CHARAKTERIZACE CITLIVOSTI NA ANTIBIOTIKA U POŠEVNÍCH KMENŮ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta CHARAKTERIZACE CITLIVOSTI NA ANTIBIOTIKA U POŠEVNÍCH KMENŮ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Ondřej Zahradníček Autor: Jana Davídková Brno, duben 2012

2 Jméno a příjmení autora: Jana Davídková Název bakalářské práce: Charakterizace citlivosti na antibiotika u poševních kmenů Streptococcus agalactiae Pracoviště: Mikrobiologický ústav, Fakultní nemocnice u sv. Anny Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Ondřej Zahradníček Rok obhajoby bakalářské práce: 2012 Souhrn: Cílem práce bylo vyhodnotit citlivost/rezistenci k penicilinu, tetracyklinu, vankomycinu a nitrofurantoinu u několika desítek poševních kmenů Streptococcus agalactiae pomocí diskového difuzního testu a následně potvrdit či vyvrátit zvyšující se rezistenci k některým antibiotikům. Výsledky naznačují, že citlivost k penicilinu, vankomycinu a nitrofurantoinu zůstává zachována, zhoršuje se však citlivost k tetracyklinu, resp. doxycyklinu. Klíčová slova: Streptococcus agalactiae, diskový difuzní test, penicilin, tetracyklin, vankomycin, nitrofurantoin, citlivost/rezistence na antibiotika. Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Ondřeje Zahradníčka a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne:...

4 Poděkování: Tímto bych chtěla poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce panu MUDr. Ondřeji Zahradníčkovi za odborné vedení, důležité rady při psaní teoretické i praktické části bakalářské práce, za věnovaný čas a milé jednání.

5 Použité symboly a zkratky: AMIES Amiesova půda s aktivním uhlím CAMP test/faktor Christie Atkinson Munch-Petersen test/faktor DDT Diskový difuzní test G+ Grampozitivní G- Gramnegativní GBS Group B Streptococcus i. v. Intravenozně LIS Laboratorní informační systém MIC Minimální inhibiční koncentrace PYR test Test pyrrolidonylpeptidázové aktivity S. agalactiae Streptococcus agalactiae S. aureus Staphylococcus aureus S. pyogenes Streptococcus pyogenes STD Sexually transmitted diseases STI Sexually transmitted infections

6 Obsah: 1 Úvod Cíl práce Streptococcus agalactiae Faktory virulence, antigenní struktura Patogenita Patogenita u novorozenců Patogenita u dospělých Léčba Prevence Diagnostika S. agalactiae Odběr vzorku Mikroskopie barvení dle Grama Princip Gramova barvení Postup Gramova barvení Kultivace Selektivní bujon pro screening S. agalactiae Krevní agar Hodnocení CAMP test Princip CAMP testu Postup CAMP testu Bacitracinový test a PYR test Princip a provedení bacitracinového testu Princip a provedení PYR testu Latexová aglutinace Chromogenní půdy Stanovení citlivosti na antibiotika Diskový difuzní test Princip diskového difuzního testu Postup diskového difuzního testu... 26

7 5.1.3 Hodnocení diskového difuzního testu Diluční mikrotest (synonymum: mikrodiluční test) Princip dilučního mikrotestu Postup dilučního mikrotestu Hodnocení dilučního mikrotestu E-test Princip E-testu Postup E-testu Hodnocení E-testu Charakteristika STD laboratoře Biologický materiál určený k vyšetření Druhy požadovaných vyšetření Příjem materiálu Zpracování materiálu Používané půdy v laboratoři STD a jejich kultivace Odečet kultivačního a mikroskopického vyšetření Interpretace výsledků Materiál a metody Materiál Charakteristika vyšetřovaných vzorků Metody Výsledky Diskuze Závěr Použitá literatura Seznam obrázků Seznam tabulek Příloha... 55

8 1 Úvod Streptococcus agalactiae je obávaný patogen především u těhotných žen a novorozenců. Proto je těhotným ženám mezi 35. až 38. týdnem prováděn screening, díky kterému je S. agalactiae zpravidla včas zachycen a nákaze novorozence je možno pomocí preventivních postupů zabránit. U novorozených dětí se obáváme vzniku časné nebo pozdní neonatální sepse, případně i meningitidy a dalších invazivních infekcí. S. agalactiae se může projevit i u dospělých, například jako infekce močových cest nebo komplikace těhotenství. S. agalactiae je obvykle dobře citlivý na používaná antibiotika. Mezi nejpoužívanější léky patří penicilin a ampicilin. V poslední době je patrný nárůst rezistence k některým antibiotikům. U těhotných žen se antibiotika nasazují při porodu, pokud měly pozitivní výsledek screeningu. Pokud nebylo screeningové vyšetření provedeno, nasazují se antibiotika podle určitých kritérií (bude popsáno dále). 8

9 2 Cíl práce Cílem mé bakalářské práce na téma Charakterizace citlivosti na antibiotika u poševních kmenů Streptococcus agalactiae bylo vyhodnotit nálezy S. agalactiae z poševních výtěrů přijatých do laboratoře Mikrobiologického ústavu LF MU a FN u sv. Anny v Brně, určit citlivost diskovým difuzním testem, změřit velikosti zón a porovnat naměřené hodnoty s velikostí referenčních zón. Diskovým difuzním testem byla vyšetřena citlivost S. aglactiae izolovaného z klinického materiálu k penicilinu, tetracyklinu, vankomycinu a nitrofurantoinu. Účelem výzkumu bylo po vyhodnocení výsledků se potvrdit či vyvrátit zvyšující se rezistence k již jmenovaným antibiotikům. Nedílnou součástí práce je také teoretický úvod, představující literární rešerši k zadané problematice, a to zejména z důvodu možnosti porovnání vlastních výsledků s výsledky jiných autorů v rámci diskuse. 9

10 3 Streptococcus agalactiae Streptococcus agalactiae je grampozitivní kok, patřící do rodu Streptococcus (čeleď Streptococcaceae, řád Lactobacillales, třída Bacilli, kmen Firmicutes, doména Bacteria Sedláček, 2007). Morfologicky jde o koky tvořící řetízky. Jedná se o nepohyblivé, fakultativně anaerobní bakterie. Netvoří spory a jsou kataláza negativní (neumějí rozkládat peroxid vodíku na vodu a kyslík). Na krevním agaru sice za normálních okolností tvoří jen částečnou hemolýzu, nicméně se zpravidla řadí mezi hemolytické ( -hemolytické) streptokoky. S. agalactiae je jediným pro člověka významným zástupcem streptokoků skupiny B dle Lancefieldové (skupinově specifický antigen B). V anglicky, ale často i česky psané lékařské literatuře se proto často jako synonymum používá zkratka GBS ( Group B Streptococcus například Dohnal, 2009). Streptococcus agalactiae je patogenem nejen u člověka, ale i řady zvířat, u kterých způsobuje nejrůznější typy infekcí. U hovězího dobytka je S. agalactiae známým původcem mastitid spojených se ztrátou tvorby mléka. Odtud také pochází jeho vědecký název (agalactiae, z řeckého galaktos mléko). U člověka se nachází v trávicím traktu a může kolonizovat urogenitální trakt, aniž by nutně došlo k infekci. Může však být příčinou závažných onemocnění, zejména u novorozenců, kteří se mohou nakazit při průchodu porodními cestami, které jsou jím kolonizovány. Obrázek 1: MOP IIIb, masivně leukocyty a grampozitivní koky bez laktobacilů, kultivačně S.agalactiae (GBS), zvětšeno 1500x (Holec, 2005) 10

11 3.1 Faktory virulence, antigenní struktura S. agalactiae tvoří několik faktorů virulence, včetně hemolyzinu (označovaného též jako CAMP-faktor), kapsulárních polysacharidů, C5 peptidázy (pouze u lidských patogenních kmenů), hyaluronidázy (není přítomna u všech kmenů) a různé povrchové proteiny, adheziny, které vážou lidské IgA (Greenwood, a další, 2007). S. agalactiae má skupinově specifický stěnový antigen B. Je možné prokázat i pouzderné polysacharidové a proteinové antigeny. Podle pouzderných polysacharidových antigenů (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI) a proteinových antigenů (R, X) je možno rozlišit větší množství serotypů (např. Bednář, 1996, jich uvádí celkem 10). Mnoho studií však naznačuje, že v rozdělení serotypů mezi kmeny S. agalactiae existuje významný posun (Harrison, a další, 1998, Zaleznik, a další, 2000). Je tedy pravděpodobné, že rozdělení serotypů S. agalactiae se časem mění, poukazují na to též netypizovatelné kmeny izolované od pacientů s invazivním onemocněním (Harrison, a další, 1998). V sedmdesátých letech bylo nejvíce onemocnění u těhotných žen a novorozenců způsobených serotypy Ia, Ib, II a III (Eickhoff, a další, 1964). Od poloviny osmdesátých let byl častým patogenem v USA S. agalactiae se serotypem V (Blumberg, a další, 1996). Studie ukázala, že S. agalactiae typ VI a VIII jsou běžně izolovány od těhotných žen v Japonsku (Lachenauer, a další, 1999). 3.2 Patogenita V posledních několika desetiletích se S. agalactiae ukázal jako významný patogen. Onemocnění vyvolaná touto bakterií jsou významná především v perinatologii. Hlavním rezervoárem S. agalactiae je pochva a trávicí trakt a kolonizace těchto regionů je rizikovým faktorem pro následné infekce těhotných žen a novorozenců ale i například dospělých se sníženou odolností podmíněnou základním onemocněním Patogenita u novorozenců Novorozenecká onemocnění způsobená S. agalactiae by bylo vhodné dělit na perinatální (vzniklá v průběhu porodu) a postnatální (vzniklá po porodu s tím, že zdrojem jsou zpravidla bakterie, které novorozence kolonizovaly při porodu). Protože však reálně zpravidla nelze okamžik vzniku infekce určit, mnohem častěji se užívá jiná klasifikace, podle níž se onemocnění dělí na časnou a pozdní formu. Je přitom zřejmé, že perinatální infekce spadají 11

12 zpravidla do formy časné, kdežto postnatální spíše do formy pozdní. Platí ovšem také to, že například meningitida se manifestuje častěji pozdní formou, i pokud vznikne perinatálně. (Blechová, 2006) Časná neonatální sepse se často projeví do 24 hodin po porodu, ale může se rozvinout až do 7 dnů po porodu (Woods, 2011). Časná, akutní sepse vzniká následkem polknutí, nebo vdechnutí kontaminovaného cervikovaginálního sekretu matky při průchodu porodními cestami (Křížová, 2008). Ke klinickým symptomům patří letargie, cyanóza a apnoe, následuje šok, a pokud není rychle zahájena léčba, nastává smrt. K rizikovým faktorům neonatální kolonizace a infekce patří předčasný odtok plodové vody, předčasný porod, nízká porodní hmotnost a porodní horečka. (Greenwood, a další, 2007) Pozdní neonatální sepse je definována jako infekce, která se projeví po prvním týdnu po porodu až do 3 měsíců života (Woods, 2011). Sepse je často provázena meningitidou, má příznivější prognózu, zanechává však následky v podobě poruch CNS (Křížová, 2008). Pozdní forma je obvykle vyvolána S. agalactiae serotypu III, způsobující bakteriémie a meningitidy. Nepřítomnost protilátek proti S. agalactiae u kojenců je rizikovým faktorem infekce (Woods, 2011). Nejčastějším projevem je hnisavá meningitida, ale může nastat i hnisavá artritida, osteomyelitida, konjunktivitida, sinusitida, otitida, endokarditida a peritonitida. Výskyt invazivních infekcí je vyšší u předčasně narozených než u novorozenců narozených v termínu. (Greenwood, a další, 2007) Patogenita u dospělých Streptokoky skupiny B se běžně vyskytují v zažívacím traktu. Bylo zjištěno, že mohou kolonizovat močovou trubici i horní cesty dýchací u žen i u mužů, aniž by došlo k infekci. Infekce močových cest jsou společným projevem onemocnění vyvolaných S. agalactiae a jsou pozorovány u těhotných i netěhotných žen i u mužů (Woods, 2011). Vzestupné šíření S. agalactiae u těhotných žen vede například k infekci plodové vody a to může mít za následek chorioamnitidu, potrat, poporodní sepse (endometritidy) a jiné infekce (např. zápal plic) v období po porodu u mladých zdravých žen (Greenwood, a další, 2007). Mezi další streptokokové infekce patří zápal plic, infekce kůže a měkkých tkání, hnisavá artritida, osteomyelitida, meningitida, zánět pobřišnice a endoftalmitida (Woods, 2011). 12

13 Teprve v posledních zhruba třech desetiletích jsou streptokoky skupiny B uznávány i jako patogeny u netěhotných dospělých. Četné studie umožnily popis klinického spektra onemocnění včetně klinických projevů, rizikových faktorů, terapie a výsledků. Onemocnění se může projevovat jako sepse, pneumonie, infekce měkkých tkání jako je celulitida a artritida a infekce močových cest komplikované bakteriémií (Greenwood, a další, 2007). S výjimkou zánětů močového měchýře jsou infekce vyvolané S. agalactiae u zdravých jedinců velmi vzácné a jsou téměř vždy spojené s existencí základního onemocnění. Mezi základní onemocnění spojené s infekcí stále častěji patří diabetes mellitus a malignity. Jiné stavy spojené s infekcí S. agalactiae u dospělých jsou kardiovaskulární a urogenitální choroby, neurologické deficity, cirhóza, AIDS, poruchy funkce ledvin, periferní cévní onemocnění a další (Woods, 2011). 3.3 Léčba Jako lék první volby pro léčbu infekcí vyvolaných S. agalactiae se stále uvádí penicilin, i když citlivost není stoprocentní (na rozdíl od Streptococcus pyogenes, u kterého v Česku stále nebyl nalezen rezistentní kmen). Klinická odpověď na antimikrobiální terapii penicilinem je často špatná i přes velké dávky antibiotika, proto je mnohými lékaři doporučováno nahrazení penicilinu ampicilinem, případně kombinace penicilinových antibiotik s aminoglykosidy (Mahon, a další, 2010). Ženy, u kterých byl S. agalactiae zachycen během těhotenství, dnes již zpravidla nebývají přeléčeny. Přeléčení totiž nesnižuje riziko onemocnění novorozence a až 70 % žen je i přes léčbu rekolonizováno. Proto se v současné době zpravidla doporučuje nepřeléčovat, ale zabezpečit porod takto kolonizované ženy, aby se zabránilo infekci novorozence. Po odtoku plodové vody nebo nástupu děložní činnosti, se intravenózně podávají antibiotika (první dávka nejpozději 4 hodiny před porodem). Tím dochází k výraznému snížení rizika přenosu z matky na dítě. S. agalactiae je citlivý k penicilinům a makrolidům. Kromě nich se případně užívají i antibiotika z dalších skupin, jak o tom hovoří několik následujících citací: V případě alergie na penicilinová antibiotika s nízkým rizikem anafylaxe a také u nevěrohodné alergické anamnézy se podávají cefalosporiny I. generace (Klikarová, 2010). Při alergii s vysokým rizikem vzniku anafylaxe podáváme klindamycin (pro výhodnější farmakokinetické 13

14 parametry) nebo erytromycin (Voříšková, 2008). Vankomycin je aplikován pouze u pacientek s vysokým rizikem anafylaxe a u pacientek s prokázanou rezistencí k předchozím antibiotikům (Klikarová, 2010). Tetracykliny u těhotných nelze použít, navíc u nich v poslední době stoupá výskyt rezistence (Bednář, a další, 1996). Navzdory výše uvedené obecné preferenci penicilinu se při profylaxi při porodu často používají dostatečné dávky ampicilinu (Votava, a další, 2003). Doporučení se však mohou lišit podle aktuálního stavu rezistence kmenů na jednotlivé antimikrobiální preparáty. Jedna velká studie, která zkoumala citlivost asi u 4800 kmenů S. agalactiae, zjistila, že 32 % bylo rezistentních vůči erythromycinu, 15 % ke klindamycinu, přičemž 99 % klindamycin-rezistentních kmenů bylo také rezistentních k erythromycinu (Woods, 2011). Je důležité, aby výsledky z testů citlivosti na antibiotika byly známy dříve, než je zahájena léčba, tj. aby léčba byla cílená se znalostí spektra citlivosti konkrétního kmene patogena. Doporučený postup intrapartální antibiotické profylaxe pro prevenci perinatálního onemocnění způsobeného S. agalactiae pak může vypadat například tak, jak je uvedeno v Tabulce 1. Tabulka 1: Antibiotická profylaxe (upraveno podle Holec, 2005) I. volba Penicilin každé 4 hod. až do porodu, i. v. Alternativa Ampicilin každé 4 hod., po druhé dávce po 6 hod. až do porodu, i. v. Alergie na penicilin Cefazolin po 8 hod., klindamycin - po 8 hod. nebo erytromycin po 6 hod., i. v. V případě sepse Ampicilin po 4 6 hod. + gentamicin po 24 hod., i. v. Léčbu končíme s okamžikem porození novorozence, pouze při klinickém nálezu infekce matky se doporučuje v léčbě pokračovat (Holec, 2005). 3.4 Prevence Ačkoli je časná forma onemocnění S. agalactiae neobvyklá, v posledních letech míra mateřské kolonizace S. agalactiae neklesá. To se týká i rizika předčasného nástupu onemocnění S. agalactiae v nepřítomnosti intrapartální antibiotické profylaxe. To zůstává 14

15 beze změny již od roku 1970 (Verani, a další, 2010). Screeningu streptokokové infekce by se měly podrobit všechny těhotné ženy (s výjimkou žen s S. agalactiae-pozitivní kultivací moči kdykoli v průběhu těhotenství) mezi 35. až 38. týdnem těhotenství (Měchůrová, a další, 2007). V některých zemích (například v USA) se provádí stěr kombinovaný (stěr z pochvy a rekta), ale v České republice se provádí pouze stěr vaginální, protože, jak tvrdí někteří gynekologové, bylo zjištěno, že kultivace z rekta není přínosná (Jiříčková, 2011). S tímto závěrem se však jiní, zejména mikrobiologové, neztotožňují, čemuž odpovídají i doporučení v laboratorních příručkách (Laboratorní příručka pro odběr primárních vzorků ZÚ Praha, 2011). Novorozenecké infekci se pak při pozitivitě screeningu předejde podáním antibiotik (penicilin, ampicilin) rodičce během porodu, jak bylo uvedeno výše. Pokud kultivační vyšetření nebylo provedeno, či jeho výsledek není k dispozici, aplikujeme antibiotickou profylaxi při přítomnosti jednoho z těchto rizikových faktorů: při předčasném porodu před 37. týdnem gravidity, po předčasném odtoku plodové vody před 12 a více hodinami, při zvýšené tělesné teplotě matky nad 38 C, při pozitivní kultivaci moči v průběhu gravidity, při porodu dítěte s časnou formou onemocnění S. agalactiae (Měchůrová, a další, 2007). Uvažuje se o možnosti imunizace těhotných, u nichž by protilátky po prostupu placentou chránily novorozence. Účelné je dezinfikovat porodní cesty (Bednář, a další, 1996). Mezi preventivní opatření patří také podání vhodných antibiotik rizikovým novorozencům, aby se zabránilo vniku a rozvoji infekce. Na novorozeneckých odděleních je nutné dodržovat provozně organizační a hygenické normy. Pokud by byly tyto normy porušeny, mohlo by dojít k šíření infekce vyvolané S. agalactiae například od kolonizovaných novorozenců. K epidemiologickým opatřením náleží také hlášení nemocných a odběr biologického materiálu ke stanovení etiologie. (Křížová, 2008) 15

16 4 Diagnostika S. agalactiae Infekce způsobené S. agalactiae se prokazují přímým, zpravidla kultivačním průkazem. Mikroskopicky nelze tohoto streptokoka odlišit od ostatních streptokoků. Podle klasické klasifikace patří tento mikroorganismus mezi grampozitivní koky, které jsou uspořádány ve dvojicích a řetízcích (Votava a kol. 2003). Mahon a další, 2010, uvádí, že při mikroskopii klinického vzorku lze pozorovat kratší řetízky než při mikroskopii izolátů S. agalactiae. Ideální teplota pro kultivaci je 37 C. Kolonie jsou při růstu na krevním agaru šedé, ploché, oproti jiným streptokokům poměrně velké (až 2 mm v průměru), vykazují změny krevního agaru (Kantorová, 2009). Na krevním agaru tvoří kolonie zpravidla obklopené zónou úplné hemolýzy (Bednář, a další, 1996). Intenzita hemolýzy se může měnit např. složením kultivačního média, či účinkem hemolyzinů jiných bakterií (Kantorová, 2009). S. agalactiae je pozitivní v tzv. CAMP testu (jeho princip je uveden dále). CAMP test se často používá k rozlišení nejběžnějších druhů hemolytických streptokoků, a to buď v kombinaci s bacitracinovým testem (Votava, a další, 2003) nebo nověji s PYR testem. Tyto oba testy má S. agalactiae negativní, jsou však zpravidla pozitivní u druhu Streptococcus pyogenes. Obrázek 2: Streptococcus agalactiae (Health, 2012) Schéma pro odlišení streptokoků skupiny A od skupiny B (upraveno podle Mahona, 2010): 16

17 Grampozitivní koky Bacitracin/PYR test Pozitivní Skupina A (S. pyogenes) Negativní CAMP test Negativní Tzv. Non-A-non-B streptokoky (rozlišení dále latexovou aglutinací) Pozitivní Skupina B (S. agalactiae) 4.1 Odběr vzorku K odběru vzorku používáme odběrovou soupravu obsahující vatový tampon a transportní medium (AMIES). Odběr u těhotné ženy se provádí z bočních stěn dolní třetiny vaginy bez použití zrcadel. Tampon následně zanoříme do transportní půdy. Obrázek 3: odběrová souprava s transportní půdou Amies (COTRAXIM s.r.o., 2009) 17

18 4.2 Mikroskopie barvení dle Grama S. agalactiae jsou grampozitivní koky v řetízcích, to znamená, že po barvení Gramem lze v mikroskopu pozorovat koky s modrofialovým zbarvením. V praxi se zpravidla neprovádí mikroskopie vzorku, v případě pochybnosti a nutnosti odlišit tohoto patogena od jiných bakterií se však provede mikroskopie kmene Princip Gramova barvení Gramovo barvení je založeno na rozdílném obsahu látek v buněčné stěně a jejich reakcí s používanými barvivy. Buněčná stěna G+ bakterií obsahuje kyselinu teichoovou, která po obarvení genciánovou violetí a moření Lugolovým roztokem vytvoří pevný barevný komplex (kyselina, barvivo, jód), který se nevymývá rozpouštědlem (alkoholem nebo acetonem). U G bakterií je barevný komplex pomocí rozpouštědla vymyt a jsou následně obarveny pomocí safraninu Postup Gramova barvení 1) Fixovaný preparát přelijeme roztokem Gram I barvíme 30 sekund. Barvivo slijeme z preparátu a opláchneme vodou (oplach lze případně vynechat). 2) Preparát přelijeme Lugolovým roztokem po 30 sekundách slijeme a opláchneme vodou (oplach lze případně vynechat). 3) Odbarvujeme alkoholem, dokud odtéká zbarvený, nejdéle 20 sekund. Následně opláchneme vodou. 4) Dobarvujeme kontrastním barvením safraninem po dobu 60 sekund. Slijeme barvivo a opláchneme vodou. 5) Mikroskopujeme pomocí imerzního systému. 18

19 Obrázek 4: Gramovo barvení Streptococcus agalactiae na dvou různých zvětšeních. Délka měřítka je ekvivalentní 5 μm (VetBactBlog, 2011). 4.3 Kultivace Selektivní bujon pro screening S. agalactiae Tampon s odebraným materiálem se zanoří do selektivního bujonu a takto kultivuje 24 hodin. Po této době se všechny bujony vyočkují na krevní agar. Tento bujon se používá pouze v případě těhotných žen (je-li na žádance uvedena těhotenská diagnóza nebo je jinak zřejmé, že jde o těhotnou ženu) Krevní agar Očkuje se na polovinu misky. Laborant nanese tamponem vzorek na cca čtvrtinu misky. Vyžíhanou kličkou, je nanesený vzorek rozočkován na zbylou část poloviny misky. Další vyžíhanou kličkou je na krevní agar do nejhustší části naočkován čarou kmen Staphylococcus aureus, a to směrem z masivněji naočkované do méně naočkované části. Na čáru se umístí sterilní jehlou disk Bacitracin H k diagnostice hemofilů. (Zahradníček, 2010) Podobným způsobem se provádí také vyočkování (subkultivace) ze selektivního bujónu, v tomto případě se však již nepoužívá disk s bacitracinem H, protože v tomto případě již jde pouze o kultivaci S. agalactiae, nikoli jiných patogenů. 19

20 Obrázek 5: GBS pozitivní vzorek poševního sekretu po 24 hodinové kultivaci na obohaceném krevním agaru, S.agalactiae vyrůstá v bělavých koloniích se slabou zónou ß-hemolýzy (výřez zvětšen 5 ) ukázka čáry Staphylococcus aureus (Holec, 2005) Hodnocení Při odečítání primokultivace na krevním agaru hledáme kolonie S. agalactiae charakteristické velikosti, barvy a tvaru, které samy o sobě vykazují jen částečnou hemolýzu, zřetelná je však výrazná synergická hemolýza v okolí čáry S. aureus. V případě, že při primokultivaci není patogen prokázán (to může být také proto, že přerůstají jiné bakterie, zejména enterobakterie), zbývá nám ještě možnost průkazu v subkultuře ze selektivního bujónu. V tomto případě již nehledíme na běžné patogeny (které by v důsledku selektivity použitého bujonu ani neměly vyrůst), ale pouze na kolonie Streptococcus agalactiae. 4.4 CAMP test CAMP test se používá pro odlišení S. agalactiae (CAMP-pozitivní) od ostatních streptokoků (CAMP-negativní) Princip CAMP testu S. agalactiae produkuje CAMP faktor (Christie, Atkins, Munch-Peterson), který difunduje agarem a váže se na membránu erytrocytů. Následně ke stejným erytrocytům doputuje také beta-hemolyzin zlatého stafylokoka (jde o sfingomyelinázu C). Ten způsobí, že namísto částečné hemolýzy vznikne hemolýza úplná. Efekt se však projeví pouze v případě, 20

21 že se hemolyziny naváží na membránu erytrocytů ve správném pořadí. Proto má v případě naočkování kmenů do kříže hemolýza charakteristický tvar dvou trojúhelníků (nebo poetičtěji motýlích křídel) tvar odpovídá zóně, kam dodifundoval CAMP faktor dříve než stafylokokový beta-hemolyzin Postup CAMP testu K testu je nutno použít takový laboratorní kmen Staphylococcus aureus, který je buďto monoproducentem beta-hemolyzinu, nebo alespoň jeho produkce výrazně převažuje nad produkcí jiných hemolyzinů (alfa a delta), které by jinak vzhled testu mohly ovlivnit. Na krevní agar naočkujeme čáru takovéhoto laboratorního kmene S. aureus a kolmo k ní, aniž bychom se jí dotkli, naočkujeme testovaný kmen streptokoka. Test inkubujeme v termostatu 24 hodin. Pokud po kultivaci vidíme zónu úplné hemolýzy charakteristického tvaru, mělo by jít o kmen S. agalactiae. Obrázek 6: S. agalactiae pozitivní CAMP test motýlovitá zóna synergické hemolýzy S. agalactiae a S. aureus (Klasifikace Bakteri, 2007) Obrázek 7: Pozitivní CAMP test (Hanson, 2006) 4.5 Bacitracinový test a PYR test Bacitracinový test a PYR test jsou používány k odlišení Streptococcus pyogenes. Přestože tyto testy nemají přímou souvislost s diagnostikou S. agalactiae, vzhledem k jejich postavení v diferenciální diagnostice streptokoků s hemolýzou se o nich alespoň zmíním. Jejich význam 21

22 spočívá také v tom, že právě některé kmeny S. pyogenes mohou mít slabě pozitivní CAMPtest, takže u nejednoznačných výsledků tohoto testu může být výsledek bacitracinového nebo lépe PYR testu rozhodující Princip a provedení bacitracinového testu Jde o klasický difúzní diskový test citlivosti s tím, že se testuje citlivost k antibiotiku, které se samostatně nepoužívá léčebně, a význam testu je tedy čistě diagnostický. Vzhledem ke kultivační náročnosti streptokoků se test provádí na půdách s krvinkami (například na krevním agaru nebo na Mueller-Hintonově agaru s krvinkami). Pokud bakterie rostou až k disku, tj. jsou rezistentní, nemělo by jít o kmen S. pyogenes. Vytvoří-li se zóna citlivosti, mělo by se jednat o S. pyogenes. V poslední době se od používání tohoto testu ustupuje pro jeho nižší spolehlivost. Obrázek 8: Bacitracinový test (Medical Microbiology) Princip a provedení PYR testu PYR test (také PYRA test) je založen na detekci pyrrolidonylpeptidázové (v mikrobiologickém slangu PYRázové ) aktivity použitím diagnostického proužku. 22

23 Pozitivní je Streptococcus pyogenes, ale také všechny enterokoky. To však v praxi nečiní problém, protože enterokoky, na rozdíl od kmenů S. pyogenes, na krevním agaru zpravidla vytvářejí jen velmi slabou částečnou hemolýzu. Test se provádí tak, že se kolonií dotkneme proužkem, napuštěným činidlem (musí být předem navlhčen), a po pěti až deseti minutách přikápneme činidlo, dodané spolu s testovacími proužky. Po cca 30 sekundách hodnotíme. Jako pozitivní se hodnotí vývoj červeného zbarvení v reakční zóně proužku. Obrázek 9: Negativní PYR test vlevo, pozitivní PYR test vpravo (faculty.matcmadison.edu) 4.6 Latexová aglutinace Latexová aglutinace pomocí komerčně dostupných souprav je způsobem, jak blíže určit kmen streptokoka do antigenních skupin dle Lancefieldové. V praxi se zpravidla provádí pouze u non-a-non-b streptokoků, a i zde pouze tam, kde by mohlo jít o klinicky významný kmen (například u izolátů z ran). V případě S. agalactiae by bylo možno samozřejmě latexovou aglutinaci použít také (pozitivní by byla aglutinace se sérem B), avšak pozitivní CAMP test, zejména při negativitě testů k průkazu S. pyogenes, se většinou považuje pro rutinní diagnostiku za zcela dostačující. Tato sérologická metoda je založena na reakci protilátky s antigenem. Jako nosič slouží latexové částice, na kterých je navázána protilátka. Pozitivní reakce se projeví jako viditelné shluky. 23

24 Obrázek 10: Aglutinace latexových částic pokrytých specifickými protilátkami Sk. A (old.lf3.cuni.cz) Obrázek 11: Detailní zvětšení pozitivní reakce z obrázku Chromogenní půdy V laboratoři, kde jsem pracovala, se nepoužívají chromogenní půdy k diagnostice S. agalactiae, a proto jsem je nepoužila ani já. Protože ho však mnohé laboratoře používají, považuji za vhodné se o něm alespoň zmínit. Díky chromogenním půdám je možné odlišit jednotlivé bakterie na základě specifické barvy narostlých kolonií. Enzymy, produkované diagnostikovanými bakteriemi, reagují s chromogenním substrátem, který je obsažený v mediu. Reakce se projeví jako nárůst barevné kolonie. Každý výrobce má jiné složení půd, díky tomu, může mít narostlá kolonie na různých mediích odlišné zbarvení, i když se jedná o stejný druh bakterie. Obrázek 12: Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus) on ChromID CPS Agar, (flickriver.com) 24

25 Obrázek 13: Streptococcus agalactiae, jiné chromogenní medium než na obrázku 12 (E&O Laboratories Ltd) 25

26 5 Stanovení citlivosti na antibiotika Testy se provádějí za účelem zjištění citlivosti nebo rezistence bakterie k danému antibiotiku. Bakterie mohou nově získávat rezistence k antibiotikům, proto je pro léčbu testování citlivosti nezbytné, výsledek testu pomáhá lékaři určit vhodnou léčbu. Citlivost na antibiotika stanovujeme u izolovaných bakterií z klinického materiálu, z takzvané čisté kultury. Podle kultivace a mikroskopie je zvolena vhodná sestava antibiotik pro testování citlivosti před jejich bližším určením (Zahradníček, 2007). U většiny kmenů užíváme diskového difusního testu, u závažných pacientů z JIP a z ARO užíváme diluční test, tj. stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), nebo E- testové proužky (Zahradníček, 2007). 5.1 Diskový difuzní test Diskový difuzní test je standardní metoda ke stanovení citlivosti daného kmene k určitému antibiotiku. Jedná se o kvalitativní test Princip diskového difuzního testu Antibiotikum difunduje kolem disku položeného na naočkované půdě. Koncentrace antibiotika v půdě se snižuje se zvyšující se vzdáleností od disku. Bakterie se množí, ale v místě, kde koncentrace antibiotika dosáhne stupně citlivosti pro danou bakterii, se růst zastaví. Tím dojde vytvoření inhibiční zóny kolem disku. Na velikost zóny mají vliv různé faktory, například citlivost kmene, rychlost množení kmene, tloušťka a fyzikální vlastnosti půdy, vlastnosti antibiotik (old.lf3.cuni.cz DDT) Postup diskového difuzního testu Několik kolonií zkoumaného kmene přeneseme kličkou do fyziologického roztoku. Výsledný zákal odpovídá standardu 0,5 1 zákalové stupnice dle McFarlanda. Suspenzi naočkujeme sterilním tamponem na Mueller-Hintonův agar, rovnoměrně po celém povrchu. Následně na půdu klademe disky napuštěné požadovaným antibiotikem. Disky aplikujeme jednotlivě pomocí jehly nebo dispenzorem celou sadu disků. Když disk na půdu položíme, 26

27 už ho nelze přesunout dochází k okamžité difuzi a výsledky by mohly byt zkreslené. Kultivujeme při 37 C hodin. (old.lf3.cuni.cz DDT, Zahradníček, 2007) U bakterií, které na Mueller-Hintonově agaru rostou špatně nebo vůbec (to se týká i S. agalactiae, ale i ostatních streptokoků, neisserií, branhamel) užíváme k testování Mueller- Hintonovy půdy s krví, na kterou očkujeme čistou kulturu bakterie přímo kličkou. Takto naočkované Petriho misky s půdami jsou kultivovány při 37 C v termostatu se zvýšenou tenzí CO hodin. (Zahradníček, 2007) Hodnocení diskového difuzního testu Výsledek tohoto testu je kvalitativní určujeme, zda je daný kmen citlivý nebo rezistentní k danému antibiotiku podle velikosti inhibiční zóny kolem disku napuštěného antibiotikem. Hraniční zóny jsou proměřovány posuvným měřítkem. Je-li zóna kolem antibiotického disku doporučené velikosti, hodnotíme daný kmen jako citlivý. Pokud je zóna menší nebo se nevytvořila žádná, hodnotíme daný kmen jako rezistentní. Obrázek 14: Schéma DDT inhibiční zóny ( 5.2 Diluční mikrotest (synonymum: mikrodiluční test) Diluční test patří mezi kvantitativní metody. Určujeme nejnižší koncentraci antibiotika, která zabrání růstu bakterií minimální inhibiční koncentrace (MIC). O mikrotestu se hovoří 27

28 proto, že historicky vznikl miniaturizací původního dilučního testu prováděného ve zkumavkách. Mikrotitrační destička o 96 jamkách (12 8 jamek) je samozřejmě oproti 96 zkumavkám daleko levnější a výrazně jejím použitím klesá i spotřeba antibiotik a použitého média. (old.lf3.cuni.cz Diluční metoda, Zahradníček, 2007) Princip dilučního mikrotestu U této metody používáme mikrotitrační destičky. V každém sloupci destičky se nachází antibiotikum rozředěné geometrickou řadou na 8 koncentrací (v posledním sloupci je koncentrací jen sedm, v horním důlku posledního sloupce se nachází kontrola růstu). To znamená, že v jedné destičce stanovíme až 12 minimálních inhibičních koncentrací různých antibiotik pro jednu testovanou bakterii. Minimální inhibiční koncentrace je tedy nejmenší koncentrace antibiotika v jamce, ve které už bakterie nenarostly Postup dilučního mikrotestu Z čisté kultury vyrostlé na pevné půdě naočkujeme několik kolonií do živného bujonu v Petriho misce, hustota suspenze by měla být 0,5 1,0 McFarlandovy zákalové stupnice. Necháme kultivovat. Následně přidáme sterilní fyziologický roztok. Pomocí vyžíhaného inokulátoru naočkujeme suspenzi bakterií do jamek mikrotitrační destičky. Kultivujeme při 37 C hodin. (Zahradníček, 2007) Hodnocení dilučního mikrotestu V každém sloupci (8 jamek) jsou klesající koncentrace jednoho antibiotika. Odečítáme koncentraci antibiotika, která zabránila růstu bakterie MIC. Stanovené koncentrace jsou porovnávány s tzv. breakpointy pro jednotlivá antibiotika. Bakterie jsou následně hodnoceny jako citlivé nebo rezistentní. Citlivé jsou v případě, že hodnota MIC je nižší nebo rovna hodnotě breakpointu, rezistentní v případě opačném. To platí i pro případ, že je přítomen zákal i v jamce prvního řádku (to znamená, že MIC nelze stanovit, hodnota MIC je vyšší než hodnota v tomto důlku). (Zahradníček, 2007) 28

29 Obrázek 15: Diluční test (old.lf3.cuni.cz Diluční metoda) 5.3 E-test Tento test řádíme mezi kvantitativní testy stejně jako diluční test, ale je založen na podobném principu jako diskový difuzní test Princip E-testu U tohoto testu se využívá proužku, který je napuštěný antibiotikem o klesající koncentraci. Na proužku je vyznačena stupnice gradientu koncentrací. Antibiotikum difunduje do půdy. Kolem proužku se vytvoří inhibiční zóna vejčitého tvaru. Odečítáme minimální inhibiční koncentraci Postup E-testu Několik kolonií zkoumaného kmene přeneseme kličkou do fyziologického roztoku. Výsledný zákal odpovídá standardu 0,5 1 zákalové stupnice dle McFarlanda. Suspenzi naočkujeme sterilním tamponem na Mueller-Hintonův agar, rovnoměrně po celém povrchu. Pomocí sterilní pinzety vložíme testovací proužek. Na misku můžeme aplikovat maximálně 2 proužky (toto omezení platí pro standardní misky o průměru 9 cm, existují i větší misky, na které se vejde proužků více). Kultivujeme při 37 C hodin. Antibiotika difundují do půdy a dojde k zábraně růstu vytvoří se inhibiční kapkovitá zóna. (old.lf3.cuni.cz Etest, Zahradníček, 2007) 29

30 U hůře rostoucích bakterií (např. betahemolytické streptokoky, pneumokoky, neisserie, branhamely) platí to stejné, co již bylo zmíněno u diskového difuzního testu užíváme Mueller-Hinton agar s krví, na kterou očkujeme čistou kulturu bakterie přímo kličkou. Takto naočkované půdy s proužky jsou kultivovány při 37 C v termostatu se zvýšenou tenzí CO hodin. (Zahradníček, 2010) Hodnocení E-testu Kolem proužku se vytvoří kapkovitá inhibiční zóna. Minimální inhibiční koncentrace daného antibiotika se odečte na stupnici proužku v místě, kde ji protne okraj zóny. Obrázek 16, Obrázek 17: Gradientová difúzní metoda - E-test (old.lf3.cuni.cz Etest) 30

31 6 Charakteristika STD laboratoře Svoji práci jsem prováděla v tzv. laboratoři STD Mikrobiologického ústavu LF MU a FN u sv. Anny v Brně. Proto bych v této kapitole chtěla krátce charakterizovat toto pracoviště. Zkratka STD pochází z anglického názvu Sexually Transmitted Diseases, přeloženo jako sexuálně přenosné choroby, přičemž v posledních letech se namísto této zkratky prosazuje nová zkratka STI, znamenající Sexually Transmitted Infections sexuálně přenosné infekce. Ve skutečnosti ovšem název laboratoře ne zcela koresponduje s jeho skutečnou činností, protože z STD se zde vyšetřují pouze některé (například syfilis se vzhledem k obvyklému způsobu průkazu vyšetřuje na laboratoři serologické), a naopak se laboratoř zabývá i diagnostikou těch urogenitálních patogenů, u kterých je sexuální přenos pouze jednou, a často tou méně významnou možností (například poševní kandidózy jsou častěji endogenní). Do laboratoře tedy přicházejí vzorky z mužských i ženských pohlavních orgánů: výtěry z pochvy, urethry, penisu, cervixu, případně ejakulát a podobně. V některých případech také vzorky moče, zejména pokud byly odebrány na gynekologickém oddělení nebo pokud byly zaslány paralelně s poševním výtěrem. Ve vzorcích hledáme bakterie, mykotické organismy a prvoky, které jsou původci zánětů urogenitálního traktu u mužů i u žen. Bakterie ze vzorku se prokazují kultivačně, z části mikroskopicky. Následně jsou blíže biochemicky určeny a je provedeno vyšetření citlivosti na daná antibiotika. 6.1 Biologický materiál určený k vyšetření Do laboratoře jsou zasílány výtěry ve vhodné transportní půdě, nejčastěji je to Amiesova půda s aktivním uhlím, a případně také v tekutém mediu soupravy CAT Swab (nutné pro vyšetření Trichomonas vaginalis). Vyšetřeno může být také sperma, prostatický exprimát a jiný tekutý či kusový materiál z pohlavních orgánů zaslaný ve sterilní zkumavce (a případně též v tekutém mediu soupravy CAT Swab). Pokud je požadováno mikroskopické vyšetření, je nutné, aby lékař požadující vyšetření, zaslal nátěr na sklíčku (případně dvou sklíčkách). Sklíčko musí být zasláno takovým způsobem, aby nedošlo k jeho poškození při transportu. Je-li zasláno jen jedno sklíčko, mělo 31

32 by být označeno, jakým způsobem má být obarveno (dle Grama nebo dle Giemsy), resp. po kterých patogenech se má pátrat. 6.2 Druhy požadovaných vyšetření Klinický lékař zvolí rozsah vyšetření podle potřeby, musí však zaslat biologický materiál ve vhodné odběrové nádobě či nátěr na sklíčku, jestliže bude požadována mikroskopie. Mezi základní vyšetření STD laboratoře patří (Zahradníček, 2010): Aerobní vyšetření, včetně kultivace Gardnerella vaginalis. Pokud je na žádance uvedeno, že se jedná o těhotnou ženu, zahrnuje vyšetření také screening Streptococcus agalactiae. Anaerobní vyšetření Vyšetření na Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis Vyšetření na kvasinky Vyšetření na Trichomonas vaginalis Vyšetření na kapavku kultivací Mikroskopické vyšetření nátěr k barvení dle Grama Mikroskopické vyšetření nátěr k barvení dle Giemsy 6.3 Příjem materiálu Vzorky zaslané na vyšetření jsou na příjmu materiálu zkontrolovány. Kontroluje se, zda je materiál odebrán do správné odběrové soupravy a zda je správně vyplněn průvodní list. Údaje na odběrové soupravě a na průvodce musí souhlasit. Následně je materiál poslán do laboratoře. Laborant označí průvodku i materiál stejným pořadovým číslem, dobou přijetí vzorku a podepíše se. Dále je materiál zapsán do laboratorního informačního systému (LIS) pod číslem, které mu bylo přiděleno laborantkou. 32

33 6.4 Zpracování materiálu Materiál se zpracovává podle požadovaného vyšetření na průvodce. Laborantka si připraví půdy nutné pro dané vyšetření a označí je daným číslem vzorku. Vzorek je vyočkován na dané půdy podle zadání ve Standardním operačním postupu. Po rozočkování vzorků se půdy umístí do termostatu a nechají se kultivovat Používané půdy v laboratoři STD a jejich kultivace Krevní agar kultivace v termostatu se zvýšenou tenzí CO 2 při teplotě 36 C. Endova půda kultivace v termostatu (s atmosférou laboratoře) při teplotě 37 C 24 hod. Krevní agar s 10 % NaCl kultivace v termostatu při 37 C 48 hod. Půda pro diagnostiku G. vaginalis kultivace v termostatu se zvýšenou tenzí CO 2 při 36 C 48 hod. VL-agar (VL-krevní agar) kultivace v anaerostatu při 37 C 48 hod. Čokoládový agar pro gonokoky bez antibiotik kultivace v termostatu se zvýšenou tenzí CO 2 při 36 C 48 hod. Čokoládový agar pro gonokoky s antibiotiky (GC agar) kultivace v termostatu se zvýšenou tenzí CO 2 při 36 C 48 hod. Šikmý Sabouraudův agar s antibiotiky (amikacin a vankomycin) kultivace v termostatu při 30 C do zjištění pozitivity nebo nejdéle 4 dny. Půdy pro diagnostiku urogenitálních mykoplasmat: Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis kultivace v termostatu při teplotě 30 C po dobu 5 dnů. Selektivní bujon pro screening S. agalactiae kultivujeme 24 hod. (Zahradníček, 2010) 33

34 6.5 Odečet kultivačního a mikroskopického vyšetření Provést odečet kultivačního, mikroskopického či doplňujícího vyšetření je oprávněn pouze zaškolený lékař či jiný vysokoškolák. Při odečtu zapisuje zaškolená laborantka výsledky vyšetření do LIS. Následně jsou výsledky vytisknuty a zaslány lékaři, který si vyšetření vyžádal, v případě vzorků odebraných v rámci nemocnice dochází zároveň k automatickému přenosu výsledku do nemocničního informačního systému. U mikroskopických vyšetření zapisuje odečítající výsledky do pracovního listu, odkud jsou pak přepsány do LIS. (Zahradníček, 2010) Interpretace výsledků U stěrů z penisu, žaludu, předkožky, popř. mužské urethry, ale také při vyšetření ejakulátu, je za normální nález považován výskyt koaguláza negativních stafylokoků nebo koryneformních bakterií, případně malé množství jiných mikrobů. (Zahradníček, 2010) Při kultivaci výtěru z pochvy žen je za normální nález považován nález laktobacilů, menší množství anaerobních bakterií či koaguláza negativních stafylokoků, případně i malé množství jiných mikrobů. Jiné bakterie jsou považovány za pravděpodobné patogeny interpretace nálezu je na zvážení klinického pracovníka. Podobně jsou interpretovány i nálezy z cervixu či urethry žen. (Zahradníček, 2010) Za normální nález u mikroskopického vyšetření je u výtěrů z vnějších genitálií považováno malé množství epitelií a bakterií. U poševních výtěrů jsou přítomny ve větším množství grampozitivní robustní tyčinky (laktobacily). Za závažný nález je považován nález grampozitivních diplokoků, trichomonád nebo kvasinek, ale také větší množství jiných bakterií. (Zahradníček, 2010) 34

35 Obrázek 18: Laboratoř STD (vlastní foto) 35

36 7 Materiál a metody 7.1 Materiál Čistá kultura S. agalactiae vyizolovaná z klinického materiálu Mueller-Hinton agar s krví připravován v přípravně půd Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny. Antibiotické disky (Oxoid, Praha, Česká republika) - Penicilin 1 unit - Tetracyklin 30 µg - Vankomycin 5 µg - Nitrofurantoin 100 µg Vybavení - Běžné vybavení laboratoře (bakteriologická klička, kahan) - Termostat Schoeller, 36 C, zvýšená tenze CO 2 (5 %) - Posuvné měřítko (Made in China China National Machinery Import & Export Corporation) Charakteristika vyšetřovaných vzorků Výtěry z pochvy, které jsem odečítala a hodnotila, byly zasílány do laboratoře STD Mikrobiologického ústavu LF MU a FN u sv. Anny v Brně z různých ambulancí (viz. Tab. 2). Poševní výtěry byly přijaty do laboratoře STD v období od do V tomto období bylo na citlivost k penicilinu, tetracyklinu, vankomycinu a nitrofurantoinu vyšetřeno pomocí diskového difuzního testu 50 kmenů S. agalactiae zachycených z poševních výtěrů Metody Citlivost nebo rezistenci na antibiotika u S. agalactiae jsem zjišťovala pomocí diskového difuzního testu v laboratoři STD Mikrobiologického ústavu LF MU a FN u sv. Anny v Brně. 36

37 Provedení testu jsem si prakticky vyzkoušela, z praktických a časových důvodů však nebylo možné, abych všechny testy připravovala sama. Využívala jsem tedy testy, které byly připraveny laborantkami laboratoře STD a následně inkubovány. V následujícím textu tedy uvádím postup provedení testu, jak je v laboratoři používán a jak jsem si ho sama vyzkoušela. S. agalactiae zachycený z výtěru pochvy je převeden do fyziologického roztoku. Tato suspenze je následně rozočkována po celé ploše Mueller-Hintonovy půdy s krví. Následně jsou na půdu vloženy disky napuštěné antibiotiky. Používají se 4 základní antibiotika penicilin, tetracyklin, vankomicin a nitrofurantoin. Takto naočkované plotny se kultivují při 36 C v termostatu se zvýšenou tenzí CO hodin. Za těchto podmínek se bakterie množí a podle jejich citlivosti se vytvoří inhibiční zóny kolem disku. Po provedené kultivaci jsem test odečetla. V případě, že jsem nemohla být bezprostředně po kultivaci přítomna, abych provedla odečet testu, byl test uložen do chladničky, kde byl uchováván při teplotě 7 C maximálně 10 dnů. Toto uložení v chladničce neovlivňuje velikost inhibičních zón. Odečet zón jsem prováděla pomocí posuvného měřítka. Změřený výsledek jsem porovnala se standardy zón jednotlivých antibiotik. Jde o standardy, pomocí kterých je kmen hodnocen jako citlivý nebo rezistentní k danému antibiotiku. Standardní velikost zón: Penicilin 18 mm Tetracyklin 23 mm Vankomycin 13 mm Nitrofurantoin 15 mm 37

38 Obrázek 19: Ukázka měřeného diskového difuzního testu penicilin, tetracyklin, vankomycin, nitrofurantoin (vlastní foto) 38

39 8 Výsledky Citlivost či rezistenci na antibiotika u S. agalactiae jsem zjišťovala pomocí diskového difuzního testu v laboratoři STD Mikrobiologického ústavu LF MU a FN u sv. Anny v Brně. V období od do bylo vyšetřeno diskovým difuzním testem 50 kmenů S. agalactiae z poševních výtěrů zaslaných z různých ambulancí (viz. Tab. 2). V případě pracoviště konsiliární gynekologie FN u sv. Anny v Brně mohlo jít i o hospitalizované pacientky, u kterých bylo vyšetření provedeno jako konziliární. Citlivost byla stanovována k penicilinu, tetracyklinu, vankomycinu a nitrofurantoinu. Tabulka 2: Počet vzorků zaslaných z jednotlivých ambulancí v období do Ambulance zasílající výtěr z pochvy Počet přijatých poševních výtěrů Gynekologické oddělení FN u sv. Anny v Brně 21 Soukromé gynekologické centrum GYN LINE s.r.o. 21 Gynekologická ambulance Masarykův onkologický ústav 4 Onkogynekologická ambulance Masarykův onkologický ústav 1 Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny v Brně 1 I. dermatovenerologická klinika FN u sv. Anny v Brně 1 I. neurologická klinika FN u sv. Anny v Brně 1 Tabulka 3: Rozložení počtu vzorků podle diagnózy Diagnóza Počet poševních výtěrů Zánět pochvy a vulvy 34 Dohled nad normálním těhotenstvím 8 Jiné 8 Ze jmenovaných ambulancí byly zasílány výtěry z pochvy. Na průvodních listech byla nejčastěji zaznaménana diagnóza Zánět pochvy a vulvy a Dohled nad normálním 39

40 těhotenstvím, mezi Jiné diagnózy jsem zařadila například Speciální prohlídky a vyšetření osob bez potíží či Jiné nemoci kůže a podkožního vaziva a další. Při kultivačním vyšetření byl zachycen S. agalactiae. Tento zachycený kmen byl následně podroben vyšetření citlivosti na penicilin, tetracyklin, vankomycin a nitofurantoin. Ukázka naměřených hodnot: Obrázek 20: Graf Naměřené hodnoty průměru inhibiční zóny u testu citlivosti na penicilin referenční zóna 18 mm Tento graf znázorňuje rozložení velikostí naměřených zón u testu citlivosti na penicilin. Vyšetřené kmeny S. agalactiae zachycené z poševního výtěru byly k penicilinu citlivé. Hodnoty se nejvíce pohybovaly v blízkosti mm (referenční zóna 18 mm) Obrázek 21: Graf Naměřené hodnoty průměru inhibiční zóny u testu citlivosti na tetracyklin referenční zóna 23 mm 40

41 Z grafu je patrné, jak pouze malé množství testovaných kmenů přesáhlo hodnotu referenční zóny (23 mm). Velikost zón těch kmenů, které byly na tetracyklin hodnoceny jako citlivé, se navíc pohybovala těsně kolem hranice standardní zóny (23 mm) Obrázek 22: Graf Naměřené hodnoty průměru inhibiční zóny u testu citlivosti na vankomycin referenční zóna 13 mm Graf znázorňuje rozložení naměřených hodnot u testu citlivosti S. agalactiae na vankomycin. Vidíme, že naměřené velikosti zón se pohybují blízko standardu (13 mm), ale ani jedena z naměřených hodnot neklesla pod tuto hranici Obrázek 23: Graf Naměřené hodnoty průměru inhibiční zóny u testu citlivosti na nitrofurantoin referenční zóna 15 mm 41

42 Z grafu můžeme vyčíst, že většina naměřených hodnot je výrazně vyšší než hodnota standardu (15 mm). Některé velikosti zón se pohybují blíže hranici standardu, ale ani jedna z hodnot neklesla pod tuto mez 15 mm. Ze všech 50 vyšetřených izolátů se prokázala citlivost k penicilinu 100 % kmenů S. agalactiae, k teracyklinu pouze u 34 % kmenů, k vankomycinu u 100 % kmenů a k nitrofurantoinu též u 100 % kmenů S. agalactiae. Rezistence S. agalactiae se objevila pouze na tetracyklin (66 %). Z těchto výsledků můžeme nárůst rezistence v případě penicilinu, vankomicinu a nitrofurantoinu vyloučit. Naproti tomu u tetracyklinu můžeme zvyšující se rezistenci potvrdit. Tabulka 4: Podíl kmenů citlivých k tetracyklinu (%) podle diagnózy Diagnóza Podíl kmenů citlivých k tetracyklinu (%) Zánět pochvy a vulvy 38,24 Dohled nad normálním těhotenstvím 12,5 Jiné 37,5 U diagnózy Zánět pochvy a vulvy bylo vyšetřeno 34 kmenů S. agalactiae, z toho bylo zaznamenáno 13 kmenů (38,24 %) citlivých k tetracyklinu. U diagnózy Dohled nad normálním těhotenstvím bylo vyšetřeno 8 izolátů S. agalactiae a jako citlivý byl hodnocen pouze 1 kmen (12,5 %). Od pacientek s ostatními diagnózami bylo vyšetřeno 8 kmenů, ze kterých vyšel výsledek citlivý u 3 kmenů S. agalactiae (37,5 %). Následující tři grafy lépe znázorňují poměr mezi citlivými a rezistentními kmeny v jednotlivých diagnózách při vyšetření citlivosti/ rezistence na tetracyklin: 42

43 Obrázek 24: Graf Zánět pochvy a vulvy porovnání citlivosti a rezistence na tetracyklin Obrázek 25: Graf Dohled nad normálním těhotenstvím porovnání citlivosti a rezistence na tetracyklin Obrázek 26: Graf Pacientky s jinými diagnózami porovnání citlivosti a rezistence na tetracyklin 43