Základní principy interpretace spekter

Transkript

1 Základní principy interpretace spekter Obecný postup interpretace spekter Určení molekulové hmotnosti Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů Fragmentace iontů s lichým počtem elektronů

2 Interpretace hmotnostního spektra 1. Určíme, které ionty souvisí s analytem a které ne 2. Určíme molární hmotnost - hledáme molekulární ion M +, adukty (M+H) +, (M+Na) +, (M+HCOO) - nebo deprotonované molekuly (M-H) -, příp. vícenásobně nabité ionty 3. Odhadneme prvky, které jsou přítomny: inspekce izotopového klastru, aplikace dusíkového pravidla 4. Určíme elementární složení na základě měření přesné hmotnosti 5. Porovnáme spektrum s knihovnou, pokusíme se najít alespoň podobná spektra 6. Řešíme fragmentaci (vyžaduje znalost fragmentačních mechanismů a empirických pravidel) 1. Vyloučení iontů, které nesouvisí s analytem

3 Ionty pozadí, kontaminanty Hmotnostní spektra často obsahují ionty, které nemají vztah k analytu nečistoty (z rozpouštědel, nádobí, předchozích nástřiků) bleeding kolony nečistoty ve vzorku klastrové ionty rozpouštědel matriční ionty v MALDI klastry ACN v APCI spektru Ionty pozadí, kontaminanty O OH Ftaláty: - změkčovadla z plastů m/z 149, 279, 301, O Polyethylenglykoly: - z plastů pravidelné píkyve spektru vzdálené 44 u

4 Ionty pozadí, kontaminanty Volně dostupné databáze běžných kontaminujících iontů: Mass spectrometry Contaminant Database Seznam tabulek a databází: Common background contaminant ions and adducts.xls, Odečet pozadí SPEKTRUM V PÍKU SPEKTRUM PO ODEČTU POZADÍ SPEKTRUM POZADÍ siloxany z kolony

5 Ionty matrice u MALDI klastry, fragmenty, adukty iontů matrice v nízké oblasti spektra, velmi intenzivní. Spektra se proto měří až od ~ m/z 500. MALDI ionty z matrice analyt 2. Určení molekulové hmotnosti

6 Určení molekulové hmotnosti identifikace molekulového iontu, případně molekulového aduktu I. Elektronová ionizace M + e - M e - Molekulový ion (M + ) je radikál kation. Jeho m/z odpovídá monoizotopické hmotnosti analytu Identifikace molekulového iontu ve spektru 1. ve spektru nemusí být přítomen 2. pokud je přítomen, musí mít nejvyšší m/z ve spektru 3. je to ion s lichým počtem elektronů (OE + ) 4. poskytuje logické neutrální ztráty I. Elektronová ionizace Určení molekulové hmotnosti dekan Mw 142 M + 1-dekanol Mw 158

7 Určení molekulové hmotnosti II. Měkké ionizační techniky (ESI, APCI, MALDI) molekulární adukty ([M+H] +, [M+Na] + ) nebo deprotonované molekuly ([M-H] - ) Molekulový adukt je ion se sudým počtem elektronů a nemusí být nejvyšším iontem ve spektru. vícenásobně nabité ionty molekulární adukty multimery (dimery, trimery..) Určení molekulové hmotnosti II. Měkké ionizační techniky (ESI, APCI, MALDI) molekulovou hmotnost určujeme na základě přítomnosti aduktů, dimerů, nebo vícenásobně nabitých iontů M+1 M+1 M+23 (M+2)/2 2M+1 M+39 Výpočet aduktů, multimerů, vícenásobně nabitých iontů Kalkulátor EIC I:\MISC\MS\DOWNLOAD\

8 Určení molekulové hmotnosti Určení molekulové hmotnosti nábojové stavy Určení počtu nábojů iontu Počet nábojů lze zjistit ze vzdálenosti mezi píky v izotopovém klastru.

9 Určení molekulové hmotnosti nábojové stavy Příklad: relativní hmotnost 1000 [M + H] + [M + 2H] 2+ Izotopy C 13 C 1 13 C 2 12 C 13 C 1 13 C 2 Spektrum (m/z!) 1001/1= /1 = /1= /2= /2 = /2=502 1 Da 0.5 Da 3. Určení prvků přítomných v molekule

10 Izotopové klastry Izotopické klastry naznačují přítomnost některých prvků v molekule (např. Cl, Br, kovy). Počítačové programy umožňují spočítat složení klastru ze zadaného sumárního vzorce a porovnat ho s experimentem. MR/IsoClus.html Dusíkové pravidlo Dusíkové pravidlo: platí pro organické sloučeniny obsahující C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br, I. Založeno na faktu, že pouze dusík má lichou vaznost při sudé nominální hmotnosti (ostatní mají sudou nebo lichou vaznost i hmotnost). lichá hmotnost molekuly = lichý počet dusíků sudá hmotnost molekuly = sudý (nulový) počet dusíků EI platí pro M + tak, jak je uvedeno Aplikace pravidla na ionty ESI, APCI, MALDI pro molekulové adukty, platí pravidlo opačně! NH 2 NH 2 + NH 3 + M=93 m/z 93 m/z 94

11 4. Určení elementárního složení z přesné hmotnosti Určení elementárního složení z přesné hmotnosti Čím přesněji určíme hmotnost iontu, tím více omezíme počet možných struktur, tj. tím spíše dojdeme ke správnému elementárnímu složení Př. paclitaxel, C 47 H 51 NO 14, mon. hmotnost Omezení pro výpočet vzorce: C: H: N: 0-10 O: 0-30

12 5. Hledání v knihovnách spekter Knihovny spekter EI NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library Wiley Registry of Mass Spectral Data EI spekter (70 ev) MS/MS spekter, retenční indexy látek strukturní vzorce EI spekter (70 ev) strukturní vzorce

13 Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Problémy s tvorbou knihoven: - vzhled MS spektra velmi silně závisí na experimentálních podmínkách (adukty v závislosti na složení mobilní fáze) - v MS spektrech většinou nejsou fragmentové ionty -> knihovny spekter na úrovni MS n -MS n spektra závisí na experimentálních podmínkách (energie ionizace, typ analyzátoru apod.) spektra v knihovnách jsou měřena při několika experimentálních podmínkách Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Veřejné uložiště MS dat pro sdílení ve vědecké komunitě (~ 40 tis. spekter). Tvorba spojeného (merged) spektra ze spekter měřených za různých podmínek CID.

14 Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Volně přístupná databáze spekter, spektrálních strumů, struktur, fragmentů, chromatografických dat, odkazů apod. (~ 170 tis. spekter, 2600 látek). Spektrální strom: databázová struktura tandemových spekter Identifikace podstruktur možnost identifikace látek které nejsou v databázi 6. Interpretace fragmentových iontů

15 Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE + ) ESI, APCI (APPI, MALDI, DESI...) Fragmentace EE + CID fragmentace iontů se sudým počtem elektronů ([M+H] +, [M+Na] +, [M-H] - ) štěpení sousední vazby vzhledem k náboji, migrace náboje R-OH + H R-OH + 2 R-OH 2+ R + + H 2 O FRAGMENTACE EE + : vzniká ion se sudým počtem elektronů (EE + ) a neutrální částice EE + EE + +M Ionty EE jsou obecně stabilnější než OE + Spektra jsou jednodušší, poskytují tak méně informací než spektra EI, bývají citlivá na malé změny ve struktuře

16 Fragmentace EE + Odštěpení neutrální molekuly závisí na bazicitě a stabilitě vznikajícího iontu Typické ztráty neutrálních částic: 17: NH 3 aminy alifatické, aromatické (+) 18: H 2 O kyslíkaté sloučeniny, hydroxyderiváty(+/-) 27: HCN - aminy alifatické, aromatické, nitrily arom. (+/-) 28: CO aldehydy, ketony, nitroaromáty (+/-) 32: CH 3 OH methyl estery (+) 42: CH 2 C=O N-acetyl deriváty (+/-) 44: CO 2 karboxylové kyselin, karbamáty (+/-) 80: SO 3 sulfonové kyseliny (+/-) 162: anhydroglukosa glukosidy (+/-) Zakázané neutrální ztráty: 3-14, 21-25, Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS C 8 H 9 NO 2 ; M= Mass Intensity

17 Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS/MS Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS

18 Kyselina menthyloxyoctová ESI-, MS/MS 75.3 C 12 H 22 O 3 ; M= Kyselina 2-merkaptonikotinová ESI+, MS/MS C 6 H 5 NO 2 S; M=

19 Kyselina 2-merkaptonikotinová ESI+, MS Cyklopentafuranol-deriv ESI+, MS/MS C 18 H 26 O 4 ;M=

20 Cyklopentafuranol-deriv, disil ESI+, MS/MS C 30 H 54 O 4 Si 2 ; M= PGF 2 -methylester, dithp ESI+, MS/MS C 31 H 52 O 7 ; M=

21 Triacylglyceroly APCI+, MS/MS OMoPo C 51 H 92 O 6 ; M= Triacylglyceroly Určete strukturu triacylglycerolu. APCI+, MS 635.5

22 Digalaktosyldiacylglyceroly ESI+, MS/MS DGDG 18:3/16:0 C 49 H 86 O 15 ; M= Fragmentace iontů s lichým počtem elektronů (OE + ) EI

23 Fragmentace OE + Při EI vznikají fragmenty již v MS kroku (nejsou nutné fragmentační techniky jako CID apod.) FRAGMENTACE OE + I. vzniká ion se sudým počtem elektronů a radikál OE + EE + +R II. vzniká ion s lichým počtem elektronů a neutrální částice OE + OE + +M Spektra jsou bohatá, informačně obsažná, mohou být použita jako fingerprint pro tvorbu knihoven spekter Probíhají pouze monomolekulární reakce Štěpení σ vazby je-li při ionizaci vyražen elektron ze -vazby, dojde k jejímu štěpení typická fragmentace pro alkany, případně pro F-, Cl-, CN- substituované alkany H 3 C CH 3 dekan (mainlib) Decane

24 Štěpení σ vazby intenzita fragmentových iontů závisí na jejich schpnosti stabilizovat náboj (mainlib) Nonadecane, 3-methyl- Chloromethan EI M + CH 3 + Cl +

25 Unknown Jaká je struktura látky? EI α-štěpení: fragmentace vyvolaná radikálem štěpení vyvolané tendencí elektronů tvořit páry lichý elektron je poskytnut na tvorbu nové vazby, štěpí se sousední vazba (mainlib) Ethyl ether

26 α-štěpení: benzylové štěpení (mainlib) Ethylbenzene Indukční štěpení: fragmentace vyvolaná nábojem štěpení vyvolané přitahováním elektronového páru nábojem (mainlib) Ethyl ether

27 Fragmentace cyklických struktur Retro Diels-Alder -elektrony dvojné vazby u cyklických struktur jsou primárním místem ionizace 4-fenylcyklohexen Přesmyky vodíku McLaffertyho přesmyk přesmyk -vodíku na nenasycenou skupinu přes 6-členný kruh. Nové radikálové místo vyvolá -štěpení

28 Přesmyky vodíku McLaffertyho přesmyk Vziklé OE + jsou typické pro řadu funčních skupin aldehydy, ketony, estery, kyseliny, amidy, karbonáty, fosfonáty apod O O (mainlib) Dodecanoic acid, methyl ester Přesmyky vodíku McLaffertyho přesmyk

29 Charakteristické iontové série Homologické série v oblasti nízkých m/z mohou podat informace o strukturních prvcích v molekule Charakteristické ionty Charakteristické ionty podle M.Poláška Škola MS

30 Logické neutrální ztráty Neutrální ztráty musí dávat chemický smysl. Ztráty radikálů i neutrálních molekul. Intenzita molekulárního iontu Intenzita molekulárního iontu souvisí s jeho stabilitou. Podle intenzity lze usuzovat na přítomnost určitých strukturních prvků v molekule.

31 Literatura EI Fred W. McLafferty and Frantisek Turecek: Interpretation of Mass Spectra. University Science Books (1993). ISBN-10: , ISBN-13: Fulton G. Kitson, Barbara S. Larsen, and Charles N. McEwen: Gas Chromatography and Mass Spectrometry. Academic Press (1996). ISBN-10: , ISBN-13: ESI APCI CI Levsen et al.: Even-electron ions: a systematic study of the neutral species lost in the dissociation of quasi-molecular ions. J. Mass Spectrom. 42, , 2007 Alex. G. Harrison: Chemical Ionization Mass Spectrometry, CRC(1992). ISBN-10: , ISBN-13: