HYDRAGEL 9 IF Violet Acide / Acid Violet. HYDRAGEL 4 IF Amidoschwarz / Amidoblack

Transkript

1 HYDRAGEL 1 IF Violet Acide / Acid Violet Ref HYDRAGEL 2 IF Violet Acide / Acid Violet Ref HYDRAGEL 4 IF Violet Acide / Acid Violet Ref Ref. 4881* HYDRAGEL 4 IF Amidoschwarz / Amidoblack Ref HYDRAGEL 9 IF Violet Acide / Acid Violet Ref Ref. 4882** 2015/09

2 POUŽITÍ SADY Sady HYDRAGEL 1 IF, 2 IF, 4 IF a 9 IF jsou určeny k detekci monoklonálních proteinů v lidském séru a v moči pomocí imunofixační elektroforézy. Sady se používají se ve spojení s poloautomatickým přístrojem HYDRASYS pro elektroforézu. Proteiny separované elektroforézou na alkalicky pufrovaných agarózových gelech jsou inkubovány se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A), mu (Ig M) a lehkým volným i vázaným kappa a lambda řetězcům. Po odstranění nezreagovaných bílkovin jsou imunoprecipitáty obarveny kyselou violetí nebo amidočerní. Elektroforegramy se hodnotí vizuálně a hledá se přítomnost monoklonálních bílkovin. Každý agarózový gel je určen k analýze : - jednoho vzorku, sada HYDRAGEL 1 IF, - dvou vzorků, sada HYDRAGEL 2 IF, - čtyř vzorků, sady HYDRAGEL 4 IF, - devíti vzorků, sady HYDRAGEL 9 IF. Sady HYDRAGEL 4 IF jsou dodávány s kyselou violetí nebo amidočerní, takže vyhoví všem uživatelským preferencím. Pro diagnostické použití In Vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU Abnormální proužky zjištěné elektroforézou v zóně beta a gamaglobulinů mohou vyvolávat podezření na výskyt monoklonálních proteinů (M-proteiny, paraproteiny, monoklonální imunoglobuliny) a tedy indikaci monoklonálních gamapatií. Pro určení těchto abnormálních frakcí se používá imunofixace. Imunofixační elektroforéza je jednoduchá technika, která umožňuje zafixování proteinů in situ, kde tvoří nerozpustné komplexy s odpovídajícími protilátkami. Provádí se ve čtyřech jednoduchých krocích a snadno se interpretuje : 1. Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu. 2. Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou příslušné migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a precipitují přítomné antigeny. Bílkoviny v referenční stopě jsou fixovány fixačním roztokem. 3. Nevysrážené, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny pomocí odsávání a promývání. Precipitovaný komplex antigen-protilátka je zachycen v matrici gelu. 4. Vysrážené proteiny jsou vizualizovány obarvením. Elektroforetické dělení, jehož cílem je detekce a identifikace podezřelých monoklonálních složek, probíhá současně v šesti stopách. Po elektroforéze slouží jedna stopa jako referenční a poskytuje úplné elektroforetické uspořádání bílkovin ve vzorku. Zbývajících pět řad umožňují charakterizaci monoklonální složky (nebo absenci) z reakce s antisérem proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A) a mu (Ig M) a proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa a lambda. Imunofixační proužky jsou porovnány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku odpovídající proužek by měl mít stejnou migrační pozici. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADÁCH HYDRAGEL 1 IF, HYDRAGEL 2 IF, HYDRAGEL 4 IF A HYDRAGEL 9 IF VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. SADA HYDRAGEL 1 IF SADA HYDRAGEL 2 IF SADA HYDRAGEL 4 IF SADA HYDRAGEL 9 IF kat. Č kat. Č (*) HYDRAGEL 4 IF MAXI-KIT (**) HYDRAGEL 9 IF MAXI-KIT kat. Č kat. Č kat. Č kat. Č. 4881* kat. Č. 4882** Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 10 gelů 10 gelů 80 gelů Pufrované proužky (připraveno k použití) 10 balení po 2 kusech 10 balení po 2 kusech 10 balení po 2 kusech 80 balení po 2 kusech Ředicí roztok pro barvicí roztok (zásobní) 1 lahvička, 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahvička, 20 ml Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahvička, 75 ml 1 lahvička, 75 ml 8 lahviček, 75 ml každá Ředicí roztok (připraveno k použití) 1 lahvička, 32 ml 1 lahvička, 32 ml 1 lahvička, 32 ml 2 lahvičky, 80 ml každá 3 lahvičky, 80 ml každá Fixační roztok (připraveno k použití) 1 lahvička, 14.4 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským těžkým řetězcům gama (připraveno k použití) 1 lahvička, 8.0 ml 1 lahvička, 10.8 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským těžkým řetězcům alfa (připraveno k použití) 1 lahvička, 8.0 ml 1 lahvička, 10.8 ml Savčí imunoglobuliny proti lidským těžkým řetězcům mu (připraveno k použití) Savčí imunoglobuliny proti lidským lehkým řetězcům (volným a vázaným) kappa (připraveno k použití) Savčí imunoglobuliny proti lidským lehkým řetězcům (volným a vázaným) lambda (připraveno k použití) 1 lahvička, 8.0 ml 1 lahvička, 10.8 ml 1 lahvička, 8.0 ml 1 lahvička, 10.8 ml 1 lahvička, 8.0 ml 1 lahvička, 10.8 ml 2 balení po 10 kusech 16 balení po 10 kusech Aplikátory (připraveno k použití) 1 balení po 10 kusech 2 balení po 10 kusech 3 balení po 10 kusech 24 balení po 10 kusech Tenké filtrační papíry 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech 8 balení po 10 kusech 2 balení po 10 kusech 16 balení po 10 kusech Hřebeny z filtračního papíru 1 balení po 10 kusech 2 balení po 10 kusech 3 balení po 10 kusech 24 balení po 10 kusech Tlusté filtrační papíry 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech 8 balení po 10 kusech SEBIA NÁVOD - Czech

3 POZNÁMKA : Fixační roztok a antiséra jsou dodávány samostatně s výjimkou balení MAXI-KIT (viz POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V SADĚ). Během přepravy může být MAXI-KIT uchován bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu a imunofixaci bílkovin. Skladujte gely v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelu a pokud struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ PROUŽkY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.1 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované proužky fungují jako zásobník pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt gelu a elektrod. Pufrované proužky skladujte ve svislé poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě nebo v chladničce (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku balení pufrovaného proužku. NEMRAZIT. Pokud je balení otevřeno a pufrovací proužky vyschlé, zneškodněte je. 3. ŘEDICÍ ROZTOk PRO BARVICÍ ROZTOk (kat. č. 4808) Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok ph 2. Pro přípravu barvicího roztoku amidočerni. Zásobní ředicí roztok pro barvicí roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 4. AMIDOČERŇ (kat. č. 4808) Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvicího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správné rekonstituce barvicího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku velmi důkladně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. V případě potřeby opakujte tento krok dvakrát až třikrát. 6. Nalijte zbylý ředící roztok do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvicí roztok je připraven k použití. POZNÁMKA : Nesprávná příprava barvicího roztoku povede k podhodnocení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce). Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla

4 5. kyselá VIOLEŤ (kat. č. 4801, 4802, 4804, 4809, 4881 a 4882) Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky barvicího roztoku. Pracovní barvicí roztok je stabilní 6 měsíců. 6. ŘEDÍCÍ ROZTOk Ředící roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 7.5 ± 0.5 ; bromofenolová modř ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Ředění vzorků. Bromfenolová modř se používá jako praktický značkovač migrace. Ředicí roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky ředicího roztoku. Ředicí roztok nesmí obsahovat sraženiny. 7. FIXAČNÍ ROZTOk (kat. č a 4882) Fixační roztok je připraven k použití. Obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho nanášení je fixační prostředek obarven neškodným barvivem odpovídajícím barvě štítku použité lahvičky. Fixace elektroforeticky rozdělených bílkovin v referenční stopě (ELP). POZNÁMKA : Fixační roztok je specifický pro imunofixační postup s maskou 1, 2, 4 nebo 9 IF. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci reagentů, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček. Fixační roztok skladujte v chladu při teplotě 2 až 8 C. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky fixačního roztoku. Fixační roztok nesmí obsahovat sraženiny. 8. ANTISÉRA (kat. č a 4882) Připraveno k použití. Všechna antiséra jsou savčí imunoglobuliny, protilátky proti lidským bílkovinám. Ke snadnějšímu rozlišení a jako pomůcka pro jejich sledování jsou antiséra zbarvena různými barvami neškodnými pro člověka, které odpovídají barvě štítku lahvičky. Při výskytu lehkého zákalu ponechejte antisérum minimálně 10 minut stát při pokojové teplotě. To by mělo dostačovat k vyčištění roztoku. Přetrvávající zákal by však neměl žádným způsobem ovlivnit imunochemickou reakci. V případě nerozpustných sraženin se doporučuje antiséra centrifugovat 5 minut při 600 g. K imunofixaci bílkovin, které byly rozděleny elektroforézou. POZNÁMKA : Antiséra jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1, 2, 4 nebo 9 IF. Antiséra mohou pocházet z různých zvířecích druhů. Nemísit dvě různé lahvičky s antiséry i když jsou stejné specificity a při výměně lahviček s antiséry VŽDY měnit špičky pipety. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci reagentů, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček. Antiséra skladujte v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. POZNÁMKA : Během přepravy je možné uchovávat antiséra a fixační roztok při pokojové teplotě (15 až 30 C) po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na jejich vlastnosti. 9. APLIkÁTORY Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků. Skladování Aplikátory skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce

5 10. TENkÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsání přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 11. HŘEBENY FILTRAČNÍCH PAPÍRŮ Předřezané hřebeny z tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití, určené k odsátí fixačního roztoku a antisér z povrchu gelů po provedení imunofixace. 12. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Bločky tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití určené k odsátí neprecipitovaných bílkovin z povrchu gelů po provedení imunofixace. Skladování Tlusté filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. BALENÍ ANTISÉR A FIXAČNÍHO ROZTOkU (pro sady kat. č. 4801, 4802, 4804, 4808 a 4809) Balení antisér a fixačního roztoku pro imunofixaci IF se Standardní maskou, SEBIA, kat. č. 4815, obsahuje 5 lahviček s antiséry proti Ig G, Ig A, Ig M, řetězcům Kappa (lehké volné a vázané) a řetězcům lambda (lehké volné a vázané), každou o objemu 1 ml, a 1 lahvičku s fixačním roztokem o objemu 2.5 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1, 2, 4 nebo 9 IF, SEBIA ANTISÉRA Viz předchozí čl FIXAČNÍ ROZTOk Viz předchozí čl ODBARVOVACÍ ROZTOk Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 ml zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztok je určen pro odstranění přebytečného barviva a odbarvení pozadí gelů. K opláchnutí barvicího oddílu po provedení mycí procedury. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 3. HYDRASYS - PROMÝVACÍ ROZTOk Každá lahvička Promývacího Roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5. Promývací roztok HYDRASYS je určen k vymytí nevysrážených bílkovin z gelů. Slouží rovněž pro čištění barvicího prostoru systému HYDRASYS. Používejte jej pravidelně - například při každodenním používání přístroje promývejte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. 4. ŘEDICÍ ROZTOk NA VZORkY HYDRAGEL IF Ředicí roztok (SEBIA, kat. č. 4588, 1 lahvička, 80 ml) je připraven k použití. Reagent potřebný pro automatické ředění vzorků. Viz předchozí odstavec

6 5. FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička, 5 ml) je připraven k použití. K ředění viskózních nebo zakalených vzorků, například sér obsahujících kryoglobulin nebo kryogel. Skladovat při pokojové teplotě. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku Fluidil. Fluidil nesmí obsahovat sraženiny. 6. BETA-MERkAPTOETHANOL (BME nebo 2-MERkAPTOETHANOL) (nedodávaný SEBIA) 7. ŘEDÍCÍ ROZTOk DTT (IF / IT) Složení Lahvička ředicího roztoku DTT (IF / IT) (SEBIA, kat. č : 1 lahvička, 13 ml) obsahuje : fosfátový tlumivý roztok s ph 7,4 ± 0,5 a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Ředicí roztok DTT (IF / IT) je určen pro přípravu lahvičky dithiothreitolu (DTT) na přípravu redukčního roztoku 0,5 M DTT, který se používá pro depolymerizaci monoklonálních bílkovin. Redukční roztok dithiothreitolu může být použit jako náhrada roztoku ß-merkaptoetanolu. Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. Skladování, stabilita a známky zhoršování Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. VOLITELNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVANÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. STANDARDNÍ MASkOVACÍ ANTISÉRUM ANTI-Ig D Lahvička antiséra (SEBIA, kat. č : 1 lahvička, 1 ml) obsahuje savčí protilátky proti lidským imunoglobulinům se specificitou proti Ig D. Je určena pro imunofixační postup SEBIA s 1, 2, 4 a 9 IF maskami., použití, skladování, stabilita a známky zhoršování : Viz příbalový leták standardní maskovací protilátky Anti-Ig D. 2. STANDARDNÍ MASkOVACÍ ANTISÉRUM ANTI-Ig E Lahvička antiséra (SEBIA, kat. č : 1 lahvička, 1 ml) obsahuje savčí protilátky proti lidským imunoglobulinům se specificitou proti Ig E. Je určena pro imunofixační postup SEBIA s 1, 2, 4 a 9 IF maskami., použití, skladování, stabilita a známky zhoršování : Viz příbalový leták standardní maskovací protilátky Anti-Ig E. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č nebo kat. č nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216, SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č nebo SEBIA ASSIST, kat. č jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Zásobní Komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS. 4. Souprava nádob dodávaná se systémem HYDRASYS. 5. Vodící tyčka šablony dodávaná s HYDRASYS systémem. 6. Příslušenství pro HYDRASYS IF, SEBIA, kat. č Příslušenství pro HYDRASYS 1 IF / 1 BENCE JONES, SEBIA, kat. č Příslušenství pro HYDRASYS 9 IF, SEBIA, kat. č Pipety : 10 µl, 20 µl, 100 µl a 200 µl. VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky. Odběr séra a moči musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložené v chladničce (2 až 8 C) co nejdříve po odběru je možné uchovávat až jeden týden. Pro delší skladování vzorky zmrazte (stabilní nejméně jeden měsíc). Mražení sér s azidem sodným, 0.02 g/dl, zvyšuje stabilitu při skladování. Obdobně zvyšuje stabilitu při skladování mražení moči s HEPES 0.1 M (ph 6.75) a s azidem sodným 0.02 g/dl. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte kyselinu boritou jako konzervant. Rozmražené vzorky mohou obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace proteinu nebo lipoproteinu

7 vzorků 1. Séra Připravte 1 vzorek pro HYDRAGEL 1 IF nebo 2 či 4 vzorky pro HYDRAGEL IF 2/4 podle použité sady a 9 vzorků pro HYDRAGEL 9 IF. Sérum před použitím zřeďte, abyste zabránili překrytí zón při vysoké úrovni antigenu. Dobře promíchejte. STOPA SÉRUM (µl) ŘEDICÍ ROZTOk (µl) Imunofixační stopa Ig G Referenční stopa ELP a všechny další imunofixační stopy Zvláštní případy Je-li hladina celkového imunoglobulinu > 2 g/dl (hypergamaglobulinemie), použijte vyšší ředění vzorku (kromě stopy ELP) pro získání normální koncentrace imunoglobulinů. Je-li hladina celkového imunoglobulinu < 0.5 g/dl (hypogamaglobulinemie), použijte menší ředění vzorku. Vzorky moči a séra pacienta mohou být testovány i na přítomnost Bence Jonesových proteinů ; v takovém případě se doporučuje použít migrační program "BENCE JONES". Vzorky by měly být testovány pomocí sady IF a protilátkami proti volným řetězcům kappa (SEBIA, kat. č. 4610), volným řetězcům lambda (SEBIA, kat. č. 4611), HYDRAGEL 1, 2 nebo 4 BENCE JONES (SEBIA, kat. č. 4821, 4822 nebo 4824). V takovém případě se sérum ředí fyziologickým roztokem nebo ředicím roztokem pro imunofixaci po předchozím ředění 1/4 (1 díl ředicího roztoku, 3 díly deionizované nebo destilované vody) : 1/10 pro stopy ELP, GAM, K, L (1 díl séra + 9 dílů fyziologického roztoku nebo ředěného ředicího roztoku) a 1/3 (1 díl séra + 2 díly fyziologického roztoku nebo ředěného ředicího roztoku) pro zóny (stopy) volných řetězců kappa a lambda (Kf, Lf). Pokud je celková koncentrace imunoglobulinů < 0.5 g/dl, doporučuje se menší zředění vzorku séra ; například 1/5 pro ELP, GAM, K a L stopy a 1/2 pro Kf a Lf stopy. Při skladování v chladničce nebo po zmrazení se některá séra (zvláště ta, obsahující kryoglobulin nebo kryogel) mohou stát viskózními nebo zakalenými. Taková séra mohou špatně difundovat do zubů aplikátoru. V takovém případě přidejte 25 µl Fluidilu na 75 µl séra a promíchejte (na vortexu) 15 sekund. Dále pokračujte podle standardního postupu. Některé monoklonální proteiny mohou polymerizovat a výsledkem je "monoklonální frakce" ve všech imunofixačních stopách. V tomto případě (i) připravte 1% beta-merkaptoetanol (BME) ve Fluidilu, (ii) přidejte 25 µl tohoto roztoku k 75 µl séra, (iii) promíchejte na vortexu a čekejte minimálně 15 minut (maximálně 30 minut). Teprve potom použijte standardní postup. Pro analýzu Ig D a / nebo Ig E použijte stejné řešení jako pro volné a vázané lehké řetězce kappa a lambda. 2. Odstředěné vzorky moči Většina vzorků moče se musí zahustit. Naneste zahuštěnou moč do všech stop. Zahušťujte (vhodným postupem) na koncentraci celkové bílkoviny v moči 0.5 g/dl. nebo celkové Ig přibližně 0.1 g/dl. Pokud hodnoty koncentrace celkové bílkoviny nebo Ig nejsou známy zahušťujte 20x 100x. (Při standardním migračním programu "IF" odpovídá detekční limit mg/dl nejnižší koncentraci monoklonální bílkoviny ve vzorku, která poskytne zřetelně detekovatelný proužek). DŮLEŽITÉ : Některé vzorky moči mají vysoký obsah soli. V důsledku toho může dojít k narušení gelu při migraci a následně ke zkreslení migračních profilů. Toto zkreslení může být příčinou nepřesné interpretace výsledků a proto by soli v těchto vzorcích měly být odstraněny dialýzou. Difúze vzorků moči do špičky aplikátorů může být narušena, pokud je moč (čistá nebo koncentrovaná) zakalená. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. stříkačkový filtr 0.45 µm). Citlivost testování moči může být zvýšena prodloužením času aplikace vzorku a času inkubace antisér za použití migračního programu "BENCE JONES". Detekční limit pak odpovídá koncentraci 1-5 mg/dl monoklonální bílkoviny. Při této technice mohou být vzorky moči analyzovány nekoncentrované nebo koncentrované pro zvýšení citlivosti. POZNÁMKA : Možnosti zvýšení citlivosti testu vyšším zahuštěním nebo koncentrováním vzorků moči na vysoký stupeň musí být dobře zváženy. příliš koncentrovaných vzorků moče vede časti ke vzniku falešných proužků. Takové vzorky je pak nutno analyzovat znovu v nižších koncentracích. Speciální případ Lehké řetězce v moči mají sklon polymerizovat a tvořit agregáty. Pokud to narušuje interpretaci výsledků, měly by být lehké řetězce polymerů nepolymerizovány : (i) smíchejte 1 objemový díl BME s 9 objemovými díly vody nebo fyziologického roztoku (např. 5 µl BME a 45 µl wody nebo fyziologického roztoku), (ii) přidejte 5 µl zředěného BME ke 100 µl moči, dobře promíchejte, nechte inkubovat 10 až 15 minut a použijte bez dalšího ředění vzorku. Zpracujte standardními programy pro imunofixaci nebo "BENCE JONES". POZNÁMKA : Úprava roztoku ß-merkaptoetanolu může být nahrazena úpravou dithiothreitolu rozpuštěného v ředicím roztoku DTT (IF / IT), SEBIA, kat. č Viz kapitola "VYŽADOVANÉ REAGENTY" a pokyny pro použití ředicího roztoku DTT (IF / IT) s dalšími informacemi. Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte vzorky plazmy. Proužek fibrinogenu poblíž aplikačního bodu v beta zóně by mohl být považován za monoklonální protein. Nepoužívejte hemolyzované vzorky. Nepoužívejte vzorky staré, nesprávně skladované moče, u nichž mohla proběhnout enzymatická degradace proteinů. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrický přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarózových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : nanesení vzorku, elektroforetická migrace, inkubace s fixačním roztokem a antisérem, vysušení, barvení, odbarvení a závěrečné vysušení. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely, nanesení fixačního roztoku a anitisér a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS

8 I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte přístroj HYDRASYS. 2. Umístěte 1 aplikátor pro HYDRAGEL 1 IF nebo HYDRAGEL 2/4 IF (2 vzorky), dva aplikátory pro HYDRAGEL 2/4 IF (4 vzorky) nebo tři aplikátory pro HYDRAGEL 9 IF, na rovný povrch s čísly jamek v pravé horní pozici (viz Obr. 1). - Naneste 10 µl správně zředěného séra nebo zahuštěné moči do jamek následujícím způsobem. Každý aplikátor naplňte do 2 minut. JAMkA Č. : MIGRAČNÍ / IMUNOFIXAČNÍ STOPA ELP G A M k L HYDRAGEL 1 IF HYDRAGEL IF 2/4 VZOREK č. 1 nebo VZOREK č. 2 nebo HYDRAGEL 9 IF VZOREK č. 1, 4 nebo VZOREK č. 2, 5 nebo VZOREK č. 3, 6 nebo POZNÁMKA : Pro HYDRAGEL IF 2/4 se jamky 1, 8 a 15 nepoužívají, je proto vhodné je označit fixem, aby nebyly omylem naplněny vzorky. - Vložte všechny aplikátory do vlhké zásobní komory zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček). Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku pro vlhkou komoru. - Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut od nanesení posledního vzorku. Pro pozdější použití (až do 8 hodin) dejte celou komůrku do chladničky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte elektrody a nosiče aplikátorů nahoru. POZOR : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy! 4. Z menu přístroje (umístěného v levé části klávesnice) zvolte program migrace "1 IF SM/DM" pro HYDRAGEL 1 IF, "2/4 IF SM/DM" pro HYDRAGEL IF 2/4 nebo "9 IF SM" pro HYDRAGEL 9 IF. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované proužky uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastikové vyztužení proužků směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte desku HYDRAGEL. - Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. - Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody pro HYDRAGEL 1 IF nebo 200 µl pro HYDRAGEL 2/4 a HYDRAGEL 9 IF do dolní třetiny rámu vyraženého na termoregulační destičce migračního modulu. - Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 3). - Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, zda je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky, a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 8. Vyjměte všechny aplikátory z vlhké komory. Uchopte je při tom za ochranný rámeček. - Odlomte ochranný rámeček chránicí zuby aplikátoru. - Položte aplikátor (y) do rámečku : - U HYDRAGEL 1 IF nebo HYRAGEL IF 2/4 (2 vzorky) do pozice č. 6, - U HYDRAGEL IF 2/4 (4 vzorky) do pozice č. 3 a 9, - U HYDRAGEL 9 IF do pozice č. 2, 6 a 10. Pro zlepšení reprodukovatelnosti aplikace vzorků umístěte vždy aplikátory na levou stranu nosiče. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Ihned zahajte proces stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. Probíhá aplikace vzorků do gelu. Migrace probíhá při konstantních 10 W pro HYDRAGEL 1 IF a méně 20 W pro HYDRAGEL IF 2/4 až do akumulovaných 42 Vh (po asi 9 minutách) a méně než 20 W pro HYDRAGEL 9 IF až do akumulovaných 31 Vh (po asi 7 minut) při 20 C řízených Peltieriho článkem. Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Na displeji se zobrazí zpráva : "e AS" / "e ANTISERA". POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během všech kroků migrace zajištěné. II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátory vzorku. 3. Zdvihněte oba nosiče, vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. - Vyjměte oba nosiče. - Otřete elektrody měkkou zvlhčenou látkou. - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte šablonu pro aplikaci reagentů následujícím postupem (viz Obr. 5). - Umístěte rámeček aplikační šablony na ukotvující trny (vodicí tyčka může být ponechána v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte šablonu za okraj a položte ji na rámeček (přičemž drážky jsou vyrovnané se značkami). - Sklopte šablonu na gel. - Nastavte pozici šablony tak, aby byly vyrovnány elektroforetické profily a jamky šablony (viz příslušenství pro HYDRASYS 9 IF SEBIA, kat. č. 1265, kde jsou uvedeny pokyny)

9 5. Reagenty používejte následujícím způsobem : STOPA Šablona 1, 2 a 4 IF OBJEM (µl) Šablona 9 IF REAGENCIE POZNÁMKA : Aby se vyloučila záměna reagentů je jejich barva vyznačena na štítcích lahviček i na šabloně. - Při pipetování se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. - Naneste reagenty (viz Obr. 6) : - Pipetu držte svisle a při aplikaci špičku zlehka opřete o boční stranu jamky. - Vstříkněte reagent do jamky tak, aby nedošlo k zachycení žádných bublin vzduchu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Ihned zahajte proces stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. Na displeji se zobrazí zpráva "[INCUBATION]". IMUNOFIXACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace při 20 C trvá 5 minut (řízeno Peltierovým efektem). Ozve se pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Na displeji se zobrazí zpráva : "a AS (SM)" / "a ANTISERA (SM)". POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během inkubace zajištěné. III. ODSTRANĚNÍ PŘEBYTEČNÝCH REAGENTŮ 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte přebytek reagentů pomocí filtračního papíru : jeden hřeben pro šablonu 1 IF a 2 IF, dva pro šablonu 4 IF a tři pro šablonu 9 IF (viz Obr. 7) : - Zasuňte každý hřeben pod úhlem 30 do štěrbin na dolním konci šablony tak, aby se zoubky dotýkaly svislé strany dále od obsluhy. - Lehce se dotkněte zoubky kapaliny tak, že sklopíte hřeben v úhlu 45 k hladině kapaliny (viz Obr. 8). DŮLEŽITÉ : Každý hřeben musí zůstat nakloněn (45 ). Pokud by byly vztyčené, mohly by poškodit gel. 3. Zahajte proces stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). ODSTRANĚNÍ REAGENTŮ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ K odsátí reagentů je vymezeno 15 sekund při 20 C (řízeno Peltierovým článkem). Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER". IV. ODSÁTÍ GELU 1. Vyjměte hřeben(y). 2. Zkontrolujte, zda jsou reagenty naabsorbované, což je indikováno : - Nepřítomností reagentů na gelu. - Obarvením celé délky zubů. Je-li absorpce neúplná, vložte stejný hřeben z filtračního papíru znovu (ve stejné pozici) a opakujte manuálně postup odstranění. 3. Uchopte šablonu pro nanášení reagentu za okraj, zdvihněte jí a odstraňte. 4. Položte na gel tlustý filtrační papír : - Vyrovnejte okraj filtračního papíru s okrajem gelu (nakloňte jej v úhlu 45 ). - A zlehka jej položte na gel. UPOZORNĚNÍ : Pevně tlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalému přilnutí ke gelu. 5. Uzavřete víko migračního modulu. 6. Zahajte proces stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). 7. Aplikační šablonu očistěte malým kartáčkem (např. kartáčkem na zuby) podle postupu uvedeného v části "POSTUP ČIŠTĚNÍ MASKY". Ověřte, že je šablona před opakovaným použitím zcela suchá ; pomocí sacího papíru odstraňte z jamek kapky vody. ODSÁTÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 40 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem Zazní zvukový signál. Na displeji se zobrazí zpráva : "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER". V. VYSUŠENÍ GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2 Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Zavřete víko. 4. Zahajte proces stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). VYSUŠENÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Vysušení při 50 C trvá 6 minut a je řízeno Peltierovým efektem. Ozve se pípnutí signalizující odjištění víka. Teplota plotny zůstává až do otevření víka na 50 C. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během sušení zajištěné. BARVA ELP fixační roztok žlutá G antisérum proti těžkým řetězcům gama růžová A antisérum proti těžkým řetězcům alfa tmavě modrá M antisérum proti těžkým řetězcům mu žlutozelená K antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům kappa světle zelená L antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům lambda světle modrá

10 VI. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. 3. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a vysušený gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz Obr. 9). 4. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení/barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na promývací roztok obsahuje nejméně 400 ml promývacího roztoku ; - zda nádoba na barvicí roztok obsahuje nejméně 300 ml barvicího roztoku ; - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 1 L odbarvovacího roztoku ; - zda je nádoba na odpad prázdná. Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužité přívody. 5. Z menu přístroje vyberte barvicí program "IF ACID VIOLET" nebo "IF AMIDO" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). POZNÁMKY : - Teplota migrační plochy poklesne po otevření až na 20 C (za méně než 5 minut). Potom je možné zahájit novou migraci. - Vraťte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Otřete migrační plochu vlhkou látkou. VII.DOkONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete jej a vyjměte vysušený gel. 2. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. POZNÁMKA : Délka jednotlivých elektroforetických migrací se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách bez vlivu na provedení testu. kontrola kvality Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788). POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být roztok Normal Control Serum séra SEBIA (kat. č. 4785) nebo roztok Hypergamma Control Serum SEBIA (kat. č. 4787) použit jako negativní kontrola. VÝSLEDkY Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. 1. Sérum Nepřítomnost monoklonální složky Normální vzorek séra vykazuje jemně difúzní zbarvení polyklonálních imunoglobulinů ve všech stopách. Hypergamaglobulinemie je charakterizována výrazně zbarvenou, difúzní zónou gama bez přítomnosti ostrých proužků. Přítomnost monoklonální složky Přítomnost monoklonálního proteinu (gamapatie) je charakterizována monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti těžkým řetězcům (gama, alfa a mu) a nebo antisérem proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Detekovaný monoklonální proužek, typicky ostře ohraničený, musí být umístěn ve stejné migrační vzdálenosti jako předpokládaný monoklonální proužek v referenční stopě (ELP). Absence reakce s antiséry proti těžkým řetězcům a současná reakce s jedním z antisér proti lehkým řetězcům může svědčit o : a) velmi vzácné gamapatii Ig D nebo Ig E : potvrďte pomocí antisér proti těžkým řetězcům delta nebo epsilon, b) gamapatii lehkých řetězců : potvrďte pomocí antisér proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Chybí-li pozitivní reakce s antiséry proti lehkým řetězcům, zatímco některé z antisér proti těžkým řetězcům reaguje, může jít o velmi vzácnou gamapatii těžkých řetězců (gama, alfa nebo mu). Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent Ve vzácných případech může proliferovat několik klonů B-buněk imunofixací je odhaleno několik monoklonálních proužků : Biklonální gamapatie je charakterizována přítomností dvou proužků těžkých řetězců (identických nebo různých) a dvou proužků lehkých řetězců (identických nebo různých). Polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány přítomností několika proužků téhož typu těžkých řetězců a jedním stejným typem lehkého řetězce. K potvrzení přítomnosti jednoduché monoklonální abnormality je nutná depolymerizace beta-merkaptoetanolem a opakovaná imunofixace (viz "Vzorky pro analýzu"). Oligoklonální gamapatie je charakterizována přítomností mnohočetných proužků jednoho nebo více typů těžkých řetězců nebo jedním či dvěma typy řetězců lehkých. Zvláštní případy Monoklonální proužek pozorovaný při elektroforéze (ELP stopa), který nelze potvrdit imunofixací, svědčí pro přítomnost fibrinogenu - jedná se zřejmě o vzorek plazmy. Vyskytne-li se monoklonální proužek ve všech imunofixačních stopách, může se jednat o kryoglobulin nebo polymerizovaný Ig M. Nutno depolymerizovat pomocí redukující reagencie a analýzu opakovat (viz "Analyzované vzorky")

11 U některých gamopatií Ig A mohu být přítomny antiséra proti lehkým řetězcům s mírnou afinitou k odpovídajícímu monoklonálnímu imunoglobulinu, takže je jejich detekce ztížena. V takovém případě se doporučuje otestovat vzorek pomocí imunofixačního postupu BENCE JONES, kdy je reakce antiséra zesílena v důsledku delší doby inkubace (viz příbalový leták sady HYDRAGEL BENCE JONES pro ředění sér). Při polyklonálním pozadí se doporučuje použít vyšší zředění vzorku pro antisérové stopy a zejména pro stopu Ig G. HYDRAGEL 9 IF : Pro oligoklonální gamopatie se doporučuje použít imunofixační postup HYDRAGEL 1, 2 nebo 4 IF pro získání lepšího rozlišení v gama zóně, kdy prodloužená gamaglobulinová zóna umožňuje vizualizace více proužků. 2. Moč Pro imunofixační typy moči platí podobné interpretační koncept jako je popsaný výše pro séra. Intaktní monoklonální bílkovina v moči je charakterizována monoklonálním proužkem detekovaným buď jedním z antisér proti těžkým řetězcům (gama, alfa nebo mu) a antiséry proti lehkým řetězcům kappa a lambda (volným a vázaným). Detekovaný monoklonální proužek, typicky ostře ohraničený, musí být umístěn ve stejné migrační vzdálenosti jako podezřelý monoklonální proužek v referenční stopě (ELP). Volný lehký řetězec, Bence Jonesova bílkovina (tabulární protein) je charakterizován monoklonálním proužkem detekovaným antisérem proti lehkým řetězcům (volným a vázaným) kappa a lambda. Ve stopách antiséra proti těžkým řetězcům (gama, alfa nebo mu) by se neměla objevit žádná pozitivní reakce. Interference a Omezení Viz VZORkY PRO ANALÝZU. Fibrinogen nebo zbytkový fibrin mohou vést k umělým proužkům ve všech stopách. Jejich intenzita, která je obecně důležitější ve stopě Ig A, se může v různých stopách lišit. jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití standardní masky, může mít negativní vliv na výsledky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány. Odstraňování problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu svého dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". ÚDAJE O VÝkONU HYDRAGEL 4 IF Reprodukovatelnost mezi vzorky (na jednom gelu) a specificita Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích : dva s jednou monoklonální složkou o vysoké koncentraci a jeden vzorek se dvěmi monoklonálními složkami o nízké koncentraci. Každý vzorek byl analyzován na gelech HYDRAGEL IF 2/4 ze dvou šarží při použití barvení kyselou violetí. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro obě šarže s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Reprodukovatelnost mezi gely a specificita Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na čtyřech různých patologických vzorcích na 20 gelech HYDRAGEL IF 2/4 ze 2 různých šarží při použití barvení kyselou violetí. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro všechny gely s typickými vzory očekávanými pro testovaný vzorek. Přesnost Třicet dva (32) různých vzorků patologických sér bylo analyzováno na gelech HYDRAGEL IF 2/4 a dalším komerčně dostupném agarózovém gelovém imunofixačním systému. Byly použity gely HYDRAGEL IF 2/4 a barvení kyselou violetí. U všech patologických vzorků při použití všech postupů byly detekovány identické proužky. Citlivost Byly připraveny následně ředěné 3 patologické vzorky, všechny vykazovaly obsah monoklonálních složek. Testováno bylo barvení amidočerní i kyselou violetí. Výsledky jsou sumarizovány dále. MONOkLONÁLNÍ SLOŽkA MEZ DETEkCE (g/l) VZOREk Č. TYP konc. (g/l) HYDRAGEL 4 IF AMIDOČERŇ HYDRAGEL 4 IF kyselá VIOLET 1 alfa kappa mu lambda gama lambda Citlivost k Ig D a Ig E Byly připravené sériově ředěné typické vzorky s obsahem Ig D a Ig E a analyzovány pomocí standardního maskovacího postupu HYDRAGEL 2 & 4 IF se (HR) se specifickými maskovacími antiséry Anti-Ig D a Anti-Ig E. Minimální mez detekce byla okolo 2,0 mg/dl pro Ig D a 6,0 mg/dl pro Ig E. HYDRAGEL 9 IF Reprodukovatelnost na gelu Reprodukovatelnost na gelu byla demonstrována na třech patologických vzorcích séra s vysokou, střední a nízkou koncentrací monoklonální složky. Každý vzorek byl analyzován na gelech HYDRAGEL 9 IF ze dvou šarží při použití barvení kyselou violetí. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro obě šarže s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Imunofixace opakovaně ukázala očekávané monoklonální proužky u všech třech patologických vzorcích

12 Reprodukovatelnost mezi gely Reprodukovatelnost mezi gely byly demonstrována na devíti patologických vzorcích séra. Vzorky byly analyzovány na gelech HYDRAGEL 9 IF ze tří šarží při použití barvení kyselou violetí. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro všechny tři šarže s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Přesnost Padesát osm různých vzorků bylo analyzováno na gelech HYDRAGEL 9 IF a dalším komerčně dostupném agarózovém gelovém imunofixačním systému. Byly použity gely HYDRAGEL 9 IF a barvení kyselou violetí. U všech patologických vzorků při použití všech systémů a postupů byly detekovány identické proužky. Citlivost Bylo připraveno šest následně ředěných patologických vzorků sér, všechny vykazovaly obsah monoklonálních složek. Výsledky jsou sumarizovány níže. MONOkLONÁLNÍ SLOŽkA MEZ DETEkCE (g/l) VZOREk Č. TYP konc. (g/l) HYDRAGEL 9 IF SROVNÁVACÍ TEST 1 gama kappa gama lambda alfa kappa alfa lambda mu kappa mu lambda

13 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir : For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to: 1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris. 2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp

14 3 4 2 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure sebia Figure 5 Figure 6 sebia

15 sebia sebia SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 Figure 8 Figure 9 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/