NMR spektroskopie biologicky aktivních molekul

Jak vidí současné a budoucí uplatnění NMR spektroskopie profesor Richard Ernst. Medicine Biochemistry Nobel prize in chemistry 1991 Chemistry Physics J.W. Emsley: NMR started as the plaything of the physicists, it became the favourite toy of the chemists and finally went on to seduce biochemists.

Kurt Wüthrich Nobel Price Winner in Chemistry 2002 G. Wagner, K. Wüthrich. 1982. Sequential resonance assignments in protein 1 H nuclear magnetic resonance spectra. Basic pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol. 155, 347-366.

1. Jaké typy biologický aktivních molekul? peptidy a proteiny nukleové kyseliny oligosacharidy 2. Jaký typ informace může být pomocí NMR získán? identifikace substrátu prostorová struktura molekuly studium dynamického chování systému prostorová struktura komplexu zkoumání vazby ligandu a substrátu

První historicky dochované NMR spektrum proteinu. Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G: J.Am.Chem.Soc. 79, 3289 (1957).

900 MHz magnet firmy Varian 900 MHz magnet firmy Bruker 900 MHz 1 H NMR spektrum lysozymu

Strategie pro určování struktur biomolekul NMR vzorek NMR experimenty Obecné informace o molekule (primární struktura, kovalentní vazby ) NMR spektra Odhad přibližné struktury Přiřazení signálů Přiřazení experimentálních NMR parametrů (NOE ) Zhodnocení kvality struktur Oprava přiřazení NMR parametrů, signálů Výpočet souboru struktur Výpočet statistických údajů pro soubor konečných struktur Porovnání s databázemi (Procheck, Whatif.) Výpočet NOESY spekter

Příprava vzorku proteinu pro NMR měření 1. Získání DNA proteinu 2. Příprava plasmidové DNA 3. Exprese rekombinantního proteinu v E.Coli 4. Izolace a čištění 5. Zakoncentrování vzorku 6. Testování vzorku na dlouhodobou stabilitu 7. Zopakování procesu s médiem obohaceným o izotopy 13 C, 15 N, případně i 2 H

Vzorek pro NMR experimenty Úspěšné řešení bezpodmínečně vyžaduje kvalitní spolupráci mezi NMR spektroskopiky a biochemiky! Vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný během NMR experimentů! rozpouštědlo ph pufr teplota aditiva koncentrace stabilita H 2 O, resp. 90-95% H 2 O a 5-10% D 2 O kompromis mezi minimalizací chemické výměny mezi signály labilních protonů a signálem vody a optimem pro studovaný protein (4.0-7.0) fosfátový pufr neobsahuje žádné protony acetátový pufr (nutno připravit deuterovaný) podle požadavků studovaného materiálu (15 40 C) nutná aditiva je možné zaměnit za deuterovaná analoga pro NMR experimenty musí být v rozsahu alespoň 0.5-2.0 mm, vzorek nesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení v tomto konc. rozmezí nutná dlouhodobá stabilita v rozsahu minimálně několika týdnů

Srovnání sbalené a nesbalené struktury WVQPI 107 AA (12 kda) IMMCS správně sbalená forma proteinu 83 AA (9 kda) WVQPI 107 AA (12 kda) IMMCS nesbalená forma téhož proteinu δ( 1 H) 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm 1 H- 15 N korelace v oblasti amidických vodíků (vzorek nespecificky obohacen 15 N) δ( 15 N) 108 110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 δ( 1 H) 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 ppm 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 ppm

Biomolekulární NMR spektroskopie: měřená jádra 1 H 13 C 15 N 2 H vysoké přirozené zastoupení (99.98%) vysoká citlivost (1.00) malá disperze chemických posunů NMR signálů (~15.0 ppm) velká disperze chemických posunů NMR signálů (~200.0 ppm) nízké přirozené zastoupení (1.108%), možné uměle navýšit až na 100% nízká citlivost (1.76x10-4 ), po 100%ním izotopovém obohacení (1.59x10-2 ) menší počet atomů než 13 C střední disperze chemických posunů NMR signálů (~30.0 ppm) (oproti 13 C nezávislost na typu aminokyseliny) nízké přirozené zastoupení (0.37%), možné uměle navýšit až na 100% velmi nízká citlivost (3.85x10-6 ), po 100%ním izotopovém obohacení (1.04x10-3 ) používá se pro speciální účely

Potlačení signálu vody Proč H 2 O? 1. Voda je fyziologické prostředí 2. Nelze použít D 2 O z důvodů chemické výměny s amidickými protony. Signál H 2 O je 10 4-10 5 násobně intenzivnější než odezva měřené molekuly. Metoda presaurace CW -ozařování 90 deg Během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým RF polem.

1 H spektrum proteinu po presaturaci H 2 O zbytkový signál H 2 O

WATERGATE: Metoda založena na selektivní manipulaci signálů vody a rozpuštěné látky spolu s gradientním echem. 90 deg 1 H τ 180 deg τ G G 1 G 2 180 deg puls

Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE

1D 1 H spektrum proteinu kuřecí lysozym 129 AA, M w = 14.6 kda methyl H NH-backbone aromatic H NH-SC aliphatic H CαH

Multidimensionální NMR spektroskopie jako nástroj pro zjednodušení spekter 1D 3D 2D F 1 ( 1 H) F 2 (X) F 2 ( 1 H) 4D F 1 ( 1 H/X) F 3 (X) F 3 ( 1 H) F 1 ( 1 H/X) Lepší rozlišení je ve vícedimenzionálních spektrech zajištěno využitím izotopového obohacení 15 N a 13 C. F 2 (X) F 4 ( 1 H) F 1 ( 1 H)

Přiřazování rezonancí NMR experimenty pro přiřazení signálů pracují se dvěma nebo třemi různými jádry najednou (experimenty s trojnásobnou rezonancí), tato jádra jsou navzájem zkorelována. Názvy takovýchto experimentů se tvoří podle typu jader, která korelují: HNCA koreluje amidický vodík s příslušným dusíkem a uhlíkem v pozici α. HN(CO)CA koreluje stejné typy atomů (jader) jako HNCA, ale přes CO. To naznačuje směr korelace, tj. H a N i-té aminokyseliny a C α aminokyseliny v pozici i-1. Směr přenosu magnetizace je v případě těchto experimentů H N C α a zpět. Experimenty se nazývají out and back Naproti tomu přenos magnetizace u experimentů např. CBCA(CO)NH začíná na atomu C Β (i-1) aminokyseliny a končí na amidickém H aminokyseliny následující, tj. experimenty out and stay.

Přiřazování rezonancí 13 C γ HNCA experiment 35Hz 13 C 13 H C 130Hz H β β β β 35Hz aminokyselinový zbytek I-1 35Hz aminokyselinový zbytek I 13 C 55Hz 13 C 15Hz α 15 N 11Hz 13 C 55Hz α 13 C H α 7Hz 90Hz H N 140Hz H α <1Hz

HNCA experiment Korelace ve spektru: H N i -N i -Cα i H N i -N i Cα i-1-1 1 H x x φ 2 x x x x x x acq t 3 15 N φ 1 x φ 4 x x t τ τ 1 /2 t 1 /2 δ δ τ τ φ 4 dec x φ 3 x 13 C α t 2 /2 t 2 /2 13 CO x x přenos magnetizace vývojová perioda

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA F 2 ( 15 N ) I F 1 ( 13 C α ) F 2 ( 15 N ) I-1 F 3 ( 1 H N ) F 1 ( 13 C α ) F 3 ( 1 H N )

Sekvenční přiřazení hlavního řetězce HN(CO)CA HNCA missing crosspík

Přiřazování rezonancí 13 C γ HN(CO)CA experiment 35Hz 13 C 13 H C 130Hz H β β β β 35Hz 35Hz 13 C 55Hz 13 C 15Hz α 15 N 11Hz 13 C 55Hz α 13 C H α 7Hz 90Hz H N 140Hz H α <1Hz

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA/HN(CO)CA F 2 ( 15 N ) F 2 ( 15 N ) I F 1 ( 13 C) F 2 ( 15 N ) I-1 I-1 F 3 ( 1 H N ) F 1 ( 13 C) F 3 ( 1 H N )

Sekvenční přiřazení hlavního řetězce HN(CO)CA HNCA missing crosspík

Přiřazování rezonancí postranních řetězců H γ C γ H γ H γ C γ H γ H β C β H β H β C β H β C α C N C α C H α H N H α

Přiřazování rezonancí postranních řetězců ppm Kompletní přiřazení Prolinu 4 proteázy M-PMV pomocí hcch-cosy spektra H : 4.296 ppm α H : 1.818 ppm β2 Pro4CG-CB-HB2 H : 2.185 ppm β3 Pro4CG-CB-HB3 H : 1.913 ppm γ Pro4CG-CG-HG H : 3.589 ppm δ2 Pro4CG-CD-HD2 H : 3.715 ppm δ3 Pro4CG-CD-HD3 H H H H γ δ N H β α H H O 30 Pro4CB-CA-HA Pro4CB-CB-HB2 Pro4CB-CB-HB3 Pro4CB-CG-HG 30 H 3 C O 40 40 3D δ( 13 C) 50 Pro4CD-CG-HG Pro4CD-CD-HD2 Pro4CD-CD-HD3 50 F 2 ( 1 H) 60 Pro4CA-CA-HA Pro4CA-CB-HB2 Pro4CA-CB-HB3 60 F 1 ( 13 C) 65 60 35 30 35 30 30 25 δ( 13 C) 55 50 55 50 ppm F 3 ( 13 C)

Práce s extra velkými molekulami M w > 25 kda Práce s velkými molekulami způsobuje dvojí komplikaci velmi komplikovaná spektra rychlá spin-spinová relaxace R 2 = γ γ 2 2 H ( D) C 8r 6 CH h [ J ' s... f τ ( )] c γ H / γ D ~ 6.6 Řešení: výměna atomů vodíku za deuterium

Práce s extra velkými molekulami M w > 25 kda Exprese proteinu v růstovém médiu obohaceném o 13 C/ 15 N/ 2 H 13 C γ 35Hz CD 3 CD 3 13 13 130Hz C β HD β C β HD β C D 35Hz 13 55Hz 13 15Hz C α C H α D 7Hz 15 11Hz N 90Hz H N 35Hz 13 55Hz C α 140Hz H α D 13 C <1Hz N H C α D CO Teoreticky může být R 2 snížen až 44 násobně, prakticky většinou maximálně 15x.

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein Missing crosspeaks are marked

Nukleární Overhauserův efekt r IS < 5Ǻ H H dipól - dipólová interakce mezi atomy σ IS 2 2 4 µ 6 ο h γ τ c 6 = 2 2 4 10 τ c 1 + 4 ris π ω τ c 6 σ IS ris fi{} S = σcal r cal f cal r = r IS cal 6 σ IS - rychlost křížové relaxace, nárůstu NOE τ c - korelační čas r IS - meziatomová vzdálenost ω - pracovní frekvence NMR spektrometru Poměr intenzit NOE efektů f I {S}/f cal je úměrný poměru vzdáleností příslušných atomů vodíku pouze pro velmi krátké časy!!!

Převod intenzity NOE krospíků na vzdálenost mezi atomy. 1.8 Ǻ r 2.5 Ǻ 1.8 Ǻ r 3.5 Ǻ 1.8 Ǻ r 5.0 Ǻ Dolní mez :1.8 Ǻ Jedná se o součet vzdáleností van der Waalsovských poloměrů dvou interagujících atomů vodíku Horní mez : Nastavuje se podle intenzity příslušného krospíku. Pro větší molekuly se používá max. vzdálenost až 6 Å.

Editovaná NOESY spektra 4D 13 C/ 15 N-editované NOESY 15 N NOE 1 H 1 H 13 C J HN 15 N 13 C J HC 1 H 1 H 3D 15 N-editované NOESY 4D 13 C/ 15 N-editované NOESY 15 N= 106.4 ppm 15 N= 106.4 ppm 13 C= 45.8 ppm 15 N= 106.4 ppm 13 C= 56.1 ppm G78 HN -G78 Hα G78 HN -S77 Hα

Nepřímá spin-spinová interakční konstanta Experimentální omezení dihedrálních úhlů Karplusova rovnice 3 J = A cos 2 Θ + Β cosθ + C Vztah mezi interakční konstantou a dihedrálními úhly peptidu H O N φ C Cα ψ H H Cβ χ 1 H χ 2 Cγ 3 J 10 8 6 4 CO-NC α -H H-NC α -H H-NC α -CO H-NC α -C β ω C O 2 0 [Hz] -120 0 60 120 Θ deg

Typické hodnoty interakčních konstant 3 J HH pro dihedrální úhel φ α-helix φ 60 deg 3 J 6 Hz typické nastavení pro úhel φ: 110 φ 10deg β-struktura skládaného listu φ 120 ο 6 J 9Hz typické nastavení pro úhel φ: 170 φ 70deg

Stereospecifické přiřazení diastereotopních atomů v C β H 2 skupinách -J αβ coupling -H N -H β NOE H β3 R H β2 H α CO H α CO H α CO R H β2 H β2 H β3 H β3 R N N tg (g - ) gt (t) gg (g + ) N J αβ = 9.5 cos 2 θ 1.6 cos θ +1.8 15 180 (gt) 10 0 J αβ 3 5 60 (gg) -60 (tg) 0 0 5 10 15 J αβ2

Vodíkové vazby C O H N Měření: - výměnné experimenty s D 2 O - teplotní závislost výměnitelných protonů (NH, OH ) NMR experimenty:- malé molekuly -COSY - velké molekuly - 1 H- 15 N HSQC Z NMR experimentů je možné získat pouze informaci o donoru!! Akceptory jsou většinou určeny až z molekulárního modelování a výpočtů!!

Vodíkové vazby v pravidelných strukturách α-helix β-sheet

Jak vše poskládat dohromady???? Omezení vzdáleností (NOEs) Omezení dihedrálních úhlů (interakční konst.) Info o kovalentní struktuře Cray T3E E = E + tot kin E pot Výpočetní algoritmus: Molekulární mechanika simulované žíhání s experimentálními omezeními (vzdálenosti, dihedrální úhly ) - molekula se ohřeje na vysokou teplotu (2000 50 000 K) - pomalu se ochladí na teplotu blízkou nule simulované žíhání v Kartézském prostoru (Newtonovy pohybové rovnice) simulované žíhání v prostoru torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

Růstový modulátor Granulin 1e Cyprinus carpio

Studium dynamických jevů proteinů pomocí NMR. Proč? Molekuly nejsou statické, vykonávají pohyby v různých časových škálách. Vypočtená statická struktura je často průměrem skutečných stavů molekuly. Funkce mnoha biologicky aktivních molekul závisína jejich flexibilitě. V roztoku (fyziologické prostředí) podléhají biologicky aktivní molekuly přirozeným pohybům, které nejsou v krystalové mřížce patrné. Výhoda NMR spektroskopie nad rentgenovou krystalografií.

Studium dynamických jevů proteinů pomocí NMR Vztah relaxační rychlostí k molekulárním pohybům v různé časové škále: NMR parametr časová škála podélná relaxace R 1 10 12 10 8 s -1 podélná relaxace během spin-locku R 1ρ 10 6 10 3 s -1 příčná relaxace R 2 10 3 10-3 s -1 Měřená jádra: 1 H téměř se neměří (obtížně definovatelné) 15 N dynamika páteře proteinu (dobře měřitelné, dobře definovatelné) 13 C dynamika postranních řetězců i páteře (obtížněji měřitelné, dobře definovatelné) 2 H - měří se ve speciálních případech (CH 3, obtížněji připravitelný vzorek, není jednoduché měřit, dobře definovatelné

Zpracování výsledků Lipari-Szabóův přístup Pro analýzu je nutný model pohybu molekuly jako celku a jejích částí. Jeden z nejúspěšnějších je Lipari-Szabóův bezmodelový přístup ( modelfree approach) Předpoklady Lipari-Szabóova modelu: relaxace je modulována dvěma pohyby: globálním a lokálním oba pohyby jsou statisticky nezávislé globální reorientace je izotropní molekulární pohyb je charakterizován parametry: t M korelační čas globálního pohybu S 2 parametr uspořádanosti (hodnota 0-1) t e R ex korelační čas lokálního pohybu rychlost chemické (konformační) výměny

Experimentální uspořádání Relaxační parametry 15 N: Měřeny relaxační časy: spin-mřížka (podélná) T 1 spin-spin (příčná) T 2 krosrelaxační rychlost (NOE) 1 H - 15 N

Výsledky parametr uspořádanosti a konformační výměna R ex znamená příspěvek konformační výměny k relaxační rychlosti 1/T 2 1/T 2* = 1/T 2 + R ex

Interpretace výsledků měření dynamiky páteře HIV-1 PR Aminokyselinové zbytky podléhající rychlým pohybům v pikosekundové časové škále (1-100 ps) o velké amplitudě Aminokyselinové zbytky podléhající pomalým pohybům (konformační výměny v mikro- až milisekundové časové škále.

HIV-1 proteáza M-PMV proteáza (12 kda) Problém: Vyskytuje se M-PMV PR též jako homodimer nebo jen v monomerní formě? Metoda řešení pomocí NMR: Studium dynamiky proteinu.

Srovnání relaxačních vlastností 15 N proteáz HIV-1 a M-PMV M-PMV protease (C7/A, D26/N, C106/A) HIV-1 protease T1 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 T2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 NOE 1 0.5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110-0.5-1 -1.5 Závěr: U proteázy viru M-PMV chybí čtyřvláknový ß-sheet ( ground floor ), který představuje hlavní stabilizační faktor homodimeru. M-PMV PR (12 kda) se vyskytuje jako monomer.

HIV-1 protease with indicated ground floor C C N N