Význam některých metod posouzení renálních funkcí Část 3. Proteinové markery tubulárních lézí u akutního poškození ledvin A. Jabor, J. Franeková Tubulární proteinurie je označení pro situace se zvýšenou koncentrací proteinů tubulárního původu v moči. Tubulární proteiny se do moče dostávají ve zvýšeném množství například při různých poruchách proximálního i distálního tubulu. kdy vázne zpětná rezorpce proteinů tubulárními buňkami, nebo při překročení kapacity tubulárních buněk zpětně reabsorbovat proteiny (překročení reabsorpčního prahu). Obvykle se za tubulární proteinurii považuje výskyt proteinů o molekulové hmotnosti 10 000 až 70 000 g/mol (10 70 kda) a tradičně se uvádějí jako diagnostické proteiny α-1- mikroglobulin, beta-2-mikroglobulin, RBP (retinolbinding protein), N-Acetyl-β-D-glukosaminidáza, GGT (GMT), lysozym a další markery. Proteinurie a její klasifikace Klasifikací proteinurie se zabývá nové doporučení České společnosti klinické biochemie, ve kterém se doporučuje stanovení poměru proteinu/kreatinin (PCR) obvykle ve vzorku první ranní moče. Fyziologický poměr PCR je pod 15 g/mol, za proteinurii se považuje pásmo 15 99 g/mol a jako těžká proteinurie jsou označeny situace s PCR 100 a více g/mol. Fyziologická mez je na úrovni citlivosti diagnostických proužků (ta je kolem 150 mg/l, tedy při předpokládané koncentraci kreatininu v moči 10 mmol/l se jedná právě o hodnotu PCR 15 g/mol). Odpovídající fyziologický poměr albumin/kreatinin v moči (ACR) má hodnotu pod 2,5 g/mol u mužů a pod 3,5 g/mol u žen. Britské doporučení (UK Chronic Kidney Disease Guidelines) obsahuje algoritmus testování proteinurie, který se zabývá praktickým řešením v primární péči. Není doporučen sběr moče za 24 hodin, jakákoli pozitivita proužkem (1+ a více) se má konfirmovat v laboratoři poměrem protein/kreatinin nebo albumin/kreatinin, současně se má vyšetřit kultivace ze středního proudu moče. Za proteinurii se považuje PCR > 45 g/mol nebo ACR > 30 g/mol. Zjištění proteinurie musí být následováno testem pro vyloučení posturální proteinurie (ranní moč), za perzistentní proteinurii se považuje pozitivita 2- a vícekrát proteinurie vyšetřené v průběhu 1-2 týdnů. Také tento algoritmus tedy neřeší jeden z hlavních problémů únik řady pacientů s malými koncentracemi albuminu v moči v pásmu mikroalbuminurie (které detekční proužky nezachytí) a pacientů s výskytem tubulární proteinurie (malá citlivost detekční zóny na tubulární proteiny). Jedinou možností je proto opatrný přístup k možným situacím s výskytem tubulární proteinurie a využití možností, z nichž některé uvádí zmíněné doporučení ČSKB. Tubulární proteinurie a akutní poškození ledvin Klinické podezření je z uvedených důvodů jednou z hlavních indikací k pátrání po (především možné tubulární) proteinurii. Současně je také nutné hledat markery časné predikce akutního poškození ledvin (acute kidney injury, AKI). Použití některých výše uvedených tradičních markerů prověřil čas, jiné jsou již bez aktuálního významu. Dosud jmenované markery jsou proto v poslední době doplňovány o nové biomarkery, které mají nebo mohou mít vztah k renoprotektivním strategiím u AKI. Kromě již uvedených se jedná například o vyšetření nových nebo méně frekventovaných biomarkerů (vyšetřují se v moči, není-li uvedeno jinak), mezi které patří alkalická fosfatáza, aprotinin, laktátdehydrogenáza, α-1-kyselý glykoprotein, Clara cell protein, cystatin C (vyšetřuje se také v séru), KIM-1, IL-18, NHE3 (sodium-hydrogen exchanger 3), NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin, vyšetřuje se také v séru), αgst (glutathion-s-transferase), πgst, L-FABP, H-FEBP, keratin-derived chemokine, aktinaktin depolymerizující faktor, MMP-9 (matrixová metaloproteáza 9), se-selektin a sicam-1. V krvi se dále jedná o karbamylovaný hemoglobin, v plazmě se vyšetřují proanp, CD-11b, interleukiny, cytokiny a chemokiny (IL-6, IL-8, IL-10, TNF, stnfr-1, stnfr-2), ICAM-1, von Willebrandův faktor, SP-A, SP-D, protein C, plazminogen aktivátor inhibitor (PAI-1), CRP a prealbumin. Z celé plejády močových (nebo plazmatických) biomarkerů tubulární léze se v tomto přehledu zaměříme pouze na α-1-mikroglobulin, NGAL, KIM-1 a FABP. Alfa-1-mikroglobulin Tubulární protein, známý také jako HC (human complex forming glycoprotein). Má fyziologickou (protektivní) funkci (imunomodulace, antioxidační účinky). Αlfa-1-mikroglobulin je produkován v játrech, vyskytuje se volně, nebo ve vazbě na IgA. Volná forma nepřesahuje v plazmě 60 mg/l, molekulová hmotnost 27 000 g/mol (27 kda). Protein se volně filtruje v glomerulu a z 99 % je reabsorbován z ultrafiltrátu plazmy přes megalinový receptor 23
v proximálním tubulu. Zvýšená exkrece v moči je důsledkem porušené reabsorbce v proximálním tubulu, takže je α-1-mikroglobulin časným markerem poškození proximálního tubulu, přičemž se může jednat o poškození tubulů různého typu. Interpretace změn α-1-mikroglobulinu není jednoduchá, protein má diurnální variaci (jednorázové vzorky tedy nemusejí přesně odpovídat 24hodinovému sběru moče, používá se samozřejmě i poměr ke kreatininu), hodnoty se mění s věkem a glomerulární filtrací, muži mají větší močové koncentrace než ženy, existuje nezanedbatelná intraa interindividuální variabilita. Běžně udávaná horní mez močové koncentrace α-1-mikroglobulinu je 12 mg/l, resp. 1,58 g/mol kreatininu. Koncentraci α-1- mikroglobulinu je ale vhodné posuzovat ve vztahu k albuminurii, jak ukazuje obrázek 1 (European Urinalysis Guidelines, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 60, 2000, Suppl. 231). Obrázek 1: Interpretační přístup k hodnocení α-1-mikroglobulinurie a albuminurie. Označení oblastí: 3 = tubulointersticiální nefropatie, 2 = sekundární glomerulopatie, 1 = primární glomerulopatie. 24 Αlfa-1-mikroglobulin patří mezi jeden z nejcennějších tubulárních proteinů, které může klinická laboratoř nabídnout, s možností imunoturbidimetrie i imunonefelometrie. Má dobrou stabilitu ve vzorku moče a proti beta-2-mikroglobulinu se jedná o prakticky velmi významný protein. NGAL (Neutrophil gelatinaseassociated lipocalin) Člen lipokalinové rodiny, v moči je přítomen po toxickém a ischemickém poškození. Jedná se o časný marker akutního poškození ledvin. Indikační skupiny tohoto stanovení tvoří ischemie ledvin po srdečních operacích, operace na velkých cévách, nefrotoxické poškození kontrastními látkami nebo aminoglykosidy, proteinurické léze ledvin, diabetická nefropatie, stavy po transplantacích ledvin, systémový lupus erytematodes a další (Brunner, 2006, Mishra, 2003, Bennett 2008, Nickolas 2008). NGAL je secernován do moče buňkami tlustého ascendentního raménka Henleho kličky, tvoří se i v cirkulujících krevních buňkách. Je součástí ochranného mechanismu tubulárních buněk, zajišťuje chelataci železo-sideroforových komplexů (které zvyšují mikrobiální růst nebo zprostředkovávají oxidativní poškození) a recykluje komplexy železa endocytózou. Není podstatně ovlivněn diuretiky a volumovou deplecí, je tvořen především při akutním poškození ledvin, kde je přímá korelace mezi poškozením a produkcí. Produkce může být zvýšena u stabilizovaného chronického renálního selhání, ale v čase se nemění. Někdy je uváděn jako reaktant
akutní fáze, ale se specifičností pro AKI. O využití NGAL je řada publikací především z oblasti kardiovaskulární chirurgie a intenzívní péče obecně. Například Bennet hodnotil pacienty s rozvojem AKI po kardiopulmonárním by-passu (CPB), kde nastalo diagnosticky významné zvýšení kreatininu v séru po 2 3 dnech po CPB, ale koncentrace NGAL v moči byla 15x zvýšená nad cut-off za 2 hod. po CPB a 25x zvýšená za 4-6 hod. po CPB. NGAL v moči je v této publikaci hodnocen jako časný prediktivní biomarker závažnosti AKI po CPB (Bennett, 2008). Prediktivní roli NGAL pro rozvoj AKI po CPB popsali i další autoři. Tuladhar hodnotil NGAL v séru i moči s hodnotou AUC při ROC analýze na úrovni 0,8. Článek sice obsahuje určité faktické chyby při udávání výsledků a při přepočtech, ale lze vyčíst použité cut-off hodnoty v moči se používal cut-off 100 µg/l, tedy kolem 15 (10 20) mg/mol kreatininu, tj. kolem 130 µg/g kreatininu (Tuladhar, 2009). Velmi kvalitní práci porovnávající efektivitu různých biomarkerů AKI předložil Nickolas. U pacientů s AKI popsali signifikantně zvýšené koncentrace NGAL v moči v porovnání s ostatními skupinami postižení ledvin (prerenální azotemie, stabilní chronické renální selhání a normální funkce ledvin). Pro cut-off 15 mg/mol kreatininu (130 μg/g kreatininu) je senzitivita detekce AKI 0,90 a specifičnost 0,995. Horší parametry byly pro NAG, α1-mikroglobulin, α1-kyselý glykoprotein, frakční exkreci sodíku a kreatinin v séru (tabulka 1). Tabulka 1: Hodnoty AUC při ROC analýze pro diagnostiku akutního poškození ledvin v diferenciálně diagnostickém prostředí prerenální azotemie, chronického onemocnění ledvin a normální funkce ledvin. Podle Nickolase, 2008. Biomarker AUC NGAL (Lipokalin asociovaný s želatinázou neutrofilů) 0,948 kreatinin 0,921 α-1-mikroglobulin 0,887 α-1-kyselý glykoprotein 0,832 NAG (N-acetyl-beta-D-glukózaminidáza) 0,713 FENa (frakční exkrece sodného kationtu) 0,708 V mnohonásobné logistické regresní analýze močový NGAL predikoval klinický stav pacienta (včetně potřeby konzultovat nefrologa, nutnosti dialyzovat nebo přijmout na JIP). Podle autorů této studie stanovení NGAL v moči napomáhá při odlišení AKI, normální funkce ledvin, prerenální azotemie a chronického selhání ledvin, na základě naměřených hodnot lze předvídat zhoršení stavu pacienta a pacienti se zvýšeným NGAL vyžadovali nejčastěji konzultaci nefrologa, dialýzu, přijetí na ICU a měli zvýšenou mortalitu (Nickolas, 2008). Stanovení NGAL a interpretace výsledků měření není bez problémů. Na obrázku 2 je vidět rozdíl firemních cut-off diagnostických souprav, které (vzhledem k imunochemickému principu stanovení) vykazují vcelku uspokojivou shodu výsledků, ale mají zásadně odlišné cut-off hodnoty. Rozdíly jsou i v cutoff hodnotách v klinických studiích, které hodnotily roli NGAL v diagnostice a určení prognózy AKI: v 19 studiích vybraných pro metaanalýzu se cut-off pro predikci AKI lišil jak u vyšetření v plazmě, tak v moči (Haase, 2009). Dobrou efektivitu NGAL v připravované publikaci popisuje i Heise se spolupracovníky, ačkoli úsměvně používají název neutrophil glucosaminidase-associated lipocalin (Heise, 2010). Přes uvedené problémy je NGAL jedním z nejvíce perspektivních markerů pro predikci a hodnocení prognózy akutního poškození ledvin. Množství publikací o tomto proteinu, systematické přehledy a metaanalýzy význam této molekuly v diagnostice jen podtrhují. Vazebné proteiny mastných kyselin (H-FABP/L-FABP) Vazebné proteiny mastných kyselin (fatty acid binding proteins) jsou proteiny s molekulovou hmotností kolem 15 000 g/mol (15 kda), které jsou uvolňovány pouze z buněčné membrány. Považují se za kandidátní markery poruchy perfuze ledvin (ischemická porucha před transplantací), další indikace představuje například kontrastem indukovaná nefropatie. Určitou zajímavou vlastností by byla možnost odlišení proximální a distální tubulární léze: L-FABP (heart type) by mělo být zvýšeno u lézí proximálních buněk, H-FABP (liver type) u lézí distálních tubulárních buněk. Podstatnou nevýhodou těchto markerů je nízká specifičnost pro onemocnění ledvin, interpretační obtíže u kardiovaskulárních chorob a absence komerčních souprav na stanovení (Pelsers, 2008). 25
Obrázek 2: Cut-off pro vyšetření NGAL v moči u dvou diagnostických souprav (vlastní data) KIM-1 (Kidney injury molecule 1) Jde o transmembránový protein, který je exprimován v proximálních tubulárních buňkách (v apikální membráně) po poškození ledviny různého původu, například ischemicky nebo toxicky (Bonventre, 2008). Zvýšení KIM-1 v moči při akutní tubulární nekróze je přítomno již za 12 hodin, před výskytem válců v moči (Han, 2002). Část prací se týká imunohistochemického průkazu v biopsiích, komerční soupravy s možností stanovit protein v nepřetržitém provozu se teprve připravují (Chaturvedi, 2009). Jednou z možných indikací jsou stavy po transplanataci ledviny, kde je vztah mezi přežíváním pacientů po transplantaci a vylučováním KIM-1. Vylučování do 0,48 ng/den bylo spojeno s šestiletým přežitím v 95 % případů (van Timmeren, 2007). Referenční interval poměru ke kreatininu 7,91 45,09 µg/mol (0,07 0,399 ng/mg) je nutno považovat za orientační vzhledem k metodice, jak byl určen (Chaturvedi, 2009). Biomarkery tubulární proteinurie u akutního poškození ledvin ve světle evidence based medicine Ve zcela recentním přehledu 54 hodnotitelných publikací o tubulárních biomarkerech u AKI za 10 let uvádí Parikh (červenec 2010) vazbu většiny z uvedených biomarkerů k diagnostice již rozvinutého akutního poškození ledvin (AKI), predikci AKI a určení prognózy AKI (Parikh, 2010). Autoři současně hodnotili kvalitu publikací a je nutno přiznat, že většina dostupných publikací o biomarkerech u AKI postrádala buď jasnou definici AKI nebo dostatečný popis tubulárních markerů. Maximální skóre kvality (10 bodů) u diagnostických markerů nedosáhla ani jedna z hodnocených publikací, u predikčních markerů dosáhly maximálního počtu 10 bodů publikace týkající se NGAL, IL-18, L-FABP a cystatinu C a u markerů prognózy (resp. závažnosti AKI) byly kvalitní publikace s maximálním skóre o NGAL, IL-18 a Herget-Rosenthalova práce o tubulárních proteinech (Herget-Rosenthal, 2004). Analýzou hodnotitelných publikací autoři vyselektovali množinu tubulárních proteinů, které lze u AKI považovat za slibné markery. Jde o skupinu močových biomarkerů (jsou uvedeny v tabulkách 2 a 3) a dva další biomarkery vyšetřované v plazmě (nebo séru) zde je zastoupen NGAL a cystatin C. Tabulka 2: Postavení slibných močových biomarkerů tubulárních lézí u AKI ve světle EBM (podle dat z publikace Parikh, 2010). Setříděno podle počtu pacientů v hodnocených studiích 26 Močový marker Celkový počet pacientů v hodnocených studiích Počet hodnocených prací NGAL 2560 21 IL-18 929 10 α-1-mikroglobulin 788 3 α-1-kyselý glykoprotein 635 1 NAG 267 4
Močový marker Celkový počet pacientů v hodnocených studiích Počet hodnocených prací αgst 179 3 KIM-1 146 3 πgst 106 2 L-FABP 106 2 cystatin C 73 1 beta-2-mikroglobulin 73 1 GGT 73 1 V tabulce 3 jsou uvedeny počty pacientů ve studiích, které bylo v Parikhově přehledu možné vyhodnotit z hlediska použití močového biomarkeru v oblasti stanovení diagnózy rozvinutého AKI, v oblasti včasné predikce AKI a určení závažnosti (prognózy) AKI. Pro některé markery chybějí studie o jejich diagnostické, prediktivní nebo prognostické roli, u jiných bylo posuzováno více ukazatelů současně. Validita prací je uvedena průměrnou hodnotou skóre (10 bodů je maximum). Pokud porovnáme údaje s tabulkou 2, je vidět, že u řady markerů není jejich použití dosud dostatečně podloženo nebo jsou podklady z méně validních prací, u jiných markerů nejsou navíc k dipozici standardizované (nebo komerční) soupravy (s CE značkou nebo schválené FDA). Tabulka 3: Role slibných močových biomarkerů pro použití při diagnostice, predikci a určení prognózy AKI (Podle dat z publikace Parikh, 2010) Močový marker Diagnostika Predikce Prognóza Počet pacientů Průměrné skóre Počet pacientů Průměrné skóre Počet pacientů Průměrné skóre NGAL 81 7,0 2099 8,6 380 9,7 IL-18 72 7,0 582 9,0 275 9,5 α-1-mikroglobulin 80 9,0 635 9,0 73 10,0 α-1-kyselý glykoprotein 0-635 9,0 0 - NAG 154 8,5 40 8,0 73 10,0 αgst 80 9,0 26 9,0 73 10,0 KIM-1 106 8,0 40 8,0 0 - πgst 80 9,0 26 9,0 0 - L-FABP 0-106 8,5 0 - cystatin C 0-0 - 73 10,0 beta-2-mikroglobulin 0-0 - 73 10,0 GGT 0-0 - 73 10,0 Je samozřejmě poněkud obtížné data uvedená v Parikhově přehledu prezentovat sumárním způsobem. Autor hodnotil přínos prací pro diagnostiku, predikci a prognózu AKI. Pokud jsou v přehledu uvedeny publikace, které se zabývaly všemi uvedenými aspekty, jsou počítány 3x. Podobně i počet pacientů, kteří byli hodnoceni, se rovněž sčítal, pokud se práce zabývala více než jedním aspektem (toto nastalo ovšem výjimečně). Některé práce se zabývaly více biomarkery a jsou proto počítány vícekrát. Přesto je z tabulek 2 a 3 vidět, že největší pozornost se soustřeďuje v písemnictví na NGAL, IL-18 a α-1- mikroglobulin. Recentní metaanalýza hodnotící roli NGAL pro diagnostiku a určení prognózy AKI shledala tento marker jako efektivní (Haase, 2009). Bylo by proto vhodné, aby se doporučení ČSKB zabývalo i významem tohoto perspektivního markeru. Závěr Sumárně lze uzavřít, že mezi nejvíce perspektivní a prakticky stanovitelné markery tubulární proteinurie u akutního poškození ledvin lze počítat 27
NGAL a α-1-mikroglobulin, které mohou měřit běžné klinické laboratoře. Pozornost si zaslouží i další markery, u kterých se sbírá datová základna v klinických studiích; z nich se jeví jako perspektivní IL-18. Mezi ukazateli v séru dominuje u akutního poškození ledvin tradičně kreatinin, ale významnou roli hraje opět stanovení NGAL a cystatinu C v plazmě (séru). Literatura 1. Bennet, M., Dent., C. L., Ma, Q. et al.: Urine NGAL predicts severity of acute kidney injury after cardiac surgery: A prospective study. Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 3, 2008, s. 665 673. 2. Bonventre, J. V.: Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1): a specific and sensitive biomarker of kidney injury. Scand. J. Clin. Lab. Invest., Suppl. 2008, 241, s. 78-83. 3. Chaturvedi, S., Farmer, T., Kapke, G. F.: Assay validation for KIM-1: human urinary renal dysfunction biomarker. Int. J. Biol. Sci., 5, 2009, č. 2, s. 128-134. 4. Haase, M., Bellomo, R., Devarajan, P. et al.: Accuracy of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in diagnosis and prognosis in acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis. Am. J. Kidney Dis., 54, 2009, č. 6, s, 1012-1024. 5. Heise, D., Rentsch, K., Braeuer, A. et al.: Comparison of urinary neutrophil glucosaminidase-associated lipocalin, cystatin C, and alfpha-1-microglobulin for early detection of acute renal injury after cardiac surgery. Eur. J. Cardiothorac. Surg., 2010 (article in press). 6. Tuladhar, S. M., Püntmann, V. O., Soni, M. et al.: Rapid detection of acute kidney injury by plasma and urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin after cardiopulmonary bypass. J. Cardiovasc. Pharmacol., 53 (3): 261-6 7. Nickolas TL, O'Rourke MJ, Yang J, et al. Sensitivity and specificity of a single emergency department measurement of urinary neutrophil gelatinaseassociated lipocalin for diagnosing acute kidney injury. Ann. Intern. Med. 2008;148:810-9. 8. Parikh, C. R., Lu, J. C., Coca, S. G., Devarajan, P.: Tubular proteinuria in acute kidney injury: a critical evaluation of current status and future promise. Ann. Clin. Biochem., 47, 2010, č. 4, s. 301-312. 9. Pelsers, M. M.: Fatty acid-binding protein as marker for renal injury. Scand. J. Clin. Lab. Invest., Suppl. 2008, 241, s. 73-77. 10. van Timmeren, M. M., Vaidya, V. S., van Ree, R. M. et al.: High urinary excretion of kidney injury molecule-1 is an independent predictor of graft loss in renal transplant recipients. Transplantation, 84, 2007, č. 12, s. 1625-1630. 28