Buněčné základy růstu a morfogeneze, signalizace u rostlin fytohormony

Transkript

1 Buněčné základy růstu a morfogeneze, signalizace u rostlin fytohormony

2 Růst a vývoj rostlin Zásadní rozdíly ve vývoji rostlin a živočichů Stavba rostlinného těla není předem určená Významný podíl nediferencovaných buněk (meristémy) Přítomnost buněčné stěny brání migraci buněk Poziční určení buněčného osudu Absence buněčných linií Neukončený vývoj

3 Růst a vývoj rostlin Růst nabývání velikosti, objemu, plochy či hmotnosti buněk či celých orgánů Diferenciace funkční rozrůznění buněk či orgánů podle jejich specializace Morfogeneze vývoj tvaru buňky či celé rostliny Vývoj je dán souhrnem procesů růstu a diferenciace, musí být pevně zasazen v čase a orientován prostorově Totipotence schopnost rostlinných buněk regenerovat za vhodných podmínek celou rostlinu. Dediferenciace opětovné nabytí schopnosti buněk realizovat více vývojových programů

4 Růst a vývoj rostlin Fenologické fáze: - praktický a experimentální význam - etapy embryonální, juvenilní (vegetativní), zralosti, stárnutí (senescence) Boyes et al, Plant Cell 13, 1499, 2001

5 Růst a vývoj rostlin Růstové fáze: - buněčné dělení - objemový růst - diferenciace Buněčné dělení - v meristémech, neustálý průběh buněčného cyklu apikální meristém prýtu kořene Objemový růst - vrcholový a difúzní typ růstu, orgány s ukončeným a neukončeným typem růstu Diferenciace - specializace na úrovni buněk, pletiv a orgánů

6 Základní rozdíly v dělení živočišných a rostlinných buněk Převzato z přenášky D. Honyse, B130P14: Fyziologie rostlin.

7 Růst a vývoj rostlin Polarita buňky a rostliny dána směrovaným buněčným dělením a směrovaným buněčným růstem...důležitá role cytoskeletu! Před cytokinezí je polarita budoucí buněčné přepážky ustavena prostřednictvím preprofázového svazku mikrotubulů

8 Růst a vývoj rostlin Polarita buňky a rostliny dána směrovaným buněčným dělením a směrovaným buněčným růstem

9 Růst a vývoj rostlin Polarita buňky a rostliny dána směrovaným buněčným dělením a směrovaným buněčným růstem Během růstu buněk: komponenty buněčné stěny ukládány s určitou orientací pohyb sekrečních váčků - aktinový a mikrotubulární cytoskelet Ukládání celulózových mikrofibril: v interakci s cytoskeletem v kortikální cytoplazmě

10 dlouživý růst buněk zvětšuje se plocha buněčné stěny plocha plazmalemy objem vakuoly a plocha tonoplastu bez turgoru buňka neroste význam K + H 2 O syntéza celulózy hemicelulóz a pektinů lipidů proteinů

11 transport pektinů, hemicelulóz a proteinů do buněčné stěny Golgiho aparát syntéza celulózy

12 Orientace buněčného dělení, buněčné vrstvy a morfogeneze Bowman (2001) Wolpert (1998) Principles of Development Uvnitř orgánu kolmý na povrch rovnoběžný s povrchem Vně orgánu Základní aspekt morfogeneze Kontrola roviny buněčného dělení ve vztahu v povrchu rostlinného těla Povrch orgánu Převzato z přenášky D. Honyse, B130P14: Fyziologie rostlin.

13 Primární apikální meristémy Meristémy Populace malých isodiametrických buněk Věčné trvání embryonálního charakteru meristému Část buněk nenastoupí cestu diferenciace, ale zachovává si dělivou schopnost po celou dobu existence vegetativního meristému iniciály / Kmenové buňky Nediferencované buňky: Po rozdělení si jedna dceřinná buňka zachová charakter iniciály (kmenové buňky) a druhá nastoupí diferenciační dráhu (může po několika dalších děleních) toitipotence iniciály x pluripotence kmnové buňky Převzato z přenášky D. Honyse, B130P14: Fyziologie rostlin, upraveno

14 Iniciace laterálních kořenů Přísná kontrola orientace buněčného dělení během morfogeneze Primordia laterálních kořenů vznikají periklinálním dělením pericyklu

15 Mezibuněčná komunikace Chemické signály Fytohormony (Auxin) du/botany/ s.com Fyzické propojení buněk Plasmodesmy Syncytium

16 totipotence rostlinných buněk podmínky úplná genetická výbava aparát schopný ji realizovat regenerace rostlin restituce (náhrada v ráně neobvyklé) 1902 Hypotéza Totipotence rostlinných buněk somatická embrya Gottlieb Haberlandt ( )

17 Rostliny jsou přisedlé organizmy vysoká schopnost regenerace doplňování a nahrazování ztracených částí těla Většina rostlinných buněk není terminálně diferencovaných Regenerace rostlin z izolovaných somatických buněk Totipotence rostlinných buněk Wolpert (1998) Principles of Development

18 Buněčný cyklus u rostlin Buněčný cyklus sekvence pravidelně se opakujících událostí fáze G1, S, G2, M, G0 kontrolní body G1/S, G2/M 2C 2C dělení růst buňky zvýšení počtu organel a ribozomů replikace DNA syntéza strukturních proteinů jádra interfáze 2C vstup do G 0 nebo příprava na fázi S

19 Buněčný cyklus u rostlin regulace buněčného cyklu CKD cyklin dependentní kinázy zy: kinázy řízené regulačními proteiny- CYKLINY cykliny: vazba na základní katalytickou jednotku a vyskytují se jen v buňkách, které se aktivně dělí mitotické: A, B; G1 fáze: D aktivní komplex CDK-cyklin fosforylace dalších proteinů = reorganizace cytoskeletu a endomembránového systému v příslušné fázi cyklu např. při vstupu do M: fosforylace (inaktivace, destrukce) histonů H1 a laminů = kondenzace chromatinu a rozpad jaderné membrány

20 Buněčný cyklus u rostlin regulace buněčného cyklu CKD cyklin dependentní kinázy kinázy řízené regulačními proteiny - cykliny fosforylace dalších proteinů = reorganizace cytoskeletu a endomembránového systému v příslušné fázi cyklu další regulace CDK: fosforylace / defosforylace specifickými kinázami / fosfatázami: v G1 fázi je CDK fosforylována v pozici Tyr 15 nebo Thr 14 (i obou) Se vstupem do S-fáze je CDK fosforylována v pozici Thr 160

21 Buněčný cyklus u rostlin regulace buněčného cyklu Degradace cyklinů specifických pro jednotlivé fáze buněčného cyklu je pod kontrolou proteolytického aparátu (komplex ubikvitin ligázy SCF)..cykliny určené k degradaci označeny ubiquitinem Převzato z Buchanan et al 2000

22 Buněčný cyklus u rostlin Endoreduplikace -zmnožení jaderné DNA bez následné cytokineze -diferenciace v G2 fázi (místo G1) -v průběhu vývoje rostlin vyšší čím je orgán starší Převzato z Buchanan et al 2000

23 Co víme po více než sto letech? O typech signálů, které rostlina přijímá? O mechanizmech jejich zpracování? Přednáška B130P14: Fyziologie rostlin Katedra fyziologie rostlin, UK PřF, Jan Petrášek

24 rostliny příjem a přenos signálů přisedlé organizmy mnohobuněčné organizmy nutnost reagovat na okolí koordinace vnitřních procesů potřeba získávat informace z vnějšího i vnitřního prostředí signály: fyzikální (světlo, změny vektorového rozložení mechanických tlaků v pletivech, změny teploty ) chemické (fytohormony, cukry, gradienty iontů, patogeny... ) Většina signálů způsobuje změny genové exprese PŘÍJEM SIGNÁLU RECEPTORY SENSORY obvykle bílkovinného chrakteru - umístěny na membránách (plasmalemě, membránách organel, i v cytoplazmě) - bílkoviny (např. hexokinasa) či bílkovinné komplexy -vnímají jako signál změnu průtoku signální molekuly (např. cukru) -metabolické enzymy, membránové přenašeče

25 rostliny příjem a přenos signálů SLOŽKY PŘENOSU signálu obecné schéma příjmu a přenosu signálu fyziologický signál nebo s. z vnějšího prostředí vnější: světlo, teplota, dotek fyziologický: fytohormony, živiny receptorová kináza, receptor spjatý s G-proteinem signální dráha kinázy, vápník, lipidy, ph odpověď exprese genů, uspořádání cytoskeletu, enzym. aktivita vyhodnocení informace = reakce na signál změny genové exprese změny v organizaci a aktivitách cytoplasmy

26 Přenos signálu v rostlinách Typy signálu lze členit dle různých hledisek na externí, interní, biotické a abiotické. Reakce rostliny spočívá v: 1) zesílení signálu 2) jeho přenosu 3) změnách růstu a metabolismu Fig. 18.1, 2.: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

27 Přenos signálu v rostlinách Přenos signálu: zachycení receptorem, aktivace druhých poslů vyvolání odpovědi buňky převzato od J. Petráška

28 Přenos signálu v rostlinách Signál míra informace v čase či prostoru Reakce rostliny na signál je závislá na: vývojovém stavu předchozích vlivech prostředí vnitřních biologických hodinách, které specifikujíčas v rámci roku a dne!! DůleD ležitost časování odpovědi di na signál příkladu klíčení semene - pokud je špatně načasováno, nelze zvrátit Zea mays, mutace v prekurzoru ABA klíčící semena na mateřské rostlině

29 Přenos signálu v rostlinách Konečná reakce rostliny (resp. buňky) bývá projevem integrace různých signálních informací kooperace mezi dvěma či více druhy signálů u rostlin např. známa v případě signalizace červeným a modrým světlem vnímání gravitace a světla světla a dostupnosti nitrátů kooperace růstových regulátorů (fytohormonů) různých minerálních látek Existence společných mechanismů pro více signálních drah

30 Příjem signálu v rostlinách - receptory 1) pomocí receptorů v plazmatické membráně / cytosolu / jádře / ER Taiz and Zeiger 2010

31 Příjem signálu v rostlinách - receptory 2) vlastní změnou membránového potenciálu, která otevírá iontové kanály Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecualr Biology of Plants, 2000 převzato od J. Petráška

32 Úrovně signalizace v rostlinném těle Komplexita regulace signálních drah: složité vztahy na úrovních: druhých poslů metabolických reakcí přestavby podpůrných struktur cytoskeletu membránového systému Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

33 Příjem signálu v rostlinách - receptory Receptory v plazmatické membráně jsou u rostlin pravděpodobně analogické živočišným receptorům (ale důkazy pro všechny typy nejsou prozatím úplné) A receptor vázanv zaný na trimerický G protein B - receptor vázanv zaný na enzym C receptor vázanv zaný na iontový kanál SIGNÁLN LNÍ DRÁHA: Sled reakcí, které vedou od receptoru aktivovaného signálem k buněčné reakci Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

34 Přehled důležitých signálních drah u rostlin Fosfatidyl inositolový signáln lní systém Fosfolipáza C enzym vázaný na plasmalemu často aktivována G-proteinem štěpení fosfatidylinositol 4,5 bisfosfátu (PIP2) inositol 1,4,5 trisfosfát (IP3) diacyl glycerol (DAG) IP3 a DAG fungují jako druzí poslové Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

35 Přehled důležitých signálních drah u rostlin Fosfatidyl inositolový signáln lní systém IP 3 aktivuje Ca 2+ kanály v membránách endoplazmatického retikula výsledný signál je zprostředkován přes kalmodulin-dependentní protein kinázy DAG zůstává vázaný na membránu může aktivovat proteinkinázu C (PKC) mění její citlivost k Ca 2+ (PKC působí v mnoha signálních drahách spojených s dělením a růstem buněk) Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

36 Přehled důležitých signálních drah u rostlin Protein kinázové kaskády nejrozšířenějším způsobem regulace genové exprese Výsledkem kinázové kaskády je aktivace transkripčních faktorů (TF) v cytoplazmě či přímo v jádře. MAPK - protein kinázy aktivující mitogeny = transkripční faktory Ca2+/ kalmodulinové kinázy po reakci s Ca2+/ kalmodulinem aktivují TF návazné fosforylace slouží k zesílení signálu a případné další regulaci Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

37 Přehled důležitých signálních drah u rostlin Řízená proteolýza signálních molekul, např. transkripčních faktorů. Protein určený k degradaci je označen ubiquitinem ve třech následných krocích: 1) Aktivační enzym E1 za spotřeby ATP aktivuje ubiquitin 2) konjugační enzym E2 ho dále napojí na komplex ubiquitin ligázy E3 3) na komplexu E3 je již vázán protein určený k degradaci a dochází k vazbě ubiquitinu Degradace proteinů následně probíhá v proteasomu ubiquitin 76 AMK protein, vysoce konzervovaný

38 Přehled důležitých signálních drah u rostlin Některé receptory fytohormonů jsou součástí ubiquitinové proteolytické dráhy (př. auxin, giberelin, k. jasmonová) v jádře: část vazebného místa IAA!přenos signálu v rostlinách často představuje INAKTIVACI REPRESORŮ část vazebného místa IAA komplex E3 ligázy negativní regulace se ukázala podle mat. modelů jako rychlejší komplex E3 ligázy a AUX/IAA represoru - ubiquitinace x živočichové spíš pozitivní (aktivační) signální dráhy AUX/IAA represor degradace 26s proteasomem

39 Rostlinná neurobiologie Nově formovaná oblast rostlinné fyziologie, která si klade za cíl studovat podstatu adaptivního chování rostlin. Alternativní název Sensorická biologie rostlin či biologie vnímání rostlin. Sdružuje více pohledů: Oblasti studia: - buněčná a molekulární biologie - elektrofyziologie - ekologie - anatomie, adaptace, signalizace během symbiózy a reakce na patogeny, rostlinná imunita, paměť a učení, komunikace mezi rostlinami, rostlinná inteligence Prezentace na příště... Jméno rostlinná neurobiologie podle Brenner et al Rostliny odpovídají na okolní svět změnami v morfologii, pohyby, reagují na elektrické podněty, přenášejí akční potenciál, tvoří signální molekuly a ovlivňující chování jiných organismů Brenner E, et al (2006) Plant neurobiology: an integrated view of plant signaling. Trends Plant Sci 11:

40 FYTOHORMONY Santner A. et al, Nature Chemical Biology 5, (2009)

41 Fytohormony Julius von Sachs ( ) hypotéza chemických signálů (morfogenů) Signální molekuly s růstově regulační funkcí Základních 6 skupin - auxiny - cytokininy - gibereliny - kyselina abscisová - etylén - brasinosteroidy Další látky s růstovr stově-regulační funkcí: - polyaminy - kyselina jasmonová - kyselina salicylová - fenolické látky - peptidové hormony - deriváty karotenoidů (strigolaktony) Santner et al. 2009, Nature Chemical Biology 5 (5),

42 Fytohormony Signální molekuly v podobě organických nízkomolekulárních látek Přítomné v nízkých koncentracích (10-6 až 10-9 M) Při vyvolání růstové či vývojové odpovědi se samy chemicky nemění Vývojové procesy jsou zajištěny změnou koncentrace určitého typu fytohormonu a současně modulací citlivosti pletiv k němu Působí v místě svého vzniku nebo i v jiných částech rostliny -transport! Spolupůsobení faktorů okolního prostředí (světelné a tepelné záření, gravitace, elektrická pole) Podrobněji o fytohormonech pojednává semestrální přednáška KEBR PřFUK Fytohormony B130P15

43 Analogie živočišných a rostlinných hormonů sporná Velmi obecný mechanismus účinku je společný: Biosyntéza HORMON Metabolismus Receptor Aktivace výkonných struktur (systém druhých poslů) a případné následné ovlivnění genové exprese Živočišné hormony: - syntéza ve specializovaných tkáních - transportovány na přednostní místo spotřeby - vyvolávají relativně specifickou fyziologickou odpověď - působí v úzké koncentrační škále mezi 10-8 až M Rostlinné hormony: - není jasně patrný rozdíl mezi místem biosyntézy a spotřeby - mají značně pleiotropní (různorodé) účinky (mohou vyvolávat kvalitativně rozdílné účinky v různých pletivech, ale v závislosti na koncentraci i ve stejném pletivu) - koncentrační rozmezí širší mezi 10-6 až 10-9 M převzato od J. Petráška

44 Syntetické látky s růstově-regulační funkcí chemicky připravené látky se strukturou podobnou fytohormonům -váží se na receptory pro fytohormony -vyvolávají růstovou odpověď rostliny -mohou mít společný mechanismus -mohou narušovat transport konkrétního hormonu - často stabilnější, lépe aplikovatelné použití v zahradnictví, agronomii PREZENTACE Commercial Uses of Gibberellins prezentace

45 Nároky na fytohormony...aneb čím izolovanější buňka je, tím závislejší se stává na tom co jí dodáme zvenčí Rostlina Zvýšení nároků na exogenní fytohormony Buňka Kalus, buněčná kultura Protoplast Protoplastová kultura Snížení nároků na exogenní fytohormony Buňka Organogeneze, embryogeneze Rostlina převzato od J. Petráška

46 Auxiny historie objevu Nejdéle známé fytohormony Darwin 1880, Paal 1919, Went 1928 v pokusech s koleoptilí ovsa prokázali existenci účinné látky (izolace z fermentační směsi) podporující prodlužování buněk (auxein=růst) Kögl (Holandsko) 1933 izoloval tuto látku z lidské moči a následně identifikoval jako kyselinu indolyl-3-octovou (IAA) teprve 1946 potvrzena ve vyšších rostlinách kyselina indolyl-3-octová

47 Auxiny historie objevu F.W. Went, , koleoptilový test na auxiny

48 Auxiny - chemické struktura endogenní auxiny IAA IBA 4-Cl-IAA Kyselina indolyl-3-octová Kyselina indolyl-3-máselná Kyselina 4-chlor-indolyl-3-octová syntetické auxiny Kyselina fenyloctová Kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová Kyselina 1-naftyloctová PAA 2,4-D NAA převzato od J. Petráška

49 Auxiny - biosyntéza Biosyntéza hlavně v mladých apikálních pletivech a rychle se dělících buňkách tj. meristémech, embryu, vyvíjejících se plodech 1) Biosyntéza vycházející z L- tryptofanu: 2) Biosyntéza nezávislá na L- tryptofanu: - Prekurzorem indol či indolylglycerol-fosfát Taiz and Zeiger 2002

50 Auxiny - metabolismus Konjugace IAA: - kovalentní vazba nízkomolekulárních látek - je reverzibilní - konjugované formy IAA jsou neaktivní (mohou se hromadit) - funguje jako rychlý regulační mechanismus - glukosylestery, myoinositol estery, konjugáty s aminokyselinami (aspartát) Funkce konjugátů: - zásobní pool auxinu (klíčící semene), až 50-90% celkového obsahu IAA - možné rychlé uvolnění aktivní formy (rychlejší než syntéza) - detoxifikační - transportní - ochrana před degradací

51 Polární transport auxinů regulační funkce Chemiosmotická teorie transportu auxinu z buňky do buňky: Odlišná prostupnost IAA a IAA - přes plazmatickou membránu IAA může procházet membránou IAA- potřeba přenašeče - Disociace molekul IAA vyšší v cytosolu (vyšší ph oproti apoplastu) -IAA - je zachytávána v cytoplasmě v tzv. aniontové pasti, Polarita toku je dána polárním umístěním přenašečů

52

53 Polární transport auxinů regulační funkce Rostlina Směr toku auxinu Kořen Přenašeč auxinu ven z buňky Přenašeč auxinu do buňky Parenchymatické buňky protofloému (Podle Grebe, BioEssays 26, 719, 2004) převzato od J. Petráška

54 Polární transport auxinů přenašeče auxinu přenašeče auxinu do buňky AUX1/LAX rodina transmembránových proteinů, podobné aminokyselinovým permeázám pin1 mutant Arabidopsis převzato z Taiz and Zeiger 2002 přenašeče auxinu z buňky PIN ABC přenašeče - rodina proteinů PIN1 - PIN8 (Arabidopsis) (ATP binding casette) lokalizace PIN1 proteinu na bazální straně buněk Petrášek and Friml, 2009, Development 136,

55 Přenašečové molekuly podléhají konstitutivnímu cyklování Přenašečové molekuly cyklují mezi plasmatickou membránou a endomembránovým systémem: - regulace inhibitory transportu auxinu (PBA, TIBA) - regulace samotnými auxiny

56 Auxiny mechanismus účinku Auxinem stimulovaná aktivace H + -ATPázy: - umožňuje snižovat ph buněčné stěny a rozvolňovat tak její strukturu, důsledkem je tzv. kyselý růst převzato od J. Petráška

57 Auxiny fyziologické účinky Stimulace prodlužovacího růstu segmenty koleoptilí ovsa H 2 O IAA

58 Auxiny fyziologické účinky Regulace tropismů - pozitivní gravitropismus kořene - negativní gravitropismus stonku Gravitropismus kořene ohyb dolů: - hromadění auxinu na spodní straně, kde je taková koncentrace inhibiční pro buněčnou elongaci Gravitropismus stonku ohyb nahoru: - hromadění auxinu na spodní straně, kde je taková koncentrace aktivační pro buněčnou elongaci Friml 2003, Current Opinion in Plant Biology 6, 1-6 Paciorek et al. 2005, Nature 435 (7046), převzato od J. Petráška

59 Auxiny fyziologické účinky odlišná citlivost a odpověď k auxinu Regulace tropismů - pozitivní gravitropismus kořene - negativní gravitropismus stonku stonek pupen kořen pleiotropní (různorodé) účinky auxinu Paciorek et al. 2005, Nature 435 (7046), Friml 2003, Current Opinion in Plant Biology 6, 1-6

60 Auxiny fyziologické účinky Regulace tropismů fototropismus stonku: - hromadění auxinu na od světla odvrácené straně, kde je taková koncentrace aktivační pro buněčnou elongaci - zřejmě souvisí se signalizací prostřednictvím fosforylace receptoru modrého světla fototropinu DR5::GUS světlo převzato od J. Petráška

61

62 Auxiny fyziologické účinky Udržování apikální dominance vzrostný vrchol produkcí auxinu a jeho transportem bazipetálně udržuje svou dominanci odstranění apikálního meristému uvolňuje inhibici růstu bočních pupenů boční (axilární) pupeny

63 Auxiny fyziologické účinky Regulace embryogeneze, zakládání laterálních orgánů Tanaka et al.,.cell. Mol. Life Sci. 63, , 2006 převzato od J. Petráška

64 Auxiny fyziologické účinky Podpora tvorby hlíz či plodů, stimulace zakořeňování normální plod odstranění nažek po odstranění nažek, stříkáno auxinem zbytnělé receptákulum nažka růst receptákula je stimulován auxinem produkovaným v nažkách Callis 2005, Nature 435, převzato od J. Petráška

65 Cytokininy historie objevu Haberlandt 1913 látka v cévních svazcích stimulující buněčné dělení Overbeek 1940 látka v mléčném endospermu z nezralých ořechů kokosu Skoog 1950 pokusy s in vitro kulturami tabáku, stimulace dělení po aplikaci částí vaskulárního pletiva na explantát, úspěch i s kvasničným extraktem a autoklávovanou DNA Miller 1954 izolace účinné látky z klávované DNA slanečka, pojmenována kinetin první syntetický cytokinin Letham 1963 první přirozeně se vyskytující se cytokinin (zeatin) izolován z nezralého endospermu kukuřice převzato od J. Petráška

66 Cytokininy chemická struktura N 6 -substituované deriváty adeninu podle postranního řetězce se dělí na isoprenoidní a aromatické Sakakibara, Annu Rev Plant Biol , 431 převzato od J. Petráška

67 Cytokininy biosyntéza Isopentenyl transferáza (IPT) agrobakterium Vychází z isopentenyl pyrofosfátu (= AMAPP dimetylalyl difosfát) rostliny + adenosin fosfátu ATP / ADP (AMP) probíhá hlavně v kořenech, embryích, mladých listech a plodech, všude tam, kde se buňky dělí -signalizace na krátkou i dlouho vzdálenost -transport xylémem převzato od J. Petráška

68 PREZENTACE Vývoj tumoru a role etylénu při jeho morfogenezi

69 Cytokininy fyziologické účinky Stimulace buněčného dělení v explantátových kulturách Poměr hladin auxinu (A) a cytokininu (CK) určující pro organogenezi: -vyrovnaný poměr kalus Převaha auxinu Převaha cytokininu model organogeneze in vitro Skoog a Miller 1957

70 Cytokininy fyziologické účinky Stimulace buněčného dělení v meristémech, narušení apikální dominance. Rostlina tabáku exprimující ipt gen z agrobakteria zvýšení syntézy cytokininů - účinek podobný exogenní aplikaci: narušena apikální dominance aktivita laterálních meristémů Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000 intaktní apex apikální meristém Odstranění apexu prorůstání úžlab. pupenu úžlabní pupen IPT izopentenyl transferáza (CK biosyntéza) CKX cytokinin oxidáza (CK degradace) auxin inhibice IPT

71 Cytokininy fyziologické účinky Zpomalení stárnutí rostliny tabáku exprimující gen ipt pod kontrolou promotoru indukovaného senescencí jsou nesmrtelné. Cytokininy stimulují tvorbu chlorofylu. ovlivnění vývoje chloroplastů Za tmy: etioplasty (prolamelární těleso) ošetřeno cytokininy vývoj thylakoidů Chory et al. 1994, courtesy of J. Chory, American Society of Plant Biologists Taiz and Zeiger 2002

72 Cytokininy fyziologické účinky cytokininy podporují redistribuci živin a asimilátů v rostlině -mění vztahy zdroj / sink -podílejí se (spolu s auxinem) na poměru vývoje kořenů / prýtu -též v závislosti na obsahu živin v daném orgánu radioaktivně 14 C značená aminokyselina kontrola (ošetřeno vodou) neošetřeno 50mM kinetinc neošetřeno neošetřeno 50mM kinetin

73 Cytokininy fyziologické účinky regulační funkce fytohormonů může být zneužita i pateogenními organismy (bakterie, hmyz, nematoda) produkce vlastních cytokininů nebo stimulace jejich produkce samotnou rostlinou kořenové tumory - Agrobacterium prolomení dormace pupenů čarověníky Agrobacterium tumefaciens. Corynebacterium fascians - aktinomyceta

74 Gibereliny historie objevu a chemická struktura 30. léta 20. století Kurosawa Japonsko, choroba rýže vyvolaná houbou Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme v imperfektním stadiu), vyvolává dlouživý růst a následné poléhání rostlin 50. léta 20. století kyselina giberelová (GA 3 ) identifikována v extraktu z houby a následně nalezena též ve vyšších rostlinách Dnes známo okolo 130 různých forem giberelinů Jsou to tetracyklické diterpeny, slabé organické kyseliny, základem tetracyklický ent-giberelanový skelet Dělení podle počtu atomů uhlíku na gibereliny C 19 a C 20, řazení dle čísel podle posloupnosti objevů. převzato od J. Petráška

75 Gibereliny historie objevu a chemická struktura První objevené a současně nejaktivnější jsou gibereliny G 19 - GA 1, GA 3, GA 4 a GA 7. Aktivita ovlivněna přítomností karboxylových skupin v poloze 7 a 19 a přítomností hydroxylových skupin. převzato od J. Petráška

76 Gibereliny biosyntéza a metabolismus Fáze 1 v plastidech: Až po ent-kauren. Fáze 2 v ER: Od ent-kaurenu až po aldehyd GA 12. Fáze 3 v cytoplazmě: Vzájemné přeměny a inaktivace giberelinů. Jsou pod vývojovou kontrolou (světlo, teplota) Inaktivace nejčastěji hydroxylací v poloze 2. či reverzibilní konjugací s cukry. Taiz, Zeiger, Plant Physiology online převzato od J. Petráška

77

78 Gibereliny fyziologické účinky Stimulace prodlužovacího růstu stonku spojena s okyselením buněčné stěny a aktivitou hydroláz - též podpořeno buněčné dělení v meristémech. Elongace listové pochvy u zakrslých semenáčků rýže po aplikaci GA 3 Elongace stonku u trpasličího semenáčku hrachu po aplikaci GA 3 Kontrola 100 pg GA 3 1 ng GA 3 Kontrola Figs , 17.7.: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000 GA 3 převzato od J. Petráška

79 Gibereliny fyziologické účinky Stimulace prodlužovacího růstu stonku Aplikace inhibitorů cytochrom P450 monooxygenáz sníží množství giberelinů v rostlině a způsobí cílenou zakrslost, praktické využití v zemědělství Poinssetia netransformovaná rostlina transrormace cdna pro giberelin-2-oxidázu (degradace GA 1 ) Kontrola Paclobutrazol inhibitor syntézy GA

80 Gibereliny fyziologické účinky Stimulace kvetení navození kvetení v jinak neinduktivních podmínkách: exogenní dodání giberelinu umožní obejít jarovizaci Gibereliny jsou nezbytné při stimulaci kvetení u mrkve požadující tzv. jarovizaci. Chlad indukuje tvorbu giberelinů. Pro indukci kvetení existují 4 vzájemně propojené dráhy indukované těmito 4 stimuly: Fotoperioda přes FT protein Počet listů a nízká teplota Sacharóza Gibereliny -GA, bez chladu +GA, bez chladu -GA, v chladu Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000 převzato od J. Petráška

81 Gibereliny fyziologické účinky gibereliny regulují přechod z juvenilní do dospělé fáze jehličnany dlouhá juvenilní fáze (20let) 14 týdenní sekvoj aplikace GA4/GA7 aplikace GA4/GA7

82 Gibereliny fyziologické účinky Stimulace klíčení semene gibereliny nahromaděny v embryu vyvíjejícího se semene na počátku klíčení se transportují do aleuronové vrstvy buněk stimulace exprese enzymu α-amylázy hydrolyzující škrob vzniklé cukry poté stimulují prodlužování buněk hypokotylu klíčícího embrya Taiz, Zeiger, Plant Physiology online

83 Kyselina abscisová historie objevu a chemická struktura 60. léta 20. století látka identifikována nezávisle při studiu dormance u javoru jako dormin (navozující dormanci) současně při studiu opadu mladých plodů bavlny jako abscisin (navozující opad) (dnes je úloha při opadu přisuzována etylénu, ne ABA) Kyselina abscisová je seskviterpen, přirozeně se vyskytuje v podobě několika isomerů, aktivní je pouze (S)-ABA. převzato od J. Petráška

84 Kyselina abscisová - biosyntéza a metabolismus Biosyntéza z karotenoidu violaxantinu (C40) Tvorba: v dormantních orgánech (pupeny, semena hlízy) v rychle rostoucích pletivech Transport floémem i xylémem. Obsah stoupá při nedostatku vody, zasolení, chladu či poranění. ABA představuje hormon odpovědi na stres Konjugace ABA s glukózou inaktivace ve vakuole

85 Kyselina abscisová fyziologické účinky Regulace vodního hospodářství snížením transpirace při nedostatku vody. Při nedostatku vody stoupá biosyntéza ABA v kořenech transport xylémem do nadzemníčásti svěracích buňkách průduchů dochází ke zvýšení výtoku iontů K + a uzavření průduchů Kontrola ABA Commelina communis, pokožkové buňky s průduchy Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000 převzato od J. Petráška

86 Kyselina abscisová fyziologické účinky ABA signalizace při odpovědi na vodní stres koncentrace ABA ve xylému se při vodním stresu mění až ze 10nM to 3000nM

87 Kyselina abscisová fyziologické účinky Regulace vodního hospodářství snížením transpirace při nedostatku vody. ABA aktivuje Ca 2+ kanály v plazmatické membráně vzestup Ca 2+ otevře další Ca 2+ kanály na tonoplastu a indukuje aktivitu aniontových kanálů (Cl - ) transportujících anionty do apoplastu výsledná depolarizace membrány podpoří aktivitu kanálů transportujících K + ionty ven z buňky. Zmenšující se obsah iontů v buňce vede ke ztrátě vody a uzavírání průduchu Julian Schroeder et al.

88 Kyselina abscisová fyziologické účinky Regulace embryogeneze a zrání semen Hromadění ABA předchází vlastní dehydrataci semena Indukce proteinů LEA (late embryogenesis abundant) - mají roli v odolnosti proti desikaci - současně ABA stimuluje produkci zásobních proteinů v semeni Indukce dormance semen a pupenů, inhibice klíčení - hromadění ABA v dormantních orgánech V semenech vysoká hladina ABA brání klíčení, které nastane až po snížení její hladiny. Mutantní rostliny s poruchou biosyntézy ABA mají narušenou dormanci a projevují viviparii semen semena klíčí ještě na mateřské rostlině. Zea mays, mutace v prekurzoru ABA Taiz, Zeiger, Plant Physiology online převzato od J. Petráška

89 Kyselina abscisová fyziologické účinky Zvýšení odolnosti proti suchu, zasolení, chladu či poškození ABA působí na expresi hydrofilních, termostabilních proteinů ochraňujících strukturu biomembrán. Stimulace tvorby laterálních kořenů reakce na nedostatek vody. Inhibice prodlužovacího růstu a urychlení stárnutí. převzato od J. Petráška

90 Etylén historie objevu a chemická struktura 1901 Dimitrij Neljubov, popsal aktivní složku svítiplynu: etylén, která indukovala v blízkosti plynových lamp opad listů 30. léta 20. století důkaz tvorby ethylenu rostlinami, v té době již využíván na defoliaci a dozrávání plodů Jediný plynný fytohormon Nejjednodušší uhlovodík H 2 C=CH 2 převzato od J. Petráška

91 Etylén - biosyntéza a metabolismus Biosyntéza z L-methioninu přes S-adenosylmethionin (SAM) a kyselinu 1-aminocyklopropan-1- karboxylovou (ACC) Oxidací ACC vzniká etylén. Biosyntéza ACC je regulována dalšími fytohormony auxiny, cytokininy, brasinosteroidy též stresovým působením Produkce etylénu téměř všemi částmi rostlin, nejvíce v rostoucích částech Největší produkce během zrání, stárnutí a opadu plodů a květů a při stresu.

92 Etylén fyziologické účinky Trojná odezva v reakci na aplikaci etylénu: - inhibice dloužení - stimulace radiálního růstu (reorganizace mikrotubulů potažmo celulóz. mikrofibril) - uzavírání háčku hypokotylu - ztráta gravitropismu semenáčky salátu stimulace tvorby kořenového vlášení kontrola + etylén vzduch etylén Semenáčky hrachu převzato od J. Petráška

93 Etylén fyziologické účinky Stimulace dozrávání plodů aktivace hydrolytických enzymů Rajče nesoucí antisense- ACC-oxidázu wt ihnibice syntézy etylenu Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

94 Etylén fyziologické účinky Stimulace dozrávání plodů aktivace hydrolytických enzymů u některých druhů: jablka, rajčata, hrušky, banány, avokádo, fíky, mango, broskve - zvýšená intenzita tzv. klimakterického dýchání Taiz and Zeiger, 2002 zpětná vazba autokatalyticky stimulovaná syntéza etylénu

95 Etylén fyziologické účinky Stimulace opadu listů u stárnoucích listů s poklesem hladiny auxinu dochází ke zvýšené tvorbě etylénu v opadové zóně bříza WT transformant necitlivý k etyléu...ale supraoptimální dávky auxinu stimulují produkci etylénu Agent Orange defoliant na bázi auxinu použitý ve vietnamské válce

96 Brasinosteroidy historie objevu a chemická struktura 1979 první rostlinný steroidní regulátor brassinolid (BR) izolován z pylu řepky (z 227 kg pylu 4mg brassinolidu) 1982 kastasteron izolován z kaštanu Dnes popsáno více než 40 příbuzných látek Jsou to rostlinné steroidní látky, přítomné ve velmi nízkých koncentracích M převzato od J. Petráška

97 Brasinosteroidy biosyntéza a metabolismus Vychází z izopentenyldifosfátu, První biologicky aktivní je kampesterol Nejsou transportovány na dlouhé vzdálenosti, biosyntéza hlavně v nadzemní části

98 Brasinosteroidy fyziologické účinky Stimulace dlouživého růstu např. odklonění čepele listu rýže (lamina inclination test) dané zvětšováním buněk na adaxiální straně Kontrola před testem Aplikace BR Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000

99 Brasinosteroidy fyziologické účinky Stimulace dlouživého růstu mutanty s postiženou biosyntézou brassinolidu jsou zakrslé zakrslý vzrůst je dán nejen menší velikostí ale i menším počtem buněk listu stimulace buněčného růstu: indukce enzymů rozvolňujících b.s. stimulace příjmu vody akvaporiny wt det2 dim většinou účinkují nedaleko místa syntézy externě dodané transportovány xylémem transpiračním proudem z listů transport ojedinělý stimulace růstu pylové láčky interakce s etylénem podporují jeho produkci zvyšují odolnost proti suchu a nízkým teplotám Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000 převzato od J. Petráška

100 Brasinosteroidy fyziologické účinky kontrola dlouživého růstu záleží na uspořádání mikrotubulů (a celulózových mikrofibril) huseníček: wild type mikrotubuly zeleně -BR +BR exogenně BR deficientní mutant

101 Polyaminy Studovány u eukaryotních organismů již přes 50 let, v rostlinách nejčastěji putrescin, spermin a spermidin. Biosyntéza 1.aminokyselin argininu a ornitinu 2.S-adenozylmethioninu (SAM) jeho dekarboxylací SAM dekarboxylázou. Nejvíce se vyskytují v meristémech. Stimulace klíčení, růstu kalusu, somatické embryogeneze atd. Díky polykationtovému charakteru se váží na DNA, ovlivňují její konformaci a regulují genovou expresi Kusano et al. 2008, Planta

102 Polyaminy v rostlinách se nacházejí ve vyšších koncentracích než základní fytohormony je třeba i vyšších koncentrací (mmol) pro vyvolání odezvy Zablokování exprese SAM dekarboxylázy (narušení biosyntézy) pleiotropní účinky u rostlin bramboru: malý vzrůst, malé listy, předčasná senescence. wt Antisense SAM Fig : Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000 převzato od J. Petráška

103 Kyselina jasmonová (jasmínová) Poprvé u rostlin izolována z esenciálních olejů Jasminum grandiflorum Biosyntéza z kyseliny linolenové hladina Ja stoupá při stresových reakcích po poranění či napadení patogenem Stimulace genů pro inhibitory proteáz produkovaných patogeny. Kyselina jasmonová (Ja) Methylester Ja (MeJa) převzato od J. Petráška

104 Kyselina salicylová Kyselina salicylová (SA) byla jako aktivní látka izolována již v 19 století z vrbové kůry, její hlavní využití je v medicíně jako analgetikum (aspirin). U rostlin je účinek SA především spojen s ochranou před patogeny, SA indukuje tvorbu proteinů (pathogenesis-related) zvyšujících rezistenci k virovému, houbovému či bakteriálnímu napadení SA se účastní na hypersensitivní reakci (nekrozy napadených listů) a systemické rezistenci vůči patogenům indukce termogenního procesu v květech Sauromatum guttatum

105 Fenolické látky Velmi široká skupina sekundárních metabolitů růstově regulační funkci mají jen některé. Účastní se např. při inhibici dlouživého růstu (kyselina skořicová) či při zprostředkování infekce půdními bakteriemi (Agrobacterium tumefaciens) u dvouděložných (syringon, acetosyringon). převzato od J. Petráška

106 Peptidové hormony Příkladem peptidového hormonu (faktoru) je systemin (18 AMK) role při odpovědi na poranění patogenem transportován floémem do míst, kde ještě poranění není spouští syntézu JA, která vyvolá tvorbu ochranných inhibitorů proteáz převzato od J. Petráška

107 Strigolaktony Strigolaktony terpenoidní látky odvozené od karoteonidů Stimulují klíčení parazitických rostlin (Striga tropická fotosyntetizující, zárazy - nezelené) Stimulují prorůstání mykorhizních hub signál pro jejich větvení Hrách setý Orobanche vulgaris Striga Inhibují větvení stonku rostlin Transportovány z kořenů do nadzemních částí Umehara et al., Gomez-Roldan et al., Nature 455, 2008 wt Biosyntetický mutant převzato od J. Petráška

108 Interakce hormonálních signálů - příklady Auxiny-cytokininy Stimulace buněčného dělení v explantátových kulturách Poměr hladin auxinu (A) a cytokininu (CK) určující pro organogenezi: -převaha A kořeny -vyrovnaný poměr kalus, -převaha CK diferenciace prýtu

109 Interakce hormonálních signálů -příklady Auxiny-cytokininy vývoj laterálních orgánů (postranních kořenů, listů, květů) je pod stálou kontrolou více hormonálních faktorů - zřejmě se účastní i strigolaktony - jsou transportovány vzhůru a jejich účinek je nadřazen auxinovému a cytokininovému účinku Leyser, Plant Cell Environment, 2009 převzato od J. Petráška

110 Interakce hormonálních signálů - příklady ABA-Gibereliny alfa amyláza blokována ABA, - stimulována GA Dodání ABA působí inhibičně na celý proces indukce klíčení giberelinem: na transkripci a syntézu α-amylázy na její sekreci z aleuronových buněk do endospermu Působení GA je v přímém protikladu stimuluje α-amylázy a následné rozvolnění endospermu pomocí hydroláz převzato od J. Petráška

111 Děkuju za pozornost Taiz, Zeiger, Plant Physiology online