! " # $! % &!!'()!*! +,-. /0123145+/0123.!+67'5! 8,-.
29):- "- 8 ; <=*>??! /0123 % +/0 % + % +9 8 4 % /01231 @ % 8 <=!6 < 8! >*?+ <=*>?!< # >!*! # *!<=>*>!+?#!$ $ *!? 29):- "- 8+9 8 4 2A6."B +2A6.")2A6.")- $ <? $! *! * -2! <,C'C2. <D<= * <D<=!<<= "?!$!E!<=*!<=.?/0 $!? 4!<4 #F$!!4 $!=!*!<!!$!? +4? >?G <! H*!+!!<!4!! < "- 8*=$! <!< $!$<= # <!?!>*!*!<! "-8 >< =>!!>?+! $!! <?!!+ $!= # # *!!"- 8 $!?!! D <!!+!D! > 4 4! 0!9?!!4 * =! <?!I!<=!"- 8$!<=>>! >?!! J.0! '' '' ' ' '',,'',' ', @ G K5 GG7:8 <=!: L '/ 01 23 +E!<= >?=*!
Obsah 1. Obsah... 5 2. Skladování... 5 3. Další potebné vybavení... 5 4. Všeobecná preventivní opatení... 6 5. Informace o pvodcích... 6 6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase... 6 7. Popis produktu... 7 8. Protokol... 7 8.1 Izolace DNA... 7 8.2 Interní kontrola... 10 8.3 Kvantifikace... 11 8.4 Píprava PCR... 12 8.5 Programování pístroje LightCycler... 16 9. Vyhodnocení... 19 10. ešení problém... 22 11. Specifikace... 24 11.1 Analytická senzitivita... 24 11.2 Specificita... 25 11.3 Pesnost... 26 11.4 Reprodukovatelnost... 28 11.5 Diagnostické hodnocení... 28 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu... 28 13. Bezpenostní informace... 28 14. Kontrola kvality... 28 artus EBV LC PCR Kit 06/2007 3
15. Literatura... 29 16. Vysvtlení symbol... 29 4 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
artus EBV LC PCR Kit Pro použití s pístrojem LightCycler. 1. Obsah Oznaení a obsah Kat. ís. 4501063 24 reakcí Kat. ís. 4501065 96 reakcí Modrá EBV LC Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns ervená ervená ervená ervená EBV LC/RG/TM QS 1 5 x 10 4 cop/µl EBV LC/RG/TM QS 2 5 x 10 3 cop/µl EBV LC/RG/TM QS 3 5 x 10 2 cop/µl EBV LC/RG/TM QS 4 5 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Zelená EBV LC IC 1 x 1 000 µl 2 x 1 000 µl Bílá Water (PCR grade) 1 x 1 000 µl 1 x 1 000 µl QS = Kvantifikaní standard IC = Interní kontrola 2. Skladování Komponenty artus EBV LC PCR Kit se skladují pi -20 C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabrate opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Pi nepravidelném používání by proto mly být reagencie alikvotovány. V pípad, že je nutné komponenty skladovat pi teplot +4 C, skladujte je takto maximáln po dobu pti hodin. 3. Další potebné vybavení Laboratorní rukavice bez pudru DNA-izolaní souprava (viz 8.1 Izolace DNA) Pipety (nastavitelné) Sterilní pipetovací špiky s filtrem Vortex mixer artus EBV LC PCR Kit 06/2007 5
Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky Color Compensation Set (Roche Diagnostics, kat.. 2 158 850) pro vytvoení souboru Crosstalk Color Compensation LightCycler kapiláry (20 µl) LightCycler Cooling Block LightCycler pístroj LightCycler Capping Tool 4. Všeobecná preventivní opatení Uživatel by ml dbát na následující: Používejte sterilní pipetovací špiky s filtrem. Skladujte, izolujte a pidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném míst než ostatní reagencie. Všechny komponenty ped poátkem testu úpln rozmrazte pi pokojové teplot. Následn komponenty ádn promíchejte a krátce centrifugujte. Pracujte plynule na ledu nebo v LightCycler Cooling Block. 5. Informace o pvodcích Penos viru Epsteina a Barrové (EBV) probíhá oráln, vtšinou kontaminovanými slinami. Infekce EBV probíhá zpravidla asymptomaticky, zvlášt v dtství. Klinickým projevem akutní infekce je infekní mononukleóza s horekou, únava, angína a také zduení lymfatických uzlin a sleziny. U nkterých pacient mohou potíže petrvávat chronicky a recidivovat. Formy infekce EBV s tžkým prbhem jsou sledovány zvlášt u imunosuprimovaných pacient a u osob s defektem T-bunk. 6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase Pi diagnostikování pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) se amplifikují specifické oblasti genomu pvodce. Detekce probíhá pi PCR v reálném ase pomocí fluorescenních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná 6 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v prbhu PCR v reálném ase umožuje prkaz a kvantifikaci produkt, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat testovací kapiláry (Mackay, 2004). 7. Popis produktu artus EBV LC PCR Kit je systém k pímému použití pro prkaz EBV DNA pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) v pístroji LightCycler. EBV LC Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 97 bp dlouhého úseku genomu viru EBV a také pro bezprostední detekci amplifikátu ve fluorimetrickém kanálu F2 pístroje LightCycler. Krom toho obsahuje artus EBV LC PCR Kit druhý heterologní amplifikaní systém pro prkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako Interní kontrola (IC) ve fluorimetrickém kanálu F3. Limit detekce analytické EBV PCR (viz 11.1 Analytická senzitivita) pitom není negativn ovlivnn. Spolu s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (EBV LC/RG/TM QS 1-4), s jejichž pomocí lze urit množství pvodce ve vzorku. Prostudujte si prosím oddíl 8.3 Kvantifikace. Upozornní: Teplotní profil pro detekci EBV DNA za pomoci artus EBV LC PCR Kit odpovídá teplotním profilm souprav artus HSV-1/2 LC PCR Kit, artus VZV LC PCR Kit a artus CMV LC PCR Kit. Díky tomu mohou být reakce PCR pro tyto artus systémy provedeny a analyzovány v jednom bhu. Dbejte pitom prosím speciálních pokyn pro vyhodnocení v kapitolách 8.3 Kvantifikace a 9. Vyhodnocení. 8. Protokol 8.1 Izolace DNA DNA-izolaní soupravy nabízejí rzní výrobci. V závislosti na protokolu zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a provete izolaci DNA podle návodu. Doporuujeme následující izolaní soupravy: artus EBV LC PCR Kit 06/2007 7
Vzorek Izolaní souprava Katalogové íslo Výrobce Nosi RNA sérum, plazma, likvor krevní buky plazma QIAamp DNA Mini Kit (50) QIAamp UltraSens Virus Kit (50) QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) EZ1 DSP Virus Kit (48)* 51 304 QIAGEN neobsažen 53 704 QIAGEN obsažen 51 104 QIAGEN neobsažen 62 724 QIAGEN obsažen *Pro použití v kombinaci s BioRobot EZ1 DSP Workstation (Kat. ís. 9001360) a EZ1 DSP Virus Card (Kat. ís. 9017707). Dležité pokyny pro použití souprav QIAamp UltraSens Virus Kit, QIAamp DNA Blood Mini Kit a QIAamp DNA Mini Kit: Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Pokud použitá izolaní souprava neobsahuje žádný nosi RNA, povšimnte si prosím, že je pi izolaci nukleových kyselin z nebunných tlesných tekutin resp. materiál s malým obsahem DNA/RNA (nap. likvor) drazn doporueno pidat nosi RNA (RNA homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat. ís. 27-4110-01). Prosím postupujte následujícím zpsobem: a) Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA v eluním pufru (nepoužívejte lyzaní pufr) izolaní soupravy (nap. AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp DNA Blood Mini Kit) a edním vytvote roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b) Používejte 1 µg nosie RNA na 100 µl lyzaního pufru. Je-li extrakním protokolem stanoveno 200 µl lyzaního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosie RNA (1 µg/µl) pímo do lyzaního pufru. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): 8 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr nap. 200 µl nap. 2 400 µl Nosi RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Celkový objem 202 µl 2 424 µl Objem pro izolaci 200 µl po 200 µl c) Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Aby bylo dosaženo vyšší stability nosie RNA dodávaného s QIAamp UltraSens Virus Kit, doporuujeme následující postup lišící se od údaj uvedených v píruce izolaní soupravy: a. Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA ped prvním použitím izolaní soupravy v 310 µl eluního pufru obsaženého v souprav (konená koncentrace 1 µg/µl, nepoužívejte lyzaní pufr). Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr AC 800 µl 9 600 µl Nosi RNA (1 µg/µl) 5,6 µl 67,2 µl Celkový objem 805,6 µl 9 667,2 µl Objem pro izolaci 800 µl po 800 µl c. Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Použitím QIAamp UltraSens Virus Kit lze docílit zkoncentrování vzorku. Pokud se v pípad vašeho vzorku nejedná o sérum nebo plazmu, pidejte k vzorku alespo 50 % (v/v) negativní lidské plazmy. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 9
Antikoagulanty obsažené ve zkumavkách pro odbr krve mohou mít inhibitivní úinek na PCR, ale uvedené izolaní soupravy je dobe eliminují. Doporuujeme nepoužívat heparinovou krev. Pi izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmínen zajistte, aby byl ped elucí proveden ješt jeden centrifuganí krok (ti minuty, 13 000 ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. Pedejdete tak možným inhibicím PCR. artus EBV LC PCR Kit není vhodný pro izolace na bázi fenolu. Dležité upozornní k použití soupravy EZ1 DSP Virus Kit: Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Pidejte tedy prosím ke každé izolaci potebné množství nosie RNA a držte se pokyn v EZ1 DSP Virus Kit Handbook. Dležité: Interní kontrolu soupravy artus EBV LC PCR Kit lze vložit pímo do izolace (viz 8.2 Interní kontrola). 8.2 Interní kontrola Spolu s produktem se dodává Interní kontrola (EBV LC IC). Máte tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR (viz Obr. 1). Pi použití EZ1 DSP Virus Kit musí být Interní kontrola vložena podle instrukcí v EZ1 DSP Virus Kit Handbook. Používáte-li QIAamp UltraSens Virus Kit, QIAamp DNA Blood Mini Kit nebo QIAamp DNA Mini Kit, pidejte Interní kontrolu k izolaci v pomru 0,1 µl na 1 µl eluního objemu. Jestliže napíklad používáte QIAamp DNA Mini Kit a eluujete DNA v 50 µl AE pufru, vložte 5 µl Interní kontroly. Množství vkládané Interní kontroly závisí pouze na eluním objemu. Interní kontrola a nosi RNA (viz 8.1 Izolace DNA) by mly být pidávány pouze k smsi lyzaního pufru a vzorku nebo pímo k lyzanímu pufru. Interní kontrola nesmí být pidána pímo ke vzorku. Pi pidání k lyzanímu pufru se musí dbát na to, aby byla sms Interní kontroly, lyzaního pufru a 10 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
nosie RNA erstv pipravena a ihned použita (skladování smsi pi pokojové teplot nebo v lednici mže již po nkolika hodinách vést k vynechání Interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Interní kontrolu a nosi RNA nepipetujte pímo do vzorku. Voliteln lze Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole možné inhibice PCR (viz Obr. 2). V tomto pípad pidejte 0,5 µl Interní kontroly na jednu testovací sms pímo do 15 µl EBV LC Master. Pro každou PCR reakci použijte 15 µl takto vytvoeného Master Mixu * a pidejte následn 5 µl izolátu. Jestliže pipravujete jeden bh pro více vzork, zvyšte potebná množství EBV LC Master a Interní kontroly podle potu vzork (viz 8.4 Píprava PCR). Soupravy artus EBV LC PCR Kit a artus CMV LC PCR Kit obsahují identickou Interní kontrolu (IC). Také artus HSV-1/2 LC PCR Kit a artus VZV LC PCR Kit obsahují identickou Interní kontrolu. 8.3 Kvantifikace S Kvantifikaními standardy (EBV LC/RG/TM QS 1-4) dodávanými spolu s produktem se zachází stejn jako s již izolovanými vzorky a pidávají se ve stejném objemu (5 µl). Standardní kivku v pístroji LightCycler vytvoíte tak, že vložíte všechny tyi Kvantifikaní standardy dodávané s produktem, definujete je v Sample Loading Screen jako standardy a zadáte uvedené koncentrace (viz LightCycler Operator s Manual, Version 3.5, Chapter B, 2.4. Sample Data Entry). Tuto standardní kivku lze použít také pro následné kvantifikace, pokud je bhem aktuálního bhu použit alespo jeden standard jedné definované koncentrace. K tomu je zapotebí díve vytvoenou standardní kivku importovat (viz LightCycler Operator s Manual, Version 3.5, Chapter B, 4.2.5. Quantification with an External Standard Curve). U této formy kvantifikace je však teba zohlednit skutenost, že v dsledku variability mezi PCR bhy mže nastat odchylka ve výsledku. * Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita není omezena. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 11
Pokud máte v bhu integrován více než jeden Herpes-artus systém, dbejte na to, aby byly analyzovány oddlen píslušnými Kvantifikaními standardy. Upozornní: Kvantifikaní standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro pepoet hodnot získaných pomocí standardní kivky na kopie/ml vzorku se používá následující vzorec: výsledek (kopie/ml) = výsledek (kopie/µl) x eluní objem (µl) objem vzorku (ml) Prosím povšimnte si, že se do výše uvedeného vzorce dosazuje zásadn pvodní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku ped izolací nukleových kyselin pozmnn (nap. redukce objemu centrifugací nebo jeho zvýšení naplnním na objem požadovaný pro izolaci). Dležité: Na www.qiagen.com/products/bylabfocus/mdx je k dispozici píruka pro zjednodušení kvantitativního vyhodnocení systém artus na pístroji LightCycler (Technical Note for quantitation on the LightCycler 1.1/1.2/1.5 or LightCycler 2.0 Instrument). 8.4 Píprava PCR Ovte, že je Cooling Block s uvnit obsaženými adaptéry (píslušenství pistroje LightCycler ) pedem vychlazen pibližn na +4 C. Do adaptér Cooling Blocku vložte takový poet kapilár LightCycler, který je potebný pro plánované reakce. Dbejte na to, aby byl spolen s každým bhem PCR proveden alespo jeden Kvantifikaní standard a jedna negativní kontrola (Water, PCR grade). Pro vytvoení standardní kivky použijte prosím u každého bhu PCR všechny spolu s produktem dodávané Kvantifikaní standardy (EBV LC/RG/TM QS 1-4). Všechny reagencie se musí ped zaátkem testu zcela rozmrazit pi pokojové teplot, musí být dobe promíchány (opakovaný nábr pipetou a vypuštní pipety nebo krátký vortex) a následn centrifugovány. 12 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
Chcete-li Interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici PCR, musí být naped Interní kontrola pidána k izolaci (viz 8.2 Interní kontrola). V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 1): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 EBV LC Master 15 µl 180 µl EBV LC IC 0 µl 0 µl celkový objem 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl po 15 µl vzorek 5 µl po 5 µl celkový objem 20 µl po 20 µl Jestliže chcete Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole PCR inhibice, je teba ji pidat pímo do EBV LC Master. V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 2): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 EBV LC Master 15 µl 180 µl EBV LC IC 0,5 µl 6 µl celkový objem 15,5 µl * 186 µl * Master Mix 15 µl * po 15 µl * vzorek 5 µl po 5 µl celkový objem 20 µl po 20 µl Do plastikového zásobníku každé kapiláry pipetujte 15 µl Master Mixu. Následn pidejte 5 µl eluátu z izolace DNA. Podobn musíte pidat jako pozitivní kontrolu 5 µl alespo jednoho Kvantifikaního standardu (EBV LC/RG/TM QS 1-4) a jako negativní kontrolu 5 µl vody (Water, PCR grade). Uzavete kapiláry. Sms pevedete z plastikového zásobníku do kapiláry tak, že na stolní centrifuze centrifugujete adaptéry s uvnit obsaženými kapilárami po dobu deseti sekund pi maximáln 400 x g (2 000 ot/min). * Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita není omezena. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 13
Pidání Interní kontroly k izolaci Izolace sms lyzaního pufru a vzorku + 0,1 µl IC* na 1 µl eluního objemu 5 µl izolátu* 15 µl artus Master* Sklenná kapilára LightCycler Obr. 1: Schéma pracovního postupu pro kontrolu izolace a PCR inhibice. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. 14 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
Pidání Interní kontroly k artus Master 0,5 µl IC* 15 µl artus Master* Izolace 15,5 µl Master Mix* 5 µl izolátu* 15 µl Master Mix* Sklenná kapilára LightCycler Obr. 2: Schéma pracovního postupu pro kontrolu PCR inhibice. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 15
8.5 Programování pístroje LightCycler Pro detekci EBV DNA vytvote na pístroji LightCycler následujícími pti pracovními kroky (viz Obr. 3-7): teplotní profil A. Poátení aktivace Hot Start enzymu Obr. 3 B. Krok Touch Down Obr. 4 C. Amplifikace DNA Obr. 5 D. Kivka tání (volitelné) Obr. 6 E. Chlazení Obr. 7 Dbejte zvlášt na nastavení Analysis Mode, Cycle Program Data a Temperature Targets. Na obrázcích jsou tato nastavení zvýraznna ernými rámeky. Pokyny pro programování pístroje LightCycler naleznete v píruce LightCycler Operator s Manual. Vytvoení kroku D kivka tání je volitelné. Kivka je potebná výhradn pro rozlišení mezi HSV-1 a HSV-2 pi souasném nasazení artus HSV-1/2 LC PCR Kit. Obr. 3: Poátení aktivace Hot Start enzymu. 16 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
Obr. 4: Krok Touch Down. Obr. 5: Amplifikace DNA. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 17
Obr. 6: Kivka tání. Obr. 7: Chlazení. 18 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
9. Vyhodnocení U vícebarevných analýz se mezi fluorimetrickými kanály vyskytují interference. Software pístroje LightCycler obsahuje soubor oznaený jako Color Compensation File, který tato záení kompenzuje. Tento soubor otevete ped, v prbhu nebo po skonení PCR aktivací pepínací plochy Choose CCC File resp. Select CC Data. Není-li instalován žádný soubor Color Compensation File, vytvote soubor podle návodu v píruce LightCycler Operator s Manual. Po aktivaci souboru Color Compensation File se ve fluorimetrických kanálech F1, F2 a F3 objeví oddlené signály. Pro analýzu výsledk PCR, které byly získány pomocí artus EBV LC PCR Kit, zvolte prosím pro analytickou EBV PCR pohledovou funkci F2/Back-F1 resp. F3/Back-F1 pro PCR Interní kontroly. Pi analýze kvantitativních bh dodržujte bezpodmínen oddíl 8.3 Kvantifikace a Technical Note for quantitation on the LightCycler 1.1/1.2/1.5 or LightCycler 2.0 Instrument, která je k dispozici na www.qiagen.com/products/bylabfocus/mdx. Pokud máte v bhu PCR integrován více než jeden Herpes-artus systém, dbejte na to, aby byly vzorky EBV analyzovány oddlen. Pro vyhodnocení zvolte odpovídající pozice rotoru. Mže dojít k následujícím výsledkm: 1. Ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 je detekován signál. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje EBV DNA. V tomto pípad je detekce signálu v kanálu F3/Back-F1 podružná, protože vysoké výchozí koncentrace EBV DNA (pozitivní signál v kanálu F2/Back-F1) mohou vést k redukovanému až chybjícímu fluorescennímu signálu Interní kontroly v kanálu F3/Back-F1 (kompetice). 2. Ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 není detekován žádný signál, nýbrž pouze v kanálu F3/Back-F1 (signál Interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná EBV DNA. Lze jej proto považovat za negativní. Pi negativní EBV PCR vyluuje detekovaný signál Interní kontroly možnost inhibice PCR. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 19
3. Signál není detekován ani v kanálu F2/Back-F1 ani v kanálu F3/Back-F1. Není možné uinit diagnostický závr. Pokyny týkající se zdroj chyb a jejich odstranní jsou uvedeny v kapitole 10. ešení problém. Píklady pozitivních a negativních PCR reakcí jsou uvedeny na Obr. 8 a Obr. 9. 20 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
Obr. 8: Prkaz Kvantifikaních standard (EBV LC/RG/TM QS 1-4) ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1. NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 9: Prkaz Interní kontroly (IC) ve fluorimetrickém kanálu F3/Back-F1 pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (EBV LC/RG/TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). artus EBV LC PCR Kit 06/2007 21
10. ešení problém Žádný signál pi pozitivních kontrolách (EBV LC/RG/TM QS 1-4) ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1: Volba fluorimetrického kanálu pi analýze dat PCR neodpovídá protokolu. K analýze dat zvolte fluorimetrický kanál F2/Back-F1 pro analytickou EBV PCR a fluorimetrický kanál F3/Back-F1 pro PCR Interní kontroly. Naprogramování teplotního profilu pístroje LightCycler je chybné. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz 8.5 Programování pístroje LightCycler ). PCR reakce byla chybn sestavena. Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz 8.4 Píprava PCR) a pop. PCR zopakujte. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy artus EBV LC PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Slabý nebo chybjící signál Interní kontroly ve fluorimetrickém kanálu F3/Back-F1 pi souasné nepítomnosti signálu v kanálu F2/Back-F1: Podmínky PCR neodpovídají protokolu. Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a pop. PCR zopakujte s opraveným nastavením. PCR byla inhibována. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Pesvdte se, že byl pi izolaci DNA ped elucí proveden dodatený doporuený centrifuganí krok k úplnému odstranní zbytk etanolu (viz 8.1 Izolace DNA). Bhem izolace dochází k úbytku DNA. Byla-li k izolaci pidána Interní kontrola, mže nepítomnost signálu Interní kontroly znamenat úbytek DNA bhem izolace. Ujistte se, že 22 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy artus EBV LC PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Signály pi negativních kontrolách ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 analytické PCR. Bhem pípravy PCR došlo ke kontaminaci. Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzavete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Pipetujte pozitivní kontroly zásadn jako poslední. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Bhem izolace dochází ke kontaminaci. Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzork za užití nových reagencií. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. artus EBV LC PCR Kit 06/2007 23
11. Specifikace 11.1 Analytická senzitivita Pro zjištní analytické senzitivity artus EBV LC PCR Kit byla vytvoena ada ední standard od 50 do nomináln 0,005 EBV-ekvivalent kopie * /µl a analyzována pomocí artus EBV LC PCR Kit. Experimenty byly provedeny ve tech rzných dnech formou osminásobných urení. Výsledek byl zjištn pomocí probitové analýzy. Jeho grafické vyhodnocení je zobrazeno na Obr. 10. Limit detekce artus EBV LC PCR Kit leží proto u 5,78 kopií/µl (p = 0,05). To znamená, že je s 95 % pravdpodobností detekováno 5,78 kopií/µl. Probitová analýza: Virus Epsteina a Barrové (LightCycler ) Obr. 10: Analytická senzitivita artus EBV LC PCR Kit. * U zde použitého standardu se jedná o klonovaný PCR produkt, jehož koncentrace byla zjištna spektrální a fluorescenní fotometrií. 24 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
11.2 Specificita Specificita artus EBV LC PCR Kit je v první ad zaruena výbrem primer a sond, jakož i volbou písných reakních podmínek. Primery a sondy byly na základ sekvenní analýzy pezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Tímto zpsobem byla kontrolována také detekovatelnost všech relevantních genotyp. Validace specificity byla provedena na šesti rzných EBV negativních sérových vzorcích, které spolu s EBV specifickými primery a sondami obsaženými v EBV LC Master negenerovaly žádný signál. K urení specificity artus EBV LC PCR Kit byla kontrolní skupina uvedená v Tabulce 1 testována na kížovou reaktivitu. Žádný z testovaných pvodc nebyl reaktivní. Tabulka 1: Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciáln kížov reaktivních pvodc. Kontrolní skupina EBV (F2/Back-F1) Interní kontrola (F3/Back-F1) Lidský herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1) - + Lidský herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2) - + Lidský herpesvirus 3 (Varicella zoster virus) - + Lidský herpesvirus 5 (Cytomegalovirus) - + Lidský virus leukémie T-bunk 1 - + Lidský virus leukémie T-bunk 2 - + artus EBV LC PCR Kit 06/2007 25
11.3 Pesnost Údaje o pesnosti pro artus EBV LC PCR Kit umožují stanovení celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z Intra-Assay variability (variabilita vzork stejné koncentrace v rámci jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita zpsobená provedením experimentu rznými osobami v jedné laboratoi a užitím rzných pístroj stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita zpsobená použitím rzných šarží). Pitom byla vždy vypoítána standardní odchylka, variance a koeficient variace jak pro specifickou PCR pvodce, tak i pro PCR Interní kontroly. Tyto údaje byly pro artus EBV LC PCR Kit stanoveny na základ Kvantifikaního standardu s nejnižší koncentrací (QS 4; 50 kopií/µl). Experimenty byly provedeny formou osminásobných urení. Vyhodnocení výsledk bylo provedeno na základ Ct hodnot amplifikaních kivek (Ct: threshold cycle, viz Tabulka 2) a z toho urených kvantitativních hodnot v kopiích/µl (viz Tabulka 3). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené koncentrace iní tedy 1,17 % (Ct) resp. 14,54 % (konc.), pro prkaz Interní kontroly 1,02 % (Ct). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílích hodnot zjištných variabilit. 26 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
Tabulka 2: Údaje o pesnosti na základ Ct hodnot. Intra-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,20 0,04 0,90 0,04 0,00 0,28 0,27 0,07 1,24 0,11 0,01 0,72 0,47 0,07 1,44 0,19 0,03 1,23 0,26 0,07 1,17 0,15 0,02 1,02 Tabulka 3: Údaje o pesnosti na základ kvantitativních hodnot (v kopiích/µl). Intra-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 1,36 1,85 13,48 1,68 2,83 16,61 1,33 1,77 13,19 1,47 2,16 14,54 artus EBV LC PCR Kit 06/2007 27
11.4 Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou poizovány za úelem pravidelného hodnocení výkonnosti artus EBV LC PCR Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základ úastí na mezilaboratorních pokusech. 11.5 Diagnostické hodnocení artus EBV LC PCR Kit je v souasné dob evaluován v nkolika studiích. 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradn pro diagnostiku in vitro. Prostedek by mli používat pouze pracovníci, kteí jsou speciáln poueni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). Pesné dodržování protokolu je bezpodmínen nutné k dosažení optimálních výsledk PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. 13. Bezpenostní informace Bezpenostní informace k souprav artus EBV LC PCR Kit naleznete v odpovídajících bezpenostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podob kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na www.qiagen.com/support/msds.aspx. 14. Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti spolenosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO 13485 byla každá šarže artus EBV LC PCR Kit testována podle pedem stanovených specifikací, aby byla zaruena jednotná kvalita produktu. 28 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
15. Literatura Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): 190-212. 16. Vysvtlení symbol Použitelné do íslo šarže Výrobce Katalogové íslo íslo materiálu Manuál Diagnostický zdravotnický prostedek in vitro <N> Obsah postaující pro <N> test Teplotní rozmezí Kvantifikaní standard Interní kontrola artus EBV LC PCR Kit 06/2007 29
30 artus EBV LC PCR Kit 06/2007
artus EBV LC PCR Kit 06/2007 31
:MN!!'CB! ;!,C,77KO,C,77I!<=<,C,77,0!8 J 'P ; :3,: ;!,7'7KO,7'7I!<=<,763 07"82",77'''! "!!- :",'-; J 8I09; 2J K- 262Q ;!777KO777I!<=<777 # /0123.!'5! ;!77KO77I!<=<77 # " $ )1 +CP ;!77KO77I!<=<,7',', %$ K!G I N!7+<= - =!- = 7+I? 7 I!! =!7'7,KO7'7,,I!<=<7'7, "& ' 1 N!,,5 4!<= ;!777KO777I!<=<777 (" 'I4!?:!)!<- 0 ;!,77,'KO,7',7I!<=<,763 07"82",77''',-.'