M. Kropáček, M. Tomeš, K. Kontrová, J. Zimová, F. Melichar. RadioMedic s.r.o.

Transkript

1 1 M. Krpáček, M. Tmeš, K. Kntrvá, J. Zimvá, F. Melichar RadiMedic s.r.. RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč

2 Úvd Stručný ppis prjektu Mnklnální prtilátka Nimtuzumab Hlavní krky výrby 177 Lu-Nimtuzumab Příprava knjugátu Značení knjugátu s 177 Lu Kntrla kvality Shrnutí a závěr RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 2

3 Experimentální činnst v rámci grantvé pdpry TAČR - prjekt TA Příjemce: RadiMedic s.r.. Další uchazeč: PřFUK Univerzita Karlva v Praze Řešené kruhy v rámci prjektu Vývj 177 Lu -Nimtuzumab (hr-3) Vývj metd přípravy derivátů bmbesinů Diagnstika 68 Ga, 64 Cu, Terapie 177 Lu, 67 Cu Vývj přípravků značených F-18 Deriváty [ 18 F]flumazenilu diagnstika lžisek epilepsie 16-a-[ 18 F]flurestradil diagnstika karcinmu prsu Splupráce ÚJV Řež, a.s. Labratř bilgickéh testvání (Bradfrd Assay, ELISA, preklinické testy na zvířatech) Centrální analytická labratř (ICP-MS) RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 3

4 Nimtuzumab (hr-3) Humanizvaná mnklnální prtilátka typu IgG1 s afinifu k receptrům EGF EGF epidermální růstvý faktr extracelulární prtein bsahující 53 aminkyselin, řadí se mezi mitgeny (látky stimulující buněčné dělení) Váže se k receptrům (EGFR) na pvrchu buňky, tyt receptry fungují jak tyrsin-kinázy, jež spuští kaskádu bichemických prcesů veducích k prliferaci buněk. EGFR patří d skupiny receptrů ErbB (tyrsin-kináz) ErbB-1 epidermal grwth factr receptr (EGFR) ErbB-2 (HER 2) ErbB-3 (HER 3) ErbB-4 (HER 4) RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 4

5 Vyvinut: Center f Mlecular Immunlgy (CMI), Havana, Kuba Kmercializace: Indie: Bicn, h-r3, BIOMAb EGFR Kanada CIMYM Bisciences, TheraCIM Evrpa Oncscience, Theralc, CIMAher Pužití - terapie Glimy, skvamózní buněčný karcinm v blasti hlavy a krku Účinek Nimtuzumabu - blkuje EGFR a tím inhibuje nekntrlvané dělení buněk RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 5

6 Výrbní krky Přípravné práce Sterilizace rztků a materiálů Zakncentrvání Nimtuzumabu Knjugace Purifikace Kntrla kvality knjugátu Značení knjugátu s 177 Lu Kntrla kvality knečnéh přípravku RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 6

7 Sterilizace rztků filtrací přes 0,22 mm filtr Vda (trace select) Fsfátvý pufr - knjugace Acetátvý pufr - značení s 177 Lu Sterilizace materiálů Sterilizace 80% rztkem ethanlu Vivaspin 6 Sterilizace v autklávu Eppendrf, skleněné lahvičky, špičky RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 7

8 Zakncentrvání hr-3 5 mg/ml v PBS mg/ml Vivaspin 6 Cut-ff Da Centrifugace při 4000 t/min Dba centrifugace 20 min Vrtex 5 minut Všechny perace prbíhají v labratři třídy čistty C, kritické perace v laminárním bxu A RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 8

9 Mnklnální prtilátka Ligand Nimtuzumab (Oncscience) p zakncentrvání v 0,1 M fsfátvém pufru ph=8,5 p-scn-bn-dota (Macrcyclics) rzpuštěn v DMSO (60mg/ml) Knjugace 2 hdiny při LT ve skleněné lahvičce, reakční bjem 1 ml Vrtex Kntrla ph reakční směsi p 60 minutách případně úprava ph Knec reakce přidáním 50ml TRIS (1,5M ph=8,88) RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 9

10 Purifikace pmcí Vivaspin 6 Obvykle 6 purifikačních cyklů Centrifugace (20 minut) Odběr filtrátu pr měření UV/VIS Dplnění na 6 ml Vrtex 5 min (mezení srpce knjugátu) Měření absrbance filtrátu při 280 nm 0,05M Acetátvý pufr ph=7 Kntrla průběhu purifikace detekce nezreagvanéh ligandu Fsfátvý pufr ph=8,5 RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 10

11 Absrbance filtrátu při 280 nm 2,5 2 1,5 1 0, Pčet purifikačních cyklů 5 6 1:10 1:20 1:1000 1:500 1:200 1:100 1:50 RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 11

12 hr3-knjugat nriu *1000 0,0 Sig A -20,0-40,0 0,00 5,00 10,00 15,00 min mau UV_A ,00 5,00 10,00 15,00 min 30 CPS ChB ,00 5,00 10,00 15,00 min Knjugát Nimtuzumab před purifikací Knjugát Nimtuzumab p purifikaci Vivaspin 6 RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 12

13 Stanvení kncentrace - zkuška pdle Bradfrdvé Tvrba kmplexu mezi knjugátem a činidlem (Brilliant Blue G) Činidl váže bazické a armatické aminkyselinvé zbytky v prteinech Absrbance při 595 nm úměrná kncentraci knjugátu. Lineární rzsah zkušky µg/ml. RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 14

14 hr3-knjugat Metda HPLC Separace Klna: TSK-GEL SW 3000 (7,5x300 nm, 10mm) Mbilní fáze 0,1M PBS + EDTA 1 ml/min Nástřik 20ml Detekce UV detektr 280 nm nriu *1000 Sig A 0,0-20,0-40,0 0,00 5,00 10,00 15,00 min mau UV_A ,00 5,00 10,00 15,00 min 30 CPS ChB ,00 5,00 10,00 15,00 min RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 15

15 Sdium Ddecylsulfate Plyacrylamide gel Electrphresis Prteiny (1 µg/jamku) byly denaturvány při 100 C během 5 min v přítmnsti ddecyl sulfátu sdnéh (SDS). Elektrfréza - pdmínky β-merkaptethanl (redukce prteinů) Kmerční gradientvý gel 4-12% NuPAGE (MES) pufr 2-(N-mrphlin)ethansulfnvá kys. Knstantní I=15 ma/gel. Barviv Cmassie Blue R-250 RadiMedic s.r.. hr3: Originální Nimtuzumab K1: knjugát hr3-dota 1:200 K2: knjugát hr3-dota 1:50 51.DNM Seč 16

16 ELISA - Indirect Enzyme-Linked Immunsrbent Assay 1. Vazba antigenu na jamku imbilizvaný lidský EGFR 2. Saturace 3% BSA v PBS, ph Vazba knjugátu na antigen Inkubace při 4 C přes nc 4. Vazba sekundárníh antigenu HRP (Hrseradish Perxidase) 5. Vizualizace kmplexů kjugát-hrp Reakce substrátu -phenylendiaminu s HRP perxidázu prdukuje barevný kmplex s maximem absrbance při 492 nm. Hdncení: křivky závislstí absrbance imunkmplexu na kncentraci prtilátky RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 17

17 A ( nm) Vliv nadbytku ligandu na imunreaktivitu knjugátu Srvnání imunreaktivity s půvdní prtilátku Nimtuzumab 3,0 2,0 y = 0,2566ln(x) + hr3 1,3957 1,0 R² = 0,9998 0,0 0,0001 0,1 100 lg c (hr3) Vzrek 10mg/ml Absrbance ( ) Rel. Asrbance [%] hr-3 2, ,0 hr-3 *) 1,996 95,5 1:10 1,560 74,7 1:20 1,168 55,9 mg/ml 1:50 0,659 31,5 RadiMedic s.r.. hr-3 *) půvdní hr-3, zpracvaný identicky jak knjugáty 51.DNM Seč 18

18 Radinuklid 177 LuCl 3 v 0.05 M HCl I.T.G. Garching, Německ Ddaná aktivita 3-10 GBq/0,5ml Frma bez nsiče (n.c.a.) Pdmínky značení Specifická aktivita MBq/mg knjugátu 0.5 M ctan amnný ph=7 Reakční bjem 1 ml Inkubace při 42 C p dbu 60 minut. Před analýzu HPLC a TLC přídavek DTPA (0.01 M, ph 6.0) a inkubace dalších 15 min při LT RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 20

19 Pr značení vybrán knjugát připravený mlárním pměrem hr-3:dota 1:20 Mnžství knjugátu [mg] Objem rztku 177 Lu [ml] Reakční směs ph Specifická aktivita 177 Lu-DOTA-hR3 [MBq/mg] Radichemická čistta [%] 0,96 9,79 6, ,96 19,58 6, ,96 39,16 6, ,79 0,96 78,32 6, Odhad přípravy terapeutické dávky 7500 MBq? Při ddržení MBq/mg je chemický bsah knjugátu cca mg. RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 21

20 177Lu-DOTA-hR3 177Lu-DTPA Radichemická čistta (HPLC) Separace Klna: TSK-GEL SW 3000 (7,5x300 nm, 10mm) Mbilní fáze 0,01M PBS + EDTA 1 ml/min Nástřik 20ml Detekce Radidetektr - NaI(Tl) nriu * ,00 5,00 10,00 15,00 min 200 mau UV_A ,00 5,00 10,00 15,00 min CPS *1000 RI-detectr UV/VIS Radidetectr Sig A 2,00 0,00 0,00 5,00 10,00 15,00 min ChB 177 Lu-hR3 knjugát 177 Lu-DTPA RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 22

21 177Lu-DTPA 177Lu-DOTA-hR3 Frnt Radichemická čistta (ITLC-SG) Separace: C/mm *1000 TLC ITLC-SG (20 x 150 mm) Octan amnný 10% (w/v) a methanl (1:1) Před separací inkubace s DTPA vazba vlnéh 177 Lu mm R f ~0 hr-3 knjugát R f ~0,8 177 Lu-DTPA RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 23

22 Připraveny knjugáty Nimtuzumab (hr3) pr značení s 177 Lu Při přípravě pužity různé mlární nadbytky ligandu DOTA 1:10, 1:20, 1:50, 1:200, 1:500 and 1:1000 Sledvání vlivu ligandu na imunreaktivitu knjugátů (ELISA) Zvlen nadbytek ligandu 1:10 Knjugáty značeny 177 Lu Radichemická čistta > 90% dsažena bez nutnsti purifikace radiaktivníh knjugátu Výrba knjugátů a značení prbíhá v čistých prstrech C, kritické perace v A Výrba knjugátů a značení respektuje principy SVP Studie bidistribuce na zdravých ptkanech d knce listpadu 2014 RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 24

23 Náš tým: Mgr. Marek Tmeš, Ph.D. Ing. Kateřina Kntrvá, Ph.D. Ing. Jana Zimvá, Ph.D. Ing. Martin Krpáček, Ph.D. Splupráce: ÚJV Řež, a.s. Labratř bilgickéh testvání Finanční pdpra: TAČR prjekt TA RadiMedic s.r.. 51.DNM Seč 25