UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE C-REAKTIVNÍ PROTEIN U AKUTNÍHO KORONÁRNÍHO SYNDROMU DIPLOMOVÁ PRÁCE

2004 UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE C-REAKTIVNÍ PROTEIN U AKUTNÍHO KORONÁRNÍHO SYNDROMU DIPLOMOVÁ PRÁCE AUTOR: MICHAELA FILIPI VEDOUCÍ PRÁCE: prof.ing. Karel Vytřas, DrCs. vedoucí analytické katedry KONZULTANT: MUDr. Petr Vojtíšek, CSc. primář kardiologického oddělení 1

2004 UNIVERSITY PARDUBICE FACULTY OF CHEMICAL TECHNOLOGY DEPARTMENT OF ANYLYTICS CHEMISTRY C-REACTIVE PROTEIN IN AN ACUTE CORONARY SYNDROME THESIS AUTOR: MICHAELA FILIPI SUPERVISOR: prof.ing. Karel Vytřas, DrSc vedoucí analytické katedry KONZULTANT: MUDr. Petr Vojtíšek, CSc, schef of kardiology department 2

Prohlašuji: Tuto práci jsem vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000Sb., autorský zákon, zejména se skutečností, že Univerzita Pardubice má právo na uzavření licenční smlouvy o užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona, a s tím, že pokud dojde k užití této práce mnou nebo bude poskytnuta licence o užití jinému subjektu, je Univerzita Pardubice oprávněna ode mne požadovat přiměřený příspěvek na úhradu nákladů, které na vytvoření díla vynaložila, a to podle okolností až co jejich skutečné výše. Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v Univerzitní knihovně Univerzita Pardubice. V Pardubicích dne Michaela Filipi 3

Nejprve bych chtěla poděkovat MUDr. Petru Vojtíškovi, CSc.primáři kardiologického oddělení za zadání zajímavého tématu a za odborné vedení. Prof.Ing. Karlu Vytřasovi, DrSc., prof. RNDr. Milanu Melounovi, DrSc. též za odborné vedení a za poskytnutí cenných rad a pomoci při vypracování mé diplomové práce a PharmDr. Jiřímu Skalickému, primáři biochemického oddělení a celému týmu za analýzu odebíraných vzorků. Mé poděkování patří přátelům a kolegům na katedře analytické chemie. V neposlední řadě děkuji své mamce, prarodičům, přátelům a Mgr. Petru Havlovi za podporu po dobu celého studia. Svou práci bych chtěla věnovat Ing. Jaroslavě Filipi.. 4

Souhrn C-reaktivní protein je dominující reaktant akutní fáze. Za normálních okolností je stopovou složkou plazmy, za patologických stavů se však jeho koncentrace může zvýšit na tisíckrát vyšší hodnotu. Klinická využitelnost C- reaktivního proteinu spočívá ve zjištění zánětu a tkáňového poškození v případech, kdy ještě jiné klinické parametry nejsou prokazatelné. Řadí se mezi tzv. proteiny s rychlou odpovědí. Tento protein má velký význam při procesu diferenciálně diagnostickém, především při monitorování bakteriálních infekcí, rozlišování mezi bakteriálními a virovými infekcemi, pooperačních komplikacích, při monitorování průběhu vaskulicity, zhoubných onemocněních, revmatických onemocněních a ostatních patologických stavů. Při lokálním nebo systémovém zánětu dochází v různé míře k reverzibilnímu poškození buněk, k jejich metabolické aktivaci, zvýšené mitotické aktivitě a k infiltraci buněk do krve. Z buněk dochází k uvolňování a k aktivní produkci řady mediátorů a signálních metabolitů s místním nebo systémovým účinkem na jednotlivé tkáně a orgány. Zvýšený metabolický obrat buněk mohou vyvolávat zánětlivé noxy. Např. při traumatickém poškození tkáně, při ischémii, chirurgickém zákroku. V takových situacích dochází v játrech k rychlým změnám v syntéze řady plazmatických bílkovin, které označuje souhrnným názvem proteiny akutní fáze. CRP je dominujícím proteinem akutní fáze s rychlou dopovědí na onemocnění, které signalizuje svou zvýšenou koncentrací. Zánět v cévní stěně je prvním projevem začínající aterosklerózy, ale také rozpadu nebo poruchy aterosklerotického plátu a jeho případného prasknutí. Mimoto řada studií ukazuje, že na základě různých známek systémového zánětu je možné předvídat, zda u pacienta v budoucnu dojde k cévní příhodě nefatálnímu nebo fatálnímu infarktu, progresi uzávěrové 5

choroby periferních tepen aniž bychom věděli o tom, zda pacient má nebo nemá aterosklerózu. Jako rizikový faktor ICHS byl nejčastěji sledován fibrinogen. Při hodnocení výsledků studie ECAT (European Concerted Action on Thrombosis) byla před téměř deseti lety po prvé popsána souvislost C-reaktivního proteinu s kardiovaskulárními příhodami. 6

Summary The C-reactive protein is the main reactant of the acute phassse. In normal conditions it si a trace aomponent of plasma, in pathological condition the level of C-reactive protein can rise. In clinical use the C-reactive rpotein is too detect in flammation and tissue damage while other clinical parametres are not evident. The C-reactive protein is clessified as s protein with fast response. This protein is very omportant in differencial diagnostic process, especially during motioring bacterial infections, distinguishing between bacterial and viral infections, in after surgery complications, during monitoring vasculity sourse, in pernicious diseases, rheumatism and other patolodical contions. During locatized or systém inflammation the cells are to an exent reversibly damged, their metabolism si activated, miotic activity is enhanced and cells infiltrate into blood. These cell srelease and actively produce series of transmitters and signal metabolites, which locally or systematically effect specific tissues or organs. Increased metabolic activity of the cells can be caused by inflammatory noxy, e.g. during traumatic injury of the tissue, ischemie disease or during surgery. On such situation plasmatic proteins in liver undergoes fast changes in synthesis and these proteins are generally called proteins of hte accute phase. C-reactive protein is the dominant protein ofacute phase with a fast resppoonse to an illnes and it s indicated by its higher concentration. 7

Zkratky ACD pravé koronární tepny ACS kmene levé věnčité tepny AIM akutního infarktu myokardu AKS akutních koronárních syndromů AST aspartataminotransferasy CK kreatinkinasy CK-MB kreatinkinasy CRP C-reaktivní proetin FW sedimentace erytrocytů ICHS ischenická choroba srdeční LD1/LD2 laktátdehydrogenáza IL-6 interleukin 6 IL-1 interleukin 1 IM infakrt myokardu RIA ramus intervetricularis anterior RC ramus circumflexus RD ramus diagonalis RIP ramus interventricularis posterior RMS ramus marginallis sinister RPLS, RPLD ramus posterolaterallis sinister nebo dexter SSA amyloid A WBC leukocyty 9

Obsah Obsah... 10 2. Úvod... 12 2. Literární část... 13 2.1. Patofyziologie C-reaktivního proteinu... 13 2.2. C-reaktivní protein-reaktant akutní fáze... 14 2.2. Vztah CRP ke kardiovaskulárnímu riziku... 16 2.3.1 Historie diagnostiky akutního infarktu myokardu... 16 2.3.2 Příklady klinického využití proteinů akutní fáze... 17 2.3.3 CRP- nejhodnotnější protein akutní fáze... 18 2.4. CRP proti dalším ukazatelé zánětu 40... 18 2.4.1 CRP proti sedimentaci erythrocytů (FW)... 18 2.4.2 CRP proti počtu leukocytů (WBC)... 19 2.4.3 CRP ve srovnání s jinými proteiny akutní fáze (SAA, IL-6, prokalcitonin)... 19 2.4.4 Homocystein, C-reaktivní protein a statiny... 20 2.5 hscrp a jeho vztah k inzulinu... 21 2.6. Ateroskleróza:... 22 2.6.1 Nové pohledy na C-reaktivní protein... 22 2.6.2 Evoluční vysvětlení... 22 2.7. Ischemická choroba srdeční... 24 2.7.1 Ischemická choroba srdeční (ICHS)... 24 Nejznámější formy ICHS... 24 2.8. Infarkt myokardu... 26 2.8.1 Definice:... 26 2.8.2 Názvosloví infarktu myokardu... 27 2.8.3 Etiologie, patofyziologie a patologie infarktu myokardu... 27 2.8.4 Klinický obraz a diagnostika infarktu myokardu... 28 3. Teoretická část... 29 10

3.1 Princip turbidimetrie... 29 3.2 Měření:... 30 3.2.1 Požadavky na sraženinu:... 30 4. Instrumentace... 31 4.1 Vysoce citlivý tlakový senzor... 31 4.2 INTEGRA reagenční kazety... 31 4.3. Software... 32 4.4. Průběžný přístup ke vzorkům... 32 4.5. Pracovní proces... 32 5. Metody analýzy CRP hscrp... 34 5.1 Denní monitorování koncentrace CRP... 34 5.2 Požadavky na CRP testy pro monitorování stavu onemocnění... 34 5.3 Metoda a činidla... 35 5.4. Provedení testu:... 35 5.5. Kalibrace:... 35 6. Výsledky a diskuse... 37 6.2. Pacienti s akutním infarktem myokardu... 38 6.2. Pacienti s nestabilní anginou pectoris (event. NSTEMI)... 43 6.3. Porovnání... 48 6.4. Pacienti s neprokázaným akutním koronárním syndromem... 52 7. Závěr... 54 9. Seznam literatury... 56 10. Příloha... 61 11

2. Úvod Tato diplomová práce je součástí studie, která probíhá na kardiologickém oddělení interní kliniky Krajské nemocnice Pardubice, na oddělení pro akutní koronární syndromy. Cílem této diplomové práce bylo sledovat dynamiku C-reaktivního proteinu u nemocnýcných přijatých na kardiologické oddělení interní kliniky Krajské nemocnice Pardubice, na oddělení pro akutní koronární syndromy a korelovat dynamiku C-reaktivního proteinu s klinickými a koronarografickými nálezy u nemocných s akutním koronárním syndromem. Získaná data zpracovat a korelovat je s klinickým průběhem onemocnění a odhadnout význam dynamiky C-reaktivního proteinu pro diagnózu a léčbu nemocných s akutním koronárním syndromem. 12

2. Literární část 2.1. Patofyziologie C-reaktivního proteinu CRP byl objeven v roce 1930 Tilletem a Francisem, kteří zjistili, že séra některých akutně nemocných osob precipitují kapsulární C polysacharid bakterie Streptococcus pneumonie. Sérový faktor způsobující precipitaci byl později identifikován jako protein a označen jako CRP. CRP je součást nespecifického imunitního obranného mechanizmu, který je schopný vázat pneumokokový kapsulární C-polysacharid, fosfocholinové skupiny membránových zbytků, stejně jako chromatin v přítomnosti Ca 2+ iontů. Je schopný aktivovat klasickou cestu komplementu a má funkci jako opsonin v leukocytové fagocytóze, stimulaci lymfocytů nebo aktivaci monocytů/makrofágů. CRP byl detekován v arterosklerotických plátech, vázáný převážně k částečně degradovanému LDL. CRP je cyklický pentamer o molekulové hmotnosti 100-115 tisíc daltonů. Jde o bílkovinu s elektroforetickou pohyblivostí v beta globulinové frakci nebo gama globulinové frakci. 32 CRP patří do skupiny pentraxinů, jejichž jméno vypovídá o struktuře. CRP se skládá z pěti nebo šesti identických nekovalentně spojených podjednotek o molekulové hmotnosti 24 000 daltonů. Každá z těchto identických složek obsahuje 206 aminokyselin. Bylo zjištěno, že proteinový řetězec CRP obsahuje tetrapeptidové sekvence, které jsou podobné sekvenci aminokyselin imunomodulačního peptidu zvaného tufsin (threonin, lysin, prolin, agrinin). 6 CPR patří do skupiny proteinů akutní fáze, je syntetizován v játrech a epiteliálních buňkách za stimulace zánětlivých lymfokinů (interleukin-6, interleukin-1, tumorového nekrotizujícího faktoru) (tab.1).není ale zcela jasné, zda zvýšení koncentrace u nemocných arterosklerózou je dáno zvýšenou 13

produkcí IL6 v makrofázích či proinflamačním působením tuku. Sekvence genů lidského CRP byla klonována v roce 1985. 2.2. C-reaktivní protein-reaktant akutní fáze CRP je dominující reaktant akutní fáze. Za normálních okolností je stopovou složkou plazmy, za patologických stavů se však jeho koncentrace může zvýšit na tisíckrát vyšší hodnotu. 42 Při lokálním nebo systémovém zánětu dochází v různé míře k vratnému poškození buněk, k jejich metabolické aktivaci, zvýšené mitotické aktivitě a k infiltraci buněk do krve. Z buněk dochází k uvolňování a k aktivní produkci řady mediátorů a signálních metabolitů s místním nebo systémovým účinkem na jednotlivé tkáně a orgány. Během zánětlivého procesu při bakteriální infekci, ve spojitosti s poškozením tkání a po operaci, koncentrace CRP znatelně stoupají. Zvýšené koncentrace CRP jsou detekovány během 6 12 hodin po začátku zánětlivého procesu. CRP není jen markérem těžkých infekcí a traumat, ale je také prediktivním ukazatelem rizika rozvoje kardiovaskulární choroby. Již minimálně zvýšené hodnoty CRP (2 3 mg/l) zdvojnásobují riziko proti hodnotám kolem 1 mg/l. Protože koncentrace CRP klesají rychle, přibližně o 50 % za den, je CRP užitečný při monitorování účinnosti antibiotické léčby. Poklesu koncentrací CRP indikuje, že léčba je úspěšná. Nejvyšších hodnot dosahuje CRP u bakteriálních onemocnění, zatímco u nádorových onemocnění nebývá tak zvýšen jako haptoglobin nebo alfa-1- antitrypsin. Jeho nárůst po navození reakce akutní fáze (infekce, chirurgický výkon, IM) je velmi rychlý 24 až 48 hod., normalizace nastává během 4 dnů, nejsou-li přidruženy komplikace. Je možno odlišit virovou pneumonii (CRP negativní) od bakteriální (CRP zvýšené). Značně zvýšené koncentrace CRP (>100 mg/l) ukazují na těžkou bakteriální infekci. Koncentrace CRP nekorelují s rozsahem tvorby arterosklerotických plátů, které u lidí začínají vznikat již v době dospívání. Nepotvrdily se ani představy o etiologické úloze některých bakterií (zejména Chlamyda 14

pneumonie a Heticobacter pylori) při vzniku ICHS, tj. o bezprostředním významu specifického akutního zánětu. CRP ukazuje celkový stav zánětlivých procesů v lidském organizmu. Uvažuje se proto o možné úloze běžných infekčních procesů (např. chronické bronchitidy, gingivitidy nebo prostatitidy) při vzniku kardiovaskulárních onemocnění. 49 Bylo zjištěno, že CRP je výborným predikčním ukazatelem, lepším než jiné markery zánětu, protože žádná jiná molekula není tak stabilní jako CRP a nemá tak široké rozmezí hodnot (u kterých je snadné odlišit normální od mírně a vysoce rizikových). Zvýšená koncentrace CRP je spolehlivým ukazatelem, který signalizuje zvýšené riziko i u pacientů s první srdeční nebo mozkovou cévní příhodou, kteří mají jen nízkou koncentraci cholesterolu v plazmě. V sérii prací z Harvardské univerzity bylo jasně dokumentováno, že hladina CRP vystihuje míru budoucího rizika, a že je spolehlivějším ukazatelem než koncentrace cholesterolu a že oba faktory, CRP a cholesterol, jsou na sobě nezávislé. Riziko pro pacienty představuje buď zvýšená koncentrace cholesterolu, nebo zvýšená koncentrace CRP. Vůbec nejohroženější jsou jedinci se zvýšenou plazmatickou koncentrací obou faktorů současně. Zůstává nejasné, jak CRP ovlivňuje vznik srdečních a dalších cévních příhod. Diskuse o tom, zda je zánět primární příčinou aterosklerózy nebo sekundárním důsledkem depozice lipidů do cévní stěny, pokračuje. 23 Infekce, trauma, nádorová a imunologicky podmíněná onemocnění způsobují poškození tkáně s následnou komplexní nespecifickou reakcí organismu, kterou označujeme jako reakci akutní fáze. Celková zánětlivá reakce je doprovázena horečkou, leukocytózou a zvýšenou sedimentací erytrocytů. Účelem reakce akutní fáze je usmrtit nebo zapouzdřit infekční podměty, odbourat poškozenou tkáň a reparovat funkci poškozených orgánů. Reakce se projevuje rychlými změnami koncentrace plazmatických bílkovin proteinů akutní fáze. Proteiny akutní fáze, u kterých se při chorobných procesech jejich syntéza v hepatocytech a tím i koncentrace v krvi zvyšuje, jsou označovány jako pozitivní. Za negativní jsou označovány proteiny akutní fáze, u kterých se za týchž stavů jejich syntéza a koncentrace v krvi snižuje. 15

Mezi proteiny akutní fáze se řadí ty, jejichž plazmatická koncentrace se v průběhu zánětu zvýší nebo sníží nejméně o 25 procent. CRP je užitečný např. v: - odlišení bakteriálních a virových infekcí - monitorování průběhu nemoci - monitorování a kontrola pooperačních stavů - sledování účinnosti antimikrobiální léčby - předpověď budoucích kardiovaskulárních chorob 2.2. Vztah CRP ke kardiovaskulárnímu riziku 2.3.1 Historie diagnostiky akutního infarktu myokardu Klinická biochemie hraje důležitou roli nejen v průkazu a monitorování rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění, ale i v diagnostice poškození myokardu v monitorování terapie AKS. Počátek enzymologie AIM je v roce 1955, kdy Karmen nalezl zvýšenou aktivitu AST v séru nemocných AIM. V roce 1956 pak byla popsána zvýšená aktivita dehydrogenasy kyseliny mléčné (LD) a v roce 1960 CK v séru nemocných AIM. Od roku 1963 Markert razil termín izoenzymy pro enzymy lišící se fyzikálními vlastnostmi, ale katalyzující stejný typ reakce, na základě elektroforetického rozlišení pěti forem sérové LD. V diagnostice AIM se využíval především poměr LD-1/LD- 2. Asi o deset let později zdůraznil Wagner význam stanovení srdečního izoenzymu CK-MB pro diagnostiku AIM. Do klinické praxe bylo zavedeno stanovení CK a CK-MB v sedmdesátých letech. 2 Od poloviny devadesátých let jsou tyto enzymatické markery nahrazovány proteiny. Jsou to C-reaktivní proteiny, myoglobin, ale především srdeční troponiny T a I (ctn). 2 16

2.3.2 Příklady klinického využití proteinů akutní fáze Kardiovaskulární choroby jsou stále nejčastější příčinou smrti a jakákoli možnost, jak zlepšit léčbu nebo jak racionálněji využít stávají prostředky farmakoterapie, by byla nesmírně cenná (tab 2). V předchozích studiích bylo zjištěno, že zvýšená koncentrace CRP (svědčící pro zánět v cévách nebo jinde v organismu) zvyšuje až 3x riziko koronární příhody a až 2x riziko ischemické mozkové příhody. Vysoká hladina CRP u osob postižených infarktem signalizuje (i po odhlédnutí od ostatních rizikových faktorů) nepříznivou prognózu: nemocných, kteří zemřeli brzy na městnavé srdeční selhání, měli nejvyšší koncentrace CRP. Dnes umožňuje stupeň zvýšení CRP stanovit nejen riziko infarktu u jednotlivých nemocných, ale i riziko dětí a příbuzných prvního stupně jedinců s IM. Přestože byl CPR objeven jako první, zůstává z proteinů akutní fáze nejvýznamnější. Jeho hodnoty u zdravých jedinců nepřesahují 2 mg/l, ale ani hodnoty do 10 mg/l (pozorované při místních zánětech a malých traumatech) nebyly dlouho považovány za klinicky významné. Hodnoty vyšší než 100 mg/l provázejí v 80-85 % bakteriální infekce. Sledování změn v koncentracích proteinů akutní fáze u nemocných, přestože chybí diagnostická specifičnost, má velký význam v prokazování zánětlivého onemocnění a jeho intenzitě. V některých případech má i význam při určení prognózy. 28 Zvýšení CRP se tak stalo spolu se zvýšenou hladinou cholesterolem, patogeneticky významnými lipidy a hyperaktivací imunity (určovanou obvykle aktivací komplementu) základním ukazatelem stupně arteriosklerózy a rizik jejích komplikací. CRP proto podle mnohých autorů představuje i nadějný terč preventivních a léčebných zásahů. K hlavním z nich patří aspirin, statiny a preparáty systémové enzymoterapie. 17

2.3.3 CRP- nejhodnotnější protein akutní fáze V současnosti je CRP nejznámější a diagnosticky nejhodnotnější ze skupiny proteinů akutní fáze, do které patří i další proteiny jako je sérum amyloid A (SAA), fibrinogen, prokalcitonin, haptoglobin, alfa-2-haptoglobin, alfa-1-kyselý glykoprotein, ceruloplazmin, alfa1-antitrypsin a albumin. Nedostatek haptoglobinu, alfa-2-haptoglobinu, alfa-1-kyselého glykoproteinu, ceruloplazminu, alfa-1-antitrypsinu a albuminu způsobuje, že rozdíly mezi normálními a patologickými hodnotami jsou velmi malé. Patologické hodnoty dosahují pouze několikanásobku normálních hodnot a jsou ovlivněny i jinými (např. nutričními) faktory. Koncentrace CRP v séru reflektuje stupeň syntézy tohoto proteinu v játrech. Hepatocytární CRP syntéza je spouštěna aktivací monocytů/makrofágů. Zvýšení koncentrace IL-6 v séru je jeden z nejrychlejších markerů zánětlivého procesu a je detegovatelný po 2-3 hodinách od začátku infekce. Problém je v tom, že koncentrace IL-6 klesá velmi rychle, často příliš rychle na to, aby mohla být detekována. Zvýšení koncentrace CRP je detekovatelné běžně o 4-7 hodin později, v závislosti na citlivosti metody měření. CRP stoupá i klesá rychle podle míry zánětu, což jej činí vhodným pro detekci zánětlivého procesu. 2.4. CRP proti dalším ukazatelé zánětu 40 2.4.1 CRP proti sedimentaci erythrocytů (FW) Zvýšená sedimentace erytrocytů je nespecifický zánětlivý maker, který byl objeven mnohem dříve než CRP a ještě se stále používá jako indikátor systémových chronických onemocnění nebo malignit. FW je primárně založena na změnách agregace buněk červených krvinek. a závisí na koncentraci pozitivně nabitých sérových proteinů jako je fibrinogen nebo 18

imunoglobuliny za zvýšení koncentrací neutralizujících čistý negativní náboj (zeta potenciál) červených krvinek. Při srovnání s FW je CRP mnohem citlivější marker pro diagnózu infekční endokarditidy, zvláště v raných fázích (>12 hodin) onemocnění. Při eliminaci patogenů se CRP normalizuje rychleji než FW. Sériové stanovování CRP je efektivnější cesta ke sledování stavu pacienta, jestliže se během léčby objevily komplikace a také ke zjišťování inter individuálních odlišností v normálních hodnotách CRP. To by mělo být bráno v úvahu zejména v nejistých případech a u předčasně narozených kojenců, u kterých zvýšené hodnoty CRP při septikémii nemusí být tak vysoké jako u dospělých. Naměřené výsledky by měly být zhodnoceny podle referenčních hodnot příslušejících k dané skupině. CRP test může a měl by nahradit FW testování u mnoha diagnóz, protože CRP reflektuje změny v zánětlivé aktivitě rychleji a vzhledem k mezinárodně standardizovaným imunometrickým metodám jsou i výsledky spolehlivější. 2.4.2 CRP proti počtu leukocytů (WBC) CRP dává přesnější informaci pro diferenciaci mezi bakteriální a virovou infekcí než sledování počtu bílých krvinek (WBC). WBC hodnoty nejsou dostatečně konsistentní, aby je bylo možno využít pro sledování účinku antimikrobiální léčby u bakteriálních infekcí. Navíc CRP lze použít k detekci akutní infekce a k monitorování antimikrobiální léčby u neutropenických a imunosupresivních pacientů. 2.4.3 CRP ve srovnání s jinými proteiny akutní fáze (SAA, IL-6, prokalcitonin) Reakce akutní fáze je společné označení pro změny v profilu sérových proteinů a buněčné imunitní odpovědi, zahrnující symptomy jako je horečka, zánět nebo trauma. Sérové proteiny, jejichž koncentrace se během 19

zánětu zvyšuje nebo snižuje, jsou nazývány pozitivní nebo negativní proteiny akutní fáze. Patologické hodnoty jsou snadno detekovatelné. Ve srovnání s jinými proteiny akutní fáze má CRP velkou výhodu v tom, že patologické hodnoty jsou snadno detekovatelné, protože CRP koncentrace stoupají a mohou dosahovat stonásobku původních hodnot. Celé rozmezí pro CRP (mg/l) je detekovatelné biochemickými analyzátory, zatímco některé jiné proteiny jako je prokalcitonin (ng/ml) nebo IL-6 (pg/ml) vyžadují odlišnou instrumentaci. Pro stanování SAA je v současnosti nedostatek rutinních měření. Naopak CRP se stanovuje pomocí turbidimetrie nebo nefelometrie. Rozhodující pro spolehlivost měření je to, že CRP je standardizován podle mezinárodního standardu IFCC CRM 470. 2.4.4 Homocystein, C-reaktivní protein a statiny Zásady pro preventivní podávání statinů zdůrazňují z hlediska výběru vhodných pacientů hlavně riziko související se zvýšenou plazmatickou koncentraci LDL cholesterolu. Je ale řada klinických poznatků, které ukazují, že vznikem ischemické choroby srdeční jsou ohroženy i jiné skupiny pacientů, jejichž hladiny LDL jsou normální. Hledají se proto další markery, s jejichž pomocí by bylo možné rizikové pacienty identifikovat. Jedním z nich je C-reaktivní protein. Bylo zjištěno, že jedinci s koncentrací LDL cholesterolu pod 149 mg/dl a zvýšenou koncentrací CRP měli vyšší riziko vzniku ICHS. A současně, že léčba statiny vedla nejen ke snížení koncentrace CRP v plazmě, ale i ke snížení rizika vzniku ICHS. Z hlediska hledání možností lepší identifikace rizikových osob, u nichž je vhodné zahájit primární prevenci statiny, je takový poznatek negativní. Na druhé straně ale ukazuje, že mezi statiny a CRP musí být nějaké biologické interakce. S tím souhlasí i poznatky o protizánětlivém působení statinů a skutečnost, že léčba statiny ovlivňuje (snižuje) sérovou koncentraci CRP podstatně více než koncentraci homocysteinu. 20

Když pak byl sledován vliv denního preventivního užívání aspirinu, bylo zjištěno, že přínos aspirinu je největší u pacientů s nejvyššími výchozími hodnotami CRP. 13 2.5 hscrp a jeho vztah k inzulinu Některé studie také odhalily protizánětlivé efekty TZDS v různých tkáních. V lidském těle sérum vysoce citlivého CRP je považováno za odraz klinického zánětu v živém organismu a hscrp je jeden z významných ukazatelů pro kardiovaskulární události. Ebeling ukázal, že troglitazony se sráží sérem škrobového A proteinu a 1- kyselého glykoproteinu. Některé faktory spojené se snížením koncentrace hscrp séra nejsou správně prezentovány. 21

2.6. Ateroskleróza 2.6.1 Nové pohledy na C-reaktivní protein Ateroskleróza byla kdysi chápána jako mechanický proces prostého ukládání tuku do cévní stěny. Čím více cholesterolu v krvi, tím spíše hrozí uzávěry artérií, podobně jako je potrubí zanášeno rzí. A tím větší je také riziko, že dojde k infarktu myokardu nebo mozkové cévní příhodě. Chybělo ovšem vysvětlení skutečnosti, že řada lidí s rozsáhlou obstrukcí cév nikdy infarkt neměla, zatímco u jiných vznikl velký infarkt i při velmi malé ateroskleróze koronárních artérií. A z hlediska predikce také vysvětlení skutečnosti, že vysoká koncentrace cholesterolu v plazmě je zjišťována jen asi u poloviny lidí se srdeční příhodou, zatímco u druhé poloviny zůstává příčina nejasná. Soustavný výzkum CRP také zjistil, že koncentrace CRP v plazmě korelují i s jinými rizikovými stavy. Základní hodnoty CRP jsou těsně spojeny s hodnotami BMI. Jsou zvýšené při obezitě, ale také při diabetu typu 2, glukózové intoleranci a metabolickém syndromu X. Zvýšenou koncentraci CRP mají kuřáci a konzumenti alkoholu. U posledně uvedené skupiny koncentrace CRP koreluje s mírou kardiovaskulárního rizika (abstinenti a alkoholici mají riziko vysoké, mírní konzumenti nízké). Hormonální substituční léčba u postmenopauzálních žen zvyšuje plazmatickou koncentraci CRP, což by mohlo vysvětlit neočekávané zvýšení výskytu infarktů myokardu po zahájení HST. 2.6.2 Evoluční vysvětlení Vliv hladiny CRP na výskyt kardiovaskulárních chorob může být samozřejmě jenom hypotetický. Jedna taková hypotéza vychází z faktu, že v dávné minulosti většina lidí v raném věku umírala na infekce nebo úrazy. 22

Schopnost organismu vytvořit protizánětlivou reakci byla nutná pro přežití. Ale ve 20. století se život lidí podstatně prodloužil, a ateroskleróza se stala nežádoucím vedlejším produktem imunity. Otázka, zda je CRP pouze markerem zánětu nebo má vlastní patogenetickou úlohu, zůstává otevřená. Ale hromadící se nové poznatky svědčí spíše pro druhou možnost. CRP je přítomen v arterosklerotických lezích a bylo prokázáno, že působí jako chemoatraktant pro monocyty. Ovlivňuje expresi adhezních molekul, podílí se na aktivaci komplementového systému. Navíc CRP specificky váže částice LDL cholesterolu a zvyšuje jejich pohlcování makrofágy (z kterých pak vznikají pěnové buňky ). Když je krysám aplikován lidský CRP a pak je u nich vyvolán prudký srdeční záchvat, rozsah poškození myokardu je o 40% větší. Neudivuje proto, že již bylo zahájeno hledání molekul, které by inhibovaly schopnost vazby CRP na buňky, a farmakologický výzkum dalších možností protizánětlivé léčby v kardiologii. Prvním praktickým krokem je soustavné sledování CRP při vyhledávání pacientů s vysokým rizikem ICHS. Odhaduje se, že každý pátý Američan, který má normální hladinu lipidů v plazmě, má zvýšenou koncentraci CRP (a patří tedy mezi osoby se zvýšeným rizikem vzniku srdeční nebo mozkové cévní příhody). Americká kardiologická společnost a Centrum pro kontrolu a prevenci chorob již také v březnu 2002 v Atlantě uspořádaly konferenci, která jednala o směrnicích pro racionální využití CRP v lékařství. 23

2.7. Ischemická choroba srdeční 2.7.1 Ischemická choroba srdeční (ICHS) Je to porucha prokrvení srdce v důsledku zužování srdečních tepen, sem patří akutní (srdeční infarkt, nestabilní angina pectoris, náhlá smrt) a chronické formy (angina pectoris, srdeční selhávání, srdeční arytmie, němá ischémie aj.) Nejznámější formy ICHS Angina pectoris (AP) - jde o chronickou formu ICHS se stenokardiemi, svíravou či pálivou bolestí na hrudi, která někdy vyzařuje do levé ruky, do krku, dolní čelisti, do břicha, mezi lopatky nebo i do zátylku. či jen tlakem bez bolesti nebo pocitem nedostatku dechu. Projevy trvají několik málo minut a dobře zareagují na podání nitroglycerinu nebo nitrátů. Při delším trvání nebo pokud po nitroglycerinu nedojde k úlevě, je vždy na místě přivolat lékaře a přesvědčit se, zda nejde o infarkt myokardu. Při nejasnostech diagnózy je vhodné dále vyšetřit nemocného metodou zátěžové ergometrie, při níž šlape na kole (bicyklovém ergometru) a současně je snímáno EKG. Dostaví-li se v důsledku námahy bolest na hrudi, na EKG se objeví typické změny a diagnóza je potvrzena. Léčba anginy pectoris sleduje několik cílů: 1. zastavení či zpomalení postupu aterosklerózy ovlivněním rizikových faktorů, zásadní význam má úprava životosprávy - tj. vyloučení kouření, dietní opatření, adekvátní pohybová aktivita, omezení stresu; 2. zlepšení průtoku krve ischemickým srdcem - obnovením průtoku angioplastikou, bypassem, uvolněním svaloviny cév, zpomalením srdeční frekvence léky; 3. bránění uzávěru cévy trombem. 24

Nestabilní angina pectoris (NAP) - na rozdíl od stabilní (chronické) anginy pectoris, která je charakterizována jako typická bolest na hrudi vyvolaná často fyzickou námahou či psychickým stressem, je NAP epizodou ischemických bolestí trvajících několik hodin, dnů až týdnů s charakteristickým náhlým vznikem či náhlou změnou dosavadních záchvatů chronické anginy pectoris. Většinou je známkou pokročilejší formy ischemické srdeční nemoci a nesmíme ji podcenit, protože může znamenat první známky rozvoje akutního srdečního infarktu, ať již prvního či opakovaného. Současně je třeba vyloučit i jiné možné příčiny mimosrdeční, které by mohly původně stabilní stav zhoršit, jako je např. hypertenze či hypotenze, dysfunkce štítné žlázy, srdeční selhání či jiné postižení. 18 Zánět v cévní stěně je prvním projevem začínající aterosklerózy, ale také rozpadu nebo poruchy aterosklerotického plátu a jeho případného prasknutí. Mimoto řada studií ukazuje, že na základě různých známek systémového zánětu je možné předvídat, zda u pacienta v budoucnu dojde k cévní příhodě nefatálnímu nebo fatálnímu infarktu, progresi uzávěrové choroby periferních tepen aniž bychom věděli o tom, zda pacient má nebo nemá aterosklerózu. Jako rizikový faktor ICHS byl nejčastěji sledován fibrinogen. Při hodnocení výsledků studie ECAT (European Concerted Action on Thrombosis) byla před téměř deseti lety po prvé popsána souvislost C-reaktivního proteinu s kardiovaskulárními příhodami. Taková souvislost je od té doby nacházena pravidelně, ale její příčina (resp. odpověď na otázku, zda vůbec jde o příčinnou souvislost) není známa dosud. Jedním z problémů je, že CRP je nespecifickou odpovědí organizmu na nejrůznější podněty včetně poškození tkáně, kouření nebo infekce. Vzorky séra byly vyšetřovány na C reaktivní protein, albumin a některé další složky. Mimo to byl zjišťován počet leukocytů. Také tato nová studie zjistila, že osoby i s jen mírně zvýšenými hodnotami CRP měly 2x zvýšené riziko, že u nich někdy v budoucnu dojde ke kardiovaskulární příhodě. Naproti 25

tomu nebyla nalezena žádná souvislost kardiovaskulárních příhod s nálezy Helicobacter pylori nebo Chlamydia pneumonie. Žádný statisticky významný vztah C. pneumonie k ICHS nenašla ani prospektivní studie Wald a spol., kteří soubor mužů středního věku sledovali 15 let. Ale ačkoli otázka vztahu dosud studovaných infekcí k ateroskleróze a ICHS zůstává otevřená a bez praktického využití, poznatky o predikčním významu přítomnosti známek zánětu praktický význam mají. Ridker a spol. již v r. 1998 ukázali, že znalost hodnoty CRP je užitečným doplněním informace o rizikovosti pacienta ve vztahu k ICHS. 2.8. Infarkt myokardu 2.8.1 Definice: Podle patofyziologické definice je jako infarkt myokardu ( MI) označovány akutní ložisková ischemická nekróza srdečního svalu vzniklá na podkladě náhlého uzávěru či progresivního extrémního zúžení věnčité tepny zásobující příslušnou oblast. Ve více než 95% je příčinou koronární ateroskeróza s rupturou intimy a trombózou v místě plátu. V ojedinělých případech může mít jiný původ ( spasmy, arteritidy, embolie do věnčitých tepen aj.). Infarkt myokardu lze definovat na základě řady klinických elektrokardiografických, biochemických nebo patologických ukazatelů. Technologický pokrok v současné době umožňuje detekovat nekrózu srdečního svalu o hmotnosti menší než 1 g. Proto bylo nutné přehodnotit klinickou definici infarktu myokardu. (1) Pro diagnózu akutního nebo vyvíjecího se IM je nutná přítomnost alespoň jednoho z následujících kritérií. 26

2.8.2 Názvosloví infarktu myokardu Akutní infarkt s elevacemi ST ( transmurální ischémie, STEIM) Klinický obraz akutního infarktu v prvních hodinách od jeho začátku provázený elevacemi ST na EKG. Elevace ST odrážejí obvykle akutní úplný trombotický uzávěr věnčité tepny. Infarkt s elevacemi se bez léčby obvykle vyvine do Q- infarktu. Při velmi včasné úspěšné reperfuzi ( tj. do 2-4 hodin od začátku příznaků ) se může postup nekrózy zastavit na pouhém non-q-infarktu. Akutní infarkt s depresemi ST ( subendokardiální ischémie, NSTEIM) Klinický obraz stejný jako u předchozího typu, na EKG nejsou elevace úseků ST, nýbrž deprese ST. Hluboké deprese ST ( >= 2 mm ) odrážejí obvykle kritickou nestabilní stenózu věnčité tepny ( v hrudních svodech na EKG jsou typické pro kritickou stenózu kmene levé věnčité tepny). Proto hluboké deprese ST znamenají stejné ohrožení pacienty jako infarkt s elevacemi ST. Infarkt s depresemi ST se obvykle vyvine v non-q-infarkt, bez revaskularizace je však vždy vysoké riziko recidivy. 2.8.3 Etiologie, patofyziologie a patologie infarktu myokardu Příčinou infarktu myokardu je uzávěr koronární tepny. Angiografické studie provedené v prvních hodinách po vzniku IM prokazují ve více než 90% částečný nebo úplný trombotický uzávěr infarktové tepny, nasedající zpravidla na nestabilní aterosklerotický plát. Klinicky prokazatelný infarkt vzniká vždy uzávěrem některého z hlavních epikardiálních kmenů věnčitých tepen: nejčastěji ramus intervetricularis anterior (RIA), ramus circumflexus (RC) nebo pravé koronární tepny (ACD), vzácněji kmene levé věnčité tepny (ACS), ramus diagonalis (RD), ramus marginallis sinister (RMS), ramus 27

posterolaterallis sinister (RPLS) či dexter (RPLD), event. ramus interventricularis posterior (RIP). Jednotlivé větve koronárních tepen zásobují následující oblasti levé komory. 2.8.4 Klinický obraz a diagnostika infarktu myokardu Nejčastějším příznakem IM je retrosternální bolest, která zpravidla trvá déle než 20 minut( ne déle než 12 hodin). Může mít charakter tlaku, svírání nebo pálení. Lokalizace může být i atypická (v zádech, mezi lopatkami, v eppigastriu, v krku, v dolní čelisti, v levé horní končetině, ). Bolest v typickém případě vyzařuje z přední strany hrudníku do některé z výše uvedených lokalizací. Přibližně u poloviny nemocných jsou přítomny též doprovodné příznaky ( dušnost, nauzea až zvracení, pocení, palpitace, strach, slabost až mdloby). Fyzikální nalez je při infarktu normální, patologické odchylky vznikají jen při komplikacích. Klíčový příznak bolesti se nevyskytuje u všech nemocných 42 CRP stoupá při akutním infarktu myokardu a v případech bez trombolytické léčby koreluje s velikostí infarktu. CRP je nižší u infarktu s průchodnou věnčitou tepnou než u infarktu s plně neprůchodnou věnčitou tepnou. Koncentrace sérového CRP u extenzivního infarktu dosahují v průměru 160mg/l, u limitovaného infarktu 40mg/l. CRP je také nezávislý ukazatel přežití po ischemické mrtvici. U pacientů s hodnotami CRP, které překračují 10mg/l je přežití horší než u pacientů s CRP <10mg/l. Nedávno bylo nalezeno, že slabé zvýšení sérového CRP předpovídá artherosklerotické onemocnění. 28

3. Teoretická část 3.1 Princip turbidimetrie Turbidimetrie je metoda, která porovnává intenzitu rozptýleného (pohlceného analyzovaným prostředím) záření s intenzitou světelného zářením zákalu látky (standardu).turbidita=zákal. Je detegován světelný tok, který prochází prostředím ve směru dopadajícího záření. Při průchodu světla roztokem dochází k jeho rozptylu na sražených částicích. Je-li definována intenzita dopadajícího záření Φ 0, lze příčně na tento tepelný tok-v kolmém a nekolmém směru-pozorovat rozptýlené záření o intenzitě Φ r.pokud jsou částice, na kterých dochází k rozptylu, dostatečně malé v porovnání s vlnovou délkou λ dopadajícího záření, pak se každá jednotlivá částice vlivem osvitu stává miniaturním oscilátorem. Jeho kmitání vyvolává záření Φ n. Většina částic světlo rozptýlí, v tomto případě se ale jedná o odraz dopadajícího záření částice samostatně nekmitají. Na povrchu molekuly dochází k rozptylu světla ve všech směrech. Výsledný tok rozptýleného světla Φ = n i= 1 Φ Φ r je dán součtem dílčích intenzit Do bilance musíme zahrnout pohlcení světla Celková bilance: Φ R = Φ r n Φ a Φ a : Φ 1 φ m Raleighův zákon: udává vztah mezi intenzitou dopadajícího světla a jeho rozptylem v závislosti na charakteru v roztoku a úhlem pozorování. Φ R 2 n2 N V = Φ 0 cos 2 2 4 2 n1 n2 λ L 2 ( 1 + β ) a množství přítomných částic 29

n 1 a n 2 : indexy lomu částic a prostředí N: celkové množství částic V: objem jedné částice λ : vlnová délka dopadajícího záření φ 0 L: vzdálenost pozorovatele β : úhel mezi paprsky dopadajícího a rozptýleného záření 3.2 Měření Světelný tok ze zdroje prochází zakaleným prostředím, zde dochází k interakci s částicemi. Míra interakce je závislá na velikosti a počtu rozptýlených částic, to se projeví úbytkem intenzity vystupujícího záření. Koncentrace se potom zjistí z kalibrační křivky nebo přímou úměrou. 3.2.1 Požadavky na sraženinu: a) Musí být chemicky stabilní, minimálně rozpustná a neměla by sedimentovat. b) Měla by být v podobě homogenní suspenze. c) Měla by obsahovat větší částice. 30

4. Instrumentace COBAS INTEGRA 400 Je určený na provádění biochemických analýz a zvýšení efektivnosti páce. Systémy COBAS INTEGRA rozšiřuje možnosti metod a inovované kazety INTEGRA kombinují čtyři vylepšené měřící principy s důmyslným, lehko použivatelným, softvérém. 4.1 Vysoce citlivý tlakový senzor Vysoce citlivý tlakový senzor vnímá nesprávné pipetovaní už při objemu 2 µl. Pipetovaní sražených vzorků je okamžitě hlášeno a označeno. Tlaky systémového promývaní jsou optimalizované tak, aby se úplně odstranila sraženina ze sérového pipetíku bez zásahu obsluhy a byl přerušen pracovní procesu. 4.2 INTEGRA reagenční kazety Patentovaná konstrukce kazet a chlazení zabraňuje vypařovaní a rozkladu činidel a zabezpečuje jejich dlouhodobou stabilitu a dlouhé kalibrační intervaly. Každá kazeta obsahuje všechny potřebné činidla až pro 800 analýz, čím se snižuje frekvence jejich doplňování a maximalizuje se kapacita testování. Systém automaticky pracuje s kazetami označenými čárovým kódem a snižuje tak možnosti chyb a šetří čas. Kombinace vysoké kvality s patentovanou konstrukcí kazet, garantuje jejich vysokou výtěžnost a současně s dlouhými kalibračními intervaly jsou menší ztráty. Kompaktní kazety s různobarevnou skupinovou identifikací analytů ulehčují orientaci. 31

4.3. Software Zařízení na COBAS INTEGRA 400 automaticky programuje analýzu každého vzorku, minimalizuje čas trvání analýzy, zvyšuje výkon, a současně dovoluje okamžitý přístup pro urgentní STAT analýzy 24 hodin denně. Program kontroly kvality monitoruje přesnost a správnost, zabezpečuje tím spolehlivost výsledků.validované výsledky jsou průběžně přenášeny do LIS čím je zaručená jejich rychlá dostupnost. Software automaticky registruje potřebu servisu a usměrňuje uživatele, když se má udělat údržba. Tyto aktivity jsou elektronicky evidované ve shodě s požadavky dobré laboratorní praxe a akreditace. 4.4. Průběžný přístup ke vzorkům Vzorkové stojánky umožňují kontinuální přístup. Jakmile jsou analýzy kompletní, mohou se doplnit stojany s novými vzory. Až 90 vzorků s čárovými kódy v šesti stojanech s 15 pozicemi může byť současně v analyzátoru. 4.5. Pracovní proces Na více jak 140 aplikací pro všechny typy vzorkových matrixů je možné použit jednu ze čtyřech měřících technologií absorbční fotometrickou turbidimetrii, fluorescenční polarizaci a ion-selektivní potenciometrií. COBAS INTEGRA 400 plus může obsahovat činidla až pro 36 různých analytů. V průběhu analýzy je možné přidat kazety pro jiné analýzy. Schopnost analyzátoru ukládat kalibrační parametry použité kazety poskytuje pro uživatele plnou flexibilitu Přístroj umožňuje analyzovat vzorky z klinické medicíny, specifické proteiny, monitorování hladiny léčiv (TDM) a testovaní drog (DAT). Možnost skladovaní 32 kazet při 12 C přímo v analyzátoru zabezpečuje stabilitu činidel až do 3 měsíců. 32

Analýzy odebraných vzorků krve byly provedeny popsanou metodou na oddělení klinické biochemie Krajské nemocnice Pardubice týmem pracovníků biochemického oddělení pod vedením PharmDr. Jiřím Skalickým, primářem biochemického oddělení. 33

5. Metody analýzy CRP hscrp 5.1 Denní monitorování koncentrace CRP Sérové stanovování CRP je nejužitečnější způsob, jak monitorovat pacienty, zda nedochází ke komplikacím při antimikrobiální terapii bakteriálních infekcí. Množství CRP v krevním řečišti odpovídá hladinám cirkulujících zánětlivých lymfokinů trvající několik hodin. Sekrece lymfokinů aktivovanými leukocyty klesá brzy poté, co došlo k eliminaci patogenů a situace se normalizuje. Jestliže léčba není úspěšná, hodnoty CRP zůstávají vysoké po dobu několika dní nebo dokonce stoupají, pokud se stav pacienta zhoršuje. 5.2 Požadavky na CRP testy pro monitorování stavu onemocnění Měření koncentrace CRP v séru se provádí kvantitativně Ke stanovení CRP s vysokou senzitivitou lze také použít latexovou imunoturbidimetrickou analýzu s použitím COBAS INTEGRA 400. Vyšetření je vhodné provádět u více proteinů akutní fáze, hodnotiti jejich vzájemné vztahy a srovnávat jejich hodnotu s hodnotou vnitřního standardu. Vztahy proteinů akutní fáze byly hodnoceny matematicko statistickými postupy. Ingenbleek a spol. navrhli tzv. PINI index. S CRP PINI S albu min ( MG / L) xs orosomukoid ( mg / l) ( g / l) xs stransthyretin( mg / l) 34

5.3 Metoda a činidla Metoda: imunoturbidimetrie při 520 nm, dvou činidlová startovaná protilátkou. Složení činidel: R1: Polyklonální protilátka stabilizovaná ve fosfátovém pufru s přídavkem polymerů. Obsahuje azid sodný SR:Fosfátový pufr s přídavkem polymerů, obsahuje azid sodný. Pomocné činidlo: roztok NaCl o koncentraci 9,0% Příprava činidla: Činidla jsou připravena k přímému použití a jsou stabilní do uvedeného data exspirace, pokud jsou skladována při 2-8 C. Činidla nezmrazujte. Vzorek: Čerstvé sérum. Sérum lze skladovat 48 hodin při 2-8 C. Pro delší skladování je nutné sérum zmrazit (při -20 C). 5.4. Provedení testu Parametry pro pipetování Krevní sérum Voda R1 82 µ l 48 µ l Vzorek 2,5 µ l 30 µ l SR 28 µ l 14 µ l Celkový objem 204,5 µ l 5.5. Kalibrace Kalibrátor: Poměr ředění kalibrátoru: automatické dávkování: Program kalibrace: CRP T standard 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:4; 1:16 a 0 mg/l pro Lineární interpolace 35

Kalkulace: Vypočítáme A = A2-A1 pro vzorek, kalibrátory a kontroly. Sestrojíme kalibrační křivku. Hodnoty změny absorbance kalibrátoru ( A) vyneseme do grafu proti příslušné koncentraci. Hodnotu koncentrace pro vzorek a kontroly odečteme z kalibračního grafu. Vzorky jejichž koncentrace je vyšší než hodnota koncentrace nejvyššího kalibrátoru, musí být analyzovány znovu po naředění. Rozsah měření: Typický detekční limit je 0,07 mg/l (0,007mg/dl). 36

6. Výsledky a diskuse Pacienti byli vybíráni do sledované skupiny MUDr. Petrem Vojtíškem, CSc. primářem kardiologického oddělení. Vybraní pacienti byli hospitalizováni na kardiologické oddělení interní kliniky Krajské nemocnice Pardubice. Ve všech dosud provedených studiích se u pacientů sledují a zaznamenávají různé informace a podle nich se dělí do požadovaných skupin. My jsme pacienty rozdělili na tři hlavní skupiny: 1. S akutním infarktem myokardu s STE (STEMI) 2. S nestabilní angínou pectoris (event. NSTEMI) 3. Nebyl prokázán akutní infarkt ani nestabilní angina pectoris Tyto tři hlavní skupiny byly ještě rozděleny na muže a ženy. U těchto skupin byl sledován C-reaktivní protein v krevním séru. Byly provedeny tři odběr (na počátku hospitalizace, po třech hodinách a za dvanáct až patnáct hodin od počátku hospitalizace). Výsledky byly vyneseny do grafů, byly z nich vypočteny průměrné hodnoty pro každou sledovanou skupinu, křivky byly extrapolovány do nulové hodnoty, aby se zjistilo,jestli je možné určit počátek akutního koronárního syndromu. Dále byl ověřován předpoklad, zda průběh křivky odpovídá závažnosti a průběhu akutního koronárního syndromu. Získané výsledky byly konzultovány s lékařem a porovnány s dalšími Všechny hodnoty jsou uvedeny v přiložených tabulkách,grafech a okomentovány. 37

6.2. Pacienti s akutním infarktem myokardu Tab. 1: Ženy s akutním infarktem myokardu s STE (STEMI) Z tabulky je zřejmé, že průměrné hodnoty této skupiny jsou: Na počátku: 3,36 [mg/l] CRP Za 3 hodiny : 5,00 [mg/l] CRP 12 hodin: 13,2 [mg/l] CRP Tyto hodnoty odpovídají představě, že během akutní koronární příhody, která se dá považovat za zánětlivý proces dochází k nárůstu C-reaktivního proteinu. Celkem bylo sledováno dvacet sedm žen a z toho u patnácti byl vývoj C-reaktivního proteinu podle našeho předpokladu, tj. jeho koncentrace během zánětu stoupala. Dva pacienti byli vyřazeni, protože koncentrace CRP byla příliš vysoká a ukazovala na jiný druh onemocnění. Byla vypočítána přibližná doba, kdy začala akutní koronární příhoda, z těchto hodnot byl také vypočten průměr. Tato hodnota nám ukazuje,že u této skupiny začala akutní koronární příhoda před 10,74 hodinou. 38

Obr. 1: Časový průběh C-reaktivního proteinu 39

Tab. 2: Muži s akutním infarktem myokardu s STE (STEMI) Z tabulky je zřejmé, že průměrné hodnoty této skupiny jsou: Na počátku: 4,48 [mg/l] CRP Za 3 hodiny : 6,11 [mg/l] CRP 12 hodin: 12,27 [mg/l] CRP Tyto hodnoty odpovídají představě, že během akutní koronární příhody, která se dá považovat za zánětlivý proces dochází k nárůstu C-reaktivního proteinu. Celkem bylo sledováno padesát šest mužů a z toho u dvaceti osmi byl 40

vývoj C-reaktivního proteinu podle našeho předpokladu, tj. jeho koncentrace během zánětu stoupala. Dva pacienti byli vyřazeni, protože koncentrace CRP byla příliš vysoká a ukazovala na jiný druh onemocnění. Byla vypočítána přibližná doba, kdy začala akutní koronární příhoda, z těchto hodnot byl také vypočten průměr. Tato hodnota nám ukazuje,že u této skupiny začala akutní koronární příhoda před 9,68 hodinou. Byly brány hodnoty do jednoho dne a proto byly z průměru vynechány hodiny 86,5-126,37, jsou to nereálné hodnoty, protože u těchto pacientů nedošlo k akutní koronární příhodě, jak je vidět z hodnot C-reaktivního proteinu. 41

6.2. Pacienti s nestabilní anginou pectoris (event. NSTEMI) Tab. 3: Ženy s nestabilní anginou pectoris (event. NSTEMI) Z tabulky je zřejmé, že průměrné hodnoty této skupiny jsou: Na počátku: 6,6 [mg/l] CRP Za 3 hodiny : 6,64 [mg/l] CRP 12 hodin: 9,56 [mg/l] CRP Tyto hodnoty odpovídají představě, že během akutní koronární příhody, která se dá považovat za zánětlivý proces dochází k nárůstu C-reaktivního proteinu. Celkem bylo sledováno dvacet žen a z toho u šesti byl vývoj C- reaktivního proteinu podle našeho předpokladu, tj. jeho koncentrace během zánětu stoupala. Tento počet ukazuje, že výskyt nestabilní anginy pectoris je méně častý. Jeden pacient byl vyřazen, protože koncentrace CRP byla příliš vysoká a ukazovala na jiný druh onemocnění. Byla vypočítána přibližná doba, kdy začala akutní koronární příhoda, z těchto hodnot byl také vypočten průměr. Tato hodnota nám ukazuje,že u této skupiny začala akutní koronární příhoda před 23,04 hodinou. Byly brány hodnoty do jednoho dne a proto byla z průměru vynechána hodina 56,33, jsou to nereálné hodnoty, protože u těchto pacientů nedošlo k akutní koronární příhodě, jak je vidět z hodnot C-reaktivního proteinu. 43

Tab. 4: Muži s nestabilní anginou pectoris (event. NSTEMI) Z tabulky je zřejmé, že průměrné hodnoty této skupiny jsou: Na počátku: 4,38 [mg/l] CRP Za 3 hodiny : 5,38 [mg/l] CRP 12 hodin: 10,03 [mg/l] CRP Tyto hodnoty odpovídají představě, že během akutní koronární příhody, která se dá považovat za zánětlivý proces dochází k nárůstu C-reaktivního proteinu. Celkem bylo sledováno třicet čtyři mužů a z toho u patnácti byl vývoj C-reaktivního proteinu podle našeho předpokladu, tj. jeho koncentrace během zánětu stoupala. Tento počet ukazuje,stejně jako u předešlé skupiny, že výskyt nestabilní anginy pectoris je i u mužů méně častý a ani průběh C-reaktivního proteinu nemá stoupající trend. Vždy byla hodnota C-reaktivního proteinu odebraného po třech hodinách nižší než počáteční a hodnota posledního odběru už zase stoupla. 45

Byla vypočítána přibližná doba, kdy začala akutní koronární příhoda, z těchto hodnot byl také vypočten průměr. Tato hodnota nám ukazuje,že u této skupiny začala akutní koronární příhoda před 10,82 hodinou. Byly brány hodnoty do jednoho dne a proto byly z průměru vynechány hodiny 978,5; 191,2 a 113,4, jsou to nereálné hodnoty, protože u těchto pacientů nedošlo k akutní koronární příhodě, jak je vidět z hodnot C-reaktivního proteinu. 46

6.3. Porovnání Tab. 5: Průměrné hodnoty C-reaktivního proteinu u žen s akutním infarktem myokardu s STE a nestabilní anginou pectoris (event. NSTEMI) V této tabulce jsou uvedeny a porovnány průměrné hodnoty C-reaktivního proteinu u žen s akutním infarktem myokardu s STE a nestabilní anginou pectoris (NSTEMI). Z nich je viditelný průběh onemocnění. Z hodnot a přiloženého grafu je vidět mnohem rychlejší a prudší nárůst koncentrace u akutního infarktu myokardu s STE. 48

Tab. 6: Porovnání průměrných hodnot C-reaktivního proteinu u mužů s akutním infarktem myokardu s STE a nestabilní anginou pectoris (event. NSTEMI) 50

6.4. Pacienti s neprokázaným akutním koronárním syndromem Tab. 5: Ženy u kterých nebyl prokázán akutní infarkt ani nestabilní angina pectoris 52

Tab. 5: Muži u kterých nebyl prokázán akutní infarkt ani nestabilní angina pectoris Pro názorné srovnání hodnot jsou uvedeny tabulky pacientů, u kterých nebyl prokázán akutní koronární syndrom. Hodnoty jsou poměrně nízké a nevykazují vzestupný trend jako tomu je u pacientů s akutním koronárním syndromem. 53

7. Závěr 54

9. Seznam literatury 1. Blaha M. a kol.: Vnitřní lékařství I. díl Vybrané kapitoly z diagnostiky, léčby a speciální ošetřovatelské péče, Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 1997; 69-72. 2. Bartecký J., Jsou ateroskeróza a akutní koronární syndromy projevem zánětlivých procesů cévy, Zdravotní noviny, 2000-15; 9-11. 3. C- reaktivní protein u dilatační kardiomyopatie, Medicína 5/ Roč. IX/ Strana 1,2 (Zdroj SCIENCE 296;242,12, April 2002). 4. Čermáková M., Štěpánová I.: Klinická biochemie I. díl, Brno 2003; 99. 5. Dvorníková I: bakalářská práce 6. Dvořáková A., Poledne R.: C-reaktivní protein, rizikový faktor rozvoje aterosklerózy, Postgraduální medicína, 2002-7, 2002-4; 746-748. 7. E. Pihl, et. al. High-sensitive C-reactive protein level and oxidative stress-related status in former athletes in relation to traditional cardiovascular risk factors, Estonia, Atherosclerosis 171 (2003) 321 326 Received 15 May 2003; received in revised form 18 August 2003; accepted 22 August 2003 8. Fischer, C.L. et al. Quantitation of Acute Phase Proteins, Amer.J.Clin.Path. 66, 840 (1976) 9. Ganong F. W.: Překlad lékařské fyziologie, Nakladatelství a vydavatelství H & H, 1995;453-476. 10. Hognestad A., MD, et. al., Heart Failure/Cardiac Transplantation Plasma C-Reactive Protein as a Marker of Cardiac Journal of the American College of Cardiology Vol. 42, No. 3, Published by Elsevier Inc. doi:10.1016/s0735-1097(03)00645-4 11. Holmlund A a, et. al., Soluble intercellular adhesion molecule-1 is related to endothelial vasodilatory function in healthy individuals Sweden Received 1 October 2001; received in revised form 20 May 2002; accepted 31 May 2002 Atherosclerosis 165 (2002) 271_/276 56

12. Homocystein, C-reaktivní protein a statiny, Medicína 7-8/Roč. IX/ Strana 8 (Zdroj: CIRCULATION 105;1776, 16 April 2002 13. Hradec J., Spáčil J.: Kardiologie, Angiologie, 2001. 14. Indrová M.: bakalářská práce 15. Jublanc C. a,b,et. al. Relationship of circulating C-reactive protein levels to thyroid status and cardiovascular risk in hyperlipidemic euthyroid subjects: low free thyroxine is associated with elevated hscrp, Received 30 June 2003; accepted 11 September 2003 16. Kazda A., Brodská H., Valenta J., Uhrová I., Hendl J., Bělohlávek J., et. Al..: Klinická biochemie a metabolismus, 2002-1; 32-37. 17. Kordač V., et al: Vnitřní lékařství III: Adviceum, Zdravotnické nakladatelství, Praha, 1991. 18. Kelner P. a kol., Vnitřní lékařství, Galén, Karolinum, Praha 1999 19. Kostiuk P.: C-reaktivní protein u dilatační kardiomyopatie, Cardiology, 3.12.1999; 91:215-219. 20. Kvasnička J.: Mechanismus účinku estrogenů v kardiovaskulárním systému, Časopis ženských lékařů GYNEKOLOG. 21. Manack, J.R., Richards, B.J., J.Immunol. 20, 1019 (1971) 22. Maruna P., Gürlich R., Fraško R., Chachkhiani I., Marunová M.,: Odlišná dynamika leptinu a kortizolu v průběhu neinfekční stresové odpovědi, Sborník lékařský 2001, 4; 489-499. 23. Maruna P., Gürlich R., Fraško R., Chachkhiani I., Marunová M., Owen K., et al.: Cytokiny a solubilní cytokinové receptory v perioperačním období, Sborník lékařský 2002, 2; 273-282. 24. Maruna P.: Pentraxiny I. C-reaktivní protein a sérový amyloid P, Klinická biochemie a metabolismus 2002-3; 100-106-5. 25. Masopust J.: Klinická biochemie: Požadování a hodnocení biochem. vyšetření I. část, Karolinium Praha 1998; 83-91. 26. Masopust J.: Klinická biochemie: Požadování a hodnocení biochem. vyšetření II. část, Karolinium Praha 1998; 437-469. 57

27. Moriarty M. P. a, et. al. C-reactive protein and other markers of inflammation among patients undergoing HELP LDL apheresis 2 a Lipid, Atherosclerosis, Atherosclerosis 158 (2001) 495 498, Received 15 December 2000; accepted 30 April 2001 28. Murray R. K., Granner D. K., Mayeis P. A.: Harperova biochemie, Nakladatelství a vydavatelství H & H, 2000;704 29. Nouza M., Nouza K.: Úloha proteinů akutní fáze při zánětu, Zdravotní noviny, 2000-34; 16-18. 30. Platzer W.: Atlas topogarifické anatomie. 1996. 31. Palovský V. Vnitřní lékařství učebnice pro střední zdravotní školy, vydavatelstvo osveta Praha, 1993; 72-80. 32. Pepys, M.B., CRP fifty years on. Lancet I, 653-657 (1981) 33. Racek J. et al.: Klinická biochemie, Galén, 1999; 65, 171, 163-177. 34. Racek J., Racková M.: Některé méně známé rizikové faktory aterogeneze-homocystein, lipoprotein (a) a C-reaktivní protein, Časopis lékařů českých, 2002-19;605-609. 35. Ridker P. M., Stampfer M. J., Rifai N.: Novel Risk factors for Systemic Atherosclerosis. A Comparison of C-Reactive Protein, Fibrinogen, Homocystein. Lipoprotein(a), and Standard Cholesterol Screening as Predictors of Peripheral Arterial Disease, JAMA, 2001;285:2481-2485. 36. Ridker P.: Clinical Application ao C-Reactive Protein for Cardiovascular Disease Detection and Prevention, Cicculation, January 2003-28;363-369. 37. Rita F. Redberg, MD, et. al., FACC, Lack of Association of C- Reactive Protein and Coronary Calcium by Electron Beam Computed Tomography in Postmenopausal Women: Implications for Coronary Artery Disease Screening, Journal of the American College of Cardiology Vol. 36, No. 1, 2000 38. Ritchie, R.F.,J.Lab.Clin.Med. 70, 512 (1971) 39. Saito M a, et. al., Relations of plasma high-sensitivity C-reactive protein to traditional cardiovascular risk factors a Department of 58

Hypertension and Cardiorenal Medicine, Japan Received 25 March 2002; received in revised form 21 August 2002; accepted 30 September 2002 Atherosclerosis 167 (2003) 73_/79 40. Semb G. A., MD, PHD, et. al., Raised Serum Levels of Soluble CD40 Ligand in Patients With Familial Hypercholesterolemia Journal of the American College of Cardiology Vol. 41, No. 2, 2003 Published by Elsevier Science Inc. PII S0735-1097(02)02718-3 41. Schneiderka at al.: Kapitoly z klinické biochemie, Karolinium, 2000;124-136 42. Suomin P. et al, CRP Guide, Espoo; 2002 43. Stejfa M. a kol.: Kardiologie-druhé, přepracované a doplněné vydání, Grada Publishing, 1998;71-84, 117-128, 306-327 44. Špaček R., Widimský P.: Infarkt myokardu. 2003 45. Tichý M., Gregor J.: Přehled biochemických markerů poškození myokardu, Klinická biochemie a metabolismus, 2002-3;176-179. 46. Tokstein A. Základy fyzikální chemie 2. díl, str. 167-168-SNTL, Praha 1982 47. Toshimitsu Yatagai a, et. al, Diabetes Research and Clinical Practice, Decrease in serum C-reactive protein levels by troglitazone is associated with pretreatment insulin resistance, but independent of its effect on glycemia, in type 2 diabetic subjects, Received 23 April 2003; received in revised form 4 July 2003; accepted 14 August 2003 48. U. Hoffmann. R. Chan, T. Brady., Non-invasive detection and characterization of coronary atherosclerotic plaque, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA, USA 49. Vokurka M., Hugo J.: Praktický slovník medicíny. 2000 50. Vojáček J., Akutní koronární syndromy: Grada Publishimg 1998 51. Vojáček J., Bulats J.: Němá ischémie myokardu. 1994 52. Wies M.: Ateroskleróza-imunopatologické zánětlivé systémové onemocnění, Zdravotní noviny, 2002-34;16-18. 59

53. Yamashita H, MD, et. al., Concentrations of Interleukins, Interferon, and C-Reactive Protein in Stable and Unstable Angina Pectoris coronary atherosclerosis and angina pectoris, and that the T-helper 1 dominance may play an important role in these diseases. _2003 by Excerpta Medica, Inc. (Am J Cardiol 2003;91:133 136) 60

10. Příloha Obr. 1:COBAS INTEGRA 400 Obr. 2 Obr. 3: 61