HYDRAGEL 9 BENCE JONES

Transkript

1 HYDRAGEL 1 BENCE JONES Ref HYDRAGEL 2 BENCE JONES Ref HYDRAGEL 4 BENCE JONES Ref HYDRAGEL 9 BENCE JONES Ref. 4383* 2009/12

2 POUŽITÍ KITU HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 HYDRAGEL 1 BENCE JONES, HYDRAGEL 2 BENCE JONES, HYDRAGEL 4 BENCE JONES, HYDRAGEL 9 BENCE JONES kity jsou určeny k identifikaci i kvalitativnímu stanovení Bence Jonesovy bílkoviny volných monoklonálních řetězců kappa a lambda v lidské moči nebo v séru imunofixační elektroforézou na agaróze. Detekce Bence Jones bílkovin pomáhá v identifikaci monoklonálních gamapatií. Každý agarózový gel je určen pro analýzu : - jednoho vzorku pomocí kitu HYDRAGEL 1 BENCE JONES, - dvou vzorků pomocí kitu HYDRAGEL 2 BENCE JONES, - čtyř vzorků pomocí kitu HYDRAGEL 4 BENCE JONES, - devíti vzorku pomocí kitu HYDRAGEL 9 BENCE JONES. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Abnormální proužky zjištěné elektroforézou v zóně beta a gamaglobulinů mohou vyvolávat podezření na výskyt monoklonálních proteinů a tím gamapatie. K identifikaci těchto abnormálních proužků slouží imunofixace. Imunofixační elektroforéza umožní zafixování proteinů in situ, kde tvoří nerozpustné komplexy s odpovídajícími protilátkami. Test se provádí ve spojení s poloautomatizovaným systémem HYDRASYS : 1. Vzorek se simultánně elektroforeticky dělí v šesti stopách na alkalicky pufrovaném agarózovém gelu. 2. Po elektroforéze první stopa (ELP) slouží jako referenční. Zbývajících 5 stop Je použito k nanesení specifických antisér trivalentní proti těžkým řetězcům (G,A,M), anti-kappa a anti-lambda volným a vázaným lehkým řetězcům a anti-kappa a anti-lambda volným řetězcům. 3. Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen-protilátka zůstává v gelové matrix. 4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány barvením kyselou violetí. Přebytek barvičky je odstraněn kyselým roztokem. 5. Proužky s imunoprecipitáty jsou porovnány s odpovídajícími abnormálními frakcemi elektroforézou rozděleného vzorku a identifikovány podle reakce s odpovídajícími antiséry. Tato jednoduchá a rychlá technika poskytuje jasné a lehce interpretovatelné výsledky. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITECH HYDRAGEL 1 BENCE JONES, HYDRAGEL 2 BENCE JONES, HYDRAGEL 4 BENCE JONES, HYDRAGEL 9 BENCE JONES HYDRAGEL 1 BENCE JONES KIT HYDRAGEL 2 BENCE JONES KIT HYDRAGEL 4 BENCE JONES KIT HYDRAGEL 9 BENCE JONES KIT KAT. Č KAT. Č KAT. Č KAT. Č. 4383* Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 10 gelů 80 gelů Pufrované stripy (připraveno k použití) 10 bal. a 2 ks 10 bal. a 2 ks 80 bal. a 2 ks Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahv., 75 ml 1 lahv., 75 ml 8 lahv. a 75 ml Fixační roztok (připraveno k použití) 1 lahv., 2.9 ml Savčí Ig proti lidským těžkým řetězcům γ, α, µ (trivalent) (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským lehkým řetězcům (volným a vázaným) kappa (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským lehkým řetězcům (volným a vázaným) lambda (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí Ig proti lidským lehkým řetězcům lambda free (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Savčí Ig proti lidským lehkým řetězcům kappa free (připraveno k použití) 1 lahv., 2.0 ml Aplikátory (připraveno k použití) 1 bal. a 10 ks 2 bal. a 10 ks 24 bal. a 10 ks Antisérové segmenty (připraveno k použití) 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 8 bal. a 10 ks Filtrační papíry - Tenké 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 8 bal. a 10 ks Filtrační papíry - Zesílené 1 bal. a 10 ks 1 bal. a 10 ks 8 bal. a 10 ks (*) HYDRAGEL 9 BENCE JONES MAXI-KIT POZNÁMKA : Fixační roztok a antiséra jsou dodávány samostatně s výjimkou balení MAXI-KIT (viz POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V SADĚ). Během přepravy může být MAXI-KIT uchován bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Připraveny k použití, každý gel obsahuje agarózu 0.8 g/dl, tris-barbital pufr ph 9.1 ± 0.1 a přídavné látky nezbytbě nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZOR : Agarózové gely obsahují 0.31 % barbitalu a 0.34 % barbiturát sodný. Nepolykat, v případě polknutí kontaktujte lékaře! Nosné medium pro elektroforézu a imunofixaci SEBIA NÁVOD - Czech

3 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ STRIPY Proužky s pufrem jsou připraveny k použití.každý obsahuje: tris-barbital pufr o ph 9.1 ± 0.3, azid sodný a další přídavné látky nezbytné pro provedení testu, neškodné v použitých koncentracích. POZOR : Pufr ve stripech obsahuje 0.92 % barbital, 1.03 % barbital sodný a azid sodný 0.30 %. Nepolknout! Při požití konzultovat lékaře. Azid sodný, pokud se dostane do kontaktu s mědí, olovem a kyselinami, může vést k tvorbě explozivních nebo toxických sloučenin. Proto při likvidaci roztoku např. vylitím do výlevky, vyplachovat velikým množstvím vody! Pufrované stripy slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu a štítcích balení s proužky. NEMRAZIT! Nepoužívejte vyschlé stripy z poškozených obalů. 3. KYSELÁ VIOLEŤ Obsah lahvičky se zásobním roztokem kyselé violeti doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po rozředění pracovní barvící roztok obsahuje kyselý roztok o ph 2 kyselou violeť g/dl, 3.25 % etylen glykol, přídavné látky nezbytné pro optimální provedení testu, v koncentracích, které neškodí zdraví. POZOR : Nepolykat, škodí! Barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 6 měsíců. 4. FIXAČNÍ ROZTOK A ANTISÉRA (kat. č. 4383) 4.1. ANTISÉRA Všechna antiséra jsou savčí imunoglobuliny protilátky proti lidským bílkovinám, ihned použitelná k analýze. Ke snadnějšímu rozlišení jsou antiséra zbarvena různými barvami shodnými s barvou štítků na lahvičkách a barvou specifických stop na aplikační masce. Lehký zákal, který se může vyskytnout v antisérech a zůstává i po 10 minutách při pokojové teplotě, při imunologické reakci nevadí. V případě nerozpustných precipitátů centrifugujte antiséra 5 minut při 3000 otáčkách. K imunofixaci bílkovin, které byly rozděleny elektroforézou. Antiséra mohou pocházet od různých živočišných druhů. Nemíchejte proto antiséra ze dvou různých lahviček ani pokud jsou specifikovány stejně. Při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičku pipety. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci reagentů, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček. Skladujte v chladničce při 2-8 C. Jsou stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu a na štítcích lahviček. Pokud se výrazným způsobem změní vzhled antisér (zákal) - vyřaďte je z použití. POZN.: Během transportu antiséra vydrží při teplotě C až 15 dní FIXAČNÍ ROZTOK Hotov k použití. Obsahuje roztok kyseliny a přídavné látky nezbytné pro optimální provedení. K usnadnění identifikace je obarven neškodnou barvičkou. K fixaci separovaných proteinů v referenční (ELP) stopě. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci reagentů, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček. Při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilita : do data exspirace vyznačeného na obalu kitu a na štítku lahvičky. Po vzniku precipitátů nelze použít

4 5. APLIKÁTORY K aplikaci vzorků na jedno použití. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 6. ANTISÉROVÉ SEGMENTY Barevné segmenty k aplikaci fixačního roztoku a antisér na gely k imunofixaci. UPOZORNĚNÍ : Se segmenty zkombinovanými s antiséry se musí zacházet jako s nebezpečným biologickým materiálem. 7. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Určeny k odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelů před aplikací vzorku. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 8. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K odsání neprecipitovaných proteinů z gelu po imunofixaci. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. ANTISÉRA A FIXAČNÍ ROZTOK (pro kity kat. č. 4321, 4322 a 4324) Balení s antiséry a fixačním roztokem, GAM, K, L (anti - γ, α, µ, anti-kappa volným a vázaným lehkým řetězcům a anti-lambda volným a vázaným lehkým řetězcům), SEBIA, kat. č. 4335, obsahuje 3 lahvičky s antiséry a 1 lahvičku s fixačním roztokem vše po 1 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s dynamickou maskou ANTISÉRA Viz článek FIXAČNÍ ROZTOK Viz článek BALENÍ S ANTISÉRY PROTI VOLNÝM LEHKÝM ŘETĚZCŮM (pro kity kat. č. 4321, 4322 a 4324) Speciální balení s anti-kappa volnými lehkými řetězci a anti-lambda volnými lehkými řetězci, SEBIA kat. č. 4336, obsahuje 2 lahvičky s antiséry po 1 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s dynamickou maskou. Viz předchozí odstavec ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, PN 4540, 10 lahviček po 100 ml) může být doplněna destilovanou nebo deionizovanou vodou do 100 L. Je však praktické ředit jen 5 ml zásobního roztoku do 5 L. Takto naředěný pracovní roztok obsahuje kyselinu citronovou 0.5 g/l. K odstranění přebytečné barvičky z gelu a k výplachu prostoru určeného k barvení po promytí. K neutralizaci acidity odbarvovacího roztoku nalej do prázdného kontejneru na odpad 15 ml 50 % roztoku NaOH. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiálního růstu ve zředěném odbarvovacím roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl roztoku ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 4. PROMÝVACÍ ROZTOK PRO HYDRASYS Každá lahvička promývacího roztoku HYDRASYS (SEBIA, PN 4541,10 lahviček a 80 ml) se ředí do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Takto připravený pracovní promývací roztok obsahuje alkalický pufr ph 8.8 ± 0.3, azid sodný. POZOR : Zásobní promývací roztok obsahuje % azid sodný. Nepolykat! Při požití konzultovat lékaře. Azid sodný, pokud se dostane do kontaktu s mědí, olovem a kyselinami, může vést k tvorbě explozívních nebo toxických sloučenin. Proto při likvidaci roztoku vyplachovat vždy velkým množstvím vody! Promývací roztok je určen k vymytí neprecipitovaných bílkovin z gelů. Slouží rovněž k čištění oddílu HYDRASYSu určeného k barvení. Při denním používání přístroje se doporučuje promývat barvící prostor jednou za týden. Viz příbalový leták s návodem k použití. Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na štítcích lahviček s promývacím roztokem. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok odstraňte

5 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 5. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Musí se připravit v laboratoři 0.9 g/dl NaCl (0.15 M) roztok v destilované nebo deionizované vodě. V případě potřeby k ředění vzorků. Skladování: při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestat používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č. 1200, kat. č. 1201, kat. č. 1202, kat. č. 1203, kat. č nebo kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor (SEBIA HYDRAPLUS, kat. č nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217) jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Zásobní Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Souprava Kontejnerů Dodávaná s HYDRASYSem. 5. Vodící Tyčka Šablony Dodávaná s HYDRASYS systémem. 6. Dynamická maska, SEBIA kat. č Pipety : 8 µl, 10 µl, 12 µl, 20 µl, 100 µl a 200 µl. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Analýzy by se měly převážně provádět čerstvou močí odebranou nejdéle před 24 hodinami (není-li to možné, je doporučeno analyzovat vzorky moči odebrané při prvním či druhém ranním vylučování). Odběr moči musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu jednoho týdne. Pro skladování na delší dobu: Bez přidání dalších látek je doporučeno skladovat moč zmraženou na - 70 C. S přídavkem konzervantu je možné vzorky zmrazit na - 20 C. Mražení s roztokem HEPES 0,1 M (ph 6,75) a/nebo azidem sodným 0,02 g/dl zvýší stabilitu při skladování. Zmražené vzorky moči jsou stabilní nejméně jeden měsíc. Roztáté či nevhodně skladované vzorky mohou vykazovat známky degradace proteinů a jsou-li přítomné imunoglobuliny i fragmentaci těžších řetězců a anodickou mobilitu (v zónách alfa-2 beta) bez odpovídajících těžších řetězců. DŮLEŽITÉ: Nepoužívejte kyselinu boritou jako konzervant. POZNÁMKA: Vzorky by neměly být skladovány při pokojové teplotě! Odběr séra pro analýzu musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. V případě potřeby lze séra skladovat při teplotě 2 až 8 C až po dobu jednoho týdne. Pro delší skladovací doby uchovávejte vzorky zmrazené. Zmražené vzorky séra jsou stabilní nejméně jeden měsíc. Rozmražené vzorky mohou obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace proteinu nebo lipoproteinu. vzorků Moč Používá se nezahuštěná moč. Hladina detekce Bence Jonesovy bílkoviny se pohybuje v rozmezí g/l. Požadujeme li vyšší citlivost stanovení, je nutno vzorek zahustit běžným postupem zavedeným v laboratoři. Obvykle stačí 20ti až 100-násobné zahuštění. POZN. : Je -li zákal v analyzované moči, může být bržděna difúze do špiček aplikátoru. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (např.: 10 min. při 3000 ot./min.) nebo filtrací (např.: stříkačkový filtr 0.45 µm). Séra K analýze se používá v případě nutnosti potvrzení nálezu volných lehkých řetězců. Sérum se ředí fyziologickým roztokem nebo diluentem pro imunofixaci po předchozím ředění 1/4 (1 díl diluentu, 3 díly deionizované nebo destilované vody) : 1/10 pro stopy ELP, GAM, K, L (1 díl séra + 9 dílů fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) a 1/3 (1 díl séra + 2 díly fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) pro zóny (stopy) kappa free a lambda free (Kf, Lf). POZN.: Pokud je celková hladina imunoglobulinů menší než 5 g/l, doporučuje se nižší ředění Sérum se ředí fyziologickým roztokem nebo diluentem pro imunofixaci po předchozím ředění 1/4 : 1/5 pro stopy ELP, GAM, K, L ( 1 díl séra + 4 díly fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) a 1/2 (1 díl séra +1 díl fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) pro zóny (stopy) kappa free a lambda free (Kf, Lf). DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte vzorky plasmy proužek fibrinogenu v blízkosti místa aplikace by mohl být zaměněn za monoklonální imunoglobulin. Některé vzorky moče obsahují vysoké koncentrace solí, které mohou způsobit deformaci gelu během migrace a následovně pokřivení migračních profilů. Toto zkreslení může být příčinou nepřesné interpretace výsledků. Proto by soli v těchto močích měly být odstraněny dialýzou. Paraproteiny v moči mohou být proteolyticky změněny v důsledku mikrobiální kontaminace. Nastává pozitivní reakce s antiséry proti volným lehkým řetězcům. V takovém případě sérový paraprotein vylučovaný do moče se může s trivalentním antisérem, s jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům a s antisérem proti odpovídajícímu volnému lehkému řetězci jevit jako monoklonální proužek. Polymerizace Bence Jones proteinů snižuje citlivost detekce antiséry proti volným lehkým řetězcům; polymerizace totiž blokuje epitopy, které normálně reagují s těmito antiséry. V případě podezření na přítomnost Bence Jonesových proteinů, proveďte před elektroforézou depolymerizaci : smíchejte 100 µl moči s 5 µl beta-merkaptoethanolu zředěného v poměru 1:10 fyziologickým roztokem nebo destilovanou či deionizovanou vodou a vložte do aplikátoru

6 PRACOVNÍ POSTUP HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 HYDRASYS je multiparametrový poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorku, elektroforetickou migraci, inkubaci se substrátem, odsávání, oplach a osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. Teplota migračního modulu je řízena na principu Peltierova efektu. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor pro HYDRAGEL 1 BENCE JONES nebo pro HYDRAGEL BENCE JONES 2/4 (2 vzorky), dva aplikátory pro HYDRAGEL BENCE JONES 2/4 (4 vzorky) nebo 3 aplikátory pro HYDRAGEL 9 BENCE JONES na rovnou plochu čísly jamek v pravé horní pozici (viz Obr. 1). - Naneste 10 µl vzorku do jamek aplikátoru dle následujícího schematu : Každý aplikátor musí být napipetován ve 2 minutách. ČÍSLA JAMEK: MIGRAČNÍ / IMUNOFIXAČNÍ STOPA ELP GAM K L Kf Lf HYDRAGEL 1 BENCE JONES HYDRAGEL BENCE JONES 2/4 VZOREK Č. 1 NEBO VZOREK Č. 2 NEBO HYDRAGEL 9 BENCE JONES VZOREK Č. 1, 4 NEBO VZOREK Č. 2, 5 NEBO VZOREK Č. 3, 6 NEBO POZN. : Pro HYDRAGEL BENCE JONES 2/4, jamky č.1, 8 a 15 se v tomto testu nepoužívají, je vhodné je označit, aby nebyly omylem naplněny vzorky. - uložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky nahoru (uchopit za ochranný plastikový rámeček), - nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víčko migračního modulu a zvedněte elektrodu a nosiče aplikátorů. POZOR : Nikdy nezavírejte víčko pokud jsou ještě zvednuty nosiče! 4. Z menu přístroje umístěného v levé části klávesnice zvolte program migrace "1 BJ SM/DM" pro HYDRAGEL 1 BENCE JONES, "2/4 BJ-UP SM/DM" pro HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES, nebo "9 BJ DM" pro HYDRAGEL 9 BENCE JONES. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu gelu hrozí jeho dehydratace! - Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody pro HYDRAGEL 1 BENCE JONES nebo 200 µl pro HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES a HYDRAGEL 9 BENCE JONES na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše migračního modulu. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez bublin vzduchu. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte oba nosiče dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. MA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte rámeček ochraňující zuby aplikátoru. - Aplikátor(y) umístěte na nosič : - HYDRAGEL 1 BENCE JONES nebo HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES (pro 2 vzorky) : do pozice č HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES (pro 4 vzorky) : do pozice č. 3 a 9. - HYDRAGEL 9 BENCE JONES : do pozice 2, 6 a 10. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). Pro zlepšení reprodukovatelnosti aplikace vzorků přesuňte vždy aplikátory na levou stranu nosiče. 9. Ujistěte se zda jsou oba nosiče sníženy. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sníženy proužky s pufrem a aplikátory kontaktují povrch gelu. Nosič aplikátoru vzorků se zvedne. Proběhne migrace při konstantních 10 W pro HYDRAGEL 1 BENCE JONES a nebo při konstantních 20 W pro HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES při 20 C až do akumulovaných 42 Vh (na asi 9 minut), nebo při konstantních 20 W do akumulovaných 36 Vh na 7 minut pro HYDRAGEL 9 BENCE JONES při 20 C řízených Peltiereovým efektem. Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko. Signál trvá do zásahu operátora. Na displeji se objeví blikající nápis "e AS" / "e ANTISERA". POZN.: Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků

7 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE Dynamická maska sestává z barevné referenční šablony pro aplikaci reagencií, segmentu pro antiséra, držáku segmentu pro antiséra, vodícího rámečku dynamické masky a distančního rámečku pro redukci délky (viz Obr. 5). Během migrace sestavte dynamickou masku následovně : 1. Položte vodící rámeček pro sestavení dynamické masky na rovnou plochu. DŮLEŽITÉ : Pro analýzu jednoho a dvou vzorků je nutné umístit do tohoto rámečku distanční rámeček pro redukci délky. 2. Nacvakněte segment pro nanášení antisér do jeho držáku (viz Obr. 6): - Segment pro antiséra nakloněný v úhlu 45 vtlačte proti plastikovým pružinkám do držáku. - Současně táhněte segment i držák od sebe a otáčejte segment tak, aby se zafixoval do zoubků držáku. POZOR : Ujistěte se o správném umístění segmentu v držáku: výstupky na koncích segmentu musí být zablokovány v zoubcích držáku. 3. Umístěte držák se segmentem pro nanášení antisér do vodícího rámečku dynamické masky (viz Obr. 7). Vložte barevnou referenční šablonu pro aplikaci reagencií (dle příslušné metody) na držák - před jamky segmentu pro nanášení antisér (viz Obr. 8). 4. Reagencie aplikujte následovně : - segment pro antiséra - 6 jamek (HYDRAGEL 1 BENCE JONES) : 8 µl na jamku, - segment pro antiséra - 15 jamek (HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES) :8 µl na jamku pro analýzu 2 vzorků, 12 µl na jamku pro analýzu 4 vzorků, - segment pro antiséra - 18 jamek (HYDRAGEL 9 BENCE JONES) : 8 µl na jamku. STOPA REAGENS BARVA ELP fixační roztok žlutá GAM trivalentním antisérem fialová K antisérum proti lehkým volným i vázaným řetězcům kappa zelená L antisérum proti lehkým volným i vázaným řetězcům lambda modrá Kf antisérum proti lehkým volným řetězcům kappa oranžová Lf antisérum proti lehkým volným řetězcům lambda červená POZN.: Reagencie jsou obarveny a stejné barvy jsou použity na referenční barevné šabloně sloužící k usnadnění jejich aplikace. DŮLEŽITÉ : V případě kitu HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES nepoužívejte jamky v pozicích 1, 8 a Při pipetování se vyvarujte tvorby a nasátí bublin do špičky pipety. - Napipetujte reagencie (viz Obr. 9) : - Pipetu držte v úhlu a při aplikaci špičku zlehka opřete o boční stranu jamky. - Vstříkněte kapku reagencie do jamky bez dotyku o dno jamky. 5. Vyjměte barevnou referenční šablonu. III. IMUNOFIXACE 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Vyjměte aplikátory vzorků a odstraňte je. 3. Zvedněte oba nosiče, vyjměte a odstraňte houbičkové proužky s pufrem : - Vyjměte oba nosiče. - Pečlivě otřete elektrody měkkou zvlhčenou tkaninou (gázou). - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte dynamickou masku pro aplikaci reagencií následujícím postupem (viz Obr. 10): - umístěte vodící kovovou tyčku na ukotvující trny (může být ponechána v migračním modulu po celou dobu), - uchopte dynamickou masku a položte ji na vodící tyčku (zářezy zarovnanými se značkami), - následně položte dynamickou masku na migrační plochu v HYDRASYSU. DŮLEŽITÉ : Upravte pozici dynamické masky pro dokonalé spojení mezi elektro-foretickými profily a jamkami masky. 5. Přesuňte držák segmentu do nejnižšího bodu vodícího rámeček dynamické masky, směrem k obsluze. Uchopte držák segmentu za úchytku na pravé straně a zatlačte prstem druhé ruky na centrálně umístěný - označený bod tak, aby se segment pro antiséra dostal do kontaktu s gelem. Po uvolnění tlaku se reagencie rozprostřou pod každou stopou (viz Obr. 11). 6. Nyní, za použití úchytky držáku segmentu, pohybujte pomalu, ale plynule nahoru a dolů po celé délce gelu dojde k rovnoměrné aplikaci reagencií. Aplikace by měla trvat přibližně 5 sekund (viz Obr. 12). POZOR : Během tohoto kroku držte masku pouze za úchytku držáku segmentu pro nanášení antisér. Nedotýkejte se vodícího rámečku dynamické masky a nestlačujte opakovaně centrální bod. Mohlo by dojít ke zkřížené kontaminaci reagencií. 7. Vyjměte vodící rámeček i s dynamickou maskou. - vyjměte držák segmentu, - vyjměte segment pro aplikaci antisér z držáku a odstraňte jej, UPOZORNĚNÍ : Se segmenty zkombinovanými s antiséry se musí zacházet jako s nebezpečným biologickým materiálem. - po aplikaci mohou v jamkách zůstat zbytky reagencií. Na výsledky testu by to však nemělo mít vliv. 8. Uzavřete víko migračního modulu. 9. Stisknutím klávesy se zelenou šipkou "START" na levé straně klávesnice proces nastartujete. Na displeji se zobrazí nápis : "[INCUBATION]". IMUNOFIXACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ Inkubace při 20 C trvá 5 minut, řízeno Peltierovým efektem. Slyšitelné pípnutí signalizuje odjištění víka migračního modulu. Na displeji se objeví následující zpráva: "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER". POZN.: Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzamčeno

8 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 IV. ODSÁTÍ GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Na gel dejte zesílený filtrační papír: Zarovnejte okraj filtračního papíru s okrajem gelu (nakloňte jej v úhlu 45 ) a zlehka jej položte na gel. DŮLEŽITÉ : Pevně tlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalé přilnavosti ke gelu. 3. Zavřete víko migračního modulu. 4. Stisknutím tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice) se tato procedura nastartuje. ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ K odsání gelu při 40 C jsou vymezeny 3 minuty (řízeno Peltier. efektem). Na displeji se zobrazí zpráva "[BLOTTING]". Zazní slyšitelný signál. Na displeji se zobrazí zpráva "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER". V. SUŠENÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Víko zavřete. 4. Sušení nastartujete stiskem klávesy "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici). SUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ Suší se 6 minut při 50 C za řízení Peltier efektem. Pípnutí signalizuje odjištění víka. Teplota plátu zůstává až do otevření 50 C. Na displeji je zpráva "MAINTAINED MIGR. TEMPERATURE" / "MAINTAINED TEMPERATURE". POZN.: V průběhu sušení zůstává víko migračního modulu zajištěno. VI. NABARVENÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte osušený gel. 3. Otevřete držák gelu. Položte jej vodorovně a plotnu (gelem nahoru) umístěte do drážek v obou tyčkách a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je v držáku umístěn správně (Obr.13). 4. Držák s gelem nyní vložte do modulu určeného k vyvolání/barvení. DŮLEŽITÉ : Před zahájením této procedury zkontrolujte : - zda kontejner na promývací roztok obsahuje nejméně 400 ml tohoto roztoku, - zda kontejner na barvicí roztok obsahuje 300 ml tohoto roztoku, - zda kontejner na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 1 litr tohoto roztoku, - zda kontejner na odpad je prázdný, Informace o připojení reagencií lze zjistit na displeji po zvolení tlačítka "REAGENT LINES". DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité linky. 5. Zvolte barvící program "IF ACID VIOLET" z menu přístroje a nastartujte proceduru stiskem klávesy "START" (zelená šipka na pravé straně straně klávesnice). Během barvících, odbarvovacích a sušících kroků tato část zůstává zajištěna. Po ochlazení slyšitelné pípnutí signalizuje, že se tento oddíl odjistil (ventilace je udržována až do vynětí držáku s gelem). POZN.: - Teplota migrační plochy poklesne po otevření až na 20 C (v méně než 5 minutách). Poté je možno zahájit novou migraci. - Vraťte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Vysušte migrační plochu měkkým hadříkem nebo gázou. VII.KONEČNÉ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák s gelem z této části, otevřete jej a suchý gel vytáhněte. 2. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou stranu gelu vlhkým hadříkem nebo gázou. Gel je nyní možno vyhodnotit. POZN.: Délka jednotlivých elektroforeogramů se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách, bez následku na provedení testu. VÝSLEDKY Interpretace Přítomnost Bence Jones bílkoviny v moči je charakterizována : - monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa nebo lambda stopy K nebo L, - stejným monoklonálním proužkem detekovaným antiséry proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda stopy K free a L free, - žádná reakce s trivalentním antisérem stopa GAM. Sérový paraprotein vyloučený do moči bez Bence Jones bílkoviny charakterizován : - jeden monoklonální proužek detekovaný trivalentním antisérem, - stejný proužek detekovaný jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, - žádnou reakcí s antisérem proti odpovídajícím volným lehkým řetězcům. Sérový paraprotein vylučovaný do moči doprovázený Bence Jones bílkovinou je charakterizován : - jedním monoklonálním proužkem detekovatelným trivalentním antisérem, - tentýž proužek detekovaný jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, - jedním monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům. Tento proužek nemigruje ve stejné rovině jako proužek detekovatelný trivalentním antisérem, - stejný proužek detekovaný jedním z antisér proti volným lehkým řetězcům,

9 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 ve vzácných případech 2 proužky migrující společně zbarvení ve stopě pro lehký řetězec je silnější než ve stopě GAM. Polymerizované formy Bence Jones proteinu jsou charakterizovány : - chyběním reakce s trivalentním antisérem, - několika proužky detekovanými pomocí jednoho z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, - stejné proužky mohou být detekovány odpovídajícím antisérem proti volným lehkým řetězcům. Omezení jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití dynamické masky, může mít špatný vliv na výsledky. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpečnostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na Technicko-Servisním středisku vašeho dodavatele. HODNOTY Reprodukovatelnost mezi vzorky a specificita HYDRAGEL 4 BENCE JONES metoda Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích : dvě moče s Bence Jonesovou bílkovinou (kappa a lambda volné lehké řetězce) a jedním sérem s lambda volnými lehkými řetězci. Každý vzorek byl podroben 4 testům na HYDRAGEL BENCE JONES 2/4 gelech 2 šarží, při použití barvení kyselou violetí. HYDRAGEL 9 BENCE JONES metoda Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích : dvě moče s Bence Jonesovou bílkovinou (kappa a lambda volné lehké řetězce) a jedním sérem s lambda volnými lehkými řetězci. Každý vzorek byl podroben 9-ti testům na HYDRAGEL 9 BENCE JONES gelech 2 šarží, při použití barvení kyselou violetí. Všechna opakování dala identický výsledek na gelech stejné šarže i mezi šaržema a jak se očekávalo i shodný typ testovaného vzorku. Bence Jonesova bílkovina byla správně identifikována ve všech vzorcích a na všech gelech, nebyla zde žádná falešná pozitivita a žádné rozdíly mezi opakováními. Reprodukovatelnost mezi gely a specificita HYDRAGEL 4 BENCE JONES metoda Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na čtyřech různých patologických vzorcích, třech močích a jednom séru s Bence Jonesovou bílkovinou (kappa nebo lambda volné lehké řetězce). Tyto vzorky byl podrobeny 10-ti testům na HYDRAGEL BENCE JONES 2/4 gelech, 3 různých šarží, při použití barvení kyselou violetí. HYDRAGEL 9 BENCE JONES metoda Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na devíti různých patologických močích a sérech s Bence Jonesovou bílkovinou (kappa nebo lambda volné lehké řetězce). Tyto vzorky byl podrobeny 10-ti testům na HYDRAGEL 9 BENCE JONES gelech, 3 různých šarží, při použití barvení kyselou violetí. Všechna opakování dala identický výsledek na gelech a jak se očekávalo i shodný typ testovaného vzorku. Přesnost Dvacet (20) sérových vzorků a třicet šest (36) močových vzorků s Bence Jonesovou bílkovinou, s pěti (5) normálními vzorky, bylo podrobeno analýze na HYDRAGEL 4 BENCE JONES gelech a jiných komerčně dostupných agarózových gelových systémech. Výsledky obou imunofixačních procedur byly v naprosté shodě. Citlivost Následně ředěné 2 patologické vzorky moče, oba s Bence Jonesovou bílkovinou byly analyzovány HYDRAGEL 4 BENCE JONES metodou s antiséry anti-kappa a anti-lambda volné a vázané lehké řetězce a s antiséry anti-kappa a anti-lambda volné lehké řetězce. Minimální detekční limit pro Bence Jonesovu bílkovinu byl okolo 3 mg/l s antiséry anti-volné a vázané lehké řetězce a okolo 12 mg/l s antiséry antivolné lehké řetězce. Díky struktuře a typu volných lehkých řetězců, detekční limit je určen antiséry anti-kappa nebo anti-lambda volné lehké řetězce, může se lehce lišit, ale obecně je pod 5 mg/dl

10 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 1. Didier Le Carrer, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier - Paris. 2. DF Keren, "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation, Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, MA, USA, 1994, 397 pp. 3. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept :

11 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure sebia

12 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 SCHÉMAS / FIGURES Figure 5 Repère couleurs Colored Reference Guide ELP G A M K L ELP HYDRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L Barrette antisérums Antisera Segment Bossage (Boss) Ergot (Pin) Support barrette Segment Holder Poignée (Flap) Encoche (notch) Puits (wells) Point d'appui central (Central Pressure Point) Ressorts (Springs) Réducteur de course Length Reducing Device Guide du masque dynamique Dynamic Mask Guide Poignée (Flap)

13 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 SCHÉMAS / FIGURES Figure 6 Figure Figure 8 Figure 9 ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L HYDRAGEL 9 IF ELP G A M K L ELP HYDRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L Figure 10 Figure 11 GEL 9 IF A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L DRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L

14 HYDRAGEL 1, 2, 4 & 9 BENCE JONES /12 SCHÉMAS / FIGURES Figure 12 DRAGEL 9 IF G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L Figure 13 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia