Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 19 Chirální separace Enantiomery jsou molekuly, které nejsou ztotožnitelné se svými zrcadlovými obrazy. Obě zrcadlové formy mají stejné fyzikální a chemické vlastnosti, kromě smyslu rotace roviny kmitů lineárně polarizovaného světla. Nemohou být separovány žádnou dosud popsanou metodou. Enantiomery mohou být rozděleny chromatografií, pokud je systém asymetrický (tzn. chirální). Toho můžeme dosáhnout několika způsoby: a) Mobilní fáze je chirální, zatímco stacionární je achirální (běžná HPLC stacionární fáze). Do použité mobilní fáze je třeba přidat malé množství chirální látky. b) Kapalná stacionární fáze je chirální, mobilní fáze je achirální. Stacionární fáze je nanesena na pevném nosiči. c) Pevná stacionární fáze je chirální a mobilní fáze achirální. Tato metoda je jednoduchá na provedení, ale je nezbytné mít k dispozici nákladnou chirální stacionární fázi. Ve všech uvedených případech při separaci vzniká diastereomerní komplex mezi jedním a druhým enantiomerem analytu a chirálním činidlem v chromatografickém systému a ty se v koloně pohybují různou rychlostí. Například měďnaté soli aminokyselin tvoří diastereomerní komplexy: dvě vazebná místa mědi jsou obsazena molekulami solutu (viz obrázek níže). Měďnaté sloučeniny aminokyselin mohou být vázány na silikagel, jak ukazuje obrázek nebo mohou být přidány do mobilní fáze.

2 Enantiomery mohou být separovány i tradičními chromatografickými metodami, ty jsou založeny na derivatizaci solutu chirální látkou před vlastní chromatografickou separací. Jsou tedy nejprve vytvořeny diasteromery, které jsou dělitelném i v nechirálním prostředí. Separační faktor, α, je důležitým parametrem charakterizace chirálních separačních systémů: kde platí k 2 >k 1. Počet teoretických pater potřebný pro dosažení určitého rozlišení je nižší, pokud je vyšší hodnota separačního faktoru. Hodnoty α menší než 1,05 nejsou v HPLC dostačující (na rozdíl od plynové chromatografie). Na druhou stranu ani příliš vysoké hodnoty α (kolem 3 a více) nejsou žádoucí, protože dvojce píků je od sebe příliš daleko a lze těžko zjistit/potvrdit, že se jedná o enantiomery. Při vhodných podmínkách (vysoká koncentrace a specifická otáčivost) může být pro detekci využit polarimetr. Je rovněž možné využít metodu cirkulárního dichroismu pro detekci a dokonce i pro záznam CD spekter. Různými dalšími metodami se dá určit i absolutní konfigurace. Separace enantiomerů je zvláště důležitá ve farmacii a klinické analýze, protože řada léčiv je založena na asymetrických látkách. Běžné organické syntézy (nechirální) vedou k oběma formám (k racemátu), které mají rozdílné biologické účinky i farmakokinetiku. Chirální mobilní fáze Jestliže je chirální činidlo schopno vytvářet komplex, iontový pár, nebo jiný adukt s enantiomery ve vzorku, je velká šance, že budou rozdílné distribuční koeficienty diastereoisomerů mezi mobilní a stacionární fází, a tím pádem, že budou separovatelné pomocí HPLC. Výhodou této metody je, že si uživatel může vybrat z velkého množství možných chirálních činidel. Naštěstí navíc některá opticky aktivní činidla nejsou ani drahá a k předběžným testům stačí jen malé množství. Nejsou žádná omezení týkající se stacionární fáze a při výběru eluentu lze vycházet z achirální chromatografie (dvě hlavní alternativy jsou vodná a nevodná mobilní fáze). Chirální činidlo nemusí být nezbytně opticky čisté (samozřejmě separace neproběhne, bude-li činidlo racemické!) a pořadí eluce může být změněno použitím opačného enantiomeru činidla jako aditiva do mobilní fáze. Separace enantiomerů chirální mobilní fází je založena na rovnováze, která se může měnit v závislosti na koncentraci, teplotě a ph. Je vhodné tyto parametry zkoušet systematicky, aby byl separační proces optimální. Jestliže je systém výrazně citlivý na jeden parametr, musí být nalezená optimální hodnota parametru přísně dodržována.

3 Nevýhodou uvedeného přístupu je, že enantiomer je po separaci ve formě diastereomerního asociátu a disociace těchto asociátů nemusí být snadná. Za takových podmínek je preparativní separace nepoužitelná. Chirální kapalné stacionární fáze Jestliže je chirální kapalina imobilizována na povrchu pevných částic sorbentu, vzniká tak chirální systém kapalina-kapalina. Mobilní fáze musí být stacionární fází nasycena. K udržení rovnováhy roztoku je nutná konstantní teplota. Pevné chirální stacionární fáze Tato varianta chirální separace je dnes v oblasti HPLC jednoznačně nejrozšířenější. Pokud máme k dispozici kolonu s potřebnou pevnou chirální stacionární fází (CSP), stává se separace enantiomerů relativně jednodušší věcí. Naneštěstí neexistuje jediná univerzální fáze, která by byla schopna řešit všechny separační problémy a je nepravděpodobné, že bude někdy v budoucnu k dispozici. Nicméně bylo vyvinuto velké množství různých CSP a řada z nich je komerčně dostupná. Zároveň bylo publikováno hodně literatury, na jejímž základě může být zvolena vhodná stacionární fáze. Někdy můžeme určitou stacionární fázi dodatečně upravit achirální derivatizací. Nejdůležitější CSP jsou uvedeny v Tabulce níže. Jsou založeny na různých separačních principech a mohou být tříděny následovně: a) kartáčový typ (brush-type) CSP, kde jsou chirální ligandy, obvykle s π-aktivními skupinami, vázány na silikagel; b) helikální polymery, hlavně celulóza a její deriváty; c) fáze s kavitou, jako např. cyklodextriny, crown-ethery a makrocyklická glykopeptidová antibiotika; d) proteinové fáze; e) makrocyklická antibiotika f) ligand-výměnné fáze.

4

5

6

7 Kartáčový typ CSP První široce využívanou a stále velice důležitou CSP kartáčového typu byl dinitrobenzoylfenylglycin (DNBPG, první v tab. výše). Podle autora, Wiliama H. Pirkla, je často nazývána Pirklova fáze, i když by správný název měl být Pirkle I, protože to není jediná fáze uvedeného autora na trhu. DNBPG má několik vlastností, které jsou typické pro téměř všechny CSP kartáčového typu. Má dvě amidové skupiny, které jsou rigidní (planární). Tím pádem budou všechny chirální skupiny preferenčně zaujímat jen omezený počet prostorových konfigurací, což je pro chirální rozpoznávání důležitá skutečnost. Amidová skupina je schopna vazby i přes interakce typu dipól-dipól a s vhodnými molekulami vytváří i vazby vodíkovým můstkem. Dinitrobenzoylová skupina je π-akceptor (kruh je slabě elektrodeficitní) a bude upřednostňovat interakce s π-donory, jakými jsou aniliny, fenoly, chlorbenzeny a naftaleny. Tato interakce je považována za nejdůležitější a prakticky není možné separovat enantiomery, které tyto skupiny nemají. Z tohoto důvodu jsou oblíbené achirální derivatizace aminů a amino kyselin na naftalamidy, alkoholů na naftyl karbamáty a karboxylových kyselin na anilidy. Obvykle je derivatizace jednoduchá a zlepšuje detekovatelnost, protože nové části molekuly intenzivně absorbují UV záření. DNBPG stacionární fáze je levná a dostupná v obou enantiomerních formách. Tato skutečnost může být důležitá pro stopovou analýzu, kdy by měl být menší pík eluován před větším sousedním píkem a nebo v preparativní HPLC, kdy je první pík lépe izolovatelný v čisté formě a druhý je znečištěn píkem předcházejícím. Obrázek níže je dobrým příkladem úspěšné aplikace DNBPG silikagelu pro separaci (D, L)- propranololu (jako oxazolidonového derivátu) v krvi. Podobně jsou používány i jiné CSP kartáčového typu: dinitrobenzoylleucin, naftylalanin, naftylleucin, chrysanthenoyl-fenylglycin, naftylethylmočovina. Všechny mají svou specifitu pro určitou skupinu látek, ačkoli je obtížné ji předvídat. Pro představu o jejich individuálních vlastnostech je vhodné nahlédnout do literatury nebo do materiálů výrobce. CSP kartáčového typu jsou robustní a dovolují nastřikovat velké množství vzorku. Helikální polymery Nederivatizovaná mikrokrystalycká celulóza je jen málo účinná při HPLC separaci enantiomerů, nicméně její deriváty jsou velmi dobře použitelné jako CSP. Triacetyl celulóza je dostupná ve formě pevného materiálu (takto je i poměrně levná), ale i nanesená na silikagelu. Jinými deriváty jsou tribenzoát, trisfenylkarbamát, trisdimethylfenylkarbamát, trischlorofenylkarbamát, tristoluát a derivát kyseliny skořicové. Fáze jsou poměrně drahé a v porovnání s kartáčovými CSP i méně robustní, ale jsou schopny separovat největší množství různých druhů enantiomerů. Jejich záběr se dá dále zvětšit pomocí derivátu poly(trifenylmetakrylátu), kde je nahrazena jedna fenylová skupina pyridylovou a nebo pomocí derivátů amylózy. Mechanismus separace a retence je složitý a dosud nebyl plně vysvětlen. Helikální polymery jsou velice dobré pro separaci zkroucených (twisted) molekul se symetrií D 2d (ačkoli může být rozlišeno i velké množství plochých analytů).

8 Fáze s kavitou Existují tři třídy používaných cyklických chirálních selektorů: cyklodextriny, crown ethery a makrocyklická glykopeptidová antibiotika. S malými molekulami, které dokáží vstoupit do jejich cyklické struktury, mohou tvořit host-guest komplexy. Pro enantioselektivní komplexaci musí být komplexace s cyklem řízena stereochemicky. Cyklodextriny jsou oligosacharidy složené ze šesti, sedmi nebo osmi glukózových jednotek. V tabulce výše je ukázán β-cyklodextrin, který je heptamerem a je nejpoužívanější. α- cyklodextriny mají šest jednotek glukózy a γ-cyklodextriny osm. Glukóza je sama o sobě chirální a v molekule cyklodextrinu, která má tvar komolého kuželu, jsou primární (na menším obvodu kuželu) a sekundární (na širším okraji kuželu) hydroxylové skupiny chirálními vazebnými místy, která se zdají být nezbytná pro enantioselektivitu. Tyto skupiny mohou být rovněž derivatizovány (např. acetylací). Cyklodextriny bývají používány v režimu reverzních fází (to znamená s velmi polární mobilní fází). Mohou separovat mnoho různých enantiomerů, ale je obtížné předvídat jejich použitelnost pro určitý konkrétní případ. Chirální crown ethery typu 18-crown-6 mohou rozlišit aminokyseliny a stejně dobře i primární aminy s aminoskupinou v blízkosti centra asymetrie. Interakci zprostředkovává proton aminoskupiny a kyslíky crown etheru. Skupiny R a R na crown etheru musí být velké a rigidní (binaftyly), aby vnutily správný přístup/geometrii malé guest molekuly pro interakci s host crown etherem. Makrocyklická antibiotika, jako je vancomycin nebo teicoplanin, jsou velké molekuly s několika peptidovými kruhovými skupinami (vedle množství fenylových cyklů). Navíc jsou glykosylované. Mohou být použity v módu normálním i reverzním. Proteiny V biochemii je dobře známo, že obzvlášť enzymy, ale i transportní proteiny, jakým je např. albumin, vykazují při svých interakcích vysokou enantioselektivitu s malými chirálními molekulami. Proteiny je možné navázat na silikagel a získat samostatnou třídu CPS. Připravené fáze jsou využitelné zejména při analýze chirálních léčiv. Několik proteinových fází je dostupných komerčně: albuminy, α-kyselý glykoprotein, ovomucoid, avidin, cellobiohydroláza I a pepsin. Liší se ve svých enantioselektivních vlastnostech, což není překvapující, protože se diametrálně odlišují ve své biologické funkci, velikosti, tvaru nebo izoelektrickém bodě. Proteinové fáze jsou finančně nákladné, citlivé na manipulaci a jejich účinnost (počet pater) i možné zatížení při nástřiku vzorku jsou malé. V jistých aplikacích jsou ale jejich nedostatky vyváženy excelentní enantioselektivitou.

9 Makrocyklická antibiotika Důležitou skupinou CSPs představují imobilizovaná makrocyklická antiobiotika jako např. vankomycin, teikoplanin, ristocetin A, teikoplanin aglykon. Nachází velmi široké uplatnění a jsou použitelná v různých typech mobilních fází od polárního iontového modu, přes RP a polárně-organický mod až k normálnímu modu. V různých mobilních fázích poskytují odlišnou selektivitu. Ligand-výměnné fáze Aminokyseliny zakotvené na silikagelu společně s Cu 2+ ionty mohou stereoselektivně interagovat s dalšími aminokyselinami ve vodném prostředí. Ionty mědi poskytují s vázanou aminokyselinou i aminokyselinou vzorku komplex. Ligand-výměnné fáze jsou vhodné pro separaci aminokyselin a také β-aminoalkoholů a jiných podobných molekul, protože tyto látky nesou dvě polární funkční skupiny v odpovídající vzdálenosti. Tento princip chirálního dělení je jen omezeně používán z důvodu nižší účinností kolon, problematické detekce nederivatizovaného analytu a rovněž může být překážkou také přítomnost mědi v mobilní fázi. Jestliže nemůže být daná separace vyřešena pomocí žádné dostupné komerční fáze, je jednou z možností laboratorní syntéza specifických polymerů s otiskem chirální molekuly, tzv. vtištěných polymerů (chiral molecul imprinted polymer, MIP). Nepřímé separace enantiomerů Jestliže jsou enantiomery derivatizovány chirálním, opticky čistým činidlem, vzniká pár diastereomerů. Diastereomery jsou molekuly s více než jedním centrem asymetrie, které se liší ve fyzikálních vlastnostech. Ze schématu níže je zcela jasné, že navzájem nejsou svými zrcadlovými obrazy. Diastereoisomery jsou separovatelné na klasických achirálních kolonách, ale v každém případě musí být pečlivě vybráno derivatizační činidlo. Velice důležitým faktorem je dokonalá optická čistota činidla. V opačném případě by produktem derivatizace byla směs čtyř diastereoisomerů (dva páry enantiomerů). Enantiomery navzájem separovatelné na achirálním systému nejsou a tudíž by celé měření poskytlo chybné výsledky (Tabulka dole). Čistota optrického aditiva Maximálně detekovatelná optická čistota vzorku 99,95 % 99,9%

10 99,5 % 99,0% 98 % 96,0% Dalším důležitým jevem, kterému musí být zabráněno, je racemizace směsi během derivatizace. Samotnou separaci rovněž může komplikovat nutnost použití přebytku činidla při derivatizaci. Pokud přebytečné činidlo nemůže být odstraněno před nástřikem, může se na chromatogramu objevit interferující pík. K derivatizaci jsou upřednostňovány skupiny, které jsou v blízkosti asymetrického centra. Větší vzdálenost center může vést k nerozlišeným diastereomerům. Pokud je to možné, měla by být vyzkoušena tvorba amidů, karbamátů, derivátů močoviny. Všechny uvedené třídy látek mají relativně rigidní strukturu (v porovnání např. s estery), což může usnadnit chirální separaci. Pokud máme možnost volby, měl by jeden z reakčních izomerů dovolit, aby byl menšinový enantiomer eluován jako první. Tak se nemůže stát, že bude malý pík maskován chvostováním píku většího. Diastereomery se mohou lišit detekovaným signálem. V kvantitativní analýze je nezbytné zjistit kalibrační závislost. Nepřímá separace bývá upřednostňována pro vzorky biologického původu. Separace žádaného píku od interferencí je v případě nepřímé metody jednodušší. Analýza je prováděna na silikagelu (s nevodnými vzorky) nebo na C 18 reverzní fázi (s biologickými vzorky), jak je prezentováno níže na obrázku.