OBECNÝ METABOLISMUS ENZYMY
Enzymy - základní terminologie Katalyzátor je látka, která zvyšuje rychlost chemické reakce, ale nemění chemickou rovnováhu Enzymy jsou katalyzátory biologických systémů umožňující chemické přeměny Při reakcích se molekula enzymů nespotřebovává Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované Enzymy jsou makromolekulární látky, jejichž základem jsou bílkoviny (globulární) Katalytickou aktivitu může mít i RNA (pravděpodobně nejranější katalyzátory - ribozymy)
Příklady enzymů Porovnání rychlostních konstant spontánní a katalyzované reakce a katalytické síly Enzym Nekatalyzovaná reakce (k noncat s -1 ) Katalysovaná reakce (k cat s -1 ) Poměr (k cat /k noncat ) Orotidinmonofosfátdekarboxylasa 2,8 x 10-16 39 1,4 x 10 17 Stafylokokální nukleasa 1,7 x 10-13 95 5,6 x 10 14 AMP nukleosidasa 1,0 x 10-11 60 6,0 x 10 12 Karboxypeptidasa A 3,0 x 10-5 578 1,9 x 10 11 Ketosteroidisomerasa 1,7 x 10-7 66 000 3,9 x 10 11 Triosafosfátisomerasa 4,3 x 10-6 4 300 1,0 x 10 9 Chorismátmutasa 2,6 x 10-5 50 1,9 x 10 6 Karbonáthydratasa 1,3 x 10-1 1 x 10 6 7,7 x 10 6
Enzymy - základní terminologie Katalýza se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném aktivní místo Vedle bílkovinné složky mohou enzymy obsahovat i nebílkovinnou součást Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá substrát Enzymy lze dělit na: 1. Jednoduché obsahují jen bílkovinnou část (např. hydrolasy pepsin, trypsin, ribonukleasa) enzymy monomerní, tvořené jedinou podjednotkou oligomerní, tvořené z více podjednotek
Struktura enzymů 2. Složené enzymy obsahují i nebílkovinou složku kofaktor vázanou na bílkovinnou součást apoenzym (apoprotein bílkovina) APOENZYM + KOFAKTOR HOLOENZYM Ionty kovů Organická skupina či sloučenina Pevně (většinou kovalentně) vázaná prostetická skupina (širší význam) odstranění ztráta aktivity - na téže enzymové bílkovině, je pevně vázáná Volně vázaná koenzym vratně disociuje disociuje z dané enzymové bílkoviny a může se regenerovat v jiné enzymové reakci - druhý substrát
Struktura enzymů
Koenzym x prostetická skupina
Koenzym x prostetická skupina Prostetická skupina Koenzym
Vitamíny Kofaktor Funkce, reakce Onemocnění B 1 thiamin B 2 riboflavin B 2 nikotinová kyselina B 2 kyselina pantothenová B 2 kyselina listová B 6 pyridoxin B1 2 kobalamin H biotin C kyselina askorbová Thiamindifosfát Přenos aldehydické skupiny Beri-beri FMN, FAD Oxidačně redukční Dermatis NAD+.NADP+ Oxidačně redukční Pelagra CoA Přenos acylové skupiny Hypertense Tetrahydrofolát Přenos C1 skupiny Megaloblastická anemie Pyridoxalfosfát Přenos aminoskupiny Deprese Kobalamin izomerace Chudokrevnost Biocytin Kyselina askorbová Přenos COOH skupiny Hydroxylace donor vodíku Není známo Skorbut
Kovový ion metaloenzymy
Chemické katalyzátory látky urychlující chemické reakce nemění přitom rovnováhy chemických reakcí snižují aktivační energii nemění se při reakci Biokatalyzátory - enzymy urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce neovlivňují rovnovážnou konstantu jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce (specifita účinku) a ve smyslu výběru substrátu (substrátová specifita) snižují aktivační energii reakce, tvoří komplex se substrátem rychlost musí být přesně regulována podle potřeb organismu
Biokatalyzátory se liší od běžných chemických katalyzátorů 1) Vyšší reakční rychlostí 2) Mírnějšími podmínkami reakce T, ph, tlak 3) Vyšší specifitou 4) Schopností regulace
Rozklad peroxidu vodíku
Principy enzymové katalýzy
Principy enzymové katalýzy
Energetika enzymových reakcí Změna volné (Gibbsovy) energie je termodynamická funkce vedoucí k pochopení katalytického účinku enzymů. 1. Reakce probíhá samovolně, když má D G negativní znaménko. 2. Systém je v rovnováze, když je DG = 0. 3. Reakce neprobíhá samovolně, když je DG pozitivní. Musí být dodána volná energie. Negativní DG neznamená, že reakce proběhne dostatečně rychle. Rychlost reakce závisí na volné aktivační energii DG *.
Typy terciární struktury fibrilární (vláknitý tvar) - skleroproteiny převládá jedna sekundární struktura; př. -keratin, -keratin globulární (kulovitý tvar) - sferoproteiny rovnoměrné zastoupení obou sekundárních struktur membránové Orientace zbytků AK Vodné prostředí - polární ven hydrofobní dovnitř Orientace zbytků AK u membránových proteinů je opačná
Aktivní místo oblast v molekule enzymu, kde se váží substráty, případně kofaktory tvoří vedlejší řetězce nesousedních aminokyselin polypeptidového řetězce, tzv. katalytické. tvoří třídimenzionální strukturu do které vstupuje substrát tvoří malou část celkového objemu enzymu interakce substrátu a enzymu v aktivním místě vede ke tvorbě přechodového stavu substráty se váží do aktivního místa řadou slabých interakcí vytváří se komplex enzym substrát (ES). specificita vazby enzym substrát je založena na přesně uspořádaných atomech v aktivním místě při tvorbě komplexu ES se uvolňuje vazebná energie přispívající ke snížení energie aktivační a tvorbě přechodového stavu
pyruvát Specificita enzymů laktát 200 000x hůře u živočichů substrátová specifita: absolutní ureasa skupinová - karboxypeptidasa u bakterií
Model interakce substrátu s enzymem Zámku a klíče Indukovaného přizpůsobení, postupné změny konformace
Třídění klasifikace IUB 1961, 6 tříd podle typu katalyzované reakce 1. třída oxidoreduktasy oxidačně redukční reakce nejpočetnější třída - laktátdehydrogenasa 2. třída transferasy přenos skupin - aspartátaminotransferasa 3. třída hydrolázy hydrolyticky (za účast H 2 O) štěpí vazby početná skupina - ureasa 4. třída lyasy nehydrolyticky (bez účast H 2 O) štěpí vazby, eliminace i adice - karbonátdehydratasa 5. třída izomerasy intramolekulární přesuny atomů či skupin - glukosa-6-fosfátizomerasa 6. třída ligasy vznik energeticky náročných vazeb nejčastěji za spotřeby ATP - asparaginsyntethasa
Názvosloví enzymů Triviální Názvy souvisely s místem výskytu nebo funkcí ptyalin (sliny), trypsin, pepsin, starý žlutý enzym Jednoduché Název substrátu nebo reakce + koncovka asa: amylasa, ureasa, oxidasa, hydrolasa, transaminasa Systematické názvosloví Odráží reakční specificitu základ systematického třídění Regulérní Substráty:produkty-reakce, typické pro jednotlivé třídy L-Glu:NAD + -oxidoreduktasa (deaminující) Zjednodušené Substrát + reakce + -asa glukosa-6-fosfátdehydrogenasa
Názvosloví enzymů - tvorba Třída / % zastoupení EC 1. Oxidoreduktasy 25,6 EC 2. Transferasy 27,6 EC 3. Hydrolasy 22,9 EC 4. Lyasy 13,1 EC 5. Isomerasy 5,3 EC 6. Ligasy 5,5 Tvorba názvu Donor:akceptoroxidoreduktasa Donor:akceptorpřenášená skupinatransferasa Substrát hydrolasy, odstraňovaná substrátová skupina-hydrolasa Substrát, odstraňovaná substrátová skupina 1.Substrát-isomerasa 2.Substrát-racemasa 3.Substrát-epimerasa 4.Substrát-mutasa 1.molekula-2.molekula spojení ligasou Příklad systematického názvu (S)-malát:NAD + -oxidoreduktasa ATP:glycerol-3-fosfotransferasa Adenosinaminohydrolasa Triacylglycerolacylhydrolasa ATP-difosfolyasa Xylosa-ketolisomerasa Alaninracemasa Glukosaepimerasa Methylmalonyl-CoA-mutasa Alanyl:tRNA ligasa (AMP) Pyruvát:CO 2 -ligasa(adp)
Třídění klasifikace http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html EC a.b.c.d Např. alkohol:nad:oxidoreduktasa (alkoholdehydrogenasa) EC 1.1.1.1 EC 1 oxidoreduktasy EC 1.1. skupina CHOH EC 1.1.1. kofaktor NAD EC 1.1.1.1 číslo uvnitř skupiny
Určující charakteristika dc/dt Rychlost reakce
Enzymové jednotky Aktivita enzymu = rychlost enzymem katalysované reakce Stanovení počáteční rychlosti v 0 1. Smluvní jednotky např. u amylasy - množství enzymu, které rozštěpilo za 30 min při 40 o C dané množství škrobu, aby ten nedával reakci s jodem 2. Mezinárodní jednotka (IU) množství enzymu, které katalysuje přeměnu 1 mmolu substrátu (tvorby produktu) za 1 minutu při 30 C (za optimálních podmínek, pufr, ph, koncentrace substrátu, kofaktor) 3. Jednotka SI (rok 1973) katal (kat) množství enzymu, které katalysuje přeměnu 1 molu substrátu (tvorby produktu) za 1 sekundu při 30 C (za optimálních podmínek, pufr, ph, koncentrace substrátu, kofaktor). Používají se mkat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat). 1 kat = 1 mol/s = 6,10 7 IU 1 IU = 16,67 nkat
Vyjadřování katalytické účinnosti enzymů Specifická aktivita aktivita vztažená na celkové množství (koncentraci) vztažného parametru( bílkoviny) např. nkat/mg Číslo přeměny látkové množství substrátu (mol) přeměněné molem enzymu za časovou jednotku (s) k [s -1 ] Aktivita se měří za optimálních podmínek teplota, ph a iontová síla roztoku.
Metody stanovení aktivity enzymu Stanovení změny [P] nebo [S] v čase: dc/dt Výhodnější [P], ale záleží na možnostech metody Spektrální absorpční, fluorescenční aj., chemické, elektrochemické (amperometrie), enzymové (spřažené reakce) POZOR - vliv prostředí
Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymů
Warburgův optický test
Stanovení glukosy
Vliv prostředí na rychlost enzymové reakce Optimální podmínky In vivo fysiologické prostředí In vitro napodobení fyziologických podmínek Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí ph. Spočívá to ve vlivu ph na kombinaci faktorů: A) Vazba substrátu na enzym B) Stav ionizace substrátu Vliv ph C) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v aktivním místě Většina enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku závislosti reakční rychlosti na ph. Hodnotu ph, při které dochází k nejvyšší rychlosti enzymové reakce nazýváme ph optimum.
Vliv ph
Vliv teploty Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je ph, iontová síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů. Substráty obecně chrání enzymy před tepelnou denaturací. Nízkomolekulární enzymy s jednoduchým polypeptidovým řetězcem obsahující disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně stabilnější než vysokomolekulární oligomerní enzymy. Obecně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů. Enzymy jsou proteiny, u kterých se terciární a kvarterní struktura udržuje slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové interakce atd. Závislost rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který označujeme jak teplotní optimum. Při dalším zvyšování teploty obvykle dochází k denaturaci proteinu. Pro práci s enzymy je doporučována IUB teplota 30 o C.
Vliv teploty
Kinetika enzymové reakce Časový průběh enzymové reakce prestacionární a stacionární stav
Rovnice Michaelise a Mentenové Kinetický popis aktivity enzymu Reakční rychlost v o se obvykle vyjadřuje jako počet molů produktu vytvořených za sekundu. Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise a Mentenové Tvorba komplexu enzym-substrát [ES]. Měříme počáteční rychlost v o, kdy se nenahromadilo takové množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci. Ustálený stav koncentrace [ES] se nemění i když koncentrace substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby [ES] je shodná s rychlostí rozpadu [ES].
Počáteční reakční rychlost [v O ] v 0 = f([s]) Rovnice Michaelise-Mentenové v 0 = (v max [S]) / (K M + [S]) Hyperbolický průběh V lim V lim Speciální případy [S] K M [S] K M [S] = K M v 0 = V lim / 2 V lim / 2 K m Maximální rychlost Koncentrace substrátu [S] v max = k cat [E] t
Stanovení kinetických parametrů Linearizace tzv. vynesení dle Lineweavera a Burka 1/v 0 = 1/f([S]) v O = V lim [S] K m + [S] Rovnice Michaelise a Mentenové 1 v O = K m + [S] V lim [S] 1 v O = K m V lim [S] + [S] V lim [S] 1 v O = K m V lim [S] + 1 V lim Sklon = K m /V lim Průsečík = 1/V lim Dvojnásobně reciproká rovnice Lineweavera a Burka
Stanovení kinetických parametrů Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / v o proti 1 / [S] dle Lineweavera a Burka 1 / v o = K M / V lim. 1 / [S] + 1 / V lim 1 / [v O ] Sklon = K m / V lim K m Průsečík = -1/ V lim Průsečík = -1/ 0 1 / [S]
Význam konstant K M je mírou afinity substrátu k enzymu K M = (k 2 + k cat ) / k 1 je vztah mezi K M a rychlostními konstantami enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise a Mentenové. Formálně disociační konstantou komplexu [ES] Není závislá na katalytickém množství (aktivitě enzymu) v pokusu, pokud pracujeme v oblasti lineární závislosti v na [E] Lze ji tabelovat a užít jako srovnávací parametr Mění se s externími parametry (ph, iontová síla ) Liší se pro různé substráty téhož enzymu Kosubstráty NAD + apod. (LDH) Vztah k metabolickým hotovostem pool. Koncentrace substrátu, při které je substrátem obsazena polovina aktivních míst enzymu. Odpovídá koncentraci substrátu in vivo.
Význam konstant K M je mírou afinity substrátu k enzymu V případě, že k 2 je mnohem větší než k cat to znamená, že ES komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt. Vztah se zjednoduší na K M = k 2 / k 1. Disociační konstanta komplexu ES je: K ES = [E] [S] / [ES] = k 2 / k 1 Jinými slovy: K M je v tomto případě rovno disociační konstantě komplexu ES. Vysoké hodnoty K M ukazují na slabou afinitu substrátu k enzymu, a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.
Význam konstant V lim je ukazatelem aktivity enzymu Závisí na katalytickém množství enzymu v experimentu Dá se užít k vyjádření katalytické účinnosti a čistoty enzymu. V těchto případech se vypočítá tzv. specifická aktivita jako poměr V lim a množství enzymu (typicky v mg bílkoviny neznáme-li jeho M r nebo pracujeme se směsí homogenát, krevní sérum apod.) Známe-li látkové množství enzymu, pak specifickou aktivitu vztaženou na látkové množství enzymu nazýváme číslem přeměny (TN): V lim / [E] [mol.s -1 /mol] = TN [s -1 ] = k cat [s -1 ]
Obvyklá chyba studentů Uvažují, že rychlostní konstanta k cat nemůže být větší než k 1 neboť by to znamenalo, že se komplex ES se rozpadá rychleji než se tvoří. Pozor: konstanty mají různé jednotky a proto nemohou být srovnávány!! Konstanta k 1 má jednotky M -1. s -1 nebo (min) -1, konstanta k cat má jednotky s -1 nebo min -1. Nejsou to rychlosti, ale rychlostní konstanty prvního a druhého řádu!!! Rychlost tvorby [ES] je k 1 [E][S] Rychlost rozpadu [ES] na E + P je k cat [ES]. Může nastat stav, kdy k cat >>k 2!!! V tom případě se K M redukuje na k cat / k 1!!!
Číslo přeměny enzymu Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na produkt enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné saturaci enzymu substrátem. Nazývá se také katalytická konstanta k cat. Enzym Číslo přeměny enzymu Karbonáthydratasa 600 000 3-ketosteroidisomerasa 280 000 Acetylcholinesterasa 25 000 Penicilinasa 2 000 Laktatdehydrogenasy 1 000 Chymotrypsin 100 DNApolymerasa 15 Lysozym 0,5
Konstanta specificity Kinetická dokonalost enzymové aktivity poměr k cat / K M k cat (vyšší účinnější katalýza) a K M (nižší větší afinita enzymu k substrátu) Spolehlivější ukazatel substrátové specificity preference substrátů V případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než K M rychlost enzymové reakce je dána k cat, což je číslo přeměny Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem nasycen Poměr [S] / K M je mezi 0,01 až 1,0. Za situace, kdy je [S] < < K M je rychlost enzymové reakce mnohem menší než k cat, protože je mnoho aktivních míst neobsazeno
Konstanta specificity Existuje nějaké číselné měřítko, které by charakterizovalo enzym za podmínek v buňce? Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci enzymu pro různé substráty. Horním limitem je rychlost difúze substrátu do aktivního místa enzymu. Ester aminokyseliny Vedlejší řetězec k cat /K M (s -1 M -1 ) Glycin - H 1,3 x 10-1 Valin isopropyl 2,0 Norvalin n-propyl 3,6 x 10 2 Norleucin n-butyl 3,0 x 10 3 Fenylalanin benzyl 1,0 x 10 5 Nejdokonalejším substrátem je fenylalanin
Dvousubstrátové reakce Sekvenční - náhodný mechanismus (bi bi) nezáleží na tom, který z obou substrátů se váže jako první na enzym příklad: kreatinkinasa ATP Kreatin Fosfokreatin ADP Enzyme Enzyme E (kreatin) (ATP) E (fosfokreatin) (ADP) Kreatin ATP ADP Fosfokreatin
Dvousubstrátové reakce Sekvenční - uspořádaný mechanismus (bi bi) substráty se váží do aktivního místa v určitém pořadí příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa (nejdříve se váže koenzym NADH a poté druhý substrát) NADH Pyruvát Laktát NAD + Enzyme E (NADH) (pyruvát) E (laktát) (NAD + ) Enzyme
Pingpongový mechanismus Dvousubstrátové reakce enzym přechází mezi dvěma stálými formami po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný enzymový meziprodukt - modifikovaný enzym první produkt se uvolní a poté se váže na modifikovaný enzym druhý substrát a odštěpí se druhý produkt příklad: aspartátaminotransferasa Aspartát Oxaloacetát -Oxoglutarát Glutamát Enzyme E (aspartát) (E-NH 3 ) (oxaloacetát) + (E-NH + 3 ) + (oxaloacetát) (E-NH 3 ) ( -oxoglutarát) E (glutamát) Enzyme
Regulační aspekty Michaelisovská kinetika vliv [S] na rychlost Alosterické enzymy oligomerní kooperativita - efektivní regulace neřídí se kinetikou Michaelise a Mentenové.
Aspartáttranskarbomoylasa (ATCasa) ATCasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových nukleotidů. ATCasa je inhibována produktem cytidintrifosfátem (CTP). Tento typ inhibice se nazývá zpětnovazebná inhibice nebo inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první reakční krok. CTP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na jiné místo enzymu než substrát. Taková místa se nazývají allosterická (z řečtiny allos jiná a steros struktura, místo). ATCasa je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá obsahuje dva řetězce). ATP je allosterický aktivátor, CTP je allosterický inhibitor.
Modulace rychlosti enzymové reakce Metabolický význam in situ Regulace metabolismu Studium metabolismu in vitro Objasnění mechanizmu působení enzymů Součást regulací jako celku Způsoby účinek metabolitů, modifikace apoenzymu Modulátory, efektory Positivní aktivátory Negativní - inhibitory
Inhibice enzymové aktivity Typy inhibitorů Ireversibilní Vážou se pevně a nevratně. Blokují nevratně enzymovou aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní komplex enzym inhibitor Reversibilní Interagují s enzymem vratně Dají se odstranit např. dialýzou, gelovou chromatografií Typy reversibilních inhibicí Kompetitivní Nekompetitivní Akompetitivní
Ireverzibilní inhibice OH Ser O F + P O O O O H H CH 3 CH 3 CH 3 DIPF CH 3 H H P CH 3 CH 3 O O CH 3 CH 3 + F - + H + Acetylcholinesterasa Inaktivovaný enzym Příklad: Inhibice cholinesterasy a proteinas diisopropylfluorfosfátem, který se kovalentně váže na Ser v aktivním místě nebo Organofosfáty, těžké kovy Lze využít jako modifikační činidla pro studium aktivního centra
Ireverzibilní inhibice SH-inhibitory - inaktivace cysteinového řetězce enzymu jodacetamidem O O Cys SH + I C S C + I - + H + C NH 2 C NH 2 H 2 H 2 Jodacetamid Enzym Inaktivovaný enzym Alkylační činidla, rtuťnaté sloučeniny (PCMB)
Inhibitor lze odstranit (dialýza, gelová filtrace) Kompetitivní Inhibitor se váže do aktivního místa Strukturní podobnost se substrátem Soutěžení inhibitoru se substrátem Nekompetitivní Inhibitor se váže jinak Substrát neovlivní vazbu inhibitoru Akompetitivní Inhibitor se váže na komplex ES Alosterická Vazba na jinou podjednotku Reverzibilní inhibice
Schéma kompetitivní inhibice Kompetitivní inhibice Klasická kompetitivní inhibice S Enzym I I Enzym S Enzym Neklasická kompetitivní inhibice S Enzym I Enzym S I Enzym Buďto vstoupí substrát do aktivního místa enzymu a zamezí vstupu inhibitoru nebo naopak.
Kompetitivní inhibitor Reaguje s volným enzymem a soutěží se substrátem Vazné místo v aktivním centru Může se navázat pouze na volný enzym V reakční směsi se pak vyskytuje mimo E, S a ES ještě EI (komplex enzym-inhibitor), který se tvoří vratně mezi volným enzymem a inhibitorem Zvýšení K M (zdánlivá hodnota) V lim se nemění Kompetitivní inhibice
Kompetitivní inhibice Grafické vyjádření této závislosti vidíme na vynesení dle Lineweavera a Burka
Kompetitivní inhibice Inhibice SDH malonátem Jantaran (sukcinát) je substrátem enzymu sukcinátdehydrogenasy (vzniká fumarát) (enzym citátového cyklu) Malonát je kompetitivním inhibitorem SDH (nelze ho dehydrogenovat) Strukturní podobnost, někdy bývá méně názorná (el. hustoty) Určení typu inhibice kineticky COO - CH 2 CH 2 COO - Sukcinát COO - CH 2 COO - Malonát Sukcinátdehydrogenasa Kompetitivní inhibitor - OOC HC CH Fumarát E + I COO - + K i = [E] [I] / [EI] EI 2 H
Potlačení intoxikace ethylenglykolem ethanolem Tvorba oxalové kyseliny z ethylenglykolu je inhibována ethanolem: O H C H 2 OH Alkoholdehydrogenasa C COOH H 2 C OH Inhibováno ethanolem H 2 C OH COOH Ethylenglykol + HO CH 2 Aldehyd Ethandiová kyselina, oxaláty CH 3 Ethanol
Schéma nekompetitivní inhibice Nekompetitivní inhibice S S Enzym I Enzym I Enzym I Enzym S
Nekompetitivní inhibice Inhibitor není podobný substrátu Váže se jak na volný E tak na komplex ES Vytváří komplex EI [EI] nezávisí na [S], ale pouze [I] V lim se snižuje K M se nemění
Nekompetitivní inhibice Grafická analýza dle Lineweavera a Burka
Kompetitivní a nekompetitivní inhibice
Kompetitivní a nekompetitivní inhibice Oranžová nekompetice Zelená - kompetice
Schéma akompetitivní inhibice Akompetitivní inhibice S Enzym I Enzym S I Enzym S
Akompetitivní inhibice 1 / [v O ] Stejné množství substrátu a inhibitoru: 30 E + S ES E + P + I Akompetitivní inhibice K m 1 1/v i = + ( [I] ) 1 + V lim [S] V lim K i 20 Nemění se sklon EIS Bez inhibice S S S E + S S + S I S Nadbytek substrátu: ES Nadbytek substrátu neovlivní reakci. ESI 10 K m se mění V lim se mění K m 1/v O = + V lim [S] 1 V lim ES + I ESI K i = [ES] [I] / [ESI] 0 100 200 300 400 500 1 / [S], M -1
Tabulka typů inhibice a příslušných konstant Inhibice Kompetitivní I se váže jen na E Nekompetitivní I se váže jak na E tak na ES Akompetitivní I se váže jen na ES Konstanty Roste K M, V lim se nemění Klesá V lim, K M se nemění Klesá V lim a K M Poměr V lim / K M se nemění
Inhibitory enzymu princip účinku řady léčiv Látka Inhibovaný enzym Pozn. Acetylsalicylová kys., ibuprofen Cyklooxygenasa - zajištuje přeměnu kyseliny arachidonové na prostaglandiny zmírňují rozvoj zánětu, bolestivost a snižují teplotu Statiny HMG-CoA reduktasa hypolipidemika, snižují hladinu cholesterolu Neostigmin acetylcholinesterasa nervosvalové choroby, pooperační atonie střev Rivastigmin, galantamin Mozková acetylcholinesterasa Alzheimerova choroba
Inhibitory enzymů bakterií antibiotika Látka Penicilíny Tetracyklíny, makrolidy, chloramfenikol Fluorované chinolony Inhibovaný enzym Transpeptidasa (výstavba buněčné stěny) Inhibice proteosyntézy Topoisomerasa II (rozplétání DNA během replikace)
Stejná aktivita Katalyzují stejnou reakci Liší se strukturou apoenzymu (primární struktura) a/nebo postranslačními úpravami Liší se fyzikálně-chemickými vlastnostmi (odlišná afinita k substrátu, K M, citlivost k inhibitorům) Často rozdílná subcelulární /tkáňová dustribuce Podjednotkové složení Úloha stáří organismu Orgánová specificita Isoenzymy Příklad LDH
Isoenzymy Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym Výskyt Procento celkové aktivity Zvýšení CK-MM svaly 94-96% Svalové trauma CK-MB srdce do 6% Infarkt CK-BB mozek stopy Poranění mozku
Neaktivní formy Posttranslační modifikace Význam proteasy Zymogeny - proenzymy
Organizace enzymů Efektivita reakcí katabolické jednodušší anabolické význam organizovanosti Typy enzymy volně rozpuštěné (cytoplasma glykolýza) multienzymové komplexy (zvl. pro anabolické pochody syntéza MK, ale i katabolické pochody využití energie) membránově vázané enzymy (organizovanost, vektoriální průběh reakcí využití energie oxidační a fotosyntetická fosforylace)
Využití enzymů v lékařství 1. Enzymy jako indikátory patologického stavu 2. Enzymy jako analytická činidla v diagnostice v klinické biochemii 3. Enzymy jak léčiva Ad 1. Při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině Enzym Referenční hodnoty Interpretace zvýšení ALT (alaninaminotransferasa) do 0,9 mkat/l hepatopatie CK (kreatinkinasa) do 4 mkat/l myopatie, infarkt myokardu
Využití enzymů v lékařství Ad 2. Enzymy jako analytická činidla v diagnostice v klinické biochemii Enzym Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Taqpolymerasa Stanovení glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST PCR metoda
Využití enzymů v lékařství Ad 2. Enzymy jako analytická činidla v diagnostice v klinické biochemii
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Diagnostika místa a rozsahu tkáňového postižení stanovení aktivit enzymů v tělesných tekutinách (nejčastěji plazma) prognostický přínos - na základě změn hladin příslušných enzymů v čase 1) Enzymy specifické pro plazmu např. srážecí faktory 2) Sekreční enzymy, v různé míře se dostávají do krve např. pankreatická amylasa či lipasa 3) Intracelulární enzymy do krve pronikají při poškození buněk příslušné tkáně Některé enzymy jsou orgánově specifické. Typicky se jedná o různé druhy izoenzymů či izoforem enzymů. Např. izoenzymy kreatinkinázy CK-MB typická pro myokard a CK-MM pro kosterní sval.
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Játra a) Markery poškození hepatocytů: 1. ALT (alaninaminotransferasa) lokalizovaná převážně v cytoplazmě 2. AST (aspartátaminotransferasa) lokalizovaná převážně v mitochondriích - dochází k jejímu uvolnění až při těžším poškození jaterních buněk b) Markery cholestázy: 1. ALP (alkalická fosfatasa) 2. 2GGT (γ-glutamyltransferasa) zvýšená aktivita u chronického alkoholického postižení jater
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Pankreas a) Pankreatická amylasa méně specifická pro postižení pankreatu než pankreatická lipasa b) Pankreatická lipasa Svalová tkáň K odlišení místa poškození se měří aktivity izoenzymů kreatinkinasy: a) CK-MM lokalizovaná v kosterním svalstvu b) CK-MB lokalizovaná v myokardu c) CK-BB lokalizovaná v mozku
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Kostní tkáň a) ALP (alkalická fosfatasa) lokalizovaná v osteoblastech tzv. kostní frakce, může ale pocházet i z jater (tzv. jaterní frakce), GIT či z ledvin b) ACP (kyselá fosfatasa) lokalizovaná v osteoklastech, může pocházet i z prostaty Dále se stanovují také: 1) Izoenzymy laktátdehydrogenasy (LD, LDH) a) LD-1 lokalizovaná v buňkách myokardu a erytrocytech b) LD-2 lokalizovaná v RES c) LD-3 lokalizovaná v plicích d) LD-4 lokalizovaná v ledvinách, pankreatu a placentě e) LD-5 lokalizovaná v játrech a kosterním svalu
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace dýchacího řetězce a aerobní fosforylace 1. Dostupnost O 2, který je finálním akceptorem elektronů 2. Poměr NADH / NAD + a FADH 2 / FAD 3. Dostupnost ADP pro syntézu ATP 4. UCP (uncoupling proteins odpřahovače DŘ od aerobní fosforylace snížení protonového gradientu) Regulace Krebsova cyklu Regulačními body (enzymy) Krebsova cyklu jsou: 1. Citrátsyntasa 2. Isocitrátdehydrogenasa - hlavní regulační enzym 3. α-ketoglutarátdehydrogenasa
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulačními faktory Krebsova cyklu jsou: Poměr NADH / NAD + a FADH 2 / FAD respirační kontrola Hromadí-li se NADH a FADH 2 dojde k inhibici isocitrátdehydrogenasy a α-ketoglutarátdehydrogenasy. Poměr ATP / (ADP a AMP) energetická kontrola Dostatek energie inhibuje isocitrátdehydrogenasu a α-ketoglutarátdehydrogenasu ATP je inhibitor, ADP a AMP jsou aktivátory. Dostupnost substrátů Krebsova cyklu substrátová kontrola Na úrovni citrátsyntasy, která produkuje tolik citrátu, kolik jí dodáme oxaloacetátu a acetyl-coa. Dostupnost O 2 těsný vztah respiračním řetězcem
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace oxidační dekarboxylace pyruvátu 1. Interkonverze pyruvátdehydrogenasového komplexu (PDH) fosforylace snižuje aktivitu komplexu defosforylace ji naopak zvyšuje. inzulin prostřednictvím defosforylace aktivuje komplex 2. Kompetitivní inhibice produkty acetyl-coa a zvýšený poměr NADH / NAD + způsobují inhibici.
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace glykolýzy Enzymy katalyzující nevratné exergonní reakce: 1. Hexokinasa / glukokinasa 2. 6-fosfofrukto-1-kinasa (PFK-1) - hlavní allosterický regulační enzym 3. Pyruvátkinasa Zvýšení poměru ATP / AMP vede k inhibici glykolýzy Citrát inhibuje glykolýzu Regulace přes fruktóza-2,6-bisfosfát (Fru-2,6-P) Glykolýzu aktivuje inzulin a inhibují ji kontraregulační hormony Inhibice kyselým ph
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace glukoneogeneze Aktivace během hladovění nebo za patologických stavů (stres v důsledku infekce, polytraumata apod.) Regulační enzymy obcházejí nevratné reakce glykolýzy 1. Pyruvátkarboxylasa: aktivuje ji acetyl-coa pocházející například z β-oxidace mastných kyselin 2. Fosfoenolpyruvátkarboxykinasa 3. Fru-1,6-bisfosfatasa 4. Glc-6-fosfatasa: regulují je stejné vlivy jako reakce glykolýzy, pouze v opačném směru. Hladina substrátů daných enzymů vznikají např. proteolýzou či lipolýzou Kontraregulační hormony glukokortikoidy, glukagon či katecholaminy glukoneogenezi zesilují inzulin ji naopak inhibuje
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace syntézy glykogenu Hlavním regulačním enzymem je glykogensyntasa 1. Aktivita je regulována pomocí fosforylace pokud je enzym fosforylován, inaktivuje se defosforylace naopak vede k aktivaci enzymu 2. Fosforylaci ovlivňuje poměr inzulin / glukagon (např. skrze intracelulární koncentraci camp) zvýšení poměru aktivuje syntézu glykogenu (inzulin je anabolický hormon) snížení poměru či katecholaminy ji naopak inhibují
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace degradace glykogenu Hlavním regulačním enzymem je glykogenfosforylasa 1. Kovalentní modifikací molekuly 2. Glykogenolýzu aktivují kontraregulační hormony glukagon, katecholaminy a glukokortikoidy (např. kortizol) inzulin ji oproti tomu inhibuje 3. Změna koncentrace Ca 2+ iontů
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace pentózového cyklu Dostupností koenzymu NADP + Regulace lipolýzy 1. Regulační enzym lipolýzy - hormon-senzitivní lipasa 2. Hormonálně inzulin jako anabolický hormon vyvolává její inhibici kontraregulační hormony (glukagon, katecholaminy) či hormony štítné žlázy ji naopak aktivují
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace β-oxidace 1. Na úrovni vstupu mastných kyselin do mitochondrie na úrovni karnitinového přenašeče na úrovni karnitinacyltransferasy I inhibice meziproduktem tvorby mastných kyselin malonyl~coa 2. Hormonálně inzulin β-oxidaci inhibuje kontraregulační hormony naopak aktivují
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace ketogeneze Regulace ketogeneze probíhá na čtyřech stupních: 1. Hormon-senzitivní lipasa lipolýza v tukové tkáni 2. Karnitinacyltransferasa I vstup mastných kyselin do mitochondrie, kde proběhne jejich β-oxidace 3. Směřování AcCoA z β-oxidace do ketogeneze a ne do Krebsova cyklu 4. Mitochondriální HMG-CoA-syntasa Vysoká hladina ketolátek v krvi signalizuje přítomnost velkého množství AcCoA Jejím následkem je inhibice lipolýzy
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace syntézy mastných kyselin 1. Dostatek substrátů i dostatkem energie. 2. Klíčovou regulační roli hraje AcCoA-karboxylasa: inzulin aktivuje karboxylasu glukagon a adrenalin ji naopak inhibují (skrze fosforylaci) citrát ji aktivuje - znak dostatku stavebních jednotek a energie palmitoyl-coa (obecně acyl-coa) inhibuje karboxylasu - feedback inhibice AMP ji inhibuje
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace močovinového cyklu 1. Hlavní regulační enzym ornitinového cyklu: Karbamoylfosfátsyntetasa I 2. Transkripce enzymů močovinového cyklu se zvyšuje u vysokoproteinové diety či u narůstajícího proteokatabolismu ve stavech zvýšené nabídky aminokyselin 3. Protože močovinový cyklus patří mezi protonproduktivní reakce, nastává jeho útlum při poklesu ph - acidóze Regulace syntézy hemu 1. Hlavní regulační enzym ALA-syntasa (δ-aminolevulová kyselina = ALA) inhibice konečným produktem celé dráhy hem (negativní zpětná vazba)