PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE
Tenkovrstvá chromatografie je technika pro identifikaci a separaci směsi organických látek Identifikace složek směsi (nutné použít standard) analysa frakcí sbíraných během purifikace analysa čistoty látek Při TLC se látky ze směsi rozdělují mezi adsorbent (stacionární fáze, obvykle silikagel, SiO 2 ) a solvent (mobilní fáze), která proudí skrz adsorbent
Uspořádání tenkovrstvé a papírové chromatografie Vzestupné Sestupné
mobilní fáze vzlíná stacionární fází TLC látky rozpuštěné v mobilní fázi putují TLC deskou složky směsi putují rozdílnou rychlostí, která záleží na intermolekulárních silách mezi látkou a silikagelem stacionární fáze a látkou a složkami mobilní fáze http://www.instructables.com/id/ew1ydcyf4rec0iu stacionární fáze SiO2 je velmi polární - silné dipól-dipól interakce, vodíkové můstky čím polárnější analyt, tím silnější vazba se stacionární fází, tím menší rychlost mobilní fáze relativně nepolární silné Londonovy síly, dipól-dipól interakce, vodíkové můstky nepolární analyt interaguje se stacionární méně silně než s mobilní fází putuje rychleji
Charakterizace separece u i R F, i = = um d d i m d i d m u i u m d i d m rychlost skvrny i-tého analytu rychlost (čela) mobilní fáze vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu vzdálenost čela mobilní fáze od startu
Co nám říká hodnota R f? o R f hodnoty lze použít k usnadnění identifikace látky v porovnání se standardy o R f hodnota není fyzikální konstanta, mělo by být provedeno srovnání pouze skvrny na stejné desce za stejnou dobu o Dvě látky, které mají stejnou hodnotu R f mohou být totožné; ty, které mají různé hodnoty R f nejsou totožné
málo polární nejvíce polární Typ látky alkany alkeny etery aromáty aldehydy a ketony alkoholy aminy organické kyseliny soli polárnější látky se váží silněji na stacionární fázi málo polární nejvíce polární rozpouštědlo hexany tetrachlormethan toluen chloroform diethyleter ethylacetát aceton methanol kys. octová voda eluční síla běžných rozpouštědel
Detekce barevný produkt SUPR UV (látky které světélkují pod UV světlem) vizualizace postřikem s vhodným chemickým činidlem (ninhydrin, H 2 SO 4, KMnO 4, I 2 )
Aplikace dělení aminokyselin, vitamínů, alkaloidů, uhlovodíků, nukleotidů, potravinářských barviv, cukrů, Flash chromatografie
Flash chromatografie použití pro purifikaci nízkomolekulárních přírodních látek a produktů organických synthes
mobilní fáze: - dvou a vícesložkové systemy běžná rozpouštědla: dichloromethan/hexan ether/hexan hexan/ethylacetát dichloromethan/methanol ethanol chloroform/ethanol chloroform/aceton
pro odhad retence na koloně: C V =1/R f C V - objem mobilní fáze potřebný k eluci komponenty vztažený na objem kolony R f - hodnota retence na TLC desce
Na začátek zařadit metody: s vysokou kapacitou velkým výtěžkem nízké rozlišení Později metody s: vysokým rozlišením dostačujícím výtěžkem kapacita méně významná Základní zásady Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku) Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími
Příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence odstranění fragmentů a komplexů Nevhodné kombinace Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace)
Sledování průběhu separace Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] Specifická aktivita [U/mg] Stupeň přečištění Výtěžek 0,8 50 1000 25-100 % (NH 4 ) 2 SO 4 2,5 10 850 34 1,4 85 % HIC 2,5 6 600 40 1,6 60 % dialysa 2,2 6,5 550 39 [%] 1,6 55 % IEX 0,2 3 500 1000 40 50 %
Sledování průběhu separace Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] 258,1 20 4000 (NH 4 ) 2 SO 4 118,1 9 4053 HIC 57,5 6 3565 GPC 19,3 2 2565
Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] 258,1 20 4000 (NH 4 ) 2 SO 4 118,1 9 4053 HIC 57,5 6 3565 GPC 19,3 2 2565 Specifická aktivita [U/mg] 0,77 Stupeň přečištění - Výtěžek [%] 100 3,81 4,9 101 10,33 13,3 89 66,45 85,8 64
Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí sčinidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mm maltosy a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na 2 CO 3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm 3.cm -1.mol -1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?
Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu SDS elektroforesa 1 2 3 4 1. Standard 2. Původní vzorek 3. Nenavázané proteiny 4. Eluované proteiny
Stanovení koncentrace bílkovin
Kjeldahlova metoda stanovení N 2 Mineralizace vzorku převedení organického dusíku na NH 4 + Stanovení NH 4 + - titrace, fotometrie, selektivní elektrody
UV spektrofotometrie 280 nm aromatické AMK interference nukleotidů 180-230 nm peptidová vazba Výhody - nedestruktivní metoda
VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost
Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v silně alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidové vazby Cu 2+ Měření : 540 560 nm 1-10 mg/ml
Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 720-750 nm 5-250 ug/ml Lowryho metoda
Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm 10-1000 ug/ml
BCA metoda Meření : 562 nm 0,4-100 ug/ml
Měření: 575 nm 1-10 ug Ninhydrinová metoda
Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu (fluorescamin) na bílkovinu měření vzniklé fluorescence Měření: 390/475 nm 10 ng
Stanovení koncentrace DNA
Metoda měření absorbance v UV oblasti
Metoda s diaminobenzoovou kyselinou Měření: depurinace + DABA Měření: 420 nm 25 ug Metoda s difenylaminem Měření: depurinace + DPA Měření: 595 nm 25 ug
Ethidiumbromid Fluorescenční metody 4`,6`-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 2-(2-[4-hydroxyphenyl]-6-benzimidazolyl)-6- (1-methyl-4- piperazyl)benzimidazol trihydrochlorid (Hoechst 33258)
Stanovení koncentrace RNA
Metoda měření absorbance v UV oblasti 1 OD 260 = 40 µg/ml ssrna
Metoda s orcinolem Princip: depurinace + reakce s orcinolem Měření: 660 nm
Elektromigrační metody
Princip metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru v = q. E / f frikční koeficient (popisuje tvar a velikost molekuly) rychlost celkový náboj intenzita el. pole + pi > ph pi < ph kladný náboj záporný náboj + - + + - + - + - - + - malé částice s velkým nábojem velká pohyblivost velké částice s malým nábojem malá pohyblivost - volná elektroforesa zónová elektroforesa rovnovážná elektroforesa isoelektrická fokusace kapilární elektroforesa
Volná elektroforesa pufr vložením elektrod do pufru se molekuly proteinů začnou pohybovat k elektrodám s opačnou polaritou a rozdělí se na základě rozdílných nábojů a koeficientů tření vzniknou pohyblivá rozhraní mezi jednotlivými druhy proteinů nevýhody: konvekční míchání zón, mnoho vzorku, složitá aparatura vzorek
Zónová elektroforesa elektroforesa na nosiči nosiče: filtrační papír celulosa agarosa polyakrylamid omezení konvenčního míchání lepší rozdělení menší spotřeba vzorku elektroforéza na celulóze pohyb iontu v rozhodující míře závislý na poměru náboje k velikosti částice elektroforéza v gelu porózní gely umožňují separaci na principu molekulového síta a zároveň elektroforetické pohyblivosti provedení v trubičkách plošná vertikální horizontální
Aparatury pro trubičkové gely
AGAROSA Gely polysacharid z červených mořských řas extrémně jednoduchá příprava pory větší než 10 nm teplota tání 35 C - 95 C low melting agarosa (teplo ta tání ~ 65 C) velikost pórů: 150 nm 1 % gel 500 nm 0,16 % gel široký separační rozsah, ale relativně nízkou rozpustnost koncentrační rozsah 0,5 % - 4 % fragmenty DNA 100 50 000 bp (větší fragmenty pulsní elektroforesa 50 000 1 000 000 bp) velmi velké proteiny a proteinové agregáty PUFR: Tris-acetát-EDTA (TAE) nebo Tris-borát-EDTA (TBE) NANÁŠECÍ PUFR ( loading buffer -PLB): sacharosa, glycerol,... bromphenolová modř a xylen-cyan
analysa a purifikace DNA restrikičních fragmentů Ethidium bromid, SYBR Green citlivost 100 pg 1 ng/proužek Nukleové kyseliny
% agarosa rozsah [kb] 0,7 0,8-20 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-4 2,0 0,1-3
Pulsní gelová elektroforesa (PFG) použití: separace nukleových kyselin (20 000 až 12 000 000 bp)
Uspořádání PFG field inversion gel electrophoresis (FIGE) transverse alternating field electrophoresis (TAFE) rotating gel electrophoresis (RGE) clamped homogeneous electric field (CHEF)
FIGE 23 kb 48,5 kb 12 kb 0,5 kb Figure 2. Increased separation of the 20-50 kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE). HSI Laboratories, Run Hoefer conditions: Scientific Instruments San Francisco, CA 230 V, 7.9 V/cm, 16 hrs., 50 msec. pulse,
RGE Figure 3. Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32 samples, a maximum of 72 are possible HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA
Imunoelektroforesa ZÓNOVÁ ELEKTROFORESA/IMUNODIFUSE směs antigenù je nejprve elektroforeticky rozdělena, po té je do podélného žlábku nanesena směs protilátek a provedena imunodifuse tvorba precipitačních linií dojde-li k tvorbě komplexu Ag-Pl
ELEKTROIMUNODIFUSE - RAKETKOVÁ TECHNIKA gel obsahuje definovanou koncentraci protilátky
POLYAKRYLAMID chemicky inertní a mechanicky stabilní obtížnější příprava oproti agarosovému gelu T celková koncentrace akrylamidu C stupeň prokřížení podíl dimeru k monomeru T C = = a + b.100[%] V b.100[%] a + b a...hmotnost akryamidu [g] b hmotnost methylenbisakrylamidu [g] V objem [ml]
logu 200 = logu K T U T...relativní pohyblivost T 0 R. Fergusonova analýza U 0...volná relativní pohyblivost K R...tzv. retardační koeficient K. 2 7 R = 2,43.10 + 5,53.10 M r log UT 150 100 0 5 10 15 koncentrace gelu [% T] Ferguson, K.A. (1964) Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13, 985 1002
PAGE Uspořádání: kontinuální diskontinuální ZAOSTŘOVACÍ GEL: nižší hodnota ph, nižší koncentrace polyakrylamidu DĚLÍCÍ GEL: má vyšší hodnotu ph než rozdělovací ELEKTRODOVÝ PUFR: Tris/Glycin/SDS zaostřovcí gel velké póry dělící gel malé póry princip zaostřování
SDS-PAGE Tris/Gly/SDS anionický detergent po zahřátí na 100 C rozbaluje protein a váže se na něj (1 molekula SDS na 2 AK, 1,4 g SDS na 1 g proteinu) velký náboj velká pohyblivost vysoké rozlišení dobrá fixace proužků lze odstranit z gelu, aniž by se uvolnily proteiny 10x vyšší detekční limit než nativní elfo Nevýhody: za nízkých teplot krystalizuje mnoho proteinů se chová anomálně -v důskedku neuniformní vazby SDS -proteiny s velkým záporným, velkým kladným nábojem a na prolin bohaté proteiny NANÁŠECÍ PUFR ( loading buffer -PLB): SDS, glycerol, DTT, pufr, bromfenolová modř, H 2 O
SDS-PAGE Tris/Tricin/SDS separace proteinů < 14 kda lineární rozlišení 1-100 kda Tricin = N-Tris(hydroxymethyl) methyl glycine
SDS-PAGE Tris/Borát/EDTA elektroforesa glykoproteinů SDS se neváže na sacharidy CTAB-PAGE CTAB kationický detergent pro záporně nabité proteiny, silně bazické nukleoproteiny nedenaturuje protein, tj. řada proteinů má i po CTAB PAGE enzymatickou aktivi kyselé prostředí ph 3-5 Nativní-PAGE i jiné pufry HEPES, MOPS, MES zymogramy
Gradientová gelová elektroforesa
Gradientová gelová elektroforesa
Preparativní PAGE
2D-PAGE