LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Transkript

1 LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ STANOVENÍ ASKORBOVÉ KYSELINY metdu vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie s UV detekcí a ptencimetricku titrací Garant úlhy: dc. Dr. Ing. Věra Schulzvá Návdy budu průběžně aktualizvány

2 OBSAH Základní pžadvané znalsti pr vstupní test... 3 Další dpručené tázky... 3 Náplň úlhy... 4 Časvý snímek cvičení... 5 Pracvní pstup pr stanvení askrbvé kyseliny v nápjích, vci a zelenině Pužitelnst metdy Princip metdy Pužívané přístrje a zařízení Chemikálie, rztky a standardy Pracvní pstup... 7 Vybavení pracvníh stlu... 9 Klasifikace... 10

3 Základní pžadvané znalsti pr vstupní test 1. Principy kapalinvé chrmatgrafie (stacinární fáze typy kln, mbilní fáze, detektry, princip spektrftmetrie, Lambert-Beerův zákn) 2. Přepčet hmtnsti na látkvé mnžství, hmtnstníh zlmku na hmtnstní kncentraci, hmtnstní kncentrace na mlární (látkvu) a napak, příprava rztků 3. Vyhdncení metdu kalibrační křivky, metdu příméh srvnání se standardem 4. Základní struktura a vlastnsti askrbvé kyseliny, její stabilita, dpručená denní dávka a běžný výskyt v ptravinách 5. Základní principy ptencimetrické titrace, základní pjmy (dměrný rztk, titrace, titrační křivka, bd ekvivalence, výpčty v dměrné analýze) 6. Pravidla bezpečnsti práce a prtipžární chrany (Pžadvané znalsti jsu v rzsahu přednášek z Chemie ptravin a Analytické chemie a navazují na cvičení a přednášky z Analýzy ptravin) Další dpručené tázky Jaká je stabilita askrbvé kyseliny při půsbení tepla, světla, vzdušnéh kyslíku? Jaký je běžný bsah askrbvé kyseliny v ptravinách? Klik g standardu askrbvé kyseliny je ptřeba pr přípravu 100 ml zásbníh rztku kncentraci 1 mg/ ml? Jaký bjem (ml) deberete z tht zásbníh rztku pr přípravu 10 ml standardních rztků kncentraci 30, 60, 90 a 120 mg/l? Deklarvaný bsah vitaminu C ve vzrku jablečnéh džusu je 10 mg/100 ml. Pžadvaná kncentrace (s hledem na rzsah kalibrační křivky) vitaminu C v naředěném vzrku je 50 mg/l. Jak připravíte 10 ml tht rztku? Deklarvaný bsah vitaminu C ve vzrku tablety je cca 100 mg v jedné tabletě. Jaký bude bsah (mg/l) vitaminu C v rztku získaném rzpuštěním tét tablety ve100 ml extrakčníh činidla? Jaký bjem (ml) tht rztku ptřebuje pr naředění 10 ml rztku kncentraci 50 mg/l? 30 g hmgenizvaných brambr byl extrahván 80 ml 3% rztku kyseliny metafsfrečné. Získaný extrakt byl přefiltrván přes filtrační papír, filtrát byl kvantitativně převeden d 100 ml dměrné baňky a dplněn p značku extrakčním činidlem. 1 ml extraktu byl přefiltrván přes membránvý filtr a 20 µl extraktu byl nastříknut d kapalinvéh chrmatgrafu. Plcha dpvídající píku askrbvé kyseliny byla A=92. Jaká je výsledná kncentrace askrbvé kyseliny v brambrách v mg/kg, je-li rvnice kalibrační křivky y=1,7333x-4,5? Výpčty v dměrné analýze, ptencimetrická titrace, příprava dměrných rztků

4 Náplň úlhy Stanvení askrbvé kyseliny v nápjích, vci a zelenině metdu HPLC/DAD (Dide Array Detectin), akreditvaná zkušební metda SZPI Praha (A/11), ČSN EN (adaptván pr ptřeby výuky) Sledvání stability askrbvé kyseliny v průběhu přípravy a hmgenizace vzrku, skladvání a tepelnéh zpracvání vce a zeleniny Stanvení askrbvé kyseliny ptencimetricku titrací Prvnání výsledků získaných metdu kapalinvé chrmatgrafie a ptencimetricku titrací Upřesnění ke stanvení bsahu askrbvé kyseliny v nápjích a vzrcích vce, zeleniny sledvání vlivu zpracvání a tepelných úprav Část studentů bude prvádět analýzy v čerstvém vzrku splečně s přípravu standardů, část studentů bude sledvat vliv zpracvání - tepelné úpravy (vaření, mražení), skladvání, různý způsb hmgenizace vzrků na hladiny askrbvé kyseliny Prvnání s nutričními tabulkami, vyhdncení vlivu tepelných úprav, degradace v závislsti na čase neb tepltě Pužité matrice Ovcné džusy, čaje a bnbóny bhacených vitaminem C, šípky, citrnvá šťáva (čerstvý vzrek, vzrek p zalití hrku vdu ), čerstvá a tepelně upravená zelenina (brambry, brklice, kapusta, pór, petržel, paprika, rajčata ) a vce. Ovce a zelenina zpracvané pmcí smthie mixéru.

5 Časvý snímek cvičení Operace Přibližná časvá nárčnst (min) HPLC/DAD, ptencimetrická titrace Úvdní výklad a zkušení, test 20 min Navážení standardů, příprava vzrku, Příprava pracvních rztků 30 min Extrakce a filtrace vzrku 30 min Výklad k HPLC a titraci 20 min Měření vzrků 120 min Úklid 20 min Celkem 240 min (4 h) Studenti prvádějí alternativně stanvení pdle pracvníh pstupu Každý student zpracvává vlastní vzrek, v případě sledvání stability zpracvávají studenti stejný vzrek: (i) v čerstvém stavu, (ii) p tepelných a jiných úpravách, (iii) p hmgenizaci pmcí smthie mixeru. Student prvná výsledky stanvení askrbvé kyseliny získané metdu HPLC/UV a ptencimetricku titrací (pkud byla prvedena) a diskutuje případné rzdíly ve zjištěných hladinách. Vlastní nález kyseliny askrbvé student prvná s deklarvaným bsahem na balu vzrku (pkud je uveden), případně s běžnými bsahy uvedenými v dstupné literatuře.

6 Pracvní pstup pr stanvení askrbvé kyseliny v nápjích, vci a zelenině (pdle akreditvané zkušební metdy SZPI Praha (A/11) a ČSN EN 14130; adaptván pr ptřeby výuky) 1. Pužitelnst metdy Metda služí ke stanvení askrbvé kyseliny v nápjích, v vci a zelenině, v rstlinných výrbcích a ve vitaminvých přípravcích. 2. Princip metdy Askrbvá kyselina se z hmgenizvanéh materiálu extrahuje rztkem kyseliny metafsfrečné. P filtraci extraktu se její bsah stanví metdu vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie s DAD detekcí. Identifikace a kvantifikace se prvádí metdu vnějšíh standardu, techniku kalibrační křivky. 3. Pužívané přístrje a zařízení Kapalinvý chrmatgraf-hewlett Packard Series HP1100 (DAD detektr, λ=254 nm) Analytická klna s RP C18 (250 4,6 mm, 5 µm; mm, 5 µm) HP Chemstatin, Hewlett Packard, USA Analytické váhy Ultrazvukvá lázeň Labratrní mixer neb kuchyňský tyčvý mixervařič, nerezvý hrnec, rychlvarná knvice Mixér na smthie Pdtlakvé filtrační zařízení (vakuvá pumpa MevacsM20 Chrmservis (ČR), Büchnerva nálevka, filtrační baňka) Ptencimetrický titrátr EasyPr Plus, Mettler Tled 4. Chemikálie, rztky a standardy - methanl (pr HPLC) - demineralizvaná a destilvaná vda - kyselina metafsfrečná - pkud není uveden jinak pužívají se chemikálie čistty p.a. - membránvý filtr przitě 5 µm - běžné labratrní skl kyselina L-askrbvá p.a. (PENTA) Příprava standardních rztků:

7 Připravte zásbní rztk kyseliny L-askrbvé kncentraci cca 1 mg/ml v extrakčním činidle (příprava extrakčníh činidla viz bd 5.1). Pr zhtvení kalibrační křivky připravte standardní rztky kncentraci 10, 30, 60, 90 a 120 mg/l v extrakčním činidle (příprava extrakčníh činidla viz bd 5.1). Pznámka: Maximální dba pužitelnsti standardů je 1 den. 5. Pracvní pstup - mdifikace nrmy SZPI Praha Příprava labratrníh vzrku Příprava extrakčníh činidla: 3 % rztk kyseliny metafsfrečné (tj. rztk 9 ml kapalné kyseliny metafsfrečné v 491 ml vdy, ppř. rzpustit 15 g pevné kyseliny metafsfrečné v 500 ml vdy) Pevné vzrky g pevnéh vzrku (v závislsti na typu vzrku, určí vyučující) se hmgenizuje s ml extrakčníh činidla p dbu 1 minuty. Získaný extrakt se přefiltruje přes filtrační papír, který se něklikrát prpláchne; případně je mžné využít filtrace za pmci vakua. Filtrát se kvantitativně převede d 100 ml dměrné baňky a dplní p značku extrakčním činidlem. Všechny rztky vzrků se před nástřikem d kapalinvéh chrmatgrafu filtrují přes skládaný filtr, ppř. membránvý filtr Kapalné vzrky Tekuté materiály se p dknalém prmíchání (mnžství se vlí pdle předpkládanéh bsahu, tak aby kncentrace v analyzvaném rztku dpvídala rzsahu kalibrace mg/l) převedu d 100 ml dměrné baňky a dplní vdu p značku. Před nástřikem d kapalinvéh chrmatgrafu je nutné extrakt přefiltrvat přes membránvý filtr Tableta Tabletu je nutn zvážit a rzdrtit, na základě výpčtu student naváží příslušné mnžství tablety dle deklarvanéh bsahu vitaminu C d pžadvanéh bjemu (25, 50 neb 100 ml bude specifikván asistentem), tak aby výsledná kncentrace vitaminu C byla v rzsahu kalibrační křivky. Pznámka: V případě nutnsti (dezva je mim rzsah kalibrace) je mžné vzrek dále ředit extrakčním činidlem (kyselinu metafsfrečnu). Sledvání stability vitaminu C v průběhu přípravy vzrku, skladvání a tepelnéh zpracvání Pevné vzrky Vzrky vce a zeleniny jsu zahřívány ve vdě a v páře v nerezvém hrnci pdmínky dle určení asistenta Kapalné vzrky, čaje s bsahem vitaminu C vzrek je zalit hrku vdu, případně skladván za definvaných pdmínek - pdmínky dle určení asistenta Ovcné a zeleninvé smthie vzrek je připraven pdle pkynů asistenta

8 5.2. Stanvení kapalinvu chrmatgrafií Analytická klna: analytická klna s RP C18 (250 4,6 mm, 5 µm neb 125 4,6 m, 5 µm;) s předklnku Mbilní fáze: methanl : vda (5:95, v/v) ph3 (H3PO4) (připravená mbilní fáze se dplyní v ultrazvukvé lázni p dbu 10 minut) Průtk mbilní fáze: 0,6-1 ml/min (dle pkynů asistenta) Detekce: DAD, 254 nm Objem nástřiku: 20 µl Teplta klny: labratrní teplta (případně teplta dle pkynů asistenta) Identifikace a kvantitativní vyhdncení Identifikace se prvádí prvnáním retenčníh času analytu ve vzrku s retenčním časem kalibračníh standardu. Další mžnstí identifikace látky je přídavek standardu ke vzrku. Kvantitativní vyhdncení se prvádí metdu vnějšíh standardu buď dečtením kncentrace analytu z kalibrační křivky (tj. závislsti plchy, příp. výšky píku na kncentraci standardu v g/l v rzsahu jednh řádu; kncentrace analytu ve vzrku musí ležet v intervalu mezi nejnižším a nejvyšším bdem kalibrační přímky) a přepčtem na půvdní vzrek neb prvnáním plchy, případně výšky píku sledvanéh analytu a standardu pdbné kncentrace a přepčtem na půvdní vzrek Stanvení ptencimetricku titrací Student bude pstupvat dle pkynů asistenta

9 Vybavení pracvníh stlu kmpletní dkumentace k úlze 2 kpie Labratrní skl: - filtrační nálevka (3 ), nálevka (1x) - váženka (1 ) - dměrná baňka 10 ml (10 ), 25 ml (1 ), 50 ml (4 ), 100 ml (7 ), 200 ml (2x), 250 ml (2 ), 500 ml (1 ), - skleněné zátky - pipeta 1 ml (1 ), 2 ml (1 ), 5 ml (1 ), 10 ml (1 ) - Pasteurvy pipety, dudlík (1 ) - dměrný válec 50 ml (1 ), 100 ml (1 ) - kádinka 150 ml (2 ), 250 ml (1 ), 50 ml (2 ), 600 ml (1x) - dsávací baňka (2 ) - Erlenmeyerva baňka 250 ml (3 ), 500 ml (2x), 1000 ml (1 ) - Bűchnerův nástavec (1 ) - tmavá zásbní láhev - vývěva Labratrní ptřeby: - stříkačka 500 µl (Hamiltn) (1 ) - lžička (2 ) - pipetvací balónek - filtrační papíry - membránvé filtry 5 µm - střička (2 ) - struhadl - mixér - prkénk na krájení - nůž Chemikálie: - kyselina L-askrbvá - kyselina metafsfrečná - methanl - kyselina fsfrečná (v labratři ve skříni s anrganickými kyselinami)

10 Klasifikace D klasifikace bude zahrnut: Příprava na úlhu, kntrla pžadvaných znalstí Výsledky kntrlníh testu / zkušení Správnst základních výpčtů v prtklu a ddržení frmálních pžadavků na prtkl Celkvá práce v labratři a přístup studenta Úklid v labratři a ddržvání rganizačních pravidel Včasné devzdání a správnst prtklu