Specifická imunita Ond!ej Beran Laborato! AIDS a bun"#né imunologie III. klinika infek#ních a tropick$ch nemocí 1. FK UK a FN Na Bulovce 3. Motolsk$ minikurz cytometrie, 29.- 30.10.2007
Metody vy!et!ování spec. imunity 1. Cytometrické MHC tetramery intracelulární stanovení cytokin! cytokinové sekre"ní eseje CD154, granzym, perforin test proliferace /CFSE/ 2. Necytometrické ELISPOT test proliferace /radioizotopy/
Vyu"ití v infektologii Na%e zku%enosti: HIV virová hepatitida B virová hepatida C jiné: herpetické infekce, ch!ipka, TB, v$voj vakcín ad.
Specifická imunita u HIV infekce retrovirus HIV zp!sobuje chronickou infekci s komplexní dysregulací imunitního systému cílem HIV jsou CD4+ bu#ky, ale postupn$ jsou naru%eny v%echny imunitní bu#ky cytotoxické T lymfocyty (CTL) jsou nezbytné p&i imunitní kontrole virov'ch infekcí CTL rozpoznávají antigen ve spojení s MHC I. t!ídy. CTL p!sobí na infikované bu#ky 2 r!zn'mi mechanismy: Lytické! granzym, perforin. Non-lytické!!-chemokiny: MIP-1", MIP-1!, RANTES, IFN-#, TNF-".
Diferenciace pam#$ov"ch a efektorov"ch CD8+ T lymfocyt% Zajac, J Exp Med 1998
Technologie MHC I tetramer%
HIV studie - tetramery prospektivní studie 63 HIV+ pacient! s"haplotypem HLA-A2 (50,2 % vy#et$en%ch HIV+ pacient!), pom&r mu'i/'eny 49/14, medián v&ku 35 let, stádium HIV infekce (dle CDC klasifikace) 16 AIDS/10 B/37A 25 pacient! bez lé(by 38 pacient! lé(en%ch HAART
Protokol - tetramery povrchové Ab p!idány ve stejném kroku jako tetramery vs. jiné protokoly doporu"ují 20 min p#ed tetramery inkubace 30 min p!i pokojové teplot" vs. jiné protokoly doporu"ují 4 C lyzace pomocí OptiLyse B vs. Optilyse C p#i anal$ze na p#ístroji Becman Coulter - s jin$mi roztoky zhor%ení kvality barvení anal#za do 24 hod.
Protokol HIV tetramery HLA typizace pomocí zna(ené monoklonální protilátky anti-hla-a2 FITC (Becton-Dickinson, N&mecko) HIV-specifické CD8+ T lymfocyty ur(eny pomocí HLA*0201/gag a HLA*0201/pol tetramer! (10ul/vz) zna(en%ch PE (Beckman Coulter, Francie) - detek(ní limit = 0,05 % 200 ul (erstvé krve/vz imunofenotypizace lymfocyt! pomocí zna(en%ch monoklonálních protilátek anti-cd3 PerCP, anti-cd4 FITC a anti-cd8 FITC (BD, N&mecko)
HIV-specifické CD8+ T lymfocyty: procento pacient% s detekovateln"m zastoupením gagspecifick"ch CD8+ T lymfocyt% 100% 80% 60% 40% 46% 52% 20% 0% HAART (n=37) Naive (n=21) Bartovská, Acta Virol 2006
HIV-specifické CD8+ T lymfocyty median frekvence gagspecifick'ch CD8+ T cells podobn' u lé"en'ch i nelé"en'ch osob (0,049 % vs. 0,06 %) procento gag-specifick'ch CD8+ T lymfocyt! nekoreluje s virovou nále(í % gag+ CD8 T bu&ky 4 3 2 1 0 HAART naïve Bartovská, Acta Virol 2006
Produktová informace EPICS XL-MCL FACSCalibur
Aplikace tetramer% p!i HIV infekci 0,17 0,16 gag pol CD8
Aplikace tetramer% p!i HIV infekci 0,08 0,44 gag pol CD8
Aplikace tetramer% p!i HIV infekci 0,15 0,44 gag pol CD8
Protokol VHB tetramery 5 HLA-A2 pozit. pacient! s akutní VHB VHB-specifické CD8+ T lymfocyty ur(eny pomocí HLA*0201/HBV core zna(en%ch PE (Beckman Coulter, Francie) - detek(ní limit = 0,05 % 200 ul (erstvé krve/vz imunofenotypizace lymfocyt! pomocí zna(en%ch monoklonálních protilátek anti-cd3 PerCP, anti-cd4 FITC a anti-cd8 FITC (BD, N&mecko)
Aplikace tetramer% p!i VHB 0,33 HBV core CD8
Tetramery p!i VHB protokol bez Optilyse HBV core CD8
Aplikace tetramer% p!i VHB 2,23 HBV core CD8 specifické CD8+ T lymfocyty detekovány u v%ech pacient& medián VHB-specifick$ch CD8+ T lymfocyt&: 0,35 %
Protokol IC barvení u HIV+ stimulace gag (5 ng/ml) pozit. kontrola: PMA/ionomycin neg. kontrola - RPMI nutná del#í inkubace 14 hod. (12 h s brefeldin A) permeabilizace pomocí Cytofix/Cytoperm (BD) imunofenotypizace lymfocyt! pomocí zna(en%ch monoklonálních protilátek anti-cd3, anti-cd8 FITC, anti- IFN&, anti-il-2 (v#e BD)
IC barvení stimulace gag peptidem pozitivní kontrola 0,08 5 IL-2 0,16 95 CD8
ELISPOT anal$za specifick$ch CD8 nebo CD4 T lymfocyt' pomocí stimulace p!íslu%n$mi peptidy nebo proteiny princip podobn$ ELISA
CD8 ELISPOT 1.den: romra(ení bun"k, pota(ení desti#ky primární monoklonální Ab anti-ifn) (Diaclone) 2.den: inkubace bun"k s peptidy/pooly (>20 hod.) (Neosystem) - ideáln" triplikáty, 50-100000 PBMC/jamku 3.den: promytí, inkubace se sekundární Ab anti-ifn) (4 hod.) - inkubace s alkal. fosfatásou/streptavidinem (2 hod.) - p!idání substrátu (Sigma) (20 min.)
ELISPOT
ELISPOT
ELISPOT
ELISPOT
ELISPOT Blank PHA gag Blank PHA gag 22 spot& 236 spot& 2360 spot&/milion PBMC detek"ní limit 50 SFC/milion PBMC
ELISPOT HIV/virová hepatitida C. A(@ %&' B C) D D C0EF3247<G!!"#$ - A(@ @ @492 *0123452 *+ *, (!, (!- (!) (!. % (!. / 6278334594728:2 ;23<=8:2 $94 728:2 $43>? 298:2 Antigeny: C22 C33 C100 NS5 Rekombinantní proteiny Pool peptid' pooly peptid' 15 a( 20 peptid' (15-18mery)
CD8 ELISPOT HIV/HCV koinfekce po transplantaci jater 16 pacient' medián specif. bun"k: HIV p24: 168 SFC/10 6 PBMC (7/16 pacient') HCV core: pozit. pouze u 1 pacienta 54 SFC/10 6 PBMC JE MO*NÉ ZV+,IT SENZITIVITU?
CD8 ELISPOT HIV/HCV koinfekce po transplantaci jater in vitro generace specifick$ch lymfocyt' pomocí stimulace peptidy 5 dní inkubace po p!idání s IL-2 v$sledky u 3 pacient' po in vitro kultivaci: HCV core pozit. 1 pacienta 1940 SFC/10 6 PBMC NS3 pozit. u v%ech 180-1020/10 6 PBMC
Záv#ry MHC tetramery,, IC barvení a ELISPOT jsou skv!lé, ale mají svoje limity, vhodn! se dopl'ují specifick# lymfocyt neznamená efektivní lymfocyt ideáln! je t"eba t pokr#t v$echnyv epitopy (drahé!) imunitní odpov!dˇ je %asto diverzifikovaná a lokalizovaná (VHB, VHC), zastoupení í spec. lymfocyt& je nízké (0,05-5%) ELISPOT nejmén én! náro%n#, n#, nejlevn!j$í $í,, funk%ní ní test, vzorky se dají analyzovat do 6 m!s.!
Pod#kování Michal Holub Zofia Bartovsk ovská Gábina Reinvartová Hanu$ Rozsypal... a vám za pozornost.