Základy hmotnostní spektrometrie

Transkript

1 Základy hmotnostní spektrometrie Lenka Hernychová Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové

2 Historie Koichi Tanaka vyvinul MALDI techniku Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida T.: Rapid Commun. Mass Spectrom , 151 Tanaka K. JB Fenn vyvinul ionizaci elektrosprejem Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64 Fenn J.B. Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie

3 Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, která určuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty. Přístroj se nazývá hmotnostní spektrometr.

4 Princip MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky Neposkytuje informace o sekundární či terciální struktuře proteinu Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace.) a může určit i místo modifikace Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13 C/ 12 C, 34 S/ 32 S, 18 O/ 16 O - kvantifikace

5 Princip Umožňuje analýzu komplexních směsí Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality Identifikaci proteinů Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby Možnost analýzy nekovalentních komplexů

6 Vlastnosti hmotnostní spektrometrie Citlivá Specifická Rychlá Jednoduchá interpretace dat

7 Popis přístroje Experimentální uspořádání 1. Iontový zdroj 2. Hmotnostní analyzátor 3. Detektor 4. Řídící počítač

8 Součásti MS systému Atmosphere Vacuum System Sample Inlet Ionisation Method Mass Analyser Detector Data System

9 MALDI-TOF hmotnostní spektrometry MALDI-TOF Voyager (Applied Biosystems) 4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems) Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)

10 Princip Ionizace 1.Měkké techniky ionizace Energetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá. 2. Tvrdé techniky ionizace Dodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.

11 Typy ionizace - nárazem elektronů (EI) -působením elektrostatického pole (FI, FD) - chemickou ionizací (CI) - nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB) - ionizací fotony - ionizací 252 Cf - elektrosprejem, termosprejem (ESI) - ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)

12 Hmotnostní analyzátory Umožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech. Typy analyzátorů Kvadrupolový analyzátor (jednoduché, trojnásobné) Iontová past Průletový analyzátor (TOF) Hybridní (Q-TOF, Q-trap, TOF-TOF, trap-tof, trap-icr, ) FT-MS (ICR-MS)

13 Detektor Poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Dělí se do dvou skupin 1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů (měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin) 2. Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)

14 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Metoda využívá ionizace laserem pulsní technika UV (N 2 ) IR (CO 2 ) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)

15 MALDI-TOF MS - ionizace MALDI destička Laser 1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) ausušen (vykrystalizován) na MALDI destičce + AH + 2. Laserový výstřel ionizuje molekuly matrice. 3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice: MH + + A M + AH kv Ground Variable Grid Grid

16 Proces MALDI ionizace Měkká ionizace Malá nebo žádná fragmentace Jednou nabité ionty [M+H] + ; [M-H] - Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery Analýza komplexních sloučenin Rychlá příprava vzorku & analýza Tolerantní k detergentům a solím Jednoduchá interpretace dat Spojený s TOF analyzátorem

17 TOF analyzátor Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu mají rychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu t = k ( m 1 /z - m 2 /z)

18 TOF analyzátor Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovém a PSD módu Lineární mód měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m) Reflektronový mód měření peptidů (dráha letu je prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m) Post-Source Decay (PSD) kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)

19 Průletový analyzátor (TOF) kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů

20 Průletový analyzátor (TOF) kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.

21 Lineární mód Reflektronový mód

22 Charakteristika reflektronový mód Vysoké rozlišení (až ) a přesnost ( ppm) Vysoká citlivost (fmol = mol) Teoreticky neomezené rozmezí m/z Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra vjednom ionizačním pulsu

23 Příprava vzorků pro MS Předseparační techniky rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, caplc, MudPIT HPLC.) Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí

24 Separace proteinů 1D elektroforézou

25 + 2-Dimensionální PolyAkrylamidová Gelová Elektroforéza 2D-PAGE První dimenze pi pi 10 + _ Druhá dimenze - - Polyakrylamid rylamidový gel

26 Separace proteinů 2D elektroforézou ph 3-10

27 Separace proteinů 2D elektroforézou ph 6-11

28 Chromatogram separace acetonitrilového extraktu (proteiny) Brucella melitensis získaný z HPLC Alliance. ACN extrakt Brucella melitensis Modrými šipkami je označena oblast, ve které byly jímány frakce, a šipky zelené označují konkrétně najímané frakce.

29 Iontový záznam v podobě BPI (base peak intensity) tryptického digestu acetonitrilového extraktu Francisella tularensis LVS separovaný na CapLC a detekovaný na hmotnostním spektrometru Q-TOF Ultima API. ACN_FT_101204_2MS TOF MS ES+ BPI 3.28e % Time

30 2D-PAGE a MALDI-TOF Postup přípravy vzorků Separovaný Protein Proteasa Proteolytické peptidy MALDI-TOF MS spektrum proteolyt. peptidů

31 Enzymatické štěpení vzorku Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidové vazby u kladně nabitých zbytků. Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin. -Phe-Trp -Met -Gly-Ala -Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys - Trypsin

32 Matrice Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N 2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpací rychlostí vakuového systému) Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, které zajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH 3 CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci

33 MALDI-TOF MS Výběr matrice α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sinapinic Acid Peptidy < 10kDa Proteiny > 10kDa 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) Super DHB 3-Hydroxypicolinic acid Neutrální karbohydráty, Syntetické polymery Proteiny, Glycosylované proteiny Oligonukleotidy HABA Proteiny, Oligosaccharidy

34 Krystalizace matrice α cyano Zakulacené Sinapinic acid Kosodélníky

35 Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541

36 Interpretace spekter Metoda peptidového mapování (PMF) Voyager Spec #1 MC[BP = , 39593] E % Intensity Mass (m/z)

37 Selekce monoizotopického píku Pro přesnost měření je důležitá kalibrace přístroje Voyager Spec #1 MC[BP = , 39593] E % Intensity Mass (m/z)

38 100 Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = , ] E % Intensity Mass (m/z)

39 MALDI-TOF % Intensity Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = , ] E Mass (m/z)

40 Hodnocení spekter pomocí databáze - identifikace proteinu Primární struktura DNA Primární struktura proteinu Spektrum z MS Štěpící místa proteinu (Arg, Lys) Experimentálně zjištěné m/z proteolytických peptidů vs. Teoreticky vypočtené m/z proteolytických peptidů Metoda peptidového mapování - Peptide Mass Fingerprinting

41 Interpretace spekter Databáze přístupné na Internetu

42 Interpretace spekter Hodnocení v databázích

43 Interpretace spekter Výsledek

44 Anotace 2D-PAGE proteinové mapy

45 Kalibrace přístroje

46

47

48 Voyager Spec #1[BP = , 17155] E % Intensity Mass (m/z)

49 Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = , 16995] E % Intensity Mass (m/z)

50 Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>MC[BP = , Angiotensin I Angiotensin II Neurotensin ACTH (1-17) ACTH (18-39) 1.7E % Intensity Mass (m/z)

51

52 MS/MS spektra

53 Schéma fragmentace

54 Schéma fragmentace b 1 b 2 b 3 R 1 R 2 R 3 R 4 NH 2 -CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO 2 H N-terminus C-terminus y 3 y 2 y 1

55 Hmotnosti aminokyselin

56 Hledání y-iontové série Jr_74 # RT: AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms @35.00 [ ] E X T X D S A F Relative Abundance m/z

57 Hledání y-iontové série Jr_74 # RT: AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms @35.00 [ ] K, Y E X T X D S A F Relative Abundance m/z

58 Hledání b-iontové série Jr_74 # RT: AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms @35.00 [ ] K, Y E X T X D S A F Relative Abundance F A S D X T X E Y K m/z

59 Kontrola hmotnosti prekurzorového píku (součet hmotností všech aminokyselin) Jr_74 # RT: AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms @35.00 [ ] K, Y E X T X D S A F Relative Abundance F A S D X T X E Y K m/z