skutečná hodnota je neznámá). f) Výtěžnost. Míra, se kterou je analyt nalezen ve vzorku. Výtěžnost a její opakovatelnost musí být známa. Cílem je samozřejmě dosáhnout 100% výtěžnosti, ale často se stává, že její dosažení není možné. Samotná výtěžnost má mnohdy největší vliv na správnost. g) Meze analýzy v případě stopových analýz. Schopnost analyzovat vzorky s nízkými obsahy zkoumaných látek. Rozeznáváme mez detekce (LOD) a mez stanovitelnosti nebo též kvantifikace (LOQ). LOD bývá volena jako jedna třetina LOQ. LOD bývá definován jako trojnásobek výšky šumu. h) Nejistota měření v případě kvantitativní analýzy. i) Robustnost. Necitlivost metody k vlivu okolních parametrů. Některé parametry při analýze musí být více či méně přísně kontrolovány a záleží pouze na konkrétní metodě a na cíli analýz, o které se jedná: teplota, složení mobilní fáze, vlastnosti detektoru, příprava vzorku, operátor (kdokoli nebo pouze odborník?) a laboratoř (je analýza proveditelná kdekoli?). To je jen příklad parametrů a seznam není ani zdaleka kompletní. Při vyhodnocení robustnosti nemůžeme nikdy zahrnout neočekávané jevy.
Zejména v případě, kdy je potřeba analýzu validovat i pro jiné laboratoře. Robustnost by měla být zhodnocena statisticky navrhnutými experimenty, abychom získali validní výsledky s nejmenším množstvím experimentů. Pozitivním vedlejším výsledkem racionálního přístupu k návrhu komplexních experimentů je hlubší pochopení metody. Úkol Analýza byla ze začátku provedena při 30 C a ph 4,5 (prostřední chromatogram). Co můžeme říct o vlivu těchto dvou parametrů na robustnost? Řešení Metoda je robustní z hlediska teploty (alespoň ve studovaném rozsahu), ale ne s ohledem na ph. Při ph 6 jsou tři píky eluovány v kratším čase. Tento fakt je nezbytné zmínit ve standardním operačním postupu. Samozřejmě by měly být studovány i další parametry zmíněné výše. Je doporučováno vytvořit detailní návod (v podstatě standardní operační postup), ve kterém je uvedeno, jakým způsobem provést validaci pro potřeby laboratoře. V každém případě je povinností validovat metody nově zavedené nebo upravené. Standardní operační postup Standardní operační postupy (SOP) jsou detailní popisy analytických metod (nebo jiných analytických úkolů, jako vážení a vedení dokumentace). Při dodržení tohoto návodu musí
proškolený personál provádět popsaný úkol(y), a proto je potřeba do něj zahrnout všechny detaily. Nejlepší je pověřit vytvořením SOP osobou, která se skutečně zabývá danou analýzou, a poté postup kriticky konzultovat s dalším odborníkem. Následně je SOP vydán a stává se závazným. SOP může být kdykoli revidován, ale v platnosti zůstává pouze nejnovější verze a starší jsou pečlivě archivovány. SOP pro kvantitativní analýzu by měl obsahovat všechny použité rovnice při vyjádření výsledku a konkrétní příklad výpočtu. SOP jsou přístupné v laboratoři, aby mohly být v případě potřeby okamžitě k dispozici. Nejistota měření Výsledek kvantitativní analýzy se skládá z naměřené hodnoty a také z nejistoty měření. Druhá hodnota určuje interval pokrývající fluktuace výsledků se spolehlivostí obvykle 68, 95 nebo 99,7%. Opakované analýzy neposkytují, při zohlednění dostatku desetinných míst, stejné hodnoty. Pro posouzení takové odchylky je potřeba zavést jednotný postup, protože bez plánu nejistot měření je obtížné určit, jestli byl překročen limit, nebo zda obě laboratoře provádějí věrohodné analýzy. Nejistotu měření můžeme určit různými metodami. Jednou možností je přidat standardní nejistoty všech parametrů, které mají vliv na konečnou hodnotu (přístup zdola nahoru ). Nicméně v chromatografických separacích je obtížné určit všechny parametry, které mají vliv na plochu píku a jejich vyčíslení je ještě složitější. Obrázek dále ukazuje problém spolehlivého určení nejistot. Některé otazníky v samotné separaci (HPLC) napovídají, že pravděpodobně nejsou všechny parametry známy. Proto nemůže být v HPLC použit čistě přístup zdola nahoru.
Je možné problém řešit i z opačného konce a deklarovat reprodukovatelnost, tzn. mezilaboratorní standardní odchylku s R, jako nejistotu měření (postup shora dolů ). Jestliže různé laboratoře provádějí stejný postup v rámci spolupráce, předpokládá se, že všechny možné vlivy jsou zahrnuty v mezilaboratorní standardní odchylce, která je ze všech dat vypočítána. Pokud nebyly provedeny žádné mezilaboratorní studie a je známa pouze standardní odchylka s R jedné laboratoře, může být její hodnota příliš malá, zejména v případě nutnosti porovnávání výsledků s dalšími laboratořemi (dodavatelů, zákazníků, autorit, konkurence). Nejistota měření může být rovněž určena z validačních dat. Možným řešením mnoha problémů je dlouhodobé sledování plochy nebo výšky píku referenčního standardu (vedením regulačních diagramů) a výpočtu jeho standardní odchylky (z ní dostáváme opakovatelnost Rep Ref ). Tímto jsme ještě nezískali nejistotu měření, protože musíme vzít v úvahu i nejistotu čistoty referenčního materiálu, u(pur Ref ), a opakovatelnost výtěžnosti, s(rec Sample ), a konečně i nejistoty hmotnosti vzorku a reference, ale tyto hodnoty lze, při použití dostatečně přesných vah, zanedbat.
Nejistota měření koncentrace ve vzorku, u(c sample ), je počítána následovně:, kde u je nejistota a s standardní odchylka. Žádný úkol na procvičení zde není uveden, protože určení některých standardních nejistot a odchylek není triviální záležitost. Kvalifikace, testování instrumentu a testy způsobilosti systému Nestačí pouze používat vhodnou a validovanou analytickou metodu. Nezbytným předpokladem pro získání přesných a správných výsledků je i dobrý stav přístroje ( fitness for purpose ). Nový přístroj musí projít čtyřmi rozdílnými kvalifikacemi: a) Kvalifikace konstrukce (Design qualification, DQ), před koupí systému. Úkol pro vedoucího laboratoře, který musí definovat požadavky a specifikace na přístroj. b) Kvalifikace instalace (Installation qualification, IQ), při montáži zařízení dokumentace a verifikace správného sestavení. Úkol pro servisního technika a vedoucího laboratoře. c) Provozní kvalifikace (Operational qualification, OQ), během montáže je proveden první test, který ukáže, zda zařízení pracuje v souladu s DQ. Úkol pro servisního technika a laboratorní personál. d) Výkonnostní kvalifikace (Performance qualification, PQ), po instalaci test na typickém analytickém úkolu. Později je PQ proveden znovu, tzv. test způsobilosti systému. Úkol pro laboratorní obsluhu. Po úspěšném dokončení těchto kroků bude možné provádět spolehlivé analýzy. Nicméně je nutné provádět testy přístroje v pravidelných intervalech, nejméně jednou za rok. V laboratořích farmaceutického průmyslu je navíc nutné, kromě těchto čtyř kvalifikací, provádět i testy způsobilosti systému (system suitability tests, SST). Jakákoli metoda může být používána pouze po úspěšném provedení testů SST a tyto testy musí být prováděny
pravidelně, obvykle jednou denně nebo alespoň na začátku analýzy série vzorků. Testování probíhá se směsí, která je typická pro vzorky. USP (United States Pharmacopoeia) požaduje pět opakovaných nástřiků, které poskytnou tato data: a) kalibrační funkci (směrnici, úsek), b) opakovatelnost plochy a výšky píků, které jsou vyjádřeny formou standardní odchylky, c) opakovatelnost retenčních časů, d) chvostování píků, e) rozlišení (vzhledem k dalšímu píku nebo rozlišení kritického páru), f) šum základní linie, g) drift základní linie. USP požaduje následující maximální relativní standardní odchylky ploch píků: a) méně než 2% pro standardní roztoky, b) méně než 15% pro bioanalytické vzorky, c) méně než 20% pro bioanalytické vzorky na úrovni meze stanovitelnosti. Úsilí o zajištění kvality Analytická laboratoř (nebo celá firma) může usilovat o ISO certifikaci nebo EN akreditaci. Certifikát se v souladu s normou ISO 9001 vztahuje pouze k formálním a technickým postupům a ne k záležitostem kvality. Pro instituce, které nabízejí zboží nebo služby, je preferovaná akreditace v souladu s EN 17025. Tato norma stanovuje, že: Kvalifikovaný personál provádí dobře definované testy v souladu s validovanými metodami a s testovaným měřícím vybavením. Všechny procedury jsou jasně regulovány a je zaručena adekvátní dokumentace. Pro usilování o akreditaci je potřeba provést dlouhou a intenzivní přípravu. Je udělována pouze po důkladné inspekci externích odborníků, kteří navštěvují laboratoř několik dní. Seznam požadavků je dlouhý a detailní. I bez certifikátu nebo akreditace je doporučováno zavést několik úkonů k zajištění kvality (pro akreditaci jsou povinné):
a) používat pouze chemikálie dobře definované kvality, b) zaznamenávat data otevření a expirace na štítky chemikálií, c) vymezit specifikace kolon, d) testovat kolony, e) opakovat testy kolon v pravidelných intervalech, f) vést pracovní deníky kolon, g) vymezit specifikace přístroje, h) provádět testy přístrojů, i) opakovat testy přístrojů v pravidelných intervalech, j) vést pracovní deníky přístroje, k) provádět testy způsobilosti systému (případně se zjednodušenou matodikou) l) používat regulační diagramy k zachycení trendů a odlehlých hodnot, m) účastnit se mezilaboratorního porovnávání, mít srovnání s ostatními laboratořemi. Úkol Stal jste se novým manažerem kvality ve firmě. Dosud nebyla provedena žádná formální měření kvality a máte malý rozpočet. Rozhodl jste se zakomponovat pět položek z následujícího seznamu. Jak budete postupovat a co bude dlouhodobým cílem? a) Vhodný software znemožní modifikovat elektronická data bez vědomí nadřízených. b) Zavést regulační diagramy. c) Na každém elektronickém dokumentu zaznamenávat podpis a datum. d) Na obalech chemikálií vést štítky se záznamy o otevření a expiraci. e) Zavést pracovní deníky přístrojů. f) Uspořádat semináře a jednání k zavedení nových úkolů personálu. g) Zavést testy způsobilosti systému. h) Firma bude usilovat o certifikát nebo akreditaci. i) Společnost bude účastnit mezilaboratorního srovnávání. j) Zavést standardní operační postupy.
Řešení Obecně neexistuje správná odpověď. Nicméně Vaše snaha bude neúspěšná, pokud se Vám nepodaří přesvědčit personál. Další levná a rychlá opatření jsou data a podpisy zaměstnanců, data spotřeby chemikálií, regulační diagramy a ochrana elektronických dat. Certifikace nebo akreditace laboratoře jsou dlouhodobé cíle, rámcově od jednoho do tří let.