Na rozdíl od genomiky se funkční genomika zaměřuje na dynamické procesy, jako je transkripce, translace, interakce protein - protein.

Transkript

1 FUNKČNÍ GENOMIKA

2 Co to je: Oblast molekulární biologie která se snaží o zpřístupnění a využití ohromného množství dat z genomových projektů. Snaží se popsat geny, a proteiny, jejich funkce a interakce.

3 Na rozdíl od genomiky se funkční genomika zaměřuje na dynamické procesy, jako je transkripce, translace, interakce protein - protein.

4 Funkční genomika hledá odpověď na otázky o funkci DNA na úrovni genů, transkriptů RNA, proteinových produktů. Základní vlastností funkční genomiky je genomový nebo dokonce celogenomový přístup k uvedeným problémům. Používají se vysokokapacitní metody spíše než klasické analýzy jednoho nebo několika genů.

5 Funkční genomika nalézá geny důležité pro funkci specializovaných fyziologických systémů a pak umožňuje ověření jejich využití např. pro vývoj nových farmak. Hlavním cílem je charakterizovat komplexní funkce genů v lidském genomu včetně jejich interakcí.

6 Studuje se genová exprese za různých podmínek. Užívá se často microarray technologie (používání čipů pro testování většího množství biologického materiálu při screeningových vyšetřeních) a bioinformatiky (zpracování přes počítačové systémy).

7 Cíl Porozumět vztahům mezi genomem organismu a jeho fenotypem. Termín se často užívá v širokém pojetí pro metody a techniky porozumění komplexu genů organismu a genových produktů. Funkční genomika zahrnuje studium přirozené variability genů, RNA a proteinů v času, např. během vývoje organismu a v prostoru, např. v jednotlivých částech těla.

8 Cíl Zabývá se ale také přirozenými nebo experimentálně vyvolanými poruchami genů, chromosomů, RNA, proteinů. Potenciálem funkční genomiky je syntéza genomických a proteomických znalostí, porozumění dynamickým vlastnostem organismu na buněčné a organismální úrovni. Jak vznikají biologické funkce z informace, kódované v genomu? Jak mutace vede k určitému fenotypu? To má význam pro diagnostiku dědičných chorob a jejich terapii.

9 Metody funkční genomiky Úroveň DNA 1. MAPOVÁNÍ GENOVÝCH INTERAKCÍ Delece genů, nebo inhibice genové exprese může být použita k identifikaci genů s příbuznou funkcí, a to i když neinteragují fyzicky. Epistáze odkazuje na fakt, že účinek knock outu dvou různých genů nemusí být aditivní. Fenotyp vzniklý v důsledku inhibice dvou genů může být jiný, než součet efektů dvou jednoduchých knock outů.

10 i neznámou funkcí, zahrnujících ca 1% genomu. Metody funkční genomiky 2. ENCODE Encyclopedia of DNA elements Koordinovaný US National Human Genome Research Institute (NHGRI) Hluboká analýza lidského genomu. Cílem je identifikovat všechny funkční elementy genomové DNA v kódujících i nekódujících oblastech. V souč. (únor 2013) je dokončena pouze pilotní fáze. Provedeno bylo několik set analýz ve 44 oblastech se známou

11 Metody funkční genomiky ENCODE Do r provedeno více než genomových analýz. Data ukazují, které oblasti jsou transkribovány do RNA, které pravděpodobně řídí geny využívané v určitém typu buněk a které oblasti jsou asociovány se škálou proteinů. Nejvýznamnější zjištění je, že část lidské DNA, která je biologicky aktivní, je podstatně větší, než byly ty nejodvážnější odhady. Biochemickou funkci má více než 80% genomu. Většina z toho je zapojena v řízení úrovně exprese kódující DNA, která sama však tvoří méně než 1% genomu.

12 Metody funkční genomiky modencode Model Organism ENCyclopedia Of DNA Elements je pokračování ENCODE, identifikace funkčních elementů v genomech vybraných modelových organismů. Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans. Modelové organismy umožňují biologické ověření počítačových a experimentálních dat z ENCODE projektu, u lidí by to bylo obtížné nebo nemožné.

13 Metody funkční genomiky Úroveň RNA Transcriptome profiling Microarrays Microarrays měří množství mrna ve vzorku, které koresponduje s příslušnou DNA sekvencí. Sonda je připevněna na pevný povrch a hybridizuje s fluorescenčně značenou analyzovanou cílovou mrna. Intensita fluorescence na určitém místě čipu je úměrná množství cílové sekvence, která se v místě hybridizovala, tj. množství mrna sekvence ve vzorku. Microarrays umožňují identifikaci kandidátních genů zapojených v určitém procesu. Identifikace je založena na rozdílné úrovni transkripce za různých podmínek a na sdílených modelech exprese mezi geny se známou funkcí.

14

15

16

17

18 Metody funkční genomiky Úroveň RNA SAGE Serial Analysis of Gene Expression Alternativní metoda analýzy exprese, založená na sekvenování RNA. Izolace mrna (např. z nádoru). Přepis mrna do cdna. Extrakce krátkého úseku sekvence (10-17 bp) z definované pozice každé molekuly cdna. Spojení těchto úseků do dlouhého řetězce. Klonování do vektoru, množení v bakteriální kultuře. Sekvenování řetězců. Počítačové zpracování dat.

19 Metody funkční genomiky SAGE Serial Analysis of Gene Expression Výstupem je seznam krátkých sekvencí a jejich počet ve vzorku. Srovnáním s databází sekvencí je možné určit, z jaké původní mrna a tedy z jakého genu pochází. Statistické metody umožňují označit a spočítat seznamy z různých vzorků a zjistit, které geny jsou více exprimovány. Např. normální tkáň může být porovnána se stejnou nádorovou, zjistí, se, které geny jsou více nebo naopak méně aktivní.

20 SAGE byla připravena pro výzkum nádorů, nyní se používá rovněž k analýze transkriptomu dalších chorob u řady druhů.

21 Metody funkční genomiky Úroveň interakce proteinů Analýza dvou hybridů, kvasinkový systém dvou hybridů Two-hybrid screening, yeast two-hybrid system Y2H Většina eukaryontních transkripčních faktorů, resp. jejich aktivační a vazebné domény fungují modulárně, tzn. i ve vzájemné blízkosti bez přímé vazby.

22 Schéma metody dvou hybridů, zjištění interakce mezi 2 proteiny nazvanými Bait a Prey. A. Gal4, gen pro transkripční faktor, produkuje dvoudoménový protein BD a AD nezbytný pro transkripci reporterového genu (LacZ). B,C. Připravíme dva fúzované proteiny, Gal4BD+Bait,Gal4AD+Prey. Ani jeden není schopný spustit transkripci sám. D. Jsou-li produkovány oba fúzované proteiny a zároveň část Bait prvního se spojí s částí Prey druhého, je spuštěna transkripce.

23 Nejobvyklejší je dvouhybridová kvasinková metoda Y2H. Použije se geneticky upravený kmen kvasinek, neschopný syntézy urč. látek (aminokyselin, NK,). Kultivaci na médiu bez této látky kvasinky nepřežijí. Kmen kvasinek může přijmout cizí plazmidovou DNA. U metody Y2H jsou do mutantního kvasinkového kmene simultánně zaváděny dva bait and prey plasmidy.

24 Plazmid jsou upraven tak, že produkuje proteinový produkt, v němž fragment DNA-binding doména (BD) je spojen s proteinem, druhý plazmid je upraven tak, že produkuje protein v němž fragment aktivační doména (AD) je fúzován s jiným proteinem. Protein fúzovaný s BD označíme bait, typicky jde o protein známý, používaný k identifikaci nového partnera. Protein fúzovaný s AD označíme prey, může to být jeden známý protein, nebo knihovna známých nebo neznámých proteinů. Knihovna může obsahovat soubor protein kódujících sekvencí reprezentujících všechny proteiny exprimované v organismu nebo tkáni, nebo může být syntetizována náhodnými sekvencemi DNA. Bez ohledu na původ, sekvence se následně inkorporují do protein- kódujících sekvencí plazmidu, jenž je vnesen do buněk zvolených pro metodu. Pokud se používá knihovna, musí být každá buňka infikována jedním plazmidem a tedy každá buňka exprimuje jeden protein z proteinové knihovny.

25 Když proteiny bait a prey interagují, tj. naváží se, AD a BD transkripčního faktoru jsou nepřímo spojeny, AD je zavedena do blízkosti startu transkripce. Proběhne transkripce reporterového genu/ů. Pokud proteiny neinteragují, transkripce neproběhne. Interakce mezi proteiny je spojena se změnou fenotypu buňky.

26 Aplikace Y2H Determinace sekvencí důležitých pro interakce. Odhalování a studium léků, jedů. Určení funkce proteinů. Výběr zinc finger proteins.

27 Metody funkční genomiky Techniky loss-of-function Mutageneze Genová funkce může být analyzována systematickým knocking out genů jednoho za druhým. To lze provést delecí nebo poškozením funkce (např. inserční mutací), poté je studován fenotyp těchto organismů. RNAi Umlčení exprese genů pomocí interakce s sirna.

28 Odbočka: mechanismus RNA interference Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) RNAi objevena u Coenorhabditis elegans Umlčování indukováno jak sense tak antisense RNA dsrna indukovala umlčování cca x účinněji dsrna indukce je závislá na vlastních genech - gen. vyhledávání

29 Odbočka: mechanismus RNA interference je to přirozený mechanismus regulace genové exprese u všech eukaryot podstatou je tvorba dsrna, která může být spuštěna několika způsoby: přítomnost cizí aberantní DNA specifické transgeny obsahující obrácené repetice částí cdna transkripce vlastních genů pro shrna (short hairpin RNA) nebo mirna (micro RNA, endogenní vlásenková RNA)

30 Na dsrna působí enzymový komplex (DICER), tvorba sirna (short interference RNA), ta se váže na enzymový komplex RITS (RNA-induced transcriptional silencing complex) nebo RISC (RNAinduced silencing komplex). RISC vede k degradaci mrna (v případě úplné similarity sirna a cílové mrna) nebo pouze k zastavení translace (v případě neúplné homologie jako např. v případě mirna).

31 Odbočka: mechanismus RNA interference

32 Mechanizmus posttranskripčního umlčování genů pomocí RNA interference (irna) antisense sense dsrna uida

33 Metody funkční genomiky Funkční anotace genů Anotace genomu Předpokládané geny mohou být identifikovány prohledáváním genomu s cílem nalézt oblasti, které pravděpodobně kódují proteiny: open reading frames (otevřené čtecí rámce) transkripční iniciační sekvence polyadenylační místa Sekvence, které byly identifikovány jako možné geny musí být potvrzeny dalšími důkazy, jako je např. podobnost k cdna nebo EST sekvencím téhož organismu, podobnost předpověděného proteinu se známým proteinem, asociace se sekvencí promotoru, nebo důkazem, že zmutovaná sekvence má za následek určitý fenotyp.

34 Metody funkční genomiky Funkční anotace genů Metoda Rosetta stone Výpočetní metoda předpovědi funkce proteinu. Je založena na hypotéze, že některé proteiny, účastné v určitém fyziologickém procesu, mohou existovat jako dva různé geny v jednom organismu a jako jeden gen v jiném organismu. Genomy jsou prohlíženy s cílem najít sekvence, které jsou nezávislé v jednom organismu, v jiném jsou v jednoduchém otevřeném čtecím rámci. Když dva geny fúzují, předpokládá se, že mají podobné biologické funkce a že taková společná regulace je výhodná.

35 Nové trendy Chemická genetika více než záznamů v databázi PubMed podobně jako v případě genetiky klasické existují i zde přístupy přímé a reverzní předmětem zájmu není gen ale protein chemická genetika se snaží identifikovat buď cílový protein po chemickém působení a následných fenotypových změnách ( přímá chemická genetika) nebo chemikálie schopné interakce s proteinem ( reverzní chemická genetika) vyhledávání v knihovnách nejrůznějších chemických látek (tisíce položek, komerčně přístupné) např. analýza endomembránového transportu u rostlin

36 Gene trapping genové pasti Vytvoření fenotypu vnesením inzerčních mutací do genomu. Inzerce tvořené vektorem, který obsahuje: - gen reporter a/nebo selektovatelný marker bez vlastního promotoru - sestřihové místo - terminátor transkripce (poly A). Pokud se vektor vmezeří do genu, dojde k jeho expresi a vzniku abnormálního fúzního transkriptu tvořeného zkrácenou genovou sekvencí a selektovatelným markerem. Genové pasti současně - inaktivují geny - poskytují informaci o genové expresi - značkují inaktivované geny, takže mohou být snadno identifikovány

37 Gene trapping genové pasti Shematic representation of the mouse gene trap strategy.

38 Genetické mapování a poziční klonování identifikace genů odpovědných za určitý fenotyp na základě jejich pozice v genomu 1. Vazebná analýza - laboratorní křížení, rodokmenová analýza, asociační (haplotypové) mapování - zjištění počtu genů, jejich polohy v genomu a vzájemných interakcí 2. Fyzikální mapování - sestavení a anotace nukleotidové sekvence kritické genomové oblasti 3. Ověřování kandidátních genů - hledání polymorfismů, transgeneze, genové knockouty

39 Vazebná analýza pomocí laboratorního křížení Zkřížením dvou linií lišících se v námi studovaném znaku, vytvoříme segregující populaci (např. BC1 či F2) pomocí které lze určit se kterými genetickými markery námi studovaný znak segreguje. Co k tomu potřebujeme: - (inbrední) linie lišící se fenotypem - genetické markery polymorfní mezi zkoumanými liniemi, ale monomorfní v rámci linie (mikrosatelity, SNP) - známá genetická mapa

40 Zpětné křížení (backcross)

41 F2 křížení (F2 Intercross)

42 Vazebná analýza pomocí BC1 či F2 křížení

43 Databáze QTL