HYDRAGEL 1 IF Violet Acide / Acid Violet. HYDRAGEL 2 IF Violet Acide / Acid Violet. HYDRAGEL 4 IF Violet Acide / Acid Violet

Transkript

1 HYDRAGEL 1 IF Violet Acide / Acid Violet Ref HYDRAGEL 2 IF Violet Acide / Acid Violet Ref HYDRAGEL 4 IF Violet Acide / Acid Violet Ref Ref. 4381* HYDRAGEL 4 IF Amidoschwarz / Amidoblack Ref HYDRAGEL 9 IF Violet Acide / Acid Violet Ref Ref. 4382** 2018/07

2 POUŽITÍ kitu HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 HYDRAGEL 1 IF, 2 IF, 4 IF a 9 IF kity jsou určeny k detekci monoklonálních proteinů v lidském séru a v moči pomocí imunofixační elektroforézy. Používají se ve spojení s poloautomatickým systémem HYDRASYS. Proteiny separované elektroforézou na alkalicky pufrovaných agarózových gelech jsou inkubovány se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům Ig G, Ig A, Ig M a lehkým volným i vázaným kappa a lambda řetězcům. Po odstranění nezreagovaných bílkovin jsou precipitáty obarveny kyselou violetí nebo amidočerní. Elektroforeogramy se hodnotí vizuálně a pátrá se po přítomnosti monoklonálních bílkovin. Každý agarózový gel je určen k analýze : - jednoho vzorku HYDRAGEL 1 IF kit, - dvou vzorků HYDRAGEL 2 IF kit, - čtyř vzorků HYDRAGEL 4 IF kit, - devíti vzorků HYDRAGEL 9 IF kit. Dle svých preferencí si uživatel navíc může vybrat soupravu HYDRAGEL 4 IF buď s amidočerní nebo s kyselou violetí. Určeno pro diagnostické použití in vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU Abnormální proužky zjištěné elektroforézou v zóně beta a gamaglobulinů mohou vyvolávat podezření na výskyt monoklonálních proteinů (M-proteiny, paraproteiny, monoklonální imunoglobuliny) a tím gamapatie. K identifikaci těchto abnormálních proužků slouží imunofixace. Imunofixační elektroforéza umožní zafixování proteinů in situ, kde tvoří nerozpustné komplexy s odpovídajícími protilátkami. Provedení ve čtyřech krocích je snadno interpretovatelné : 1. Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu. 2. Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou příslušné migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a precipitují přítomné antigeny. Proteiny v referenční stopě jsou jsou fixovány fixačním roztokem. 3. Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen-protilátka zůstává v gelové matrix. 4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány obarvením. Elektroforetické dělení vzorku probíhá simultánně v šesti stopách. Po elektroforéze první stopa (ELP) slouží jako referenční. Zbývajících 5 stop je použito k nanesení specifických antisér trivalentní proti těžkým řetězcům (G, A, M) a anti-kappa a anti-lambda volným a vázaným lehkým řetězcům. Imunofixační proužky jsou porovnány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku odpovídající proužek by měl mít stejnou migrační pozici. REAGENCIE A MATERIÁL V kitech HYDRAGEL 1 IF, HYDRAGEL 2 IF, HYDRAGEL 4 IF A HYDRAGEL 9 IF VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. HYDRAGEL 1 IF kit HYDRAGEL 2 IF kit HYDRAGEL 4 IF kit HYDRAGEL 9 IF kit kat. Č kat. Č kat. Č kat. Č kat. Č kat. Č. 4381* kat. Č. 4382** Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 10 gelů 10 gelů 80 gelů Pufrované stripy (připraveno k použití) 10 bal. a 2 ks 10 bal. a 2 ks 10 bal. a 2 ks 80 bal. a 2 ks Ředicí roztok pro amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv., 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv., 20 ml Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahv., 75 ml 1 lahv., 75 ml 8 lahv. a 75 ml Diluent (připraveno k použití) 1 lahv., 32 ml 1 lahv., 32 ml 1 lahv., 32 ml 2 lahv. a 80 ml 3 lahv. a 80 ml Fixační roztok (připraveno k použití) 1 lahv., 2.9 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským těžkým řetězcům gama (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským těžkým řetězcům alfa (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským těžkým řetězcům mu (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským lehkým řetězcům (volným a vázaným) kappa (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským lehkým řetězcům (volným a vázaným) lambda (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Aplikátory (připraveno k použití) 1 bal. a 10 ks 2 bal. a 10 ks 16 bal. a 10 ks 2 bal. a 10 ks 3 bal. a 10 ks 24 bal. a 10 ks Antiséra 2 bal. a 5 ks 2 bal. a 5 ks 2 bal. a 5 ks 16 bal. a 5 ks Filtrační papíry - Tenké 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 8 bal. a 10 ks Filtrační papíry - Zesílené 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 8 bal. a 10 ks (*) HYDRAGEL 4 IF MAXI-KIT (**) HYDRAGEL 9 IF MAXI-KIT POZNÁMKA : Fixační roztok a antiséra jsou dodávány samostatně s výjimkou balení MAXI-KIT (viz POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V SADĚ). Během přepravy může být MAXI-KIT uchován bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti SEBIA NÁVOD - Czech

3 OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. podpůrné medium pro elektroforézu a imunofixaci bílkovin. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ STRIPY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.1 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované stripy slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu a štítcích balení s proužky. NEMRAZIT! Nepoužívejte vyschlé stripy z poškozených obalů. 3. ŘEDÍCÍ ROZTOk PRO AMIDOČERŇ Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok ph 2. barvícího roztoku s amidočerní. Zásobní roztok ředícího roztoku pro amidočerň se skladuje při pokojové teplotě nebo při teplotě 2-8 C. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 4. AMIDOČERŇ (kat. č. 4308) Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. Opakujte tento krok 2-3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. POZN. : Nesprávná příprava barvícího roztoku povede k nedostatečnému barvení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce). Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla

4 5. kyselá VIOLEŤ (kat. č. 4301, 4302, 4304, 4309, 4381 a 4382) Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 6 měsíců. 6. DILUENT Ředící roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 7.5 ± 0.5 ; bromofenolová modř ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Ke zředění vzorku. Bromfenolová modř slouží k ulehčení nanášení vzorku a jako migrační marker. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do doby exspirace. Nesmí obsahovat sraženiny. 7. ANTISÉRA A FIXAČNÍ ROZTOk (kat. č a 4382) 7.1. ANTISÉRA Všechna antiséra jsou savčí imunoglobuliny protilátky proti lidským bílkovinám, ihned použitelná k analýze. Ke snadnějšímu rozlišení jsou antiséra zbarvena různými barvami shodnými s barvou štítků na lahvičkách a barvou specifických stop na aplikační masce. Lehký zákal, který se může vyskytnout v antisérech a zůstává i po 10 minutách při pokojové teplotě, při imunologické reakci nevadí. V případě nerozpustných precipitátů centrifugujte antiséra 5 minut při 600 g. Při odebírání těchto antisér (s manuální nebo automatickou distribucí prostřednictvím ASSIST / HYDRAPLUS) zkontrolujte, že je objem nad sraženinou dostatečný, aby se neodebírala tato sraženina, která může rušit interpretaci analýzy. K imunofixaci bílkovin, které byly rozděleny elektroforézou. Antiséra mohou pocházet od různých živočišných druhů. Nemíchejte proto antiséra ze dvou různých lahviček ani pokud jsou specifikovány stejně. Při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičku pipety. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci reagentů, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček. Skladujte v chladničce při 2-8 C. NEMRAZIT! Jsou stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu a na štítcích lahviček. Pokud se výrazným způsobem změní vzhled antisér (zákal) - vyřaďte je z použití FIXAČNÍ ROZTOk Fixační roztok je připraven k použití. Obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho nanášení je fixační prostředek obarven neškodným barvivem. K fixaci separovaných proteinů v referenční (ELP) stopě. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci reagentů, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček. Fixační roztok skladujte v chladu při teplotě 2 až 8 C. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky fixačního roztoku. Fixační roztok nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKA : Během přepravy je možné uchovávat antiséra a fixační roztok při pokojové teplotě (15 až 30 C) po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na jejich vlastnosti. 8. APLIkÁTORY K aplikaci vzorků na jedno použití. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 9. ANTISÉROVÉ SEGMENTY Barevné segmenty k aplikaci fixačního roztoku a antisér na gely k imunofixaci. UPOZORNĚNÍ : Se segmenty zkombinovanými s antiséry se musí zacházet jako s nebezpečným biologickým materiálem. 10. TENkÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Určeny k odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelů před aplikací vzorku. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /

5 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF / ZESÍLENÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K odsání nezaprecipitovaných proteinů z gelu po imunofixaci. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. ANTISÉRA A FIXAČNÍ ROZTOk (pro kity kat. č. 4301, 4302, 4304, 4308 a 4309) Balení s antiséry a fixačním roztokem, SEBIA, kat. č. 4315, obsahuje 5 lahviček s antiséry a 1 lahvičku s fixačním roztokem vše po 1 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s dynamickou maskou ANTISÉRA Viz čl FIXAČNÍ ROZTOk Viz čl ODBARVOVACÍ ROZTOk Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat. č. 4540, 10 lahviček po 100 ml) může být doplněna destilovanou nebo deionizovanou vodou do 100 L. Je však praktické ředit jen 5 ml zásobního roztoku do 5 L. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. K odstranění přebytečné barvičky z gelu a k výplachu prostoru určeného k barvení po promytí. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Nepřidávat azid sodný. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 3. PROMÝVACÍ ROZTOk PRO HYDRASYS Každá lahvička HYDRASYS Wash Solution (SEBIA, kat. č. 4541,10 lahviček a 80 ml) se ředí do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5. Promývací roztok je určen k vymytí neprecipitovaných bílkovin z gelů. Slouží rovněž k čištění oddílu HYDRASYSu určeného k barvení. Při denním používání přístroje se doporučuje promývat barvící prostor jednou za týden. Viz příbalový leták s návodem k použití. Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na štítcích lahviček s promývacím roztokem. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok odstraňte. 4. ŘEDICÍ ROZTOk NA VZORkY HYDRAGEL IF Ředicí roztok (SEBIA, kat. č. 4588, 1 lahvička, 80 ml) je připraven k použití. Reagent potřebný pro automatické ředění vzorků. Viz předchozí odstavec FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahv. 5 ml) připraveno k použití. K ředění viskózních nebo zakalených vzorků např. sér obsahujících kryoglobulin. Při teplotě místnosti. Stabilní do doby exspirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny. 6. BETA-MERkAPTOETHANOL (BME nebo 2-MERkAPTOETHANOL) (nedodávaný SEBIA)

6 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 7. ŘEDÍCÍ ROZTOk DTT (IF / IT) Složení Lahvička ředicího roztoku DTT (IF / IT) (SEBIA, kat. č : 1 lahvička, 13 ml) obsahuje : fosfátový tlumivý roztok s ph 7,4 ± 0,5 a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Ředicí roztok DTT (IF / IT) je určen pro přípravu lahvičky dithiothreitolu (DTT) na přípravu redukčního roztoku 0,5 M DTT, který se používá pro depolymerizaci monoklonálních bílkovin. Redukční roztok dithiothreitolu může být použit jako náhrada roztoku ß-merkaptoetanolu. Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. Skladování, stabilita a známky zhoršování Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : - HYDRASYS kat. č. 10 nebo kat. č. 11 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č.. nebo - HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 00, HYDRASYS 2 kat. č. 01, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 02, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor (SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 16, SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 17 nebo SEBIA ASSIST, kat. č. 18) jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Zásobní Komora kat. č. 70, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Souprava Kontejnerů dodávaná s HYDRASYSem. 5. Vodící tyčka šablony dodávaná s HYDRASYS systémem. 6. Dynamická maska, SEBIA, kat. č Pipety : 8 µl, 10 µl, µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl. ANALYZOVANÉ VZORkY Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky. Odběr séra a moči musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložené v chladničce (2 až 8 C) co nejdříve po odběru je možné uchovávat až jeden týden. Pro delší skladování vzorky zmrazte (stabilní nejméně jeden měsíc). Mražení sér s azidem sodným, 0.02 g/dl, zvyšuje stabilitu při skladování. Obdobně zvyšuje stabilitu při skladování mražení moči s HEPES 0.1 M (ph 6.75) a s azidem sodným 0.02 g/dl. POZOR : Kyselinu boritou jako konzervans nepoužívejte. Rozmražené vzorky mohou obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace proteinu nebo lipoproteinu. vzorků 1. Séra Připravte 1 vzorek pro HYDRAGEL 1F, 2 nebo 4 vzorky pro každý HYDRAGEL 2/4 IF a 9 vzorků pro HYDRAGEL 9 IF. Sérum se ředí před aplikací pro prevenci prozone efektu při vysokých hladinách. Dobře promíchat. STOPA SERUM (µl) DILUENT (µl) Imunofixační stopa Ig G Referenční stopa ELP a všechny další imunofixační stopy Zvláštní případy Je-li hladina celkových Ig vyšší než 20 g/l (hypergamaglobulinemie), použijte vyšší ředění vzorku (kromě stopy ELP). Je-li hladina celkových Ig nižší než 5 g/l (hypogamaglobulinemie), použijte nižší ředění vzorku (kromě stopy ELP). Séra a moče pacientů lze testovat na přítomnost Bence Jonesovy bílkoviny, potom lze použít program migrace "BENCE JONES". Vzorky by měly být testovány pomocí IF kitu a anti-kappa volnými řetězci (SEBIA, kat. č. 4370), anti-lambda volnými řetězci (SEBIA, kat. č. 4371) nebo HYDRAGEL 1, 2 nebo 4 BENCE JONES (SEBIA, kat. č. 4321, 4322 nebo 4324). V tomto případě nařeďte sérum fyziologickým roztokem nebo diluentem pro imunofixaci, předředěným 1/4 (1 díl diluentu a 3 díly destilované nebo deionizované vody), v poměru 1/10 v případě stop ELP, GAM, K a L (1 díl séra + 9 dílů ředěného diluentu nebo fyziologického roztoku) a 1/3 (1 díl séra + 2 díly ředěného diluentu nebo fyziologického roztoku ) pro stopy Kf a Lf). Je-li hladina celkových Ig menší než 5 g/l, vzorek se naředí v menším poměru např. : 1/5 pro stopy ELP, GAM. K a L, popř. 1/2 pro stopy Kf a Lf. Po ochlazení nebo zmražení některých sér (zvláště obsahují-li kryoglobuliny) dochází ke zvýšení viskozity nebo ke vzniku zákalu. Aby se předešlo problémům při nanášení vzorků, přidejte 25 µl Fluidilu k 75 µl séra a smíchejte po dobu 15 vteřin na Vortexu. Poté lze použít standardní postup. Některé monoklonální proteiny mohou polymerizovat a výsledkem je "monoklonální frakce" ve všech imunofixačních stopách. V tomto případě připravte 1% beta-merkaptoetanol (BME nebo 2-mercaptoethanol, 2 ME) ve Fluidilu - (je stabilní 1 týden v uzavřené mikrozkumavce při pokojové teplotě), přidejte 25 µl tohoto roztoku k 75 µl séra, promíchejte na vortexu a čekejte minimálně 15 min (maximálně 30 minut) a teprve potom použijte standardní postup

7 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 2. Koncetrované moče Většina vzorků moče se musí zahustit. Aplikuje se do všech stop. Zahušťujte na koncentraci celkové bílkoviny v moči 5 g/l. nebo celkové Ig ª 1 g/l. Pokud hodnoty koncentrace celkové bílkoviny nebo Ig nejsou známy zahušťujte 20x - 100x. DŮLEŽITÉ : Některé vzorky moče obsahují vysoké koncentrace solí, které mohou způsobit deformaci gelu během migrace a následovně pokřivení migračních profilů. Toto zkreslení může být příčinou nepřesné interpretace výsledků. Proto by soli v těchto močích měly být odstraněny dialýzou. Zákal moči (čiré nebo zahuštěné) může být příčinou zamezení difúze vzorku moči do špiček aplikátoru. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. : stříkačkový filtr 0.45 µm). Sensitivita testování močí může být zvýšena prodloužením času aplikace vzorku a času inkubace antisér za použití migračního programu "BENCE JONES". Hranice detekce pak odpovídá mg/l monoklonálního proteinu. Při této technice mohou být vzorky moči analyzovány nekoncentrované nebo koncentrované pro zvýšení citlivosti. POZN. : Pokusy zvýšit citlivost testu zahuštěním vzorků moče na co nejvyšší stupeň často rezultují ve vznik falešných proužků. Takové vzorky je pak nutno analyzovat znovu v nižších koncentracích. Speciální případ Lehké řetězce v moči mají sklon polymerizovat a tvořit agregáty. Pokud to narušuje interpretaci výsledků, měly by být lehké řetězce polymerů nepolymerizovány : (i) smíchejte 1 objemový díl BME s 9 objemovými díly vody nebo fyziologického roztoku (např. 5 µl BME a 45 µl wody nebo fyziologického roztoku), (ii) přidejte 5 µl zředěného BME ke 100 µl moči, dobře promíchejte, nechte inkubovat 10 až 15 minut a použijte bez dalšího ředění vzorku. Zpracujte standardními programy pro imunofixaci nebo "BENCE JONES". POZNÁMKA : Úprava roztoku ß-merkaptoetanolu může být nahrazena úpravou dithiothreitolu rozpuštěného v ředicím roztoku DTT (IF / IT), SEBIA, kat. č Viz kapitola "VYŽADOVANÉ REAGENTY" a pokyny pro použití ředicího roztoku DTT (IF / IT) s dalšími informacemi. Nepoužívat Vzorky plasmy proužek fibrinogenu v blízkosti místa aplikace v ß-zóně by mohl být zaměněn za monoklonální imunoglobulin. Hemolyzované vzorky. Vzorky staré, nesprávně skladované moče, u nichž mohla proběhnout enzymatická degradace proteinů. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP HYDRASYS je multiparametrový poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorku, elektroforetickou migraci, inkubaci s fixačním roztokem a antiséry, sušení, barvení, odbarvování a finální osušení. Manipulace se vzorky, gely, aplikace fixačního roztoku a antisér, reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS & HYDRASYS 2. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte 1 aplikátor pro HYDRAGEL 1 IF nebo HYDRAGEL 2/4 IF (2 vzorky), dva aplikátory pro HYDRAGEL 2/4 IF (4 vzorky) nebo tři aplikátory pro HYDRAGEL 9 IF, na rovný povrch s čísly jamek v pravé horní pozici (viz Obr. 1). - Naneste 10 µl zředěného séra nebo koncentrované moči do jamek aplikátoru dle následujícího schematu. Každý aplikátor musí být napipetován v průběhu dvou minut. Č. JAMkY : MIGRAČNÍ / IMUNOFIXAČNÍ STOPA ELP G A M k L HYDRAGEL 1 IF HYDRAGEL IF 2/4 VZOREK Č. 1 NEBO VZOREK Č. 2 NEBO HYDRAGEL 9 IF VZOREK Č. 1, 4 NEBO VZOREK Č. 2, 5 NEBO VZOREK Č. 3, 6 NEBO DŮLEŽITÉ : Pro HYDRAGEL IF 2/4, jamky č.1, 8 a 15 se v tomto testu nepoužívají, je vhodné je označit, aby nebyly omylem naplněny vzorky. - Uložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky nahoru (uchopit za ochranný plastikový rámeček). Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. - Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Pro pozdější použití (až po 8 hodinách) dejte celou komůrku do chladničky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte nosiče elektrod a aplikátorů. POZOR : Nikdy nezavírejte víko pokud jsou ještě zvednuty nosiče!

8 4. Vyberte program migrace z menu přístroje (levá strana klávesnice). HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 PŘÍSTROJ HYDRASYS 2 HYDRASYS PROGRAM MIGRACE PRO : VS < VS < 2.40 VS 2.40 Gel HYDRAGEL 1 IF 1 IF SM/DM 1 IF SM/DM 1 IF SM/DM nebo 1 IF SM/DM 1 IF fast SM/DM Gel HYDRAGEL IF 2/4 2/4 IF SM/DM 2/4 IF SM/DM 2/4 IF SM/DM nebo 2/4 IF SM/DM 2/4 IF fast SM/DM Gel HYDRAGEL 9 IF 9 IF SM/DM 9 IF DM 9 IF DM nebo 9 IF fast DM 9 IF DM 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - rychle a rovnoměrně narolujte tenký filtrační papír na povrch gelu tak, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! - Naneste 0 μl destilované nebo deionizované vody pro HYDRAGEL 1 IF nebo 200 μl pro HYDRAGEL IF 2/4 a HYDRAGEL 9 IF na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez bublin vzduchu. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte oba nosiče dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NOSIČE NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte rámeček ochraňující zuby aplikátoru. - HYDRAGEL 1 IF nebo 2/4 IF (2 vzorky) : aplikátor umístěte na nosič do pozice č HYDRAGEL 2/4 IF (4 vzorky) : dva aplikátory umístěte na nosič do pozic č. 3 a 9. - HYDRAGEL 9 IF : další aplikátory do pozic 2, 6 a 10. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). Ke zvýšení reprodukovatelnosti nanášení vzorků přesuňte aplikátory vždy k levé straně nosiče. 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sníženy tak, že proužky houbičky s pufrem a aplikátory kontaktují povrch gelu. Nosič aplikátoru vzorků se zvedne. Migrace se provádí za konstantního napětí 10 W pro HYDRAGEL 1 IF a za konstantního napětí 20 W pro HYDRAGEL IF 2/4 až do nahromaděné hodnoty 42 Vh a za konstantního napětí 20 W do 35 Vh nahromaděné hodnoty pro HYDRAGEL 9 IF při 20 C řízené Peltierovým jevem. Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko. Signál trvá do zásahu obsluhy. Na displeji se objeví blikající nápis "e AS" / "e ANTISERA". POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků. II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE Dynamická maska sestává z barevné referenční šablony pro aplikaci reagencií, segmentu pro antiséra, držáku segmentu pro antiséra, vodícího rámečku dynamické masky a distančního rámečku pro redukci délky (viz Obr. 5). Během migrace sestavte dynamickou masku následovně : 1. Položte vodící rámeček pro sestavení dynamické masky na rovnou plochu. DŮLEŽITÉ : Pro analýzu jednoho a dvou vzorků je nutné umístit do tohoto rámečku distanční rámeček pro redukci délky. 2. Nacvakněte segment pro nanášení antisér do jeho držáku (viz Obr. 6) : - segment pro antiséra nakloněný v úhlu 45 vtlačte proti plastikovým pružinkám do držáku, - současně táhněte segment i držák od sebe a otáčejte segment tak, aby se zafixoval do zoubků držáku. UPOZORNĚNÍ : Ujistěte se o správném umístění segmentu v držáku : výstupky na koncích segmentu musí být zablokovány v zoubcích držáku. 3. Umístěte držák se segmentem pro nanášení antisér do vodícího rámečku dynamické masky (viz Obr. 7). Vložte barevnou referenční šablonu pro aplikaci reagencií (dle příslušné metody) na držák - před jamky segmentu pro nanášení antisér (viz Obr. 8). 4. Reagencie aplikujte následovně : - segment pro antiséra - 6 jamek (HYDRAGEL 1 IF) : 8 μl na jamku, - segment pro antiséra - 15 jamek (HYDRAGEL IF 2/4) : 8 μl na jamku pro analýzu 2 vzorků, μl na jamku pro analýzu 4 vzorků, - segment pro antiséra - 18 jamek (HYDRAGEL 9 IF) : 8 μl na jamku

9 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 STOPA REAGENCIE BARVA ELP fixační roztok žlutá G antisérum proti těžkým řetězcům gama růžová A antisérum proti těžkým řetězcům alfa tmavomodrá M antisérum proti těžkým řetězcům mu žlutozelená K antisérum proti lehkým řetězcům kappa (volné i vázané) světlezelená L antisérum proti lehkým řetězcům lambda (volné i vázané) světlemodrá POZN. : Reagencie jsou obarveny a stejné barvy jsou použity na referenční barevné šabloně sloužící k usnadnění jejich aplikace. DŮLEŽITÉ : V případě kitu HYDRAGEL IF 2/4 nepoužívejte jamky v pozicích 1, 8 a Při pipetování se vyvarujte tvorby a nasátí bublin do špičky pipety. - Napipetujte reagencie (viz Obr. 9). - Pipetu držte v úhlu a při aplikaci špičku zlehka opřete o boční stranu jamky. - Vstříkněte kapku reagencie do jamky bez dotyku o dno jamky. 5. Vyjměte barevnou referenční šablonu. III. IMUNOFIXACE 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Vyjměte aplikátory vzorků a odstraňte je. 3. Zvedněte oba nosiče, vyjměte a odstraňte houbičkové proužky s pufrem. - Vyjměte oba nosiče. - Pečlivě otřete elektrody měkkou zvlhčenou tkaninou (gázou). - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte dynamickou masku pro aplikaci reagencií následujícím postupem (viz Obr. 10) : - Umístěte vodící kovovou tyčku na ukotvující trny (může být ponechána v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte dynamickou masku a položte ji na vodící tyčku (zářezy zarovnanými se značkami). - Následně položte dynamickou masku na migrační plochu v HYDRASYSU. DŮLEŽITÉ : Upravte pozici dynamické masky pro dokonalé spojení mezi elektro-foretickými profily a jamkami masky. 5. Přesuňte držák segmentu do nejnižšího bodu vodícího rámeček dynamické masky, směrem k obsluze. Uchopte držák segmentu za úchytku na pravé straně a zatlačte prstem druhé ruky na centrálně umístěný - označený bod tak, aby se segment pro antiséra dostal do kontaktu s gelem. Po uvolnění tlaku se reagencie rozprostřou pod každou stopou (viz Obr. 11). 6. Nyní, za použití úchytky držáku segmentu, pohybujte pomalu, ale plynule nahoru a dolů po celé délce gelu dojde k rovnoměrné aplikaci reagencií. Aplikace by měla trvat přibližně 5 sekund (viz Obr. ). POZOR : Během tohoto kroku držte masku pouze za úchytku držáku segmentu pro nanášení antisér. Nedotýkejte se vodícího rámečku dynamické masky a nestlačujte opakovaně centrální bod. Mohlo by dojít ke zkřížené kontaminaci reagencií. 7. Vyjměte vodící rámeček i s dynamickou maskou. - vyjměte držák segmentu, - vyjměte segment pro aplikaci antisér z držáku a odstraňte jej, - po aplikaci mohou v jamkách zůstat zbytky reagencií. Na výsledky testu by to však nemělo mít vliv. 8. Uzavřete víko migračního modulu. 9. Stisknutím klávesy se zelenou šipkou "START" na levé straně klávesnice proces nastartujete. Na displeji se zobrazí nápis : "[INCUBATION]". IMUNOFIXACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků Inkubace řízená Peltierovým jevem při 20 C. Slyšitelné pípnutí signalizuje odjištění víka migračního modulu. Na displeji se objeví následující zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER". POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzamčeno. IV. ODSÁTÍ GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Na gel dejte zesílený filtrační papír : Zarovnejte okraj filtračního papíru s okrajem gelu (nakloňte jej v úhlu 45 ) a zlehka jej položte na gel. DŮLEŽITÉ : Pevně tlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalé přilnavosti ke gelu. 3. Zavřete víko migračního modulu. 4. Stisknutím tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice) se tato procedura nastartuje. ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků Odsátí řízené Peltierovým jevem při 40 C. Na displeji je zobrazena zpráva "[BLOTTING]". Zazní slyšitelný signál. Na displeji se zobrazí zpráva "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER". V. SUŠENÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Víko zavřete. 4. Sušení nastartujete stiskem klávesy "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici)

10 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 SUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků Vysušení řízené Peltierovým jevem při 50 C. Pípnutí signalizuje odjištění víka. Teplota plátu zůstává až do otevření 50 C. Na displeji je zpráva "MAINTAINED MIGR. TEMPERATURE" / "MAINTAINED TEMPERATURE". POZN. : V průběhu sušení zůstává víko migračního modulu zajištěno. VI. NABARVENÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte osušený gel. 3. Otevřete držák gelu. Položte jej vodorovně a plotnu (gelem nahoru) umístěte do drážek v obou tyčkách a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je v držáku umístěn správně (viz Obr. 13). 4. Držák s gelem nyní vložte do modulu určeného k vyvolání / barvení. DŮLEŽITÉ : Před zahájením této procedury zkontrolujte : - zda kontejner na promývací roztok obsahuje nejméně 400 ml tohoto roztoku, - zda kontejner na barvicí roztok obsahuje 300 ml tohoto roztoku, - zda kontejner na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 1 litr tohoto roztoku, - zda kontejner na odpad je prázdný (není plný). Informace o připojení reagencií lze zjistit na displeji po zvolení tlačítka "REAGENT LINES". DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité vývody. 5. Z menu přístroje vyberte barvicí program a spusťte jej stisknutím klávesou "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice) pro vzorky séra a koncentrované moči. PŘÍSTROJ HYDRASYS HYDRASYS 2 VS < VS < 2.40 VS 2.40 PROGRAM PRO BARVENÍ IF ACID VIOLET nebo IF AMIDO IF ACID VIOLET nebo IF AMIDO IF ACID VIOLET* nebo IF fast ACID VIOLET** nebo IF AMIDO IF ACID VIOLET SERUM nebo IF AMIDO * Pro programy migrace "1 IF SM/DM", "2/4 IF SM/DM" nebo "9 IF DM". ** Pro programy migrace "1 IF fast SM/DM", "2/4 IF fast SM/DM" nebo "9 IF fast DM". VAROVANÍ : U HYDRASYS 2 (VS 2.40), když se analyzují vzorky programem migrace "BENCE JONES", musí se zvolit program pro barvení "IF/BJ ACID VIOLET - URINE". Nebarvěte gel programem pro barvení "IF ACID VIOLET SERUM". Během barvících, odbarvovacích a sušících kroků tato část zůstává zajištěna. Po ochlazení slyšitelné pípnutí signalizuje, že se tento oddíl odjistil (ventilace je udržována až do vynětí držáku s gelem). POZN. : - Teplota migrační plochy poklesne po otevření až na 20 C (v méně než 5ti minutách). Poté je možno zahájit novou migraci. - Vraťte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Vysušte migrační plochu měkkým hadříkem nebo gázou. VII.kONEČNÉ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák s gelem z této části, otevřete jej a suchý gel vytáhněte. 2. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou stranu gelu vlhkým hadříkem nebo gázou. POZN. : Délka jednotlivých elektroforeogramů se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách, bez následku na provedení testu. kontrola kvality Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788). POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být roztok Normal Control Serum séra SEBIA (kat. č. 4785) nebo roztok Hypergamma Control Serum SEBIA (kat. č. 4787) použit jako negativní kontrola. VÝSLEDkY Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. 1. Serum Nepřítomnost monoklonální komponenty Normální vzorek séra vykazuje jemně difúzní zbarvení polyklonálních imunoglobulinů ve všech stopách. Hypergamaglobulinemie je charakterizována výrazně zbarvenou, difúzní zónou gama bez přítomnosti ostrých proužků

11 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 Přítomnost monoklonální komponenty Přítomnost monoklonálního proteinu (gamapatie) je charakterizována monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti těžkým řetězcům (g, a a µ) a nebo antisérem proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Detekovaný monoklonální proužek, typicky ostře ohraničený, musí být umístěn ve stejné migrační vzdálenosti jako susp. monoklonální proužek v referenční stopě (ELP). Chybění reakce s antiséry proti těžkým řetězcům a současná reakce s jedním z antisér proti lehkým řetězcům může svědčit pro (i) gamapatii lehkých řetězců nebo (ii) velmi vzácnou gamapatii Ig D nebo Ig E. Potvrzení se provádí v prvním případě pomocí antisér proti volným lehkým řetězcům kappa a lambda, nebo ve druhém případě antiséry anti-delta nebo anti-epsilon těžkým řetězcům. Chybí-li pozitivní reakce s antiséry proti lehkým řetězcům, zatímco některé z antisér proti těžkým řetězcům reaguje, může jít o velmi vzácnou gamapatii těžkých řetězců (g, a a µ). Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent Ve vzácných případech může proliferovat několik klonů B-buněk imunofixací je odhaleno několik monoklonálních proužků : Biklonální gamapatie je charakterizována přítomností dvou proužků těžkých řetězců (identických nebo různých) a dvou proužků lehkých řetězců (identických nebo různých). Polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány přítomností několika proužků téhož typu těžkých řetězců a jedním stejným typem lehkého řetězce. K potvrzení přítomnosti jednoduché monoklonální abnormality je nutná depolymerizace beta-merkaptoetanolem a opakovaná imunofixace (viz "Analyzované vzorky"). Oligoklonální gamapatie je charakterizována přítomností mnohočetných proužků jednoho nebo více typů těžkých řetězců nebo jedním či dvěma typy řetězců lehkých. Zvláštní případy Monoklonální proužek pozorovaný při elektroforéze (ELP stopa), který nelze potvrdit imunofixací, svědčí pro přítomnost fibrinogenu - jedná se zřejmě o vzorek plazmy. Vyskytne-li se monoklonální proužek ve všech imunofixačních stopách, může se jednat o kryoglobulin nebo polymerizovaný Ig M. Nutno depolymerizovat pomocí redukující reagencie a analýzu opakovat (viz "Analyzované vzorky"). U některých gamopatií Ig A mohu být přítomny antiséra proti lehkým řetězcům s mírnou afinitou k odpovídajícímu monoklonálnímu imunoglobulinu, takže je jejich detekce ztížena. V takovém případě se doporučuje otestovat vzorek pomocí imunofixačního postupu BENCE JONES, kdy je reakce antiséra zesílena v důsledku delší doby inkubace (viz příbalový leták sady HYDRAGEL BENCE JONES pro ředění sér). Při polyklonálním pozadí se doporučuje použít vyšší zředění vzorku pro antisérové stopy a zejména pro stopu Ig G. HYDRAGEL 9 IF : Pro oligoklonální gamopatie se doporučuje použít imunofixační postup HYDRAGEL 1, 2 nebo 4 IF pro získání lepšího rozlišení v gama zóně, kdy prodloužená gamaglobulinová zóna umožňuje vizualizace více proužků. 2. Moč Pro imunofixační typy moči platí podobné interpretační koncept jako je popsaný výše pro séra. Intaktní monoklonální bílkovina v moči je charakterizována monoklonálním proužkem detekovaným buď jedním z antisér proti těžkým řetězcům (g, a a µ) nebo antiséry proti lehkým řetězcům kappa a lambda (volným a vázaným). Detekovaný monoklonální proužek, ostře ohraničený, musí být lokalizován ve stejné migrační vzdálenosti jako suspektní monoklonální proužek v referenční elektroforetické stopě (ELP). Volný lehký řetězec, Bence Jonesova bílkovina (tubulární protein) je charakterizován monoklonálním proužkem detekovaným antisérem proti anti-kappa nebo anti-lambda lehkým řetězcům (volným a vázaným). Žádná pozitivní reakce by neměla být viděna ve stopách s antiséry proti těžkým řetězcům (g, a a µ). Interference a omezení Viz kapitola ANALYZOVANÉ VZORkY. Fibrinogen nebo zbytkový fibrin mohou vést k umělým proužkům ve všech stopách. Jejich intenzita, která je obecně důležitější ve stopě Ig A, se může v různých stopách lišit. jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití dynamické masky, může mít špatný vliv na výsledky. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : HODNOTY Reprodukovatelnost mezi vzorky a specificita HYDRAGEL 4 IF metoda Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích : dva s jednou monoklonální komponentou o vysoké koncentraci a jeden vzorek se dvěmi monoklonálními komponentami o nízké koncentraci. Každý vzorek byl podroben 4 testům na HYDRAGEL IF 2/4 gelech 2 šarží, při použití barvení kyselou violetí. HYDRAGEL 9 IF metoda Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích, každý s jednou monoklonální komponentou o vysoké koncentraci. Každý vzorek byl podroben 9 testům na HYDRAGEL 9 IF gelech 2 šarží, při použití barvení kyselou violetí. Všechna opakování dala identický výsledek na gelech stejné šarže i mezi šaržemi, a jak se očekávalo, i shodný typ testovaného vzorku

12 Reprodukovatelnost mezi gely a specificita HYDRAGEL 4 IF metoda Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na čtyřech různých patologických vzorcích s jednou nebo vícemi monoklonálními komponentami. Tyto vzorky byl podrobeny 10-ti testům na HYDRAGEL IF 2/4 gelech 3 různých šarží, při použití barvení kyselou violetí. HYDRAGEL 9 IF metoda Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na devíti různých patologických vzorcích : dva s jednou monoklonální komponentou o vysoké koncentraci, jeden vzorek se dvěmi monoklonálními komponentami o nízké koncentraci a jeden vzorek se dvěmi monoklonálními komponentami, jednou o nízké a druhou o vysoké koncentraci. Každý vzorek byl podroben 10 testům na HYDRAGEL 9 IF gelech 3 šarží, při použití barvení kyselou violetí. Všechna opakování dala identický výsledek na gelech stejné šarže i mezi šaržema, a jak se očekávalo, i shodný typ testovaného vzorku. Přesnost HYDRAGEL 4 IF metoda s kyselou violetí Sedmdesát tři (73) různých patologických sérových vzorků, jedenáct (11) normálních sér a dvanáct () zahuštěných močí bylo podrobeno analýze na HYDRAGEL IF 2/4 gelech a jiných komerčně dostupných agarózových gelových systémech. HYDRAGEL 4 IF metoda s barvením amidočerní Dvacet osm (28) různých patologických sérových vzorků a čtyři (4) normální séra byla podrobena analýze na HYDRAGEL IF 2/4 gelech a jiných komerčně dostupných agarózových gelových systémech. HYDRAGEL 9 IF metoda s barvením kyselou violetí Devadesát pět (95) různých patologických sérových vzorků, čtyři (4) normální séra a dvanáct () zahuštěných močí bylo podrobeno analýze na HYDRAGEL 9 IF gelech a jiných komerčně dostupných agarózových gelových systémech. Ve všech případech, výsledky analyzované na gelech SEBIA a jiných komerčně dostupných testech, byly identické. Citlivost Následně ředěné 4 patologické vzorky séra s monoklonální bílkovinou byly analyzovány HYDRAGEL 4 IF metodou. Pro barvení byla použita jak kyselá violeť, tak i amidočerň. Výsledky jsou následně sumarizovány : HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 VZOREk Č MONOkLONÁLNÍ SLOŽkA TYP konc. (g/dl) gama kappa 1.09 gama lambda 0.78 alfa lambda 0.58 mu kappa 0.34 DETEkČNÍ LIMIT (mg/dl) HYDRAGEL 4 IF HYDRAGEL 4 IF kyselá VIOLET AMIDOČERŇ / / V závislosti na umístění monoklonální komponenty, úrovně polyklonálního pozadí v gama zóně a barvičce, detekční limit se může pohybovat od do 25 mg/dl

13 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir : For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to: 1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris. 2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp. 3. Su L, Keren DF, Warren JS. Failure of anti-lambda immunofixation reagents mimics alpha heavy-chain disease [letter]. Clin. Chem., 41, 1-2 (1995). 4. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact- Internat, 1986 ; Sept :

14 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure sebia

15 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 SCHÉMAS / FIGURES Figure 5 Repère couleurs Colored Reference Guide ELP G A M K L ELP HYDRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L Barrette antisérums Antisera Segment Bossage (Boss) Ergot (Pin) Support barrette Segment Holder Poignée (Flap) Encoche (notch) Puits (wells) Point d'appui central (Central Pressure Point) Ressorts (Springs) Réducteur de course Length Reducing Device Guide du masque dynamique Dynamic Mask Guide Poignée (Flap)

16 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 SCHÉMAS / FIGURES Figure 6 Figure Figure 8 Figure 9 ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L HYDRAGEL 9 IF ELP G A M K L ELP HYDRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L Figure 10 Figure 11 GEL 9 IF A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L DRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L

17 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 IF /07 SCHÉMAS / FIGURES Figure DRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L Figure 13 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia

18 Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0) Fax : 32 (0) sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : Fax : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, Fulda Deutschland Tel. : 49 (0) Fax : 49 (0) sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n Barcelona España Tel. : Fax : sebia@sebia.es Inc Corporate Drive Norcross, GA U.S.A. Tel. : Fax : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 500 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : Fax : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0) Fax : 44 (0) info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0) sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room Fuzhou Road Shanghai China Tel. : (21) Fax : (21) sebia@sebia.cn