Laboratorní cvičení č. 5

Transkript

1 Laboratorní cvičení č. 5 SPEKTROFOTOMETRICKÁ MĚŘENÍ ÚKOL č. 11: Stanovení proteinové koncentrace metodou BCA s pomocí spektrometru Agilent 8453 s automatickým podavačem a průtočným systémem I přes časovou náročnost nabízí Bicincholinová metoda (BCA) několik výhod, oproti standardně používané metodě Bradfordové. Činidlo Bradfordové je totiž poměrně citlivé na řadu sloučenin obsažených ve vzorku a může tedy snadno dojít ke zkreslení výsledků. Mezi látky, které nejčastěji interferují s metodou Bradfordové, patří především detergenty (Triton X-100, Tween 20 apod.), které se běžně používají jako součást extrakčních pufrů. Naproti tomu metoda BCA není citlivá na přítomnost těchto látek. Navíc citlivost této metody je poměrně vysoká a lze měřit proteinové koncentrace v rozmezí µg/mL. Využitím spektrofotometru vybaveného automatickým podavačem vzorku (tzv. autosamplerem) lze navíc podstatně zkrátit vlastní dobu měření. Přístroj lze naprogramovat tak, aby metoda probíhala plně automaticky, a není tedy potřeba přítomnost obsluhy, která se může věnovat jiné činnosti. Využitím autosampleru tak lze snadno a rychle zpracovat velké objemy vzorků. Vnesení chyb způsobených nepřesným pipetováním je taktéž minimalizováno, jelikož dávkování vzorku probíhá automaticky. V následující úloze si tedy vyzkoušíte měření neznámého vzorku pomocí metody BCA. Nejprve si připravíte činidlo BCA, smícháním dvou složek A a B v poměru 50 : 1. Vždy připravte jenom tolik činidla, kolik opravdu spotřebujete (počítejte však s rezervou pro několik vzorků). V dalším kroku je třeba připravit si standardy nutné k sestavení kalibrační křivky. Standardy připravíte vhodným naředěním zásobního roztoku proteinu BSA o známé koncentraci. Paralelně se standardy si vhodným naředěním připravíte i neznámý vzorek, v němž budete stanovovat koncentraci proteinů. V posledním kroku ke všem standardům a vzorku napipetujete 1,5 ml činidla BCA, necháte minimálně 30 minut inkubovat. Během této doby máte dostatek času k zapnutí všech potřebných komponent spektrofotometru a nastavení metody, jelikož inicializace přístroje zabere minimálně 15 minut. Na závěr úlohy provedete samotné měření a výsledky vyhodnotíte. MATERIÁL a CHEMIKÁLIE Spektrofotometr Agilent 8453 vybavený automatickým podavačem (autosampler), zkumavky kompatibilní s autosamplerem Agilent, automatické pipety, Reagent A, Reagent B, hovězí sérový albumin (BSA, proteinové standardy od 0,1 2,0 mg/ml) POSTUP A. Příprava činidla Připravte si pracovní roztok BCA (Working Reagent, WR) pro stanovení proteinové koncentrace: 50 dílů Reagent A + 1 díl Reagent B. Pro stanovení pomocí autosampleru Agilent ve zkumavkách je třeba 1,5 ml roztoku na jeden vzorek, na manuální stanovení v kyvetách postačí 1,0 ml roztoku. WR je stabilní několik dnů při laboratorní teplotě v uzavřené nádobě.

2 B. Příprava vzorků pro měření ve zkumavkách 1. Připravte si vhodné ředění vašich vzorků. Oblast linearity pro standardy BSA je v rámci této metody 0,1 až 2,0 mg/ml. Připravte si tedy standardy o koncentracích 0,5; 1,0 a 1,5 mg/ml. 2. Odpipetujte 100 µl každého z vybraných standardů a z vašich vzorků do označené zkumavky. Pro blank (na odečtení pozadí) pipetujte 100 µl vody. 3. Do každé zkumavky pipetujte 1,5 ml WR. Každou zkumavku dobře protřepejte na vortexu a ponechte inkubovat při laboratorní teplotě po dobu minimálně 30 min (lépe inkubovat 45 až 60 min). Pro zvýšení citlivosti je rovněž možné inkubovat reakci 30 min při 60 C, za těchto podmínek je ovšem snížena oblast linearity (asi µg/ml proteinu). C. Příprava spektrofotometru pro měření 1. Zapněte všechny moduly systému: spektrofotometr Agilent 8543 (levý dolní roh), pumpu 1FS (kolébka na předním panelu přístroje), autosampler Agilent (kolébka na zadní straně přístroje vedle napájecího kabelu) a termostat Agilent 89090A (levý dolní roh). Teplota na termostatu je pro toto měření nastavena na hodnotu 28 C. 2. Zapněte počítač a přihlaste se do systému (účet: amin, heslo: dabi). 3. Spusťte program (Instrument 1 Agilent Sys, operátor HPST, OK) a vyčkejte na inicializaci přístroje. 4. Pro jednoduché stanovení koncentrace proteinů použijte metodu BCA_BASIC (File > Load method > BCA_BASIC.M). Stanovení probíhá při vlnové délce 562 nm. Pro optimální hodnoty stanovení ponechte přístroj před samotným měřením alespoň 15 min. zapnutý. D. Kvantifikace vzorků ve zkumavkách za použití autosampleru 1. Naložte všechny zkumavky do autosampleru v následujícím pořadí: blank (WR+voda), standard 1, standard 2, standard 3 a následně všechny vaše vzorky. Pozice v autosampleru jsou číslovány zleva doprava počínaje pozicí číslo jedna vlevo dole na prvním stojánku. Pro manuální ovládání raménka autosampleru použijte ikonu zkumavky (klikněte na ikonu zkumavky a zvolte buď Next position nebo Autosampler Control). V menu Autosampler Control lze přímo volit číslo pozice pomocí zadání čísla pozice (Vial Number) a následně příkazu Go To 2. Před tím, než provedete novou kalibraci, ověřte, zda tabulka standardů neobsahuje již nějaké kalibrační hodnoty. Přepínání mezi tabulkou vzorků (Samples) a standardů (Standards) lze provést pomocí příslušných nabídek pod ikonou kalibrační křivky. Vymazat tabulku standardů s aktuálně požívanými hodnotami kalibrace lze provést pomocí příkazu Clear > Standards (podobně lze vymazat i tabulku vzorků). 3. Znovu zkontrolujte správné řazení zkumavek standardů a vzorků a proveďte kontrolu systému. Na pozici číslo jedna můžete otestovat měření pozadí (klikněte na nabídku Blank). Jeden nástřik spotřebuje více než 1 ml roztoku; ověřte, že ve všech zkumavkách je dostatečné množství roztoků. Při dlouhodobém měření odečítejte pozadí dostatečně často (nejméně jednou za půl hodiny). 4. Spuštění sekvence měření se provádí z nabídky Automation (levý dolní roh). Vyplňte požadované hodnoty v menu Automation. Save results to: název vašeho měření; Blank: First time only; Standards: vyplňte tři zvolené hodnoty koncentrace BSA pro tvorbu kalibrační křivky; Controls: použité kontroly ve vašem experimentu, pokud nějaké máte; Samples: maska pro označení vzorků; Dilution: použité ředění (zadejte vaše ředění nebo ponechte nevyplněné); Number of samples: DŮLEŽITÉ! Zde vyplňte počet vašich vzorků. 5. Spusťte sekvenci měření (Run Automation). Systém postupuje zleva doprava v pořadí blank, standardy 1, 2 a 3, dále pak následují vaše vzorky v počtu uvedeném v nabídce Automation.

3 6. Systém provede automaticky vyhodnocení výsledků na základě vygenerované kalibrační křivky. Jsou-li hodnoty kalibrace nevyhovující, lze provést novou, manuální kalibraci (předtím je nutno vymazat současné hodnoty kalibrace, viz. výše) nebo zopakovat novou sekvenci měření pomocí Automation. 7. Výsledky měření i kalibraci můžete uložit pomocí příslušných příkazů (File > Save > Samples As / Standards As > ). 8. Na závěr vašeho měření promyjte systém vodou z připravené zkumavky, vypněte program (neukládejte vaše změny do používané metody!) a postupně vypněte všechny moduly systému.

4 Laboratorní cvičení č. 12 PRÁCE S MIKROSKOPEM ÚKOL č. 26: Pozorování fází buněčného cyklu v kořenech cibule Genetická informace každého organismu je uložena v několika (příp. mnoha) molekulách DNA (deoxyribonucleic acid deoxyribonukleová kyselina) neboli chromosomech. Například lidské buňky obsahují po 46 chromosomech, zatímco buňky cibule po 8 chromosomech. Sled pochodů, při kterých každá buňka zdvojnásobí svůj obsah, včetně genetického materiálu a rozdělí se na dvě dceřiné buňky, se nazývá buněčný cyklus. Buněčný cyklus eukaryotních buněk se dělí do čtyř fází: G 1 (gap), S (synthesis), G 2 a M (mitosis). Doba mezi dvěma M-fázemi se nazývá interfáze. Označení pochází z doby, kdy rozlišení pro pozorování buněk nebylo veliké a kromě syntézy DNA (v S-fázi) a samotného dělení (v M-fázi) nebylo během buněčného cyklu nic vidět. Dnes již víme, že je buňka metabolicky aktivní během celé interfáze, kdy dochází k syntéze např. nukleotidů a histonů pro replikaci DNA, stejně jako mnoha dalších proteinů i nízkomolekulárních látek. Trvání buněčného cyklu i poměr jednotlivých fází závisí na typu buňky a organismu. Mitosa (M-fáze) má 4 fáze: profázi, metafáze, anafáze a telofáze zakončená cytokinezí neboli samotným rozdělením buňky. Během profáze jednotlivá vlákna DNA spiralizují a tzv. kondenzují. Vznikají chromosomy pozorovatelné pod mikroskopem. Ke konci profáze se rozpouští jaderná membrána a jednotlivé chromosomy jsou přichyceny na mikrotubuly vřeténka a pohybují se k ekvatoriální rovině buňky. Tím začíná metafáze, během níž se rozdělí centromery, které spojují obě chromatidy jednotlivých chromosomů. V okamžiku, kdy je každá chromatida (dceřiný chromosom) tažena na opačnou stranu, hovoříme o anafázi. Pohyb chromatid se nazývá segregace. V telofázi se tvoří kolem každé sady chromosomů nová jaderná membrána. Prakticky zároveň probíhá i cytokineze, kdy se vytvoří přepážka mezi nově vzniklými buňkami. U rostlinných buněk vzniká buněčná destička (fragmoplast) od středu buňky k obvodu (centrifugálně), zatímco u živočišných buněk se plasmatická membrána tvoří od obvodu dovnitř (rýhováním, centripetálně). Chromosomy nejsou v normálním světle viditelné, protože mají stejný lom světla jako cytoplasma. Je možné je zviditelnit použitím fázového kontrastu nebo barvením. Nejčastěji se používají acetobarviva (organická barviva v kyselině octové nebo propionové). Před vlastním barvením se provádí fixace materiálu a macerace, při které se rozruší střední lamela mezi buňkami, takže je pak možné preparát jemným tlakem rozložit do tenké vrstvy a není třeba ho řezat. Tomu se říká roztlakový preparát. Je vhodné vybrat materiál, kde dochází k intenzivnímu buněčnému dělení meristémy, které se nacházejí na vzrostném vrcholu stonku a v kořenové špičce. MATERIÁL a CHEMIKÁLIE nafixované kořenové špičky cibule kuchyňské (Allium cepa), podložní a krycí sklo, pinzeta, žiletka, Pasteurova pipeta, preparační jehla, Schiffovo reagens, laktopropionový orcein (1g rozpustíme za chladu v 50 l směsi kyseliny propionové a mléčné 1:1; po týdnu přefiltrujeme a uchováváme v tmavé lahvi v chladu; zásobní roztok ředíme v poměru 10:3 destilovanou vodou a případně zfiltrujeme), 5M HCl

5 POSTUP Ustřihněte si asi 1 cm dlouhé kořínky cibule a vložte je do mikrozkumavky. Přidejte 5M HCl a nechte působit asi 10 minut při laboratorní teplotě. Opláchněte kořínky destilovanou vodou a jeden přeneste na podložní sklíčko a oddělte kořenovou špičku s meristematickým pletivem; zbytek kořene vyhoďte. Kápněte na kořenovou špičku laktopropionový orcein nebo Schiffovo reagens. Nechte působit 5 minut, poté přiložte krycí sklíčko a přitlačte plastovým koncem preparační jehly. Opatrně, abyste sklíčkem neposunuli nebo neotočili! VYHODNOCENÍ Pozorujte preparáty pod mikroskopem a zakreslete do protokolu buňky v jednotlivých fázích. Porovnejte obě metody barvení.