MUDr. Soòa Peková, PhD. CHAMBON s.r.o., Laboratoø molekulární diagnostiky, Evropská 176/16, Praha Využití GS Junior v projektu hledání nových markerù pro sledování minimální reziduální nemoci u akutních leukémií Úvod Akutní leukémie (AL) patøí mezi závažná hematoonkologická onemocnìní s velmi heterogenním biologickým prùbìhem. Abnormality karyotypu u de novo zjištìných akutních leukémií jsou prokazatelné pøibližnì u 50 procent dospìlých pacientù s akutní myeloidní leukémií (AML), resp. u 70 procent dospìlých pacientù s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL) (1), avšak pouze èást karyotypových zmìn má za následek vznik fúzního produktu, jenž je možné detekovat na molekulární úrovni. K rutinnì vyšetøovaným fúzním transkriptùm, které lze monitorovat na RNA úrovni, patøí u pacientù s akutní myeloidní leukémií zejména AML1-ETO (RUNX1- RUNX1T1), PML-RARα, DEK-CAN (DEK-NUP214), CB β-myh11 (2). U pacientù s akutní lymfoblastickou leukémií jsou to fúzní transkripty BCR-ABL, MLL- A 4 (MLL-A 1), E2A-PBX1 (TC 3- PBX1), TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) (3,4). U nìkterých pacientù jsou pomocí metod molekulární biologie identifikovány nejrùznìjší mutace v hematologicky významných genech - NPM1, CEBP, LT3, c-kit, WT1 (5-7). U pacientù s ALL jsou èasté pøestavby tìžkých øetìzcù imunoglobulinu (IGH) a T-bunìèného receptoru (TCR) (8). Zmínìné chromozomové abnormality, genové mutace a pøestavby mohou být Obr. 1. Molekulárnì cytogenetická analýza karyotypu pacienta s akutní leukémií A) Mnohobarevná fluorescenèní in situ hybridizace (m ISH) B) Mnohobarevné pruhování s vysokou rozlišovací schopností (mband) pro chromozomy X, 4 a 11 8 Labor Aktuell 04/12
v prùbìhu léèby pacientù s akutní leukémií použity jako molekulární markery k monitorování minimální reziduální nemoci (MRN). Detekce MRN je v souèasné dobì rozhodujícím nástrojem ke zhodnocení kvality odpovìdi pacienta na léèbu, jelikož umožòuje predikovat její selhání, pøípadnì u pacientù po transplantaci kostní døenì dovoluje vèas pøedpovìdìt blížící se relaps onemocnìní. Proto je velmi žádoucí identifikovat unikátní klonálnì specifické znaky leukemických bunìk, a umožnit tak monitorování MRN i pacientùm, u nichž nebyla nalezena žádná ze standardnì vyšetøovaných aberací. Moderní techniky molekulární biologie založené na technikách celogenomového sekvenování (Next Generation Sequencing; NGS) umožòují mapovat a identifikovat unikátní klonální abnormality, což dovoluje konstruovat kvantitativní Real- Time PCR eseje pro sledování MRN šitých na míru jednotlivým pacientùm; jinými slovy - tento pøístup umožòuje personalizovanou medicínu v hematoonkologii. Obr. 2. Reverzní ISH. Ovìøení specifiènosti disekovaných chromozomových fragmentù u pacienta s akutní leukémií. A) Derivovaný chromozom 4 B) Derivovaný chromozom 11 Tab. 1. Základní informace o analýze jednotlivých zlomových míst Obr. 3. Schématické zobrazení postupu pøi identifikaci zlomového místa na derivovaném chromozomu Labor Aktuell 04/12 9
Technologie Pro NGS identifikaci unikátních abnormalit na nukleotidové úrovni je klíèovým momentem identifikace derivovaných chromozomù pomocí technik molekulární cytogenetiky - m ISH a mband, tenkojehlová mikrodisekce èásti derivovaného chromozomu a následná sekvenace disekovaného materiálu pomocí celogenomového sekvenování na platformì GS Junior (Roche). Na konkrétním pøíkladu pacienta s akutní leukémií je v dalším textu tato technika objasnìna. Molekulárnì cytogenetickým vyšetøením (m ISH a mband) byla u pacienta s akutní leukémií nalezena balancovaná chromozomová translokace zahrnující gen MLL - 46,XX,t(X;4;11)(q25;q21;q23) (Obr. 1). Z každého derivovaného chromozomu bylo mikrodisekováno deset fragmentù. Jejich specifiènost byla ovìøena hybridizací na metafázní chromozomy ne- Obr. 6. Kvantifikaèní grafy A) Relativní kvantifikace chromozomového zlomu na der(4) B) Relativní kvantifikace chromozomového zlomu na der(11) C) Relativní kvantifikace fúzního transkriptu MLL-A 4 (BM = kostní døeò) Obr. 4. Long-range PCR produkty u pacienta s akutní leukémií A) Derivovaný chromozom 4 B) Derivovaný chromozom 11 Obr. 5. Sekvence long-range PCR produktù A) derivovaný chromozom 4; fúze genu A 4 (intron 5) a pseudogenu LOC392539 na chromozomu X B) derivovaný chromozom 11; fúze genù MLL (intron 9) a A 4 (intron 5) gativní kontroly (Obr. 2 A, B). Sekvenací disekovaných chromozomových fragmentù na pøístroji GS Junior bylo získáno 122 279, resp. 120 209 ètení pro chromozomy der(4), resp. der(11) (Tab. 1). Získaná ètení byla pomocí in-house software GeneAnalyzer (Plachý R., nepublikováno) pøiøazena na referenèní sekvence chromozomù 4 a 11, což umožnilo identifikaci potenciálních míst zlomu obou chromozomù. Na tuto sekvenci byly ekvidistantnì (po cca 1 500 bp) navrženy primery pro longrange PCR (LR-PCR) (Obr. 3). LR-PCR amplifikace vedla k zisku produktù o velikostech ~ 0,5 kb pro derivovaný chromozom 4, resp. ~ 3 kb pro derivovaný chromozom 11 (Obr. 4). Sekvenováním LR-PCR amplikonù na kapilárním sekvenátoru ABI3130 (Applied Biosystems, USA) jsme identifikovali DNA sekvence bodù zlomù obou fúzních partnerù. Derivovaný chromozom 4 vznikl fúzí pseudogenu LOC392539 z chromozomu X a genu A 4 na 4q21. Derivovaný chromozom 11 vznikl fúzí genù MLL (intron 9) a A 4 (intron 5) (Obr. 5). Novì identifikované sekvence byly poté využity ke konstrukci Real-Time PCR eseje pro klonálnì-specifickou kvantifikaci MRN (zlomy derivovaných chromozomù 4 a 11 - zlomová místa Xq25; 4q21, resp. 4q21; 11q23). Novì identifikované mole- 10 Labor Aktuell 04/12
kulární cíle byly rovnìž srovnány s již zavedeným cílem pro sledování MRN (fúzní transkript MLL-A 4) (Obr. 6). Pøíklad mapování zlomového místa (derivovaný chromozom 4) pomocí inhouse aplikace GeneAnalyzer je uveden na obrázku 7. Závìr Sledování dynamiky minimální reziduální nemoci u akutní leukémie pomocí klonspecifických Real-Time PCR esejí umožòuje preciznì monitorovat osud maligní populace bunìk v tìle pacienta v prùbìhu léèby a vyhodnotit léèebnou odpovìï. Cílem naší práce bylo pomocí moderních technik molekulární cytogenetiky, celogenomového sekvenování a standardního Sangerova sekvenování pøipravit flexibilní metodiku pro identifikaci nových klonálnì specifických znakù leukemických bunìk u pacientù s akutní leukémií, u kterých nelze pomocí bìžného screeningového panelu analýz v záchytu onemocnìní nalézt molekulární marker pro sledování minimální reziduální nemoci. - - Prognostický význam detekce MRN pomocí PCR byl potvrzen mnoha pracemi (9-13). V naší laboratoøi slouží jako cíl pro monitorování MRN pacientù s akutními leukémiemi klonální pøestavby tìžkých øetìzcù imunoglobulinu (IGH) a T-bunìèného receptoru (TCR), fúzní transkripty a klonálnì specifické mutace prognostických markerù asociovaných s leukémiemi identifikované pomocí konvenèní PCR s následným sekvenováním. úzní transkripty jsou zahrnuty v unikátním diagnostickém systému AcutePlexX (14), díky Tab. 2. AcutePlexX. Seznam rekurentních chromozomových abnormalit detekovaných u pacientù s akutní leukémií. kterému jsme schopni detekovat více než sto známých fúzních transkriptù a jejich sestøihových variant (Tab. 2). Uvedenými pøístupy identifikujeme cíl pro sledování minimální reziduální nemoci pøibližnì u 50 procent dospìlých pacientù s akutní myeloidní leukémií. Popsaný postup identifikace nových klonálnì specifických markerù maligních bunìk umožòuje využívat i dosud nepopsané chromozomové aberace jako specifický cíl pro detekci a kvantifikaci MRN na molekulární úrovni. GS Junior Mikrodisekované fragmenty chromozomù byly celogenomovì amplifikovány a sekvenovány na platformì GS Junior, který pøedstavuje pro výše popsanou aplikaci ideální pøístup - GS Junior poskytuje ètení s mediánem pøibližnì 400 bp, což umožòuje precizní mapování i repetitiv- Labor Aktuell 04/12 11
ních sekvencí, èímž stoupá využitelnost jednotlivých ètení. Kombinace metod cytogenetiky a molekulární biologie umožòuje pøevést cytogenetický znak (derivovaný chromozom) leukemických bunìk pacientù s akutní leukémií až na molekulární (DNA sekvence) cíl urèený k detekci a kvantifikaci MRN pomocí techniky kvantitativní Real- Time PCR. Tato technologie pøedstavuje zcela unikátní postup identifikace molekulárního markeru pro sledování MRN u pacientù s akutní leukémií. Obr. 7. Zlom na derivovaném chromozomu 4 urèený pomocí in-house software GeneAnalyzer Jde o laboratorní pøístup šitý na míru nemocných s akutní leukémií, který naplòuje naši pøedstavu o personalizované medicínì. V optimálním pøípadì je Real- Time MRN esej na podkladì unikátního klonálnì specifického znaku leukemické populace pøipravena již za šest týdnù od stanovení diagnózy, což je zcela v souladu s potøebami rutinního diagnostického procesu u pacientù s akutní leukémií, kdy první vzorky ke sledování MRN dostává laboratoø po doznìní indukèní terapie, což je pøibližnì jeden mìsíc od záchytu onemocnìní. Literatura: 1) Mrózek K, Heerema NA, Bloomfield CD. Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev 2004; 18: 115-36. 2) Grimwade D, Hills RK, Moorman AV, et al. Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials. Blood 2010; 116: 354-365. 3) Bassan R, Spinelli O, Oldani E, et al. Improved risk classification for risk-specific therapy based on the molecular study of minimal residual disease (MRD) in adult acute lymphoblastic leukemia (ALL). Blood 2009; 113: 4153-4162. 4) Brüggemann M, Gökbuget N, Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring of minimal residual disease as a therapeutic principle. Semin Oncol 2012; 39: 47-57. Review. 5) Cairoli R, Beghini A, Grillo G, et al. Prognostic impact of c-kit mutations in core binding factor leukemias: an Italian retrospective study. Blood 2006; 107: 3463-3468. 6) Schlenk R, Döhner K, Krauter J, et al. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med 2008; 358: 1909-1918. 7) Rossi G, Minervini MM, Carella AM, et al. Comparison between multiparameter flow cytometry and WT1-RNA quantification in monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia without specific molecular targets. Leuk Res. 2012; 36: 401-406. 8) Campana D. Minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010; 2010: 7-12. 9) Brüggemann M, Raff T, Kneba M. Has MRD monitoring superseded other prognostic factors in adult ALL? Blood 2012; [Epub ahead of print] PubMed PMID: 23033265. 10) Schnittger S, Weisser M, Schoch C, et al. New score predicting for prognosis in PML- RARA+, AML1-ETO+, or CB BMYH11+ acute myeloid leukemia based on quantification of fusion transcripts. Blood 2003; 102: 2746-2755. 11) Weisser M, Kern W, Schoch C, et al. Risk assessment by monitoring expression levels of partial tandem duplications in the MLL gene in acute myeloid leukemia during therapy. Haematologica 2005; 90: 881-889. 12) Perea G, Lasa A, Aventín A, et al. Prognostic value of minimal residual disease (MRD) in acute myeloid leukemia (AML) with favorable cytogenetics [t(8;21) and inv(16)]. Leukemia 2006; 20: 87-94. 13) Abdelhamid E, Preudhomme C, Helevaut N, et al. Minimal residual disease monitoring based on LT3 internal tandem duplication in adult acute myeloid leukemia. Leuk Res 2012; 36: 316-23. 14) Plachy R, Zejskova L, Cmejla R, et al. ive-color multiplex Real-Time PCR technology to detect over 75 recurrent chromosomal abnormalities in acute myeloid leukemia; benefits for minimal residual disease detection. Blood 2011; 118: 1083 Abstract 2526. 12 Labor Aktuell 04/12