POROVNÁNÍ ÚÈINNOSTI MEZENCHYMÁLNÍCH STROMÁLNÍCH BUNÌK ODVOZENÝCH Z AMNIONU A KOSTNÍ DØENÌ V LÉÈBÌ PORANÌNÍ VAZÙ A ŠLACH U KONÍ

Transkript

1 VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC POROVNÁNÍ ÚÈINNOSTI MEZENCHYMÁLNÍCH STROMÁLNÍCH BUNÌK ODVOZENÝCH Z AMNIONU A KOSTNÍ DØENÌ V LÉÈBÌ PORANÌNÍ VAZÙ A ŠLACH U KONÍ INVESTIGATING THE EFFICACY OF AMNION-DERIVED COMPARED WITH BONE MARROW-DERIVED MESENCHYMAL STROMAL CELLS IN EQUINE TENDON AND LIGAMENT INJURIES ANNA LANGE-CONSIGLIO, STEFANO TASSAN, BRUNA CORRADETTI, AURORA MEUCCI, ROBERTA PEREGO, DAVIDE BIZZARO A FAUSTO CREMONESI SOUHRN Toto je první studie porovnávající ošetøení poranìných šlach a vazù koní pomocí mezenchymálních stromálních bunìk (MSCs) získaných ze dvou rùzných zdrojù: amniové membrány (AMSCs) a kostní døenì (BM-MSCs). Cílem této studie bylo prokázat pøíznivý efekt AMSCs injikovaných in vivo. Pìt milionù alogenních rozmrazených AMSCs nebo autologních èerstvých BM-MSCs bylo injikováno pøímo do léze u koní patøících do skupiny A ( koní) nebo B ( koní). Interval od poranìní po implantaci bunìk byl dní pro AMSCs a dní pro BM-MSCs. Hojení lézí bylo hodnoceno klinicky a ultrazvukem. Konì byli sledováni po dobu dalších let od návratu k plné práci. U žádného ze studovaných koní nezávisle na typu implantovaných stromálních bunìk nebyly pozorovány žádné signifikantní nežádoucí úèinky po léèbì MSCs. Všechna zvíøata patøící do skupiny A se vrátila k pøedchozím aktivitám za mìsícù po léèbì, zatímco zvíøata ze skupiny B za mìsícù. Míra opìtovného poranìní koní léèených AMSCs byla nižší (, %) ve srovnání s prùmìrem pozorovaným u koní léèených BM-MSCs (,8 %). Možnost aplikovat alogenní AMSCs v optimální dobì, døíve než se v poranìné šlaše/vazu objeví jakákoli ultrasonografická zmìna, spolu s vyšší plasticitou a proliferaèní kapacitou tìchto bunìk ve srovnání s BM-MSCs, pøedstavují hlavní dùvody zájmu o tento nový léèebný pøístup. Zøetelné aktivní proliferativní hojení v oblasti injekce AMSCs èiní tyto buòky úèinnìjšími než BM-MSCs. Klíèová slova: amniové mezenchymální buòky, mezenchymální buòky kostní døenì, kùò, recidiva poranìní, onemocnìní šlach SUMMARY Background aims. This is the first study to compare the treatment of horse tendon and ligament injuries with the use of mesenchymal stromal cells (MSCs) obtained from two different sources: amniotic membrane (AMSCs) and bone marrow (BM-MSCs). The objective was to prove the ability of AMSCs to exert beneficial effects in vivo. Methods. Five million allogeneic frozen-thawed AMSCs or autologous fresh BM-MSCs were injected intralesionally in horses belonging to group A ( horses) and group B ( horses). The interval lesion/implantation was of e days for the AMSCs and e days for the BM-MSCs. Healing was assessed clinically and ultrasonographically. Follow-up was monitored for further years from return to full work. Results. No significant adverse effects after MSCs treatment were seen in any of the horses studied, independent of the type of stromal cell implanted. All animals belonging to group A resumed their activities between e months after treatment, whereas animals of group B resumed their activities after e months. The rate of re-injury in horses treated with AMSCs is lower (.%) compared with the average observed when horses were treated with BM-MSCs (.8%). Conclusions. The possibility to inject allogeneic AMSCs in real time, before any ultrasonographic change occurs within the injured tendon and ligament, together with the higher plasticity and proliferative capacity of these cells compared with BM-MSCs, represents the main features of interest for this novel approach for the treatment of equine tendon diseases. An obvious active proliferative healing in the area injected with AMSCs makes these cells more effective than BM-MSCs. Key words: amniotic mesenchymal cells, bone marrow mesenchymal cells, equine, re-injury, tendon disease

2 Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Úvod Použití kmenových bunìk ve veterinární praxi je zamìøeno na léèbu ortopedických nemocí, a to zejména u koní. Mezenchymální kmenové buòky (MSCs) byly zatím použity zejména experimentálnì a pouze v omezeném poètu klinických studií pro chirurgickou léèbu subchondrálních kostních cyst, reparaci zlomenin kostí (Kraus a Kirker-Head, ) a poškození chrupavek (Brehm et al., ; Wilke et al., ). Nejèastìji popsané použití MSCs v koòské medicínì je léèba sportem zpùsobeného zranìní šlachy povrchového ohýbaèe prstù (superficial digital flexor tendon SDFT; latinsky: tendo musculi flexoris digitalis supeficialis) a léze závìsného vazu (suspensory ligament SL; latinsky: ligamentum suspensorium). Tyto dvì struktury spolu z biomechanického hlediska vzájemnì korelují a pøedstavují nejèastìji postižené mìkké tkánì u sportovnì využívaných koní. Šlachy a vazy se po zranìní hojí pomalu a jen zøídka získají svou pùvodní elasticitu a pružnost. Suboptimální léèení, prodloužená doba rehabilitace a vysoký výskyt recidivy komplikují úspìšnou léèbu tìchto poranìní. Prognóza bývá pro pacienty s poranìním šlachy nebo poškozením kloubu èasto špatná. Kromì krátké akutní zánìtlivé fáze procesu hojení dominuje fibroplazie a hojení mùže být považováno spíše za substituci než regeneraci, protože bìhem této reparace se tvoøí hypercelulární tkáò s nedostateènì organizovanou extracelulární matrix, která pøechází v jizvu. Ve srovnání s pùvodní šlachou je u takto zhojené šlachy zvýšená ztuhlost a snížená elasticita (Richardson et al., ). Standardní léèba je konzervativní a šlachy vyžadují dlouhou dobu hojení s vysokým rizikem recidivy zranìní po návratu koní do sportovní zátìže. V posledním desetiletí se zamìøení lékaøské vìdy pøesunulo od reparace k regeneraci. Proto se výzkum léèby poranìní šlach z dùvodu dosažení normální nebo témìø normální struktury a funkce zranìného orgánu zamìøil na regenerativní medicínu. Regenerativní medicína, vèetnì tkáòového inženýrství, vyžaduje vnìjší zdroj bunìk. Tento pøístup vychází z poznání, že vìtšina tkání má subpopulaci tkáòovì specifických progenitorových bunìk, které pøirozenì využívá k obmìnì svých bunìk a jako pomoc pøi reparaci po zranìní (da Silva Meirelles et al., ). Pro použití v regenerativní medicínì lze v souèasné dobì vybírat z nìkolika zdrojù bunìk, i když stále ještì není jasné, které z nich je možné považovat za terapeuticky optimální. Pro efektivní terapii šlach a vazù se zdají být nejslibnìjší MSCs izolované z kostní døenì (BM) a tuku, nicménì v poslední dobì byly nalezeny i jiné zdroje kmenových bunìk potenciálnì využitelné pro stejný úèel. Mezi tyto zdroje patøí extrafetální kmenové buòky, které mohou být snadno získány pøi narození a uloženy pro budoucí použití (Lange-Consiglio et al., ; Cremonesiet al., ) a embryonální nebo fetální kmenové buòky (Guest et al., ; Watts et al., ). Pøestože BM-MSCs pøedstavují nejvíce zkoumané buòky pro použití ve veterinární regenerativní medicínì, je dùležité zdùraznit, že tyto buòky mají omezený proliferaèní potenciál in vitro (pøibližnì dní od izolace k implantaci). Zpoždìní týdny z dùvodu získání dostateèného množství bunìk potøebných k léèbì pøedstavuje limitující faktor pro použití autologních (vlastních) BM-MSCs (Guest et al., ). Již døíve jsme prokázali, že implantované alogenní (dárcovské) ekvinní mezenchymální stromální buòky získané z amnionu (AMSCs) jsou koòmi dobøe tolerovány (Lange-Consiglio et al., ). Proto cílem této studie bylo porovnat úèinnost léèby poranìných šlach s použitím AMSCs a BM-MSCs. Metodika Pokusná zvíøata BM-MSCs použité pro tuto studii byly odebírány od dospìlých koní rùzného vìku a pohlaví. Amniotické membrány byly získávány pøi porodu. Všechny odbìry byly provádìny podle schváleného protokolu institucionální etické komise a s písemným souhlasem majitele. Izolace a kultivace AMSCs a BM-MSCs Izolace AMSCs byla provedena podle Lange-Consiglio a kol. (). Zkrácenì, kousky amnionu byly inkubovány po dobu 9 minut pøi teplotì C v roztoku PBS s, U/ml dispázy (Becton Dickinson, Milán, Itálie). Dále byly ponechány min pøi pokojové teplotì v médiu HG-DMEM (Euroclone, Milán, Itálie), doplnìném % tepelnì inaktivovaného fetálního hovìzí séra (FBS; Sigma Chemical, Milán, Itálie) a mmol/l L-glutaminu (Sigma). Fragmenty byly dále štìpeny kolagenázou typu I (Sigma) a DNAzou (Roche, Mannheim, Nìmecko) po dobu pøibližnì hodin pøi C. Fragmenty amnionu pak byly odstranìny a buòky byly pøed centrifugací pøi g po dobu minut prosety pøes mm bunìèné sítko (Sigma). Pøed vysetím primární kultury (P) byly získané stromální buòky obarveny trypanovou modøí (Sigma) a spoèítány v Bürkerovì komùrce. AMSCs byly vysety v hustotì bunìk/cm v HG- -DMEM doplnìném % FBS, UI/ml penicilinu mg/ml streptomycinu (Euroclone),, mg/ml amfotericinu B (Euroclone), mmol/l L-glutaminu (Sigma) a ng/ml epidermálního rùstového faktoru (Sigma) a inkubovány pøi teplotì 8, C ve zvlhèené atmosféøe (9 %) s % CO. Jak jsme prokázali již døíve (Lange-Consiglio et al., ), AMSCs mají schopnost diferencovat in vitro do mezodermální a ektodermální linie. AMSCs byly zmrazeny na. pasáži (P) v HG-DMEM s % FBS a % dimetyl sulfoxidu (Sigma) a po dobu minimálnì mìsícù uchovány v kapalném dusíku. Podle Lange-Consiglio a kol. () mohou být koòské AMSCs zmrazeny a rozmrazeny bez ztráty své funkèní integrity, morfologie, pøítomnosti specifických markerù kmenových bunìk a diferenciaèní schopnosti, i když jejich schopnost dìlit se byla mírnì nižší než u èerstvì izolovaných bunìk (doubling time doba potøebná pro zdvojnásobení populace byla, dne pro èerstvé AMSCs a,88 dne pro kryokonzervované AMSCs). Imunocytochemické studie provedené na. pasáži (P) ukázaly (Lange-Consiglio et al., ), že AMSCs byly pozitivní pro specifické embryonální markery (TRA--, SSEA-, SSEA- a Oct-). Pozitivní exprese mezenchymálních markerù (CD9, CD, CD a CD) byla prokázána reverzní transkriptázovou polymerázovou øetìzovou reakcí v P a P. Marker CD byl negativní v P, avšak 8

3 VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC zaèal být exprimován v P. Buòky exprimovaly také hlavní histokompatibilní komplex (MHC)-I na obou pasážích P i P a na obou pasážích jim chybìla exprese MHC-II. Pro získání BM-MSCs bylo do injekèních støíkaèek, které obsahovaly UI/ml heparinu (Schwarz Pharma SpA, Milán, Itálie), odebráno pomocí Jamshidiho bioptické jehly (Biopsybell, Modena, Itálie) pøibližnì ml kostní døenì z hrudní kosti každého zranìného konì. Vzorky byly skladovány pøi teplotì C a zpracovány bìhem nìkolika hodin po odbìru centrifugací pøi g po dobu minut. Po centrifugaci byl odstranìn supernatant a byla odebrána vrstva mononukleárních bunìk (buffy layer), která byla dvakrát promyta v PBS. Získané mononukleární buòky byly pøed výsevem primární kultury (P) obarveny trypanovou modøí a spoèítány v Bürkerovì komùrce. Expanze probíhala za stejných podmínek a ve stejném médiu jako u AMSCs. Pro každý vzorek BM-MSCs byla provedena studie doby potøebné pro zdvojnásobení populace (Lange- -Consiglio et al., ). V pøedchozí studii (Lovati et al., ) jsme charakterizovali BM-MSCs, které exprimovaly mezenchymální marker CD, adhezivní molekuly CD9 a CD a byly negativní pro hematopoetický marker CD. Kromì toho byly tyto buòky pozitivní pro MHC-I a negativní pro MHC-II. Imunocytochemická analýza ukázala, že BM- -MSCs exprimují Oct- a SSEA- a byly slabì pozitivní pro TRA--. Navíc BM-MSCs diferencovaly do osteogenní, adipogenní a chondrogenní linie. Transplantace bunìk in vivo Klinický nález (pøítomnost nebo nepøítomnost kulhání, bolest, otoky) a ultrazvukové vyšetøení (Medison Sonovet Pico, Miami, FL, USA) byly vyhodnoceny vždy stejným veterinárním lékaøem u devadesáti dvou sportovních koní s poranìnou šlachou. Všechny léze byly dokumentovány ultrasonograficky jak transverzálnì, tak longitudálnì. Léze byly podle kvantitativního ohodnocení rozdìleny do šesti kategorií (Rantanen, ). Aby mohl být kùò Tab. : Specifikace koní a klinické aspekty úrazù u zvíøat ve skupinì A léèených amniovými stromálními buòkami (AMSCs). Pøípad Kulhavost Otok Zesílení Poèet koní (celkem = ) Vìk koní (v letech) Poškozená struktura Konèetina Ano Ne Ano Ne Ano Ne Mírné léze Tìžké léze Parkur 9 8 SL, SDFT DDFT f Drezúra SL, 9 SDFT h, f Všestrannost 8 SDFT f Klusácké 8 SL, SDFT h, f Rovinné DDFT, SDFT f SL, suspensory ligament závìsný vaz, SDFT, superficial digital flexor tendon šlacha povrchového ohýbaèe prstù, DDFT, deep digital flexor tendon šlacha hlubokého ohýbaèe prstù, p pøední konèetina, z zadní konèetina Tab. : Specifikace koní a klinické aspekty úrazù u zvíøat ve skupinì B léèených mezenchymálními buòkami z kostní døenì (BM-MSCs). Kulhavost Otok Zesílení Poèet koní (celkem = ) Vìk koní (v letech) Poškozená struktura Konèetina Ano Ne Ano Ne Ano Ne Mírné léze Tìžké léze Parkur 9 SL, 9 SDFT DDFT f Drezúra 8 SL, 8 SDFT h, f Všestrannost 8 SDFT f Klusácké SL, SDFT h, f Rovinné 8 DDFT, SDFT 8 f SL, suspensory ligament závìsný vaz, SDFT, superficial digital flexor tendon šlacha povrchového ohýbaèe prstù, DDFT, deep digital flexor tendon šlacha hlubokého ohýbaèe prstù, p pøední konèetina, z zadní konèetina 9

4 Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Poèet zvíøat 8 8 Skupina A: AMSCs DDFT SDFT SL Rovinné Poèet zvíøat 8 8 Skupina B: BM-MSCs DDFT SDFT SL Rovinné Parkur Drezúra Všestrannost Klusácké Parkur Drezúra Všestrannost Klusácké Obr. : Distribuce podle disciplíny a poranìní šlach/vazù ve skupinách ošetøených buòkami odvozenými z amnionu a kostní døenì. SL, suspensory ligament závìsný vaz, SDFT, superficial digital flexor tendon šlacha povrchového ohýbaèe prstù, DDFT, deep digital flexor tendon šlacha hlubokého ohýbaèe prstù zahrnut do léèby pomocí MCSs, musel mít nový, jednostranný akutní úraz a ultrazvukem detekovatelnou hypoechogenní lézi zaøazenou v kategorii. Kategorie byly oznaèeny jako mírná (stupeò ), støednì tìžká (stupeò ) a tìžká (stupeò ). Pro úèely této studie byli konì náhodnì rozdìleni do dvou skupin; koní (skupina A) bylo léèeno pomocí alogenních rozmrazených AMSCs a koní (skupina B) bylo léèeno èerstvými autologními BM-MSCs. Snažili jsme se mít v každé pokusné skupinì podobný podíl koní z každé disciplíny, pro kterou byli pùvodnì využíváni bez ohledu na závažnost poranìní. Vlastnosti tìchto skupin jsou uvedeny v tabulce a. Projekt pokusu byl schválen institucionální etickou komisí a vlastníci koní dali písemný souhlas se zaøazením jejich koní do pokusu. Pod ultrazvukovou kontrolou bylo do poranìných šlach koní patøících do skupiny A nebo B injikováno v ml autologní plazmy pìt milionù alogenních rozmrazených AMSCs nebo autologních èerstvých BM-MSCs na. pasáži. Interval mezi poranìním a implantací bunìk byl dní pro AMSCs a dní pro BM-MSCs. Pøed vlastní implantací byla oholena srst a místo vpichu asepticky ošetøeno chlorhexidinem a alkoholem. V blízkosti místa vpichu bunìk bylo aplikováno lokální anestetikum (% mepivakain) a konì byli mírnì sedováni detomidinem (Pfizer Italia, Latina, Itálie). Do lézí SDFT byly buòky injikovány longitudinální technikou v proximálním až distálním smìru pomocí jehly g mm. Do všech ostatních lézí byly buòky injikovány transverzálnì jehlou g mm. Po aplikaci byly konèetiny obvázány sterilním obvazem na dobu 8 hodin a konì dny odpoèívali v boxu. Dalších dní byli konì vodìni na ruce každý den minut a následnì minut po dobu dalších dní. Koním nebyly podávány žádné nesteroidní protizánìtlivé léky (NSAID) ani antibiotika. Bìhem rekonvalescence a rehabilitace byli konì vyšetøeni klinicky a ultrazvukem v pøibližnì mìsíèních intervalech po dobu mìsícù. Další informace byly získány po letech od návratu koní do tréninku, pøípadnì døíve, pokud došlo k recidivì zranìní. Prezentujeme výsledky u koní, kteøí se vrátili ke svému døívìjšímu sportovnímu využití. Statistická analýza Pro hodnocení rozdílù v míøe opakovaných zranìní u koní ošetøených AMSCs nebo BM-MSCs byl použit Pearsonùv test. Hodnoty p <, byly považovány za signifikantní. Výsledky Kultivace BM-MSCs Každému koni bylo odebráno pøibližnì 8 ml kostní døenì a z každého vzorku bylo získáno asi mononukleárních bunìk. Vzorky s MSCs byly kultivovány pøibližnì dní, dokud nedosáhly konfluence. Z každého vzorku bylo získáno v prùmìru 8 bunìk, s maximem a minimem,. Doba populaèního zdvojení pro BM-MSC byla, ±, dne. In vivo výsledky Tabulky a a obrázek ukazují údaje vztahující se ke zvíøatùm použitým v této studii; 9, % (/) koní ze skupiny A a 8,8 % (/) koní ze skupiny B mìlo zranìní šlachy na hrudní konèetinì. Nebyly pozorovány žádné signifikantní rozdíly (p =,) mezi tìmito dvìma skupinami (obr. ). Celkem, % (/) pacientù ze skupiny A, a, % (/) pacientù ze skupiny B mìlo poranìní SDFT, bez signifikantních rozdílù (p =,) mezi tìmito dvìma skupinami. Další procenta byla rozdìlena mezi zranìní SL (, % a, % ve skupinì A a B, resp.) a šlachy hlubokého ohýbaèe prstu (DDFT;,88 % a, % ve skupinì A a B, resp.). Celkem,9 % (/) koní ze skupiny A a,9 % (9/) koní ze skupiny B kulhalo, bez signifikantního

5 VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC % recidivy zranìní Skupina A: AMSCs Skupina B: BM-SCs Parkur Drezúra Všestrannost Klusácké Rovinné Prùmìr Obr. : Podíl koní, u kterých se vyskyt la recidiva zranìní po návratu ke døívìjšímu sportovnímu využití, vztažené ke skupinì a disciplínì. = statisticky významný rozdíl mezi skupinami. rozdílu (p =,) mezi tìmito dvìma skupinami. Ve skupinì A vykazovalo mírný otok struktur v oblasti léze 8, % (/) pacientù a ve skupinì B, % (/) pacientù. Vìtšinou byl viditelný mírný difuzní edém bez signifikantního rozdílu (p =,) mezi tìmito dvìma skupinami. Celkem 8, % (/) koní ze skupiny A a, % (/) koní ze skupiny B vykazovalo zesílení postižené oblasti v dùsledku zánìtlivé reakce bez významného rozdílu (p = ) mezi tìmito dvìma skupinami. Ve skupinì A mìlo závažnou SDFT lézi, % (/) koní, ve skupinì B, % (/), tedy bez významného rozdílu (p =,8) mezi tìmito dvìma skupinami. V obou skupinách mìlo % koní (/ ve skupinì A a / ve skupinì B) tìžkou lézi SL. V obou skupinách byly léze DDFT charakterizovány jako mírné (tøi ve skupinì A a dvì ve skupinì B). Na základì údajù získaných pro každou popsanou vlastnost mohou být obì skupiny považovány za podobné. Následné informace o prùbìhu léèby byly k dispozici pro všechny léèené konì. Alogennì transplantované AMSCs koním ze skupiny A byly dobøe tolerovány. Po transplantaci nebyla pozorována ani bolestivost, ani zánìty. Pacienti byli schopni chùze a ostrého obratu brzy po aplikaci, pøièemž je nutno vzít v úvahu, že nebyla aplikována žádná NSAID. U ošetøených koní byla nìkolik dní po implantaci bunìk pozorována redukce kulhání spolu s patrnou redukcí objemu a sníženou bolestivostí pøi palpaci. Všechna zvíøata, která patøila do skupiny A, obnovila svou døívìjší aktivitu za mìsícù po aplikaci bunìk s výjimkou jednoho parkurového konì, který uhynul v dùsledku støevní koliky mìsíce po implantaci AMSCs. Dva drezurní konì se opìtovnì zranili, když se vrátili na svou bývalou sportovní úroveò. Tito tøi konì mìli zranìní SDFT. Dva roky po transplantaci bunìk byl prùmìrný výskyt recidivy zranìní u koní léèených AMSCs, %, pouze u drezurních koní byl tento výskyt èastìjší,,9 % (tab., obr. ). Nebyla zjištìna statisticky významná korelace mezi vìkem a opìtovným zranìním (r =,; p =,), ale byla zjištìna korelace (r =,; p =,) mezi opìtovným zranìním a sportovními disciplínami, pro které Tab. : Výskyt opìtovných zranìní u koní, kteøí se vrátili ke svému døívìjšímu sportovnímu využití, vztažené k použitému typu bunìk a disciplínì. Skupina A (celkem = ) Skupina B (celkem = 9) Poèet koní (%) Poškozená struktura Poèet koní (%) Poškozená struktura Parkur Drezúra Všestrannost / (,) / (,) / (,9) tìžká SDFT /9 (,) / (,) / (,) mírná SL tìžká SDFT mírná SDFT tìžká SDFT tìžká SL tìžká SDFT Klusácké / (,) / (,) Rovinné / (,) /8 (,) tìžká SDFT SL, suspensory ligament závìsný vaz, SDFT, superficial digital flexor tendon šlacha povrchového ohýbaèe prstù, DDFT, deep digital flexor tendon šlacha hlubokého ohýbaèe prstù

6 Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Tab. : Výskyt recidivy zranìní podle disciplíny. Celkový poèet koní Poèet koní s recidivou zranìní Procento výskytu recidivy zranìní (%) Parkur 8,8 Drezúra,9 Všestrannost 9, Klusácké 8, Rovinné, byli konì pùvodnì využíváni. K opakovaným zranìním docházelo èastìji u rovinných dostihových plnokrevníkù a u drezurních koní (tab. ). Porovnáme-li ultrazvukový nález dvou pøípadù tìžkých poranìní stejné šlachy (akutní èásteèná ruptura SDFT) léèených v podobném èasovém intervalu buï autologními BM-MSCs (pøípad ), nebo alogenními AMSCs (pøípad ), zdá se, že v druhém pøípadì mùžeme sonograficky pozorovat aktivnìjší vývoj hojení v mírnì kratší dobì, a to i pøesto, že ve druhém pøípadì došlo k narušení svazkù vláken a podélné architektury šlachy (obr. ). Diskuse Injekce autologních BM-MSCs do léze jsou hojnì využívány pøi léèbì poranìných šlach. Tento postup je zdlouhavý, protože je úzce spojen s expanzí bunìk in vitro, která vyžaduje tøítýdenní období kultivace (Fortier a Smith, 8). V tomto èasovém intervalu se uvnitø šlachy objevují ultrastrukturální zmìny, které pøedstavují limitující faktor pro úèinnou regeneraci a disponují poranìnou šlachu k opakovanému zranìní. Od odbìru BM od poranìného konì po injekci bunìk do šlachových lézí je tøeba pøibližnì dnù. Vzhledem k tomu, že cílem léèebné terapie je obnovit normální strukturální architekturu a biomechanickou funkci poškozené tkánì šlachy, je dùležité implantovat buòky brzy po akutní zánìtlivé fázi ještì pøed migrací fibroblastù a následnou formací fibrózní tkánì (v praxi to znamená implantovat buòky do šlachy do tøí týdnù od úrazu). Z tohoto dùvodu je v nìkterých studiích preferována jednokroková izolace BM-MSCs, která se vyhýbá laboratorním manipulacím s buòkami, které mohou omezit a limitovat proliferaèní a funkèní kapacity BM-MSCs po prodloužené kultivaci, což mùže vést ke snížení léèebného potenciálu (Koch et al., 9). Rostoucí poèet chirurgù dává pøednost injekci tohoto koncentrátu kostní døenì (Crovace et al., ), protože umožòuje aplikaci relativnì malého množství kmenových bunìk a produkci bunìèné zásoby s minimální bunìènou manipulací bez rizika bunìèné transformace bìhem rùstu in vitro. Avšak prekurzory kostních a tukových bunìk obsažených v kostní døeni mohou mít negativní dopad na léèbu aktivací tvorby dystrofické mineralizace nebo metaplazie v místì vpichu. Dalším zdrojem MSCs komerènì využívaným u lidí a zvíøat je tuková tkáò (Vidal et al., ; Del Bue et al., 8; Martinello et al., ; Jezierska-Wozniak et al., ). Rychlý a úspìšný odbìr tukových MSCs lipektomií (kùò) (Vidal et al., ) nebo odbìrem viscerálního tuku pøi ovariohysterektomii (pes) (Martinello et al., ) následovaný enzymatickým štìpením èiní tuto tkáò slibným zdrojem pro klinické aplikace. Tukové MSCs vykazují vyšší proliferaèní potenciál a nižší stupeò senescence ve srovnání s MSCs z jiných zdrojù (Wagner et al., ; Colleoni et al., 9; Vidal a Lopez, ). Nìkteré studie uvádìjí dobrý diferenciaèní potenciál do mezodermálních tkáòových linií (Martinello et al., ; Jezierska-Wozniak et al., ), zatímco jiné skupiny pozorovaly omezený chondrogenní a osteogenní potenciál u potkanù nebo koní (Yoshimura Pøípad Pøípad Obr. : Pøípad byl ošetøen BM-MSCs. Pøíèný a podélný ultrazvukový nález v dobì aplikace bunìk dní po zranìní (A, B) a za 8 dní (C, D). Pøípad byl ošetøen AMSCs. Pøíèný a podélný ultrazvukový nález v dobì aplikace bunìk dní po zranìní (E, F) a za dní (G, H). Bez ohledu na ponìkud kratší periodu ( dní 8 dní) a tìžší lézi ve srovnání s pøípadem je v pøípadì patrný aktivnìjší vývoj reparace.

7 VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC et al., ; Vidal et al., 8). Nicménì odbìr této tkánì je u koní invazivní. Abychom pøekonali omezení kostní døenì a tukové tkánì, byla jako atraktivní alternativní zdroj progenitorových bunìk navržena extrafetální tkáò, která otevírá nové perspektivy v oblasti regenerativní medicíny. Mezi extrafetální zdroje MSCs, které lze odebírat neinvazivní metodou, patøí pupeèní šòùra (tkáò i krev) a amnion. MSCs izolované z pupeèníkové tkánì pøedstavují heterogenní, a tedy rychle proliferující bunìèné populace, které musí být izolovány napøíklad proséváním (Corradetti et al., ). Dosud nebyly tyto buòky u koní klinicky použity k léèbì šlachových onemocnìní, avšak Carrade a kol. () injikovali autologní a alogenní ekvinní MSCs odvozené buï z tkánì pupeèní šòùry, nebo z pupeèníkové krve do zdravých kloubù, aby otestovali imunologické vlastnosti tìchto bunìk. Jejich údaje naznaèují, že neexistují rozdíly v typu nebo stupni zánìtu vyvolaného podáním bunìk odvozených ze stejného nebo jiného jedince. Kromì toho byl zánìt klinicky mírný a nebyl spojen s poruchami chùze nebo sebeomezením, což nám umožòuje dospìt k závìru, že MSCs odvozené z extrafetální tkánì nevyvolávají žádnou hyperakutní nebo akutní (MHC-zprostøedkovanou) imunitní odpovìï. Již døíve jsme popsali proliferaèní a diferenciaèní potenciál bunìk odvozených z amnionu koní a první terapeutickou aplikaci tìchto bunìk pøi poranìní šlach (Lange-Consiglio et al., ). V této studii, stejnì jako v té pøedchozí, ultrasonografické vyšetøení ukázalo podobnou strukturu šlach a vazù jako po ošetøení autologními BM-MSCs. Porovnáním této inovativní terapie s konvenèní léèbou pomocí BM-MSCs jsme zjistili, že i když je doba potøebná na zotavení velmi podobná (v obou skupinách je minimální doba pøibližnì mìsíce), recidiva zranìní u koní ošetøených AMSCs je nižší (, % versus,8 % pro AMSCs a BM-MSCs). Takto dobrý výsledek mùže být zpùsoben možností aplikovat AMSC ve vhodné dobì ještì pøed zaèátkem výskytu strukturálních zmìn v poškozené šlaše. BM-MSCs vyžadují prodlouženou in vitro kultivaci, což zkracuje èasový rámec vhodný pro jejich implantaci, a pravdìpodobnì v dùsledku ne zcela optimální regenerace jsou zvíøata náchylnìjší k recidivì zranìní. Regenerovaná tkáò mùže být ménì pružná, a proto funkènì horší než normální zdravá šlacha. Vhodná doba implantace spolu s vyšší plasticitou a proliferaèní kapacitou AMSCs ve srovnání s BM-MSCs pøedstavují hlavní dùvody zájmu o tento nový pøístup k léèbì poranìní šlach u koní. Bohužel stále není jasné, zda hlavním léèebným úèinkem MSCs je jejich diferenciace do tenocytù a v souvislosti s tím i tvorba molekul extracelulární matrix, èi spíše produkce rùstových faktorù, které stimulují buòky uvnitø šlachy (Richardson et al., ; Chong a Chang, 9), nebo zda dochází ke kombinaci obou mechanismù (Yagi et al., ; Fortier a Travis, ). Rùstové faktory dodané s kmenovými buòkami mohou stimulovat diferencované buòky, ale mohou také stimulovat nativní kmenové buòky a další populace bunìk disponovaných k reparativním procesùm. Naèasování implantace musí být rovnìž peèlivì zváženo. Pøi použití AMSCs se dá pøedpokládat, že èasnìjší implantace mùže být výhodnìjší pro hojení šlachy snížením zánìtu, aktivací nativních kmenových bunìk a podporou produkce kolagenu a jiných bílkovin extracelulární matrix (Reed a Leahy, ). Navíc podle pøedchozích prací (Guest et al., ; Watts et al., ) o ekvinních embryonálních kmenových buòkách a fetálních buòkách je možné spekulovat, že AMSCs jsou primitivnìjší ve srovnání s buòkami dospìlého jedince a vykazují vyšší úroveò transplantovatelnosti ve srovnání s BM-MSCs. Jak je vidìt na pøípadu dvou rùzných poranìní stejné šlachy, léèených autologními BM-MSCs (pøípad ), nebo heterologními AMSCs (pøípad ), ve srovnatelném èasovém intervalu, byla aplikace AMSCs úèinnìjší než BM-MSCs. Kromì toho je dùležité zdùraznit, že AMSCs používané v této studii byly kryoprezervované, vykazovaly tedy ještì vyšší efektivitu léèby v porovnání s èerstvými BM-MSCs. Jak bylo publikováno døíve (Lange-Consiglio et al., ), buòky se po rozmrazení diferencovaly do stejných linií, které byly testovány na èerstvých buòkách a exprimovaly stejné pluripotentní a MSC markery. Jejich míra proliferace byla mírnì nižší než u èerstvých bunìk, ale stále vyšší ve srovnání s èerstvými BM-MSCs. V naší studii, a to i pøes rùznorodost vzorkù skládajících se z rùzných plemen, disciplín a zranìní, se ve shodì s odbornou literaturou nejèastìji vyskytovala léze SDFT ve støední zónì metakarpu. V obou skupinách došlo k recidivì hlavnì po léèbì závažných poranìní SDFT u drezurních koní. Vzhledem k tomu, že SDFT vykazuje podobnost s lidskou Achillovou šlachou, co se týèe anatomie, biomechaniky a patogeneze onemocnìní, kùò pøedstavuje vynikající model pro studie lidských šlach. Námahou vyvolaná zranìní tìchto šlach budou vyžadovat takovou regeneraci tkánì, která povede k dosažení dostateèné biomechanické pevnosti a odolnosti k metakarpofalangeální hyperextenzi. Kromì toho vnitøní uspoøádání SDFT funguje jako pøirozené lešení pro buòky injikované do léze, a není proto potøeba aplikovat podpùrný materiál (Alves et al., ). Je však vhodné aplikovat bunìènou suspenzi pod kontrolou ultrazvukem, aby se zabránilo dalšímu poškození pacienta (Smith et al., ). V analyzované populaci dostihových a sportovních koní nebyla zjištìna korelace mezi vìkem a mírou opìtovného zranìní, jak bylo již døíve prokázáno Dysonem (), i když nebylo pozorováno Reardonem a kol. (). Vysoký výskyt primárního poranìní a vysoká míra opìtovného zranìní SDFT byly zjištìny u drezurních koní. Ruptura SDFT v tomto sportu je ménì èastá v porovnání s rovinnými, ale èastìji dochází k recidivì. Toto je pøekvapivé a zajímavé zjištìní, které bylo zmínìno zatím pouze Koldem a Dysonem (). Je tøeba vzít v úvahu odlišnou patogenezi lézí u tìchto elitních sportovních koní, èasto støedního vìku. Údajnì hrají hlavní roli degenerativní zmìny. Vliv stárnutí a fyzické zátìže na biochemické složení celé šlachové matrice je známý stav, který popsal Smith a kol. (), ale v souvislosti s tréninkem opakovanì namáhajícím spìnky pøi prodlouženém kroku ve vysoké kvalitì mùže docházet k degeneraci šlach a k jejich oslabení. Dlouhodobá a prodloužená metakarpální/tarzofalangeální fáze bìhem pasáže a ještì více bìhem piafy a pøi cvalových piruetách, spolu s prodlouženou tréninkovou sezonou hrají významnou mechanickou roli. V souladu s literaturou je poranìní SL u výkonných sportovních koní druhým

8 Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO nejèastìjším zranìním. Vysoká míra recidivy je popisována u zánìtu SL bez ohledu na disciplínu nebo závažnost léze. Je to vysoce zatìžovaná struktura vystavená opakovanému pøetížení a je tøeba vzít v úvahu degenerativní zmìny uvnitø tohoto vazu. K zodpovìzení otázky, zda vedou, èi nevedou v této sportovní kategorii biomechanické a/nebo biochemické mechanismy k neuspokojivému hojení u SL i SDFT, bude potøeba další výzkum, který nám dovolí lépe porozumìt tomuto stavu. I pøes nejlepší výsledky, jež byly dosaženy s AMSCs, ukazuje tato studie øadu omezení. Je velmi obtížné demonstrovat zlepšené hojení na ošetøených zvíøatech, protože nebyla zahrnuta kontrolní skupina. Potíže s urèením kontrolní populace jsou spojeny se zpùsobem ošetøení v chovu koní. Navíc interpretace výsledkù mùže být zavádìjící z dùvodù rùznorodosti sportovních disciplín, pro které jsou konì využíváni, povahy zranìní, závažnosti poèáteèního zranìní a stáøí koní. Dále je obtížné standardizovat statistické hodnocení s ohledem na to, že ošetøení šlach u koní je vysoce variabilní. Všechny tyto faktory ovlivòují prognózu. Optimální èas ošetøení a optimální dávka a zpùsob podání kmenových bunìk ještì nebyly urèeny pro žádný typ kmenových bunìk, lézi ani zvíøecí druh. Mnozí autoøi se shodují s Richardsonem a kol. (), že optimální naèasování implantace bunìk je po poèáteèní zánìtlivé fázi, ale ještì pøedtím, než se zaène formovat fibrózní tkáò. Pøedpokládá se, že pøítomnost fibrózní vazivové tkánì uvnitø šlachy by èinila implantaci obtížnìjší a snížila by výhody terapie kmenovými buòkami kvùli její perzistenci. Další diskuse se týkají množství kmenových bunìk potøebných ke stimulaci regenerace nebo délky sledování, které by umožnilo pøímé porovnání. K dnešnímu dni neexistují studie zabývající se množstvím bunìk v dávce: v literatuøe se rozsah implantovaných bunìk pohybuje v rozmezí bunìk v závislosti na velikosti léze a následné sledování pacientù se pohybuje od mìsíce do let. Na tyto otázky bude muset odpovìdìt další výzkum. Údaje uvedené v této studii ukazují, že neexistují žádné signifikantní nepøíznivé úèinky vyvolané léèbou MSCs u jakéhokoli ze sledovaných koní. Klinické a ultrasonografické hodnocení šlach neodhalilo pøítomnost nevhodné tkánì nebo vznik nádoru. Klinické výsledky po transplantaci MSCs byly pøíznivé; avšak signifikantnì nižší míra opakovaných zranìní pozorovaná po implantaci AMSCs ukazuje, že léèba amnionovými stromálními buòkami je úèinnìjší ve srovnání s implantací BM-MSCs. Pøeklad originálního pøíspìvku z èasopisu Cytotherapy, podporováno MŠMT NPÚ I: LO9 Pøeklad: Ing. Irena Vacková, CSc. ÚEM AV ÈR, v.v.i. Vídeòská 8 Praha MŠMT NPÚ I: LO9 Literatura Alves A, Stewart A, Dudhia J. Cell-based therapies for tendon and ligament injuries. Vet Clin North Am Equine Pract :,. Brehm W, Aklin B, Yamashita T, Rieser F, Trüb T, Jakob RP, et al. Repair of superficial osteochondral defects with an autologous scaffold- -free cartilage construct in a caprine model: implantation method and short-term results. Osteoarthritis Cartilage :,. Carrade DD, Owens SD, Galuppo LD, Vidal MA, Ferraro GL, Librach F, et al. Clinicopathologic findings following intra-articular injection of autologous and allogeneic placentally derived equine mesenchymal stem cells in horses. Cytotherapy :9,. Colleoni S, Bottani E, Tessaro I, Mari G, Merlo B, Romagnoli N, et al. Isolation, growth and differentiation of equine mesenchymal stem cells: effect of donor, source, amount of tissue and supplementation with basic fibroblast growth factor. Vet Res Commun :8, 9. Corradetti B, Lange-Consiglio A, Barucca M, Cremonesi F, Bizzaro D. Size-sieved subpopulations of mesenchymal stem cells from intervascular and perivascular equine umbilical cord matrix. Cell Prolif :,. Cremonesi F, Corradetti B, Lange Consiglio A. Fetal adnexa derived stem cells from domestic animal: progress and perspectives. Theriogenology :,. Crovace A, Lacitignola L, Rossi G, Francioso E. Histological and immunohistochemical evaluation of autologous cultured bone marrow mesenchymal stem cells and bone marrow mononucleated cells in collagenase-induced tendinitis of equine superficial digital flexor tendon. Vet Med Int 98,. da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci 9(Pt ):,. Del Bue M, Ricco S, Ramoni R, Conti V, Gnudi G, Grolli S. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Vet Res Commun (Suppl ):S, 8. Dyson SJ. Medical management of superficial digital flexor tendonitis: a comparative study in 9 horses (99-). Equine Vet J : 9,. Fortier LA, Smith RK. Regenerative medicine for tendinous and ligamentous injuries of sport horses. Vet Clin North Am Equine Pract :9, 8. Fortier LA, Travis AJ. Stem cells in veterinary medicine. Stem Cell Res Ther :9,. Guest DJ, Smith MR, Allen WR. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Vet J :,.

9 ŽÁDNÉ KLÍŠŤATA A BLECHY JE MOU JASNOU VOLBOU KRÁSNÁ LESKLÁ SRST ARPALIT UDĚLÁ Z VAŠEHO PSA HVĚZDU KAŽDÉ SPOLEČNOSTI! OSTI! PROTOŽE: hubí blechy, klíšťata a jejich vývojová stádia účinkuje dlouhodobě chrání před nemocemi přenášenými klíšťaty Kvalita od fi rmy Avefl or, vyrobeno v České republice.

10 Léèba poranìní vazù a šlach u koní pomocí MSC VETERINÁRNÍ LÉKAØ ROÈNÍK ÈÍSLO Chong AK, Chang J, Go JC. Mesenchymal stem cells and tendon healing. Front Biosci :98, 9. Jezierska-Wo_zniak K, Nosarzewska D, Tutas A, Miko³ajczyk A, nski M, Jurkowski MK. Use of adipose tissue as a source of mesenchymal stem cells. Postepy Hig Med Dosw (Online) :,. Koch TG, Berg LC, Betts DH. Current and future regenerative medicine: principles, concepts, and therapeutic use of stem cell therapy and tissue engineering in equine medicine. Can Vet J :, 9. Kold S, Dyson S. Lameness in the dressage horse. In: Ross MW a Dyson S (eds). Diagnosis and Management of Lameness in the Horse. st ed. St Louis: WB Saunders Co :9 8. Kraus KH, Kirker-Head C. Mesenchymal stem cells and bone regeneration. Vet Surg :,. Lange-Consiglio A, Corradetti B, Bizzaro D, Magatti M, Ressel L, Tassan S, et al. Characterization and potential applications of progenitor-like cells isolated from horse amniotic membrane. J Tissue Eng Regen Med :,. Lovati AB, Corradetti B, Lange Consiglio A, Recordati C, Bonacina E, Bizzaro D, Cremonesi F. Comparison of equine bone marrow-, umbilical cord matrix and amniotic fluidderived progenitor cells. Vet Res Commun :,. Martinello T, Bronzini I, Maccatrozzo L, Mollo A, Sampaolesi M, Mascarello F, et al. Canine adipose-derived mesenchymal stem cells do not lose stem features after a longterm cryopreservation. Res Vet Sci 9:8,. Rantanen NW. Ultrasonographic evaluation of the equine limb: technique. In: Ross MW a Dyson SJ (eds). Diagnosis and Management of Lameness in the Horse. st ed. St Louis: WB Saunders Co :. Reardon RJM, Boden LA, Mellor DJ, Love S, Newton JR, Stirk AJ, et al. Risk factors for superficial digital flexor tendinopathy in Thoroughbred racehorses in hurdle starts in the UK (e9). Equine Vet J : 9,. Reed SA, Leahy ER. Growth and development symposium: Stem cell therapy in equine tendon injury. J Anim Sci 9:9,. Richardson LE, Dudhia J, Clegg PD, Smith R. Stem cells in veterinary medicine-attempts at regenerating equine tendon after injury. Trends Biotechnol :9,. Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE. Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment. Equine Vet J :99,. Vidal MA, Kilroy GE, Lopez MJ, Johnson JR, Moore RM, Gimble JM. Characterization of equine adipose tissue-derived stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stroma cells. Vet Surg :,. Vidal MA, Robinson SO, Lopez MJ, Paulsen DB, Borkhsenious O, Johnson JR, et al. Comparison of chondrogenic potential in equine mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue and bone marrow. Vet Surg :, 8. Vidal MA, Lopez MJ. Adipogenic differentiation of adult equine mesenchymal stromal cells. Methods Mol Biol :,. Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frankhauser M, Wirkner U, Krause U, et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol :,. Watts AE, Yeager AE, Kopyov OV, Nixon AJ. Fetal derived embryonic- -like stem cells improve healing in a large animal flexor tendonitis model. Stem Cell Res Ther :,. Wilke MM, Nydam DV, Nixon AJ. Enhanced early chondrogenesis in articular defects following arthroscopic mesenchymal stem cell implantation in an equine model. J Orthop Res :9,. Yagi H, Soto-Gutierrez A, Parekkadan B, Kitagawa Y, Tompkins RG, Kobayashi N, et al. Mesenchymal stem cells: mechanisms of immunomodulation and homing. Cell Transplant 9: 9,. Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, Yokoyama A, Koga H, Sekiya I. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell Tissue Res :9,.