Dynamika aktivity trávicích enzymů nymfálního stádia klíštěte Ixodes ricinus

Středoškolská odborná činnost Dynamika aktivity trávicích enzymů nymfálního stádia klíštěte Ixodes ricinus Markéta Jirsová České Budějovice 2012

Středoškolská odborná činnost 2011/2012 Obor 4 Biologie Dynamika aktivity trávicích enzymů nymfálního stádia klíštěte Ixodes ricinus Dynamics of digestive enzymes activity in the nymfal stage of the tick Ixodes ricinus Autor: Markéta Jirsová Škola: SZŠ a VOŠZ České Budějovice Husova 3, 371 60, České Budějovice Vedoucí práce: RNDr. Petr Kopáček, CSc. Parazitologický ústav Biologické centrum Akademie věd ČR, v. v. i. Branišovská 31, 370 05, Č. Budějovice Odborný dozor: Jitka Konvičková Studentka Biologie, Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích České Budějovice 2012

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci vypracovala samostatně, použila jsem pouze podklady (literaturu, SW atd.) uvedené v přiloženém seznamu a postup při zpracování a dalším nakládání s prací je v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění. V Českých Budějovicích dne 28.února 2012 podpis:

Poděkování: Děkuji svému školiteli RNDr. Petru Kopáčkovi, CSc. za zadání zajímavého tématu, možnost pracovat v Laboratoři imunologie vektorů, trpělivost a čas, který mi při této práci věnoval. Díky patří i Jitce Konvičkové za její odborné vedení při experimentálních činnostech, obětavou pomoc, podnětné připomínky a rady, které mi během práce poskytovala.

Anotace: Bylo provedeno stanovení průběhu aktivit trávicích enzymů v homogenátech nymf klíštěte Ixodes ricinus během sání a následující metamorfózy na dospělce. Pomocí specifických fluorescenčních substrátů bylo zjištěno, že trávicí enzymy (cathepsin B cathepsin L, cathepsin C a legumain) dosahují nejvyšších hodnot třetí den sání a poté až ve třetím týdnu po odpadnutí nymfy z hostitele. Klíčová slova: Klíště; Ixodes ricinus; nymfa; trávení krve; Cathepsin B; Cathepsin C; Cathepsin L; Legumain; aktivita enzymů

Annotation: The dynamics of digestive enzymes activity were measured in the nymphal stage of the tick Ixodes ricinus during the feeding and during the following metamorphosis into the adult stage. Using the specific fluorescent substrates, the digestive enzymes (cathepsin B cathepsin L, cathepsin C a legumain) were shown to reach their highest activity during the third day of feeding and subsequently in the third week after dropping from the host. Key words: Tick; Ixodes ricinus; Nymph; Blood digestion; Cathepsin B; Cathepsin C; Cathepsin L; Legumain; activity of enzymes

Obsah 1 Úvod... 8 1.1 Charakteristika klíšťat... 8 1.2 Fyziologie klíšťat... 8 1.2.1 Srovnání Argasidae a Ixodidae... 8 1.2.2 Ixodes ricinus (klíště obecné)... 9 1.3 Klíšťata jako přenašeči... 10 1.4 Trávení krve u klíšťat... 11 2 Cíle práce... 13 3 Metodika... 14 3.1 Klíšťata Ixodes ricinus... 14 3.2. Homogenizace a příprava vzorků... 15 3.2 Měření aktivit trávicích proteáz v homogenátech nymf... 16 3.3 Výpočet aktivit... 18 3.4 SDS elektroforéza a imunobloting... 19 4 Výsledky a diskuze... 20 5 Závěr... 26 6 Použité zkratky:... 27 7 Použitá literatura... 28 7

1 Úvod 1.1 Charakteristika klíšťat Klíšťata jsou krevsající roztoči, patřící do říše členovců (Arthropoda). Zatím bylo popsáno asi 850 druhů klíšťat, které dělíme do dvou hlavních čeledí; klíšťákovití (Argasidae) a klíšťovití (Ixodidae). Tyto čeledi řadíme do podřádu Metastigmata (Ixodida). Klíšťata jsou obligatorní ektoparazité (tzn. bezpodmíneční vnější parazité), protože všechna vývojová stádia (až na některé výjimky) jsou závislá na sání krve svých hostitelů. 1.2 Fyziologie klíšťat 1.2.1 Srovnání Argasidae a Ixodidae Argasidae označujeme v anglosaské literatuře jako soft tick, protože jejich tělní pokryv (integument) je kožovitý a nemají na hřbetní straně těla tvrdý štítek (scutum), jen u larev je vyvinutá jakási jeho napodobenina. Gnathosoma (hlavová část) je zakryta idiosomou (tělem). Všechna vývojová stádia (včetně dospělého samce) obvykle sají opakovaně na jednom hostiteli, ale jen krátkou dobu (cca 30 min), pouze larvální stádia sají delší dobu (Volf a Horák, 2007). Oplodněné samičky pokračují v rychlém trávení krve, které vede k nakladení vajíček. Pokud nenastane páření, může neoplodněná samička uchovat živiny ve střevě a po delší době jejich trávení obnovit. Argasidae mají 2-8 nymfálních stadií a samička klade vajíčka vícekrát za život. U Ixodidae je scutum charakteristickým znakem, proto jsou Ixodidae v angličtině označována jako hard tick. U samečka scutum pokrývá téměř celou dorsální stranu. U samiček je to asi 1/3 až 1/2 jejich velmi elastické idiosomy, díky tomu jsou samičky schopné několikanásobně zvětšit svůj objem (až na stonásobek) a získat tak dostatek výživy pro tvorbu vajíček. Na okraji štítku mívají klíšťata oči, pouze u rodů Ixodes a Haemaphysalis oči chybí. Ixodidae mají vpředu dobře viditelnou gnathosomu. Gnathosoma, které vyčnívá z obrysu těla, je vybaveno typickým ústním ústrojím, na němž je nejvýraznější hypostom ( rypáček ) s koncentrickými řadami zahnutých 8

zoubků. Gnathosoma je dále tvořeno malými párovými a zdvojenými ostrými nožíky se zoubky zvanými chelicery. Pomocí těchto částí gnathosomy se klíště zakusuje do kůže hostitele a pevně se v ní uchytí 1) (Ryšavý a kol., 1989). K vyhledávání hostitele mají všechna klíšťata na tarzálním článku prvního páru nohou jamku vyplněnou smyslovými brvami zvanou Hallerův orgán, kterým zaznamenávají teplo, koncentraci CO 2 a další chemické sloučeniny (Ryšavý a kol., 1989). Při čekání na hostitele zaujímají hladová klíšťata typickou vyčkávací polohu ( questing ) s roztaženým předním párem nohou. Na rozdíl od Argasidae čeleď Ixodidae prochází jen jedním nymfálním stádiem a samička naklade vajíčka pouze jedenkrát za život a poté umírá. 1.2.2 Ixodes ricinus (klíště obecné) Nejběžnějším zástupcem v České republice i v Evropě je Ixodes ricinus, které se vyskytuje především v nížinách a pahorkatinách. Může se vyskytovat od března do listopadu, nejvíce však v období května až září. Na jižní Moravě se dále můžeme setkat s druhy Dermacentor reticulatus (piják lužní) a Haemaphysalis concinna (klíšť lužní). Ixodes ricinus je typickým trojhostitelským klíštětem (ke svému vývoji potřebuje 3 různé hostitele); larva saje na drobných hlodavcích, ptácích a ještěrkách, nymfa vyhledává spíše větší obratlovce. Dospělý samec nesaje a samička napadá větší lesní zvěř, běžně však saje i na psech a domácích kopytnících. Člověk se může stát náhodným hostitelem kteréhokoli stádia. Klíště na hostiteli parazituje řadu dní, je uchyceno pomocí hypostomu a zvláštní bílkovinné hmoty (tzv.,cementu ), vylučované některými druhy klíšťat. Po odpadnutí plně nasátého klíštěte a strávení krve dochází k přeměně na vyšší instar: larva >> nymfa; nymfa >> dospělec. U čeledi Ixodidae trvá každé stádium asi 1 rok, celý životní cyklus tedy 2-3 roky. Podstatným rozdílem ve vývojových stádiích klíštěte je velikost těla a počet nohou. Larvální stádium má 3 páry nohou, nymfa a dospělec už 4 páry. Ačkoliv samci krev nesají, můžeme se s nimi na těle hostitele setkat, a to z důvodu jejich kopulace se samicemi. K oplození dojde tak, že samec nasaje své pohlavní buňky do hypostomu a vnoří je do samičích pohlavních orgánů umístěných mezi zadním párem nohou. Hostitelské tělo je nejčastějším místem 1) Navzdory přesvědčení většiny lidí, nezáleží na směru vytáčení klíštěte z rány, protože jeho zoubky netvoří žádné spirálky. 9

pro setkání obou pohlaví. Teprve po oplození se samice dokáže plně nasát a po odpadnutí z hostitele stráví nasátou krev, vyprodukuje velké množství vajíček (řádově tisíce) a následně umírá. 1.3 Klíšťata jako přenašeči Celosvětově jsou klíšťata vedle komárů nejběžnějšími přenašeči řady vážných onemocnění, u nás především klíšťové encefalitidy a lymeské boreliózy. Proti klíšťové encefalitidě, jež je virového původu (skupina flavivirů), je k dispozici účinné očkování. Tato nemoc má dvoufázový průběh, ale může proběhnout i inaparentně. První fáze má chřipkové příznaky a fáze druhá (v některých případech vůbec nenastane) se projevuje jako meningitida (zánět mozku). Původcem lymeské boreliózy jsou bakterie spirochety Borrelia burgdorferi. Onemocnění se obvykle podchytí už v prvním stádiu, kdy se na kůži v místě vstupu infekce po 2 až 3 týdnech objeví červený oválný erytém se světlým středem. Proti této nemoci byla dosud vyvinuta vakcína pro Severní Ameriku, používaná pouze pro veterinární účely. U nás tato vakcína není dostatečně účinná, protože existuje celý komplex druhů Borrelia burgdorferi (Volf a Horák, 2007). V ostatních částech světa jsou různé druhy klíšťat přenašeči řady dalších závažných onemocnění. Patří mezi ně např.: babezióza (původce prvoci Babesie, výskyt Asie, druh klíštěte Boophilus), tropická theilerióza (původce prvoci Theilerie, výskyt Asie a Afrika, druh klíštěte Rhipicephalus appendiculatus), horečka Skalistých hor (původce bakterie Rickettsia rickettsii, výskyt Amerika, druh klíštěte Dermacentor), anaplazmóza (původce hl. bakterie Anaplasma, výskyt - USA, Evropa, klíšťata rodu Ixodes), erlichióza (původce bakterie riketsie rodu Ehrlichia spp., výskyt USA, druh klíštěte Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis) a řada dalších onemocnění (de la Fuente a kol, 2008). U hospodářských zvířat jsou klíšťata různých rodů (např. Rhipicephalus, Hyalomma, Amblyomma a Boophylus) přenašeči cowdriózy (bakterie Ehrlichia ruminantium). 10

1.4 Trávení krve u klíšťat Klíšťata sají krev, aby získala dostatek živin k přeměně na vyšší instar nebo v případě dospělých samic k tvorbě vajíček. Proces trávení krve klíšťat se velmi liší od trávení krve jiných krevsajících parazitů. V porovnání s nimi jde o mnohem pomalejší proces, který probíhá intracelulárně (vnitrobuněčně) v kyselém prostředí uvnitř trávicích vakuol buněk střevního epitelu. Na trávení hostitelské krve, především hemoglobinu (tj. hlavní proteinová složka krve), se podílejí střevní proteázy. V samotném střevním lumen tyto proteázy nejsou přítomny a krev je zde pouze dlouhodobě uchovávána (Sonenshine, 1991). Určité fragmenty hemoglobinu mají antimikrobiální účinky (působí jako antibiotika) a pomáhají tak potlačovat nežádoucí mikrobiální rozklad nasáté krve (Fogaca et al., 1999). Proteázy, nebo-li proteolytické enzymy, jsou hydrolázy, které katalyzují hydrolytické štěpení peptidových vazeb proteinů (Vodrážka, 2002). Podle místa působení dělíme proteázy na endopeptidázy (katalyzují hydrolázu uvnitř řetězce, přičemž vznikají peptidy různé velikosti) a exopeptidázy (katalyzují odštěpování pouze koncových aminokyselin z polypetidového řetězce) (Špička, 2004). Čtyři hlavní skupiny proteáz jsou serinové (v aktivním místě obsahují aminokyselinu serin), cysteinové (v aktivním místě je cystein), aspartátové (v aktivním místě obsahují kyselinu asparagovou) a metaloproteázy (v aktivním místě vážou kation kovu, např. zinek). U klíštěte I. ricinus bylo popsáno 5 trávicích proteáz: kyselé cysteinové proteázy papainového typu (cathepsin B, cathepsin L a exopeptidáza cathepsin C), asparaginylová endopeptidáza legumain (tj. cysteinová proteáza jiného typu). U dospělých samic byla ještě popsána aspartátová peptidáza typu cathepsinu D. Tyto enzymy tvoří hemoglobinolytickou kaskádu postupného štěpení hemoglobinu od velikých fragmentů až po jednotlivé aminokyseliny (Obr. 1), které jsou dále zužitkovány v syntéze nových proteinů potřebných pro vývoj klíštěte nebo tvorbu vajíček (Sojka a kol., 2008, Horn a kol. 2009, Franta a kol. 2010). 11

Hem Hemoglobin Cathepsin D, legumain, cathepsin L Agregát hemu Polypeptidy Antimikrobiální fragment Cathepsin B, cathepsin L Peptidy Cathepsin C, cathepsin B Aminokyseliny Obr. 1 Schéma degradace hemoglobinu v klíštěcím střevě Hemoglobin je nejprve štěpen endoprotéázami Cathepsin D a cathepsin L na velké fragmenty, z nichž některé mají antibakteriální aktivitu. Další štěpení probíhá zejména díky majoritní proteáze cathepsinu B. Štěpení na peptidy umožňují exopeptidázy, zejména cathepsin C. Uvolněné krevní barvivo, hem, je z klíštěcího střeva odstraněno ve formě agregátů (převzato a upraveno podle Mareš a Kopáček, 2008; Horn a kol., 2009) 12

2 Cíle práce 1) Stanovit průběh aktivit trávicích enzymů v homogenátech nymf klíštěte Ixodes ricinus během sání a následující metamorfózy na dospělce. 2) Porovnat výsledky aktivitního profilu cathepsinu B s proteinovými hladinami tohoto enzymu metodou imunoblotingu. 13

3 Metodika 3.1 Klíšťata Ixodes ricinus V této práci byly použity 3 sady nymfálního stádia klíštěte Ixodes ricinus: jarní sada 2010, sada z laboratorních chovů 2010/11 parazitologického ústavu BC AVČR a letní sada 2011. Jarní a letní sady nymf byly nasbírány metodou vlajkování (tj. sběr na vlněnou vlajku) v okolí lesa za sídlištěm Máj v Českých Budějovicích. Tyto nymfy sály na laboratorních morčatech. Morčata byla pro experimentální sání připravena tzv. strojením (Obr. 2). Pro pokusy byly použity nenasáté nymfy, nymfy odebrané v denních intervalech během sání (Obr. 3) a nasáté nymfy odebrané v týdenních intervalech po odpadnutí až do doby těsně před metamorfózou v dospělce (cca 4 týdny). Pro každou skupinu bylo odebráno 15-25 nymf (přesný počet byl zaznamenán), které byly skladovány v mikrozkumavkách Eppendorf 1,5 ml při 80 C až do jejich homogenizace. Obr. 2 Postup strojení morčat (snímky Jan Erhart, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR). Morčata byla uspána intramuskulárně injekcí roztoku NARKETAN (VETOQUINO) dávkou 0,2ml/morče. Ke snadnější lokalizaci nymf byla morčatům vyholena srst (panel A) a nalepen gumový kroužek, tzv. klobouček (panel B) pomocí lepidla Chemopren. Dovnitř gumového kroužku byly vloženy nymfy (cca 100 nymf na morče) (panel C) a kroužek byl zakryt přilepením ochranné síťky. Tento krok se opakoval každý den (panel D) po odebrání určitého počtu nymf. 14

Obr. 3 Velikost nymf odebraných v průběhu sání (snímky Jan Erhart, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR). Nymfy odebrané v průběhu sání byly pro srovnání velikostí umístěny na milimetrový papír. 1d po prvním dni sání, 2d po dvou dnech sání, 3d po třech dnech sání, 4d po čtyřech dnech sání, tj. plně nasáté. 3.2. Homogenizace a příprava vzorků Pro zjištění aktivit trávicích proteáz byly použity vzorky celotělových homogenátů z nymf odebraných v průběhu sání a po dokončení sání. Po rozmražení byly nymfy nejprve rozdrceny plastovým homogenizátorem v 1,5 ml mikrozkumavce se 100 µl extrakčního pufru (0,1 M octan sodný, ph 5,0). Poté byl každý vzorek rychle zmražen kapalným dusíkem a opět homogenizován. Tento krok byl proveden celkem třikrát. Podle objemu homogenátu a konkrétního počtu nymf bylo ke vzorku přidáno 250 600 µl extrakčního pufru, výsledný objem byl určen vážením na předvážkách a 15

zaznamenán. Z výsledného objemu bylo odebráno 100 µl vzorku na následnou elektroforetickou analýzu (viz níže). Ke zbytku vzorku byla přidána 1/10 objemu 10% vodného roztoku detergentu CHAPS (Sigma). Výsledný vzorek byl vložen do termomixéru Eppendorf a třepán při teplotě 4 C a frekvenci 1050 rpm po dobu 30 min. Následně byly vzorky stočeny v předchlazené centrifuze Hereaus Multifuge 3 (4 C, 15 000 rpm, 10 min). Vyextrahované supernatanty byly rozpipetovány po 50 µl do alikvotů a uchovány při teplotě -80 C. 3.2 Měření aktivit trávicích proteáz v homogenátech nymf Aktivita jednotlivých proteáz ve vzorcích byla stanovena pomocí specifických fluorescenčních substrátů firmy Bachem na bázi aminomethylcoumarinu (AMC) (Tab. 1). Rychlost enzymové reakce a rozkladu enzymu závisí na teplotě (při vyšší teplotě probíhá reakce i rozklad rychleji) a na ph (Tab. 1). Aby nedocházelo k samovolnému rozkladu enzymů v tělních extraktech, byly vzorky během práce udržovány na ledu. Měření bylo prováděno na mikrodestičkovém fluorimetru TECAN Infinite 200M s dvojitým monochromátorem (Obr. 4) v černých mikrodestičkách (Nunc) s 96 jamkami (Obr. 5). Tab. 1 Použité fluorescenční substráty a pufry pro měření aktivit jednotlivých enzymů Enzym Pufr (AB) Substrát (S) ph Cathepsin B 0.2M NaH 2 PO 4 + 2.5µM DTT + 1M EDTA Z-Phe-Arg-AMC (10µM) 5.5 Cathepsin L 0.2M NaH 2 PO 4 + 2.5µM DTT + 1mM EDTA + 2.5µM CA-074 a) Z-Phe-Arg-AMC (10µM) 4.0 Cathepsin C 0.1M NaH 2 PO 4 + 0.025M NaCl + 2.5µM DTT Gly-Arg- AMC (20µM) 5.5 Legumain (IrAE) 0.05M citric acid + 0.1M NaH 2 PO 4 + 0.1M NaCl + 2.5µM CA-074 a) Z-Ala-Ala-Asn-AMC (200µM) 5.5 a) Pro měření aktivity Cathepsinu L a legumainu byl použit specifický inhibitor CA-074 pro selektivní odstínění aktivity Cathepsinu B. 16

Obr. 4 TECAN Infinite 200M (zdroj: labtech.co.uk) Mikrodestičkový fluorimetr. Obr. 5 Mikrodestička pro měření aktivit (zdroj: labtech.co.uk) Pipetovací schémata a podmínky měření fluorescence (excitační a emisní vlnová délka) jsou uvedeny v Tab. 2. Ke 20 µl vzorku enzymu bylo přidáno 60 nebo 80 µl AB pufru a reakce byla zahájena přidáním 20 nebo 100 µl substrátového roztoku. Průběh enzymatické reakce byl měřen po dobu 10 minut. Nejprve bylo provedeno orientační zjištění aktivit postupným dvojkovým ředěním (20 µl vzorku enzymu ve 20 µl AB pufru) v jednotlivých homogenátech, podle kterých bylo upraveno ředění vzorku pro další měření tak, aby změna v časových intervalech odpovídala přibližně 1500 RFU/min. Tab. 2 Pipetovací schéma a podmínky měření aktivit trávicích proteáz Střevní proteázy Pipetovací schéma Excitace / emise [nm] CatB, CatL 20 µl vzorku + 80 µl AB + 100 µl S 360/ 465 CatC 20 µl vzorku + 60 µl AB + 20 µl S 360/ 465 IrAE 20 µl vzorku + 80 µl AB + 100 µl S 360/ 465 17

3.3 Výpočet aktivit Finální dynamika aktivit proteáz byla stanovena matematickým výpočtem z fluorimetrických dat. Rozdíl relativních fluorescenčních jednotek (RFU) byl zaznamenáván v minutových intervalech v 11 cyklech. Výsledná aktivita byla vyjádřena jako změna RFU za minutu vztažená na 1 nymfu. Na obrázku 6 je uveden příklad měření fluorescenční aktivity Cathepsinu B v celotělových homogenátech (14 nymf) ve druhém týdnu trávení. Hodnota této změny v lineární části reakce odpovídala přibližně 11 000 RFU/8min při 20x ředěném vzorku. Výpočet aktivity pro tento konkrétní příklad byl následující: (11 000 RFU / 8min) x 20-násobné ředění / 14ks nymf = 1 375 RFU/min/nymfa Rozdíl RFU/8min Obr. č. 6 Příklad odečtení relativní fluorescenční aktivity enzymu z kinetického měření (rozdíl RFU/min). Měření provedeno v duplikátech: A4,A5 ředění 20x; B4,B5 ředění 40x; C4,C5 ředění 80x; H4,H5 kontrola bez homogenátu. Černě je označena část křivky použitá pro stanovení aktivity. 18

3.4 SDS elektroforéza a imunobloting Elektroforéza v gradientovém (5-17.5%-ním) polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS PAGE) a následující elektroforetický přenos na PVDF membránu (Immobilon) byly provedeny podle dříve popsaného postupu dosud používaného v laboratoři (Kopáček et al., 1995). Cathepsin B byl detekován pomocí dříve získaných specifických králičích protilátek připravených proti rekombinantnímu cathepsinu B. Jako sekundární protilátka byla použita prasečí protikráličí IgG protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (SwAR/Px, Sevac, Praha). 19

4 Výsledky a diskuze V této práci byly stanoveny aktivity enzymů nymf během sání a po puštění (tj. během následující metamorfózy na dospělce). Měření těchto aktivit v celotělových homogenátech nymf bylo provedeno pomocí specifických fluorescenčních substrátů. Výsledné hodnoty aktivit jednotlivých proteáz, které jsou uvedené v tabulkách 3 6, jsou průměrem hodnot získaných měřením ve třech jamkách (triplikátech). Na třech sadách nymfálního stádia I. ricinus (jarní sada 2010, sada z laboratorních chovů 2010/2011 a letní sada 2011) byly měřeny aktivitní profily čtyř hlavních trávicích enzymů. Největší aktivitu vyvíjí CatB. Z dat (Tab. 3) a obrázku (Obr. 7A) je vidět postupný nárůst aktivity CatB s vrcholem ve třetím dni sání. Následně aktivita prudce klesá, ale po odpadnutí z hostitele se opět obnoví a ve třetím týdnu trávení krve dosahuje podobné hodnoty jako ve třetím dni sání. Podobný průběh byl ověřen sledováním hladiny CatB na proteinové úrovni metodou imunoblotingu (Obr 7B). Průběh dynamiky Cat L je zaznamenán v tabulce 4 a zobrazen na Obr. 8. Aktivita CatL byla měřena za přítomnosti specifického inhibitoru CA-074, který potlačil aktivitu CatB. První tři dny sání aktivita CatL postupně roste, svého maxima dosahuje třetí den (podobně jako CatB) a následně prudce klesá. Narozdíl od CatB se aktivita CatL během metamorfózy příliš neobnovuje. Aktivita CatC (Tab. 5, Obr. 9) má podobnou tendenci jako aktivita CatB, ale v porovnání s ním je řádově menší. Při měření aktivity Legumainu byl také použit specifický inhibitor CA-074. Legumain vykazuje velice nízké hodnoty aktivit ve všech časových intervalech (Tab. 6, Obr. 10), které naznačují podobný trend jako cathepsin B a C. Všechny měřené enzymy mají během sání i metamorfózy podobný trend, s výjimkou CatL, jehož aktivita se po puštění nymfy z hostitele příliš neobnoví. Bylo zjištěno, že aktivita všech sledovaných trávicích enzymů postupně narůstá až do třetího dne sání. Před úplným dosátím (4. den) byl pozorován nápadný pokles aktivit. Po odpadnutí z hostitele aktivita většiny enzymů (cathepsin B, cathepsin C a legumain) narůstá během dalších dvou až tří týdnů a opět klesá před přeměnou nymfy v dospělce (4. týden). Výsledky mé práce byly porovnány s již naměřenými aktivitními profily trávicích proteáz u dospělých samic (Franta a kol., 2010). Měřené enzymy mají podobnou tendenci u obou vývojových stádií. U dospělých samic dosahují aktivity maximálních 20

hodnot až v posledním dni sání (kromě CatL), zatímco u nymf byly nejvyšší hodnoty naměřeny den před úplným nasátím. Tab. 3 Číselné hodnoty CatB naměřené ve fluorimetru. RFU/min/ nymfa Cathepsin B Jarní sada 2010 Laboratorní sada 2010 Letní sada 2011 Dny sání Týdny po puštění 0 1 2 3 4 5 1T 2T 3T 4T 27 122 464 2559 1045-1781 1499 2952 781 1 41 332 1199 345 951 1117 1181 930 827 0-31 374 779 300 2510 2093-1081 Obr. 7A Profil aktivit CatB v celotělových homogenátech nymf I. ricinus v průběhu sání a metamorfózy. 21

Obr. 7B Proteinový profil CatB získaný pomocí imunoblotingu. 22

Tab. 4 Číselné hodnoty CatL naměřené ve fluorimetru. RFU/min/ nymfa Cathepsin L Dny sání Týdny po puštění 0 1 2 3 4 5 1T 2T 3T 4T Jarní sada 2010 a) 167 337 389 1067 69-17 54 111 83 Laboratorní sada 2010 1 4 33 48 3 3 4 11 8 9 Letní sada 2011 1-6 70 36 1 8 22-25 a) Patrná vyšší aktivita Cathepsinu L u jarní sady nymf je pravděpodobně způsobena použitím staršího alikvotu inhibitoru CA-074, který zcela nepotlačil aktivitu Cathepsinu B. V dalších sadách byl již použit nový inhibitor. Obr. 8 Profil aktivit CatL v celotělových homogenátech nymf I. ricinus v průběhu sání a metamorfózy. 23

Tab. 5 Číselné hodnoty CatC naměřené ve fluorimetru. RFU/min/ nymfa Cathepsin C Jarní sada 2010 Laboratorní sada 2010 Letní sada 2011 Dny sání Týdny po puštění 0 1 2 3 4 5 1T 2T 3T 4T 1 8 55 233 1-58 145 367 166 6 12 101 245 33 30 64 84 72 69 1-35 88 160 72 88 96-79 Obr. 9 Profil aktivit CatC v celotělových homogenátech nymf I. ricinus v průběhu sání a metamorfózy. 24

Tab. 6 Číselné hodnoty IrAE naměřené ve fluorimetru. RFU/min/ nymfa Legumain Jarní sada 2010 Laboratorní sada 2010 Letní sada 2011 Dny sání Týdny po puštění 0 1 2 3 4 5 1T 2T 3T 4T 1 1 7 33 14-17 54 111 83 1 1 12 26 6 5 13 28 37 57 1-1 3 1 10 19 66-23 Obr. 10 Profil aktivit legumainu v celotělových homogenátech nymf I. ricinus v průběhu sání a metamorfózy. 25

5 Závěr Během této práce bylo provedeno měření enzymové kinetiky pomocí specifických fluorescenčních substrátů a následná detekce proteinů metodou imunoblotingu. Práce přinesla dosud nepopsané údaje o dynamice proteolytických aktivit v nymfálním stádiu klíšťat, které mohou být využity mimo jiné při hledání vhodných kandidátů pro vývoj účinné "protiklíštěcí" vakcíny, která by pomohla redukovat množství klíšťat na domácích a hospodářských zvířatech. Z naměřených aktivit vyplývá, že všechny sledované enzymy jsou nejaktivnější ve třetím dni sání, tj. v čase nejvyšší pravděpodobnosti přenosu spirochet lymeské boréliózy. Moje výsledky mohou být využity při hledání vhodného zranitelného místa ve fyziologii klíštěte, na které by se mohl zaměřit další vývoj účinných prostředků v boji proti klíšťatům a jimi přenášeným patogenům. Práci by bylo vhodné doplnit o další data, např. imunolokalizace trávicích proteáz v nymfách. Další možností je zaměřit se na první parazitické stádium klíštat - larvy a získat tak, spolu s již provedenou analýzou u dospělců, kompletní přehled o trávicím systému klíšťat ve všech vývojových stádiích. 26

6 Použité zkratky: CatB Cathepsin B CatL Cathepsin L CatC Cathepsin C IrAE asparaginylová endopeptidáza AB assay buffer reakční pufr S substrát RFU/min relativní fluorescenční jednotky z minutu CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate DTT dithiothreitol AMC aminomethylcoumarin SDS dodecylsulfát sodný EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová kda kilo Dalton Substráty: Z-Phe-Arg-AMC Benzyloxycarbonyl- L-phenylalanyl- L-arginine 4- methylcoumaryl-7-amide Z-Ala-Ala-Asn-AMC Benzyloxycarbonyl- L-alanyl- L-alanyl- L-asparagine- 4- methylcoumaryl-7-amide Gly-Arg- AMC glycyl- L-arginine- 4-methylcoumaryl- 7-amide 27

7 Použitá literatura Fogaca AC, da Silva PI, Jr., Miranda MT, Bianchi AG, Miranda A, Ribolla PE, Daffre S: Antimicrobial activity of a bovine hemoglobin fragment in the tick Boophilus microplus. J Biol Chem 1999, 274(36):25330-25334. Franta Z, Frantova H, Konvickova J, Horn M, Sojka D, Mares M, Kopacek P: Dynamics of digestive proteolytic system during blood feeding of the hard tick Ixodes ricinus. Parasites & Vectors 2010, 3. Horn M, Nussbaumerova M, Sanda M, Kovarova Z, Srba J, Franta Z, Sojka D, Bogyo M, Caffrey CR, Kopacek P, Mareš M: Hemoglobin digestion in blood-feeding ticks: mapping a multipeptidase pathway by functional proteomics. Chem Biol 2009, 16(10):1053-1063. Kopacek P, Weise C, Gotz P: The prophenoloxidase from the wax moth Galleria mellonella: Purification and characterization of the proenzyme. Insect Biochemistry and Molecular Biology 1995, 25(10):1081-1091. Mareš M. a Kopáček P.: Molekulární pohled do světa klíšťat. Vesmír 2008, 87 (10) 670-673. Ryšavý B a kol.: Základy parazitologie. SPN Praha; 1989. Sojka D, Franta Z, Horn M, Hajdusek O, Caffrey CR, Mares M, Kopacek P: Profiling of proteolytic enzymes in the gut of the tick Ixodes ricinus reveals an evolutionarily conserved network of aspartic and cysteine peptidases. Parasites & Vectors 2008, 1. Sonenshine DE: Biology of ticks. New York: Oxford University Press; 1991. Volf P, Horák P a kol.: Paraziti a jejich biologie. TRITON Praha/Kroměříž; 2007. 28