METODIKA DIAGNOSTIKY CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS, PŮVODCE BAKTERIÁLNÍHO VADNUTÍ RAJČETE

Transkript

1 Kokošková Blanka, Mráz Ivan, Fousek Jan METODIKA DIAGNOSTIKY CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS, PŮVODCE BAKTERIÁLNÍHO VADNUTÍ RAJČETE CERTIFIKOVANÁ METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. 2012

2 Metodika vznikla za finanční podpory MZe ČR a byla vypracována v rámci projektu QH71229 Diagnostika a metody integrované ochrany proti karanténním a dalším ekonomicky významným patogenům plodové a listové zeleniny. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2012 ISBN:

3

4 METODIKA DIAGNOSTIKY CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS, PŮVODCE BAKTERIÁLNÍHO VADNUTÍ RAJČETE Kokošková Blanka, Mráz Ivan, Fousek Jan CERTIFIKOVANÁ METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. 2012

5

6 Metodika diagnostiky Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, pů vodce bakteriálního vadnutí rajčete Předmětem metodiky bylo optimalizovat detekci a determinaci karanténní bakterie Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, původce bakteriálního vadnutí rajčete. Choroba způsobuje značné ekonomické ztráty v skleníkových i polních porostech indeterminantních rajčat ve všech pěstitelských oblastech této plodové zeleniny v ČR i ve světě. Metodika je založena na kombinaci dvou optimalizovaných technik o různém principu účinku, a to imunochemickém (IF) a molekulárním (PCR). Předkládaný diagnostický protokol umožňuje eliminovat případné falešné negativy i pozitivy a zajistit tak co nejvyšší spolehlivost výsledků. Specifická a včasná detekce původce bakteriálního vadnutí rajčete umožní účinnou aplikaci ochranných opatření. Diagnostic method for Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, the causal agent of bacterial wilt of tomato The aim of this methodology was to optimize the detection and determination of quarantine bacterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, the causal agent of bacterial canker of tomato. The disease causes high ecomomic losses in main production areas on indeterminate greenhouse and field tomatoes. Methodology is based on a combination of both optimized techniques utilizing different principles of action: immunochemical (IF) and molecular (PCR). The submitted diagnostic protocol allows to eliminate potential false negatives and positives and ensure the highest reliability of results. Specific and timely detection of C. m. subsp. michiganensis will allow an effective application of plant protection mesures. Oponenti: Ing. Jaroslav Horký, CSc. Státní rostlinolékařská správa, Olomouc Ing. Petr Dědič, CSc. Výzkumný ústav bramborářský, s. r. o., Havlíčkův Brod Metodika byla schválena Státní rostlinolékařskou správou pod j. č.: SRS /2012 Státní rostlinolékařská správa doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.

7

8 Obsah I) Úvod... 9 II) Cíl metodiky III) Vlastní popis metodiky Příprava a zpracování vzorků Determinace a detekce původce bakteriálního vadnutí Imunofluorescenční test (IF) Polymerázová řetězová reakce (PCR) Přílohy (obrázky, tabulka, graf, mapa) IV) Srovnání novosti postupů V) Popis uplatnění metodiky VI) Ekonomický přínos VII) Seznam použité související literatury VIII) Seznam publikací autorů předcházejících vypracování metodiky IX) Dodatky... 35

9

10 1) Úvod Bakterie Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis [(Smith) Davis et al.] (dále jen C. m. subsp. michiganensis), způsobující bakteriální vadnutí rajčete, patří v zemích EU, Českou republiku nevyjímaje, mezi karanténní organismy (OEPP/EPPO 2005). Patogen je příčinou významných výnosových ztrát, jak ve sklenících, tak polních porostech ve všech pěstitelských oblastech této plodové zeleniny (Gleason et al. 1993). Škodlivost původce choroby je proměnlivá v závislosti na ročníku. V některých letech mohou být výnosové ztráty zanedbatelné, jindy %, výjimečně mohou dosáhnout až 70 %. Infikované rostliny jsou méně výnosné, mnohdy musí být napadené porosty předčasně likvidovány (Kokošková 2008). Rajče je ekonomicky nejvýznamnějším hostitelem, ale bakterii C. m. subsp. michiganensis najdeme i na jiných kulturních i plevelných druzích čeledi Lilkovité, jako např. na paprice a lilku (OEPP/ EPPO 2005). Ve sklenících je charakteristickým příznakem choroby postupné vadnutí jednotlivých lístků lichozpeřených listů, které se lodičkovitě zkrucují, hnědnou a usychají. Později vadnou celé listy, zpravidla na jedné straně lodyhy. V polních podmínkách většinou na infikovaných rostlinách postupně usychají spodní listy od špiček, až uschne celá rostlina, aniž by se objevilo reverzibilní vadnutí (Kůdela et al. 2002). Patogen se pomnožuje a šíří v cévním systému rostliny. Dochází proto k diskoloraci cévních svazků, což je patrné na příčném řezu stonkem. U silně infikovaných rostlin se na stoncích objevují praskliny. Sekundární infekce listů má za následek listovou skvrnitost, která je ve vlhkých sklenících běžným příznakem napadení (Kokošková 2008). Bakterie C. m. subsp. michiganensis může přežívat po několik měsíců na různých zařízeních ve skleníku anebo v infikovaných Certifikovaná metodika pro praxi 9

11 rostlinných zbytcích v půdě nebo na půdním povrchu (Gleason et al. 1991). V semenech může patogen přežívat jen omezeně, ale často kontaminuje povrch semen (OEPP/EPPO 2005; Kaneshiro et al. 2006). Latentně infikované sazenice jsou považovány za velmi důležitý zdroj infekce (Chang et al. 1991). Ochranná opatření spočívají v používání zdravého osiva ze semenářských porostů v suchých oblastech prostých patogena (Jahr et al. 1999). Doporučuje se získávat semena kvašením plodů a následně je ošetřit teplou vodou nebo slabým roztokem kyselin. Při zaštipování výhonů je zapotřebí dezinfikovat nářadí i ruce. Při výskytu choroby v porostech rajčat se doporučují postřiky měďnatými přípravky, zpravidla v kombinaci s manebem či mancozebem (Kokošková 2008). V polních porostech je třeba vyloučit pěstování hostitelských rostlin na stejném pozemku po dobu 4 5 let, ve sklenících je nezbytná sterilizace půdního substrátu a pečlivý sběr a likvidace rostlinných zbytků. Karanténní inspekci podléhají semena a sazenice (Kůdela et al. 2002). K detekci a identifikaci fytopatogenních bakterií se používají různé diagnostické metody založené na odlišných principech účinku. V případě C. m. subsp. michiganensis to bývá nejčastěji sklíčková aglutinace, ELISA, imunofluorescence, PCR a biologické testy na rajčeti (OEPP/EPPO 2005). Imunochemické testy jsou závislé na kvalitě dostupných protilátek. Ty jsou buď polyklonální (PAb), monoklonální (MAb) nebo kombinované (Alvarez 2004). PAbs mají obvykle vyšší reaktivitu, ale nižší titr a specifičnost ve srovnání s MAbs (Pánková a Kokošková 2002; Alvarez 2004). Tyto protilátky mohou křížově reagovat s doprovodnými fytopatogenními a saprofytickými bakteriemi, které jsou přítomné v infikovaných rostlinách rajčat (Jahr et al. 1999; Keneshiro et al. 2006). Kaneshiro et al. (2006) však produkovali vysoce kvalitní MAb, která reagovala s geograficky odlišnými kmeny C. m. subsp. michiganensis a s hypovirulentními kmeny C. m. subsp. michiganensis 10 Certifikovaná metodika pro praxi

12 izolovanými ze semen rajčat. Většina komerčních protilátek pro C. m. subsp. michiganensis jsou však PAbs, u nichž lze předpokládat křížové reakce s jinými bakteriemi. MAbs pro C. m. subsp. michiganensis nejsou na trhu běžně dostupné, ale Agdia Inc. (Elkhart, USA) prodává MAbs pro C. m. subsp. michiganensis pro nepřímou ELISA a ImmunoStrip. Hybridizace, PCR a real -time PCR jsou rychlé, vysoce citlivé a specifické metody používané pro detekci a identifikaci fytopatogenních bakterií (Santos et al. 1997; Kokošková et al. 2007). Dreier et al. (1995) uvádějí, že PCR se jeví jako rychlý a spolehlivý test pro detekci C. m. subsp. michiganensis v infikovaném rostlinném pletivu. Rep -PCR s BOX, ERIC a REP primery jsou považovány za rychlé, reprodukovatelné a velmi spolehlivé pro identifikaci čistých kultur založených na fingerprints (Louws et al. 1998). Diagnostikcé metody, ať už imunochemické či molekulárně biologické, jsou stále zdokonalovány, aby bylo možné detekovat C. m. subsp. michiganensis v přirozeně a uměle infikovaných rostlinách a semenech stale rychleji a spolehlivěji. II) Cíl metodiky Cílem metodiky je optimalizovat detekci a determinaci karanténní bakterie C. m. subsp. michiganensis, původce bakteriálního vadnutí rajčete. Předkládaná metodika zvýší citlivost a specifičnost použitých diagnostických technik, a zajistí tak co nejvyšší spolehlivost výsledků. III) Vlastní popis metodiky 1. Příprava a zpracování vzorků K rozborům je nejlépe předávat nebo zasílat celé rostliny i s kořenovým systémem nebo uříznuté těsně nad zemí. Jako obaly Certifikovaná metodika pro praxi 11

13 se osvědčily plastové pytle na odpad odpovídající velikosti. Pro zasílání rostlinných vzorků menší velikosti, např. listů s řapíky, se osvědčily papírové sáčky s perforovanou folií, které zajišťují dostatečnou provzdušněnost prostředí a zabraňují tak vysychání nebo naopak hnití obsahu vzorků. V době velmi suchého a teplého počasí je žádoucí obalit konce odříznutých výhonů do ovlhčené buničiny. Vzorky s typickými příznaky bakteriálního vadnutí: Rostlinné vzorky s typickými příznaky choroby mohou zahrnovat celé rostliny či jejich části jako např. napadené stonky, řapíky, listy, výjimečně i plody. Vzorky by měly být zpracovány co nejdříve po obdržení nebo uchovány při 4 8 ºC do doby zpracování. Pro úspěšné izolace původce bakteriálního vadnutí rajčete jsou nezbytné čerstvě připravené maceráty z rostlinných pletiv. Doporučujeme rozborovat nekrotizované okraje listů (obr. 4) a tenké příčné řezy z bází, stonků či řapíků, na nichž jsou pod mikroskopem vidět zahnědlé cévní svazky ucpané masou bakterií (obr. 3). Ze silně infikovaných vzorků je možné bakterii izolovat přímo roztěrem na agarová média jako např. MPA nebo C médium (viz dodatek č. 1), neboť typické kolonie patogena narůstají v hojném počtu. Vzorky s atypickými příznaky nebo bez příznaků bakteriálního vadnutí: Pokud jsou příznaky bakteriálního vadnutí pokročilé nebo naopak, když jsou příznaky choroby nejasné, počet kultivovatelných buněk může být velmi nízký. Přerostou -li Petriho misky saprofytickými bakteriemi, může být izolace C. m. subsp. michiganensis obtížná. V těchto případech doporučujeme detekovat původce bakteriálního vadnutí přímo, nejlépe v imunochemickém i molekulárním testu zároveň. 12 Certifikovaná metodika pro praxi

14 2. Determinace a detekce původce bakteriálního vadnutí Připravíme maceráty z infikovaného rostlinného pletiva ve sterilní vodě na hodinovém sklíčku tak, že odebereme rostlinné segmenty (cca 3 4 mm) z rozhraní zdravé a napadené části rostliny (list, řapík, stonek, báze, plod apod.) a skalpelem pečlivě rozmacerujeme. Sterilní kličkou odebereme do očka tekutinu a rozetřeme na P. misce křížovým roztěrem. Po 3 až 4 dnech prohlížíme misky pod mikroskopem a vytipováváme charakteristické kolonie, ze kterých provádíme další roztěry na P. misky. Čisté kultury podezřelých izolátů (obr. 1) napěstovaných z drobných, hladkých, lesklých, vypouklých a žlutě zbarvených kolonií na C médiu mohou být testovány v sklíčkové aglutinaci, která je rychlým sérologickým testem umožňujícím rutinně ověřit velké množství izolátů. Poté by měly být všechny pozitivní izoláty testovány v IF (obr. 2) a PCR testu. Pro potvrzení patogenity by měl být použit biologický test. V každém testu by měl být použit jako pozitivní kontrola referenční kmen C. m. subsp. michiganensis (viz dodatek č. 3). Rostlinné vzorky, z nichž není možné C. m. subsp. michiganensis izolovat, by měly být zařazeny přímo do IF a PCR testu Imunofluorescenční test (IF) Uvádíme námi optimalizovaný IF test pro C. m. subsp. michiganensis, který vznikl kombinací protokolů směrnice EU (Janse a Kokošková 2009), společnosti NeogenEurope Ltd., UK a vlastních zkušeností. IF test může být proveden: a) s čistými kulturami vytipovaných izolátů připravených jako bakteriální suspenze přibližně v koncentraci cfu/ml (OD=0,1 0,001 při 620 nm) ve fosfátovém pufru (viz dodatek č. 2). Certifikovaná metodika pro praxi 13

15 b) s čerstvými rostlinnými maceráty či krátce skladovanými při teplotě 4 8 ºC v lednici c) výjmečně s dlouhodoběji skladovanými rostlinnými extrakty při nízkých teplotách ( 70 ºC a méně) s přídavkem glycerolu. Před testováním je třeba glycerol odstranit přidáním 1 ml fosfátového pufru, centrifugací vzorku 15 minut při g, odstraněním supernatantu a resuspendováním pelety ve fosfátovém pufru. Pro IF testy se používají nejčastěji komerční polyklonální protilátky většinou v ředění uvedeném na etiketě. Jako pozitivní kontrola by měl být použit sbírkový kmen C. m. subsp. michiganensis v koncentraci 10 6 cfu/ml (viz dodatek č. 3). Jako negativní kontrola by měla být použita bakterie reagující negativně s použitou protilátkou (např. Pseudomonas fl uorescens nebo Pantoea agglomerans) a extrakt ze vzorku zdravé rostliny. V případě testovaných vzorků by měly být použity maceráty neředěné a ředěné ve fosfátovém pufru v poměru 1:10 a 1:100, případně 1:1000. Každý vzorek a každé ředění je buď 2 opakováno na jednom sklíčku nebo jsou použity 2 vzorky na jednom sklíčku v jednom opakování. V současné době jsou na trhu pro IF testy dostupná podložní sklíčka od firmy Marienfeld (SRN), specifikovaná jako mikrosklo podložní, epoxidová maska 10/7 modrá, broušené provedení, balení po 50 kusech. Používají -li se tato sklíčka, osvědčilo se nám prodloužit v IF testu u jednotlivých kroků fixační doby. V postupu jsou uvedeny námi odzkoušené časy, které prodlužují fixaci antigenu na povrch skla, fixaci protilátky na antigen atd. a zabezpečují vyšší citlivost testu ve srovnání s kratšími fixačními časy uvažovanými v EU protokolu. Postup Připravit bakteriální suspenze testovaných vzorků včetně pozitivních a negativních kontrol ve fosfátovém pufru. U čistých kultur proměřit počáteční optickou hustotu 0,1 při 620 nm na 14 Certifikovaná metodika pro praxi

16 spektrofotometru, která odpovídá koncentraci 10 8 cfu/ml. Další koncentrace tj. 0,01, 0,001, případně i 0,0001 připravit desetinným ředěním do eppendorfek (např. 30μl suspenze + 270μl pufru PBS nebo 40μl suspenze + 360μl pufru PBS). Vzorky nakapat podle připraveného schématu do okének na podložním sklíčku po 20ml do každého okénka o průměru 7 mm. Podložní sklíčka nechat vysoušet 60 minut při teplotě ºC na desce termostatu. Fixovat bakteriální buňky na podložním sklíčku protažením jeho spodní strany v nesvítivé části plamene, opakovat 3. (pozn. Neosvědčila se aplikace acetonu doporučovaná firmou NeogenEurope Ltd., my doporučujeme fixaci plamenem.) Nakapat naředěnou protilátku po 20 ml do každého okénka. Podložní sklíčka inkubovat 75 minut při laboratorní teplotě v temné vlhké komůrce. Podložní sklíčka opláchnout pod mírným proudem fosfátového pufru, vložit do nádobky s fosfátovým pufrem a promývat za stálého třepání na rotační třepačce (150 otáček/min). Po 10 minutách vyměnit fosfátový pufr a pokračovat v promývání stejným způsobem, tj. promývat celkem 20 minut. Sklíčka opláchnout destilovanou vodou a ponechat na filtračním papíru do úplného oschnutí, tj. asi minut. Nakapat naředěný konjugát (anti -rabbit IgG) po 20 ml do každého okénka. Poté sklíčka inkubovat 75 minut při laboratorní teplotě v temné vlhké komůrce. Podložní sklíčka opláchnout pod mírným proudem fosfátového pufru, vložit do nádobky s fosfátovým pufrem a promývat za stálého třepání na rotační třepačce (150 otáček/min). Po 10 minutách vyměnit fosfátový pufr a pokračovat v promývání stejným způsobem, tj. promývat celkem 20 minut. Třepat za nepřístupu světla. Sklíčka opláchnout destilovanou vodou a ponechat na filtračním papíru do úplného oschnutí, tj. asi minut. Dokonale osušit obvod podložního sklíčka. Certifikovaná metodika pro praxi 15

17 Celý obvod podložního sklíčka pokapat 0,1 M fosfátovým pufrem s glycerolem (5 10 μl v jedné kapce), překrýt krycím sklíčkem a důkladně odstranit případná vzduchem zaplněná místa. Krycí sklíčko přichytit v rozích lakem k podložnímu sklíčku. Sklíčka je možné skladovat jako trvalé preparáty v lednici nebo při 20 ºC až 3 měsíce. Hodnocení IF testu Sklíčka prohlížet v epifluorescenčním mikroskopu s filtry pro excitaci FITC pod olejovou imerzí při zvětšení Zkoumat okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a podél obvodu. U vzorků s žádným nebo malým počtem buněk prohlédnout nejméně 40 mikroskopových políček v okénku podložního sklíčka. Odhad fluoreskujících buněk v 1 ml a na vzorek (viz dodatek č. 4). Interpretace výsledků IF testu Test je proveden správně, jestliže v okénkách sklíčka, kde byla aplikována pozitivní kontrola, jsou pozorovány jasně zeleně fluoreskující buňky s morfologií typickou pro C. m. subsp. michiganensis a v okénkách sklíčka, kde byla aplikována negativní kontrola, nejsou pozorovány žádné fluoreskující buňky. Vlastní vzorky jsou pak hodnoceny jako pozitivní nebo negativní podle toho, jak odpovídají oběma kontrolám. Jako nejnižší limit pro spolehlivou detekci C. m. subsp. michiganensis v IF testu je uvažována koncentrace 10 3 cfu/ml. U vzorků s nižší koncentrací C. m. subsp. michiganensis mohou být výsledky sporné nebo negativní, a proto by měl být vzorek testován znovu v IF nebo jiném testu. Vzorky se slabě fluoreskujícími buňkami by měly být testovány s vyšším ředěním protilátek nebo jinými protilátkami. Při podezření z jakékoliv kontaminace, např. kontaminace pufru nebo kontaminace povrchu sklíčka mezi okénky pozitivními buňkami, musí být test opakován. 16 Certifikovaná metodika pro praxi

18 Při zjištění přítomnosti fluoreskujících buněk s atypickou morfologií se může jednat o křížově reagující doprovodné fytopatogenní nebo saprofytické bakterie. V takovém případě je nutné opakovat IF test s jinými protilátkami nebo použít jiný test, např. PCR, neboť ten je velmi specifický Polymerázová řetězová reakce (PCR) Uvádíme námi optimalizovanou reakci PCR se dvěma dvojicemi primerů Cmm5 a Cmm6 (Dreier et al. 1995) viz dodatek č. 5 a s vlastními primery Cmm1F a Cmm1R. Pro testování vzorků pomocí PCR lze použít bakteriální kulturu ve 3 různých variantách. Je rovněž možné použít vyizolovanou a přečištěnou DNA z rostlinného pletiva či semen Bakteriální kulturu bez jakýchkoliv úprav odebranou z misky sterilním párátkem nebo kličkou přidat přímo do namíchané PCR reakce Použít bakteriální lyzát připravený následujícím způsobem: Připravit čerstvý 50 mm NaOH Sterilní kličkou o objemu 1 ml přenést 48 hodinovou bakteriální kulturu kultivovanou při cca 21 ºC (platí pro grampozitivní bakterie) do 1,5 ml eppendorfky se 100 ml čerstvě připraveného 50 mm NaOH a řádně vortexovat Směs na heat bloku zahřívat 15 min. (grampozitivní bakterie) při 100 ºC, pak rychle zchladit na ledu K tomuto alkalickému lyzátu přidat 900 ml sterilní destilované vody a vortexovat Bakteriální lyzát uchovávat na ledu Přidat 1 ml lyzátu do namíchané PCR reakci Certifikovaná metodika pro praxi 17

19 Při každé nové přípravě bakteriálního lyzátu je nutné připravit nový 50 mm NaOH Použít vyizolovanou genomovou (bakteriální) DNA V současné době existuje více možností pro izolaci genomové bakteriální DNA. Doporučujeme provést izolaci pomocí kitu Wizard SV Genomic DNA Purification System od firmy Promega. Srozumitelný návod je přiložen v každém balení kitu. Do namíchané PCR reakce přidat 1 l vyizolované genomové DNA Použití DNA vyizolované z rostlinného pletiva či semen s jejím následným přečištěním. Existuje více možností pro izolaci DNA z rostlinného pletiva. Doporučujeme provést izolaci DNA pomocí kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) a získaný produkt zkontrolovat na agarosovém gelu. Pokud se získaná DNA jeví jako znečištěná, lze použít Wizard SV Gel and PCR Clean -Up System (Promega) k následnému přečištění. Přečištěný produkt je vhodné zkontrolovat na agarosovém gelu. Srozumitelný návod je přiložen v každém balení jednotlivých kitů. Do namíchané PCR reakce přidat 1 l vyizolované DNA Použité primery: Pro PCR reakci lze použít následující dvě dvojice primerů pro detekci C. m. subsp. michiganensis s dobrými výsledky: Optimalizované primery Cmm5 a Cmm6 (Dreier et al. 1995), velikost amplifikačního produktu (VAP) je 614 bp (obr. 6) Vlastní primery Cmm1F (5 gac AAg CAC CTC TAC ACC Tgg 3 ) a Cmm1R (5 TTg ATC CCT gac TTC AgC gt 3 ), VAP činí 500 bp (obr. 6) Primery je možné si nechat nasyntetizovat např. u firmy Generi Biotech v Hradci Králové. 18 Certifikovaná metodika pro praxi

20 Reakční směs PCR PCR reakci zcela postačuje provádět v celkem 15 l reakční směsi. Místo jednotlivých komponentů (polymeráza, nukleotidy, pufr, MgCl 2 aj.) doporučujeme používat tzv. PPP Master Mix (např. firma Top Bio, ČR), kde jsou výše zmiňované komponenty vyváženě zastoupeny. Používané primery skladujeme obvykle jako zásobní roztok v koncentraci 200 pmol/ l v mrazícím boxu při teplotě 20 º C, před použitím je pak ředíme 10, tj. na koncentraci 20 pmol/ l. Tyto zbylé naředěné primery skladujeme co nejkratší dobu opět v mrazícím boxu. Používané balení PPP Master Mix skladujeme v lednici, ostatní balení v zásobě pak v mrazícím boxu také při teplotě 20 º C. Složení reakční PCR směsi: PPP Master Mix 7,5 ml primer 1 (20 pmol/ul) 0,5 ml primer 2 (20 pmol/ul) 0,5 ml genomová DNA (bakteriální lyzát) 1,0 ml sterilní destilovaná voda 5,5 ml Amplifikační program pro jednotlivé primery: U jednotlivých primerů se amplifikační program odlišuje teplotou a dobou annealingu, dobou syntézy DNA či počtem proběhnutých cyklů. Pro amplifikaci C. m. subsp. michiganensis DNA primery Cmm5 a Cmm6 (Dreier et al. 1995) vyizolovanou z bakteriální kultury a rostlinného pletiva je vhodný následující PCR program: Úvodní denaturace: 5 min. 95 ºC (1) Denaturace: 1 min. 94 ºC (2) Certifikovaná metodika pro praxi 19

21 Doba a teplota annealingu: 30 sec. 66 ºC (3) Syntéza DNA: 30 sec. 72 ºC (4) Krok (2) až (4) opakovat 30 (5) Syntéza řetězce: 15 min. 72 ºC (6) Chlazení při 4 ºC (7) Pro amplifikaci C. m. subsp. michiganensis DNA vyizolované z infikovaných semen primery Cmm5,6 je vhodnější následující PCR program: Úvodní denaturace: 5 min. 95 ºC (1) Denaturace: 1 min. 94 ºC (2) Doba a teplota annealingu: 90 sec. 55 ºC (3) Syntéza DNA: 60 sec. 72 ºC (4) Krok (2) až (4) opakovat 30 (5) Syntéza řetězce: 15 min. 72 ºC (6) Chlazení při 4 ºC (7) Pro amplifikaci C. m. subsp. michiganensis DNA vlastními primery Cmm1F (5 gac AAg CAC CTC TAC ACC Tgg 3 ) a Cmm1R (5 TTg ATC CCT gac TTC AgC gt 3 ) vyizolovanou z bakteriální kultury a rostlinného pletiva je vhodný následující PCR program: Úvodní denaturace: 5 min. 95 ºC (1) Denaturace: 1 min. 94 ºC (2) Doba a teplota annealingu: 10 sec. 69 ºC (3) Syntéza DNA: 30 sec. 72 ºC (4) Krok (2) až (4) opakovat 30 (5) Syntéza řetězce: 15 min. 72 ºC (6) Chlazení při 4 ºC (7) 20 Certifikovaná metodika pro praxi

22 Pro amplifikaci C. m. subsp. michiganensis DNA vyizolované z infikovaných semen vlastními primery Cmm1F,R je pak doporučen následující PCR program: Úvodní denaturace: 5 min. 95 ºC (1) Denaturace: 1 min. 94 ºC (2) Doba a teplota annealingu: 10 sec. 62 ºC (3) Syntéza DNA: 10 sec. 72 ºC (4) Krok (2) až (4) opakovat 25 (5) Syntéza řetězce: 15 min. 72 ºC (6) Chlazení při 4 ºC (7) Vyhodnocení PCR na agarosovém gelu Příprava tzv. Loading Buffer (vkládacího pufru) Na 10 ml vkládacího pufru smícháme 3 ml glycerolu, 200 l 0,5% Bromphenol Blue, 200 l 0,5% Xylen Cyanol (například Sigma Aldrich) a doplníme pufrem 1 TE (viz dodatek č. 6) do objemu 10 ml. Do 0,5 ml této směsi přidáme 0,5 l barviva Sybr Green (Sigma Aldrich), kterým se zviditelňuje DNA. Tímto způsobem připravený vkládací pufr lze uchovávat v lednici v dobrém stavu přibližně jeden týden. Po této době je potřeba připravit pufr nový Příprava vzorků a agarosového gelu pro elektroforesu Jeden l směsi vkládacího pufru se Sybr Green smícháme s 1 l amplifikátu (naamplifikované DNA) a nanášíme na zpravidla 1% agarosový gel umístěný v horizontální elektroforese. Pro přípravu agarosového gelu se nám osvědčila agarosa SeaKem LE Agarose (Lonza, East Port). Příslušné množství agarosy s vhodným pufrem (např. TBE, TE aj.) rozvaříme v mikrovlnné troubě. Orientace běhu vzorků na gelu je od minus pólu k plus pólu. Pufr používaný v elek- Certifikovaná metodika pro praxi 21

23 troforese jako elektrolyt (např. 1 TE) musí být shodný s pufrem použitým pro přípravu agarosového gelu. Jako marker pro zjištění velikosti amplifikátů používáme v tomto případě tzv. stovkový velikostní standard (marker) 100 bp DNA Ladder (Promega), který nanášíme v množství 1,0 1,5 l ve směsi s 1 l vkládacího pufru se Sybr Green. 22 Certifikovaná metodika pro praxi

24 Příloha s obrázky 1) Kolonie C.m. subsp. michiganensis 2) Imunofluorescenční test 4) Infikované nekrotické listy 5) Skvrny typu ptačí oko 3) Napadené cévní svazky

25 Tab. 1: Fytopatogenní a saprofytické bakterie doprovázející C. m. subsp. michiganensis v rostlinách rajčete Bakterie Kmen PTA ELISA IIF PCR a PCR b c Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis CCM Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus d RICP 12/5/ Clavibacter michiagensis subsp. nebraskensis CCM Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus d NCPPB Curtobacterium albidum CCM Curtobacterium flaccumfaciens CCM Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum CCM Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum CCM 1008 Dickeya sp. CCM Pantoea agglomerans CCM Pantoea dispersa CCM 4414 Pseudomonas corrugata Re Pseudomonas fluorescens CCM Pseudomonas marginalis pv. marginalis BCCM/LMG 2210 Pseudomonas syringae pv. syringae CCM 4073 Pseudomonas syringae pv. tomato RICP 2/1/99 Re Pseudomonas viridiflava BCCM/LMG 2352 Rahnella aquatilis CCM Ralstonia solanacearum NCPPB 2505 Xanthomonas vesicatoria CCM PTA -ELISA hladina absorbance: negativní (< 0.20); + slabě pozitivní ( ); ++ středně pozitivní ( ); +++ silně pozitivní (> 0.50) IIF počet fluoreskujících buněk v okénku: negativní (žádná); + slabě pozitivní (1 100); ++ středně pozitivní ( ); +++ silně pozitivní (> 500) PCR intenzita proužků: žádný proužek; + slabě intenzivní proužek; ++ středně intenzivní proužek; +++ silně intenzivní proužek CCM Česká sbírka mikroorganizmů, Masarykova Univerzita, Brno, česká republika BCCM/LMG Belgian Co -ordinated Collections of Micro -organisms a Komerční primery Cmm 5,6 (Dreier et al., 1995) před úpravou PCR protokolu b Komerční primery po optimalzaci PCR protokolu c Vlastní primery v optimalizovaném protokolu Cmm1F,R (Kokošková et al., 2010) d Ověření specifičnosti polyklonálního antiséra pro C. m. subsp. michiganensis prokázalo křížovou reakci i s poddruhy, které se v rajčatech nevyskytují

26 Obr. 6: Specifičnost komerčních (Cmm5, Cmm6) a vlastních (Cmm1F, Cmm1R) primerů pro identifikaci Clavibacter michiganen subsp. michiganensis sis testem PCR M -100bp DNA Step Ladder (Promega) Linka 1 (Cmm), 2 (Cmn), 3 (Cf), 4 (Ca), 5 (Pd), 6 (Pag), 7 (Ra), 8 (Rs), 9 (Pcor), 10 (Pss), 11 (Pf), 12 (Pmm), 13 (Pv), 14 (Pst), 15 (Xv), 16 (Ecc) Optimalizace PCR protokolu 1. Komerční primery: teplota annealingu zvýšena z 55 na 66 o C a doba annealingu snížena z 60 na 30 sec Cmm5 původní: 5 GCG AAT AAG CCC ATA TCA A -3 ; Cmm5 opravená: 5 GCG AAT ACG CCC ATA TCA A -3 ; 2. Vlastní primery Cmm1F, Cmm1R: teplota annealingu stanovena na 69 o C a doba annealingu na 10 sec specifi kace primerů Cmm1F: 5 GAC AAG CAC CTC TAC ACC TGG -3 ; Cmm1R: 5 TTG ATC CCT GAC TTC AGC GT

27 Graf 1 shrnuje výsledky 426 analýz ze vzorků indeterminantních rajčat podezřelých na přítomnost C. m. subsp. michiganensis. V 68 % vzorků byl patogen prokázán. Pomocí IF byl patogen spolehlivě detekován do ředění 1:1000 a pomocí ELISA do ředění 1:100 (nepřímá ELISA a DAS -ELISA) a 1:10 (PTA -ELISA). Všechny tři typy ELISA technik jsou doporučovány pro prověření příznakových vzorků rajčat na přítomnost C. m. subsp. michiganensis. Na základě našich výsledků však nepřímá ELISA pomocí MAb byla citlivější než PTA -ELISA s PAb. IF byla cca 10 citlivější než ELISA techniky, což odpovídá literárním údajům (Alvarez 2004). Optimalizovaná PCR s komerčními (Dreier et al. 1995) i našimi vlastními primery pro PCR z genu tomatinázy bakterie C. m. subsp. michiganensis (Kokoskova et al. 2010) byly srovnatelné. Patogen byl spolehlivěji detekován z bází, stonků a řapíků než z listů napadených rostlin.

28 Mapa: Průzkum bakteriálního vadnutí rajčete v České republice Pro hodnocení napadení porostů rajčat původcem bakteriálního vadnutí byla použita čtyřbodová stupnice: 0 žádné, 1 slabé (do 25 % rostlin s příznaky choroby), 2 střední (od 25 do 50 % rostlin s příznaky choroby, 3 silné (více než 50 % rostlin s příznaky choroby)

29 IV) Srovnání novosti postupů Metodika zahrnuje výběr, ověření a optimalizaci několika diagnostických metod používaných pro detekci a determinaci C. m. subsp. michiganensis v souladu s požadavky EU (graf 1). Při determinaci čistých kultur podezřelých jako C. m. subsp. michiganensis i při detekci původce bakteriálního vadnutí z příznakově charakteristických i problematických vzorků doporučujeme rostlinné maceráty ověřit v optimalizovaných IF a PCR testech. Námi optimalizovaný IF test zahrnuje prodloužení fixačních časů ve srovnání s časy uvedenými v protokolu EU, neboť prodloužené časy činí IF test citlivější. Námi optimalizovaný PCR test zahrnuje možnost použít 2 varianty: 1) komerční primery v námi optimalizovaném PCR protokolu, který se vyznačuje zvýšením teploty a zkrácením doby annealingu a úpravou komerčních primerů, které jsou po optimalizaci specifičtější než původní primery (obr. 6) anebo 2) vlastní primery navržené z genu tomatinázy, které jsou 10 citlivější než primery komerční. Specifičnost námi optimalizovaných komerčních i našich primerů je srovnatelná (tab. 1). Obě varianty PCR testu jsou specifičtější než původní PCR test a varianta s našimi primery je navíc citlivější než původní PCR test. Techniky jako nepřímá ELISA, DAS -ELISA a PTA -ELISA nedoporučujeme, protože jsou méně citlivé i specifické ve srovnání s námi optimalizovanými IF a PCR testy (tab. 1, graf 1). Dále doporučujeme, aby rutinní rozbory rostlinných vzorků rajčat podezřelých na přítomnost C. m. subsp. michiganensis prováděné v laboratořích Státní rostlinolékařské správy vycházely z analýz cévních svazků, v nichž patogen přežívá mnohem déle než v listech (graf 1). 28 Certifikovaná metodika pro praxi

30 V) Popis uplatnění metodiky Metodika je určena orgánům státní správy, šlechtitelským organizacím a zemědělské praxi. Předmětem uplatňované metodiky je optimalizovaný diagnostický protokol pro C. m. subsp. michiganensis, který je určen především pro rutinní využití v diagnostických laboratořích Státní rostlinolékařské správy. Součástí metodiky je i mapa průzkumu výskytu a šíření původce bakteriálního vadnutí rajčete v ČR v letech sledování choroby, kterou ocení především šlechtitelsko -semenářské organizace a jednotliví pěstitelé. VI) Ekonomický přínos Předpokládané ekonomické přínosy v diagnostické laboratoři mohou být tisíc ročně v důsledku využití spolehlivějších IF a PCR testů. V IF testech s prodlouženými časy v jednotlivých krocích uvedeného postupu je možné použít i protilátky, které jsou na hranici expirace či krátce za datem expirace. Může se tak ušetřit Kč ročně. Optimalizací primerů byly odstraněny falešně pozitivní reakce, což přineslo jak úsporu chemikálií pro další analýzu podezřelých vzorků, tak i snížení pracnosti a úsporu času, a v neposlední řadě i získání přesnějších výsledků. Námi navržené primery Cmm- 1F,R vykazovaly oproti komerčním (Cmm 5,6) o 1 řád (10 3 CFU/ ml) vyšší citlivost. V případě použití vlastních primerů bylo možno podchytit i infikované rostlinné vzorky s nižší koncentrací patogena než při použití primerů komerčních. Při předpokládaném množství testovaných vzorků cca ks ročně, tak pouze na chemikáliích vč. primerů potřebných k PCR lze ušetřit cca Kč. Ekonomický přínos spolehlivé diagnostiky původce bakteriálního vadnutí rajčete zhodnotí cílový uživatel, což jsou jak pěstitelé Certifikovaná metodika pro praxi 29

31 zeleniny sdružené v Zelinářské unii ČR, tak i další pěstitelé zeleniny. Ekonomický přínos je možné vyjádřit v hodnotě zvýšené produkce konzumních rajčat i jejich osiva. Rajčata pro konzum se v posledních 3 letech pěstovala v průměru na ploše 409 ha a rajčata pro osivářské účely na ploše 3,51 ha. Výnos konzumních rajčat v posledních 3 letech dosahoval v průměru 39,08 t/ha. Výnos osiva rajčat činil v průměru za poslední 3 roky 0,397 t/ha. U výrobců představovala průměrná cena konzumních rajčat Kč/t, zatímco průměrná cena za osivo rajčat činila Kč/t. Škodlivost původce bakteriálního vadnutí nebyla dosud v ČR ekonomicky hodnocena, a proto je zapotřebí se opírat o zahraniční údaje. Snížení výnosů konzumních rajčat se může pohybovat v rozmezí %. Napadené semenné porosty rajčat by však musely být zamítnuty, neboť v případě C. m. subsp. michiganensis se jedná o karanténní bakterii, která se přenáší osivem. Spolehlivá diagnostika C. m. subsp. michiganensis se na procesu zvýšení výnosů může podílet odhadem %. Pokud bychom počítali pouze s polovičním přínosem spolehlivé diagnostiky, tedy s 5 10 %, dosáhl by ekonomický přínos za úsek konzumních rajčat i osiva celkově pro uživatele mil Kč ročně. 30 Certifikovaná metodika pro praxi

32 VII) Seznam použité související literatury ALVAREZ A. M.: Integrated approaches for detection of plant pathogenic bacteria and diagnosis of bacterial diseases. Annu. Rev. Phytopathol. 42, (2004). CHANG R. J., RIES S. M., PATAKY J. K.: Dissemination of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis by practices used to produce tomato transplants. Phytopathology 81, (1991). DREIER J., BERMPOHL A., EICHENLAUB R.: Southern hybridization and PCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Phytopathology 85, (1995). GLEASON M. L., BRAUN E. J., CARLTON W. M., PETERSON R. H.: Survival and dissemination of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in tomatoes. Phytopathology 81, (1991). GLEASON M. L., GITAITIS R. D., RICKER M. D.: Recent progress in understanding and controlling bacterial canker of tomato in Eastern North America. Plant Dis. 77, (1993). JAHR H., BAHRO R., BURGER A., AHLEMEYER J., EICHENLAUB R.: Interactions between Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis and its host plants. Environ. Microbiol. 1(2), (1999). JANSE J. D., KOKOŠKOVÁ B.: Indirect immunofluorescence microscopy for the detection and identification of plant pathogenic bacteria (In particular for Ralstonia solanacearum). In: Burns R. (eds) Plant Pathology. Techniques and Protocols. Scottish Agricultural Science Agency, DMB, Edinburg, UK: (2009). KANESHIRO W. S., MIZUMOTO C. Y., ALVAREZ A. M.: Differentiation of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis from seed borne saprophytes using ELISA, Biolog and 16S rdna sequencing. Eur. J. Plant Pathol. 116, (2006). KING, E.O., WARD, M.K., RANEY, D.E.: Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. labor. clin. Med. 44, (1954). Certifikovaná metodika pro praxi 31

33 KOKOŠKOVÁ B., MRÁZ I., HÝBLOVÁ J.: Comparison of specificity and sensitivity of immunochemical and molecular techniques for reliable detection of Erwinia amylovora. Folia Microbiol. 52 (2), (2007). KOKOŠKOVÁ B. Bakteriální choroby plodové zeleniny (II). Zahradnictví 11, (2008). KŮDELA V., NOVACKY A., FUCIKOVSKY L.: Rostlinolékařská bakteriologie. Academia, Praha 2002, 347 s. LOUWS F. J., BELL J., MEDINA-MORA C. M., SMART C. D., OPGENORTH D., ISHIMARU C. A., HAUSBECK M. K., DE BRUIJN F. J., FULBRIGHT D. W.: Rep-PCR-mediated genomic fingerprinting: A rapid and effective method to identify Clavibacter michiganensis. Phytopathology 88, (1998). OEPP/EPPO. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. OEPP/EPPO Bull. 35, , (2005). PÁNKOVÁ I., KOKOŠKOVÁ B.: Sensitivity and specificity of monoclonal antibody Mn -Cs1 for detection and determination of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, the causal agent of bacterial ring rot of potato. Plant Protect. Sci. 38, (2002). SANTOS M. S., CRUZ L., NORSKOV P., RASMUSSEN O. F.: Rapid and sensitive detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in tomato seeds by polymerase chain reaction. Seed Sci. Technol. 25, (1997). 32 Certifikovaná metodika pro praxi

34 VIII) Seznam publikací autorů předcházejících vypracování metodiky Beran P., Mráz I., Lenz O., Kokošková B Detection of important pathogenic bacteria on tomato and pepper using microarray technique. In: Proceedings of the 12th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria. June, 7 11, 2010, Saint -Denis, Lle de la Réunion, France: 55 Kokošková B Bakteriální choroby plodové zeleniny (II) Zahradnictví, č. 11: Kokošková B., Mráz I., Fousek, J Reliability of diagnostic techniques for identification of fluidal and less fluidal variants of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. J. Plant Pathol., 90 (2, Suplement), S (Abstract) ISSN Kokošková B., Mráz I., Fousek J Reliability of commonly used diagnostic techniques for Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. In: Šafránková I., Šefrová H. (eds.) XVIII. Czech and Slovack plant protection conference. Sborník abstraktů. MZLU v Brně, září 2009: 50. Kokošková B., Mráz I., Fousek J Comparison of specificity and sensitivity of immunochemical and molecular techniques for determination of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Folia Microbiol. 55(3): Kokošková B., Mráz I., Pouvová D., Beran P Průzkum bakteriálního vadnutí rajčete v ČR a spolehlivost detekce Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis z rajčat různými diagnostickými technikami. Úroda 12 (věd. příloha): Mráz I., Kokošková B., Beran P Detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis from tomato plants and seeds using ELISA, IF and PCR with commercial and own primers. In: Book of Abstracts of the 3rd International Symposium on Tomato Diseases. July, 25 30, 2010, Ischia, Naples, Italy: 110 Mráz I., Kokošková B., Beran P Detection of Clavibacter mi- Certifikovaná metodika pro praxi 33

35 chiganensis subsp. michiganensis from tomato plants and seeds using ELISA, IF and PCR with commercial and own primers. Acta Horticulturae. Proc. III rd on Tomato Diseases No. 914, Mráz I., Kokošková B., Beran P., Pouvová D Spolehlivost diagnostických technik pro detekci karanténní bakterie Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis v rostlinách a semenech rajčete. Úroda 12, (věd. příloha): Certifikovaná metodika pro praxi

36 IX) Dodatky Dodatek č. 1: Živná média: King B médium (King et al. 1954): pepton N o 3 20 g; glycerol 10 ml; K 2 HPO 4 1,5 g; MgSO 4. 7 H 2 O; agar 15 g; destilovaná voda do 1 L. Upravit ph na 7,0 7,2. Sterilizovat v autoklávu 15 minut při 120 o C. C médium (Dreier et al. 1995): pepton (pro bakteriologii) 10 g; kvasničný autolyzát 5 g; NaCl 5 g; glukosa 5 g; agar 20 g; destilovaná voda do 1 L. Upravit ph pomocí 1 N NaOH na hodnotu 7,0 7,2. Sterilizovat v autoklávu 20 minut při 121 C. MPA (masopeptonový) agar: živný agar č g; glukóza 7 g; agar 22 g; destilovaná voda do 1 L; Upravit ph na 7,0 7,2. Sterilizovat v autoklávu 15 minut při 120 o C. Dodatek č. 2 Pufry pro nepřímý IF test (podle NeogenEurope protokolu): Fosfátový pufr (PBS): chlorid sodný (NaCl) 8,0g; di- -hydrogenfosforečnan draselný (KH 2 PO 4 ) 0,2 g; hydrogenfosforečnan sodný (Na 2 HPO 4 ) 1,115 g; chlorid draselný (KCl) 0,2 g; destilovaná voda 1L; Upravit ph na 7,0 7,2 Glycerolový pufr: hydrogenfosforečnan sodný (Na 2 HPO 4 12 H 2 O) 3,2 g; di -hydrogenfosforečnan sodný (NaH 2 PO 4 2 H 2 O) 15 g; glycerol 50 ml; destilovaná voda 100 ml Certifikovaná metodika pro praxi 35

37 Dodatek č. 3 Sbírkové kmeny Jako pozitivní kontroly do testů jsou doporučovány sbírkové kmeny C. m. subsp. michiganensis, např. kmen BCCM/LMG 7333 a 5727 ze sbírky Belgian Co -ordinated Collections of Microorganisms/ Laboratory for Microbiology of the Faculty of Sciences of Ghent University, Ghent, Belgium Dodatek č. 4 Počítání typických fluoreskujících buněk v IF testu Nejprve spočítat průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím políčku (c). Poté vypočítat počet typických fluoreskujících buněk v jednom okénku sklíčka (C). C = c S/s kde S = plocha jednoho políčka na sklíčku s více okénky s = plocha pole objektivu s = π i 2 /4G 2 K 2 kde i = koeficient políčka (v rozmezí od 8 24 podle typu okulárů) K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25) G = zvětšení objektivu (např. 100 aj.) Nakonec vypočítat počet typických fluoreskujících buněk na 1 ml testovaného vzorku (N). N = C 1000/y kde y = objem vzorku aplikovaného na jedno okénko (v našem případě 20) 36 Certifikovaná metodika pro praxi

38 Dodatek č. 5 Sekvence primerů podle Dreier et al. (1995) použitých v metodice: Primer Cmm5: 5 gcg AAT AAg CCC ATA TCA A 3 (19 mer) Primer Cmm6: 5 CgT CAg gag gtc gct AAT A 3 (19 mer) Sekvence vlastních primerů Cmm1F a Cmm1R je uvedena v textu. Dodatek č. 6 Příprava pufru 1 TE V současné době lze zakoupit již hotový 100 TE Buffer (Appli- Chem), ph 8,0 a následně vhodným naředěním získáme pufr o požadované koncentraci. Certifikovaná metodika pro praxi 37

39 Autoři: Ing. Blanka Kokošková, CSc. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Drnovská 507, Praha 6-Ruzyně Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc. Ing. Jan Fousek, Ph.D. Biologické centrum AV ČR, v. v. i. Ústav molekulární biologie rostlin Branišovská 31, České Budějovice Název: Metodika diagnostiky Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, původce bakteriálního vadnutí rajčete Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Drnovská 507, Praha 6-Ruzyně Vydáno bez jazykové úpravy Tisk a vazba: Powerprint, s. r. o. Brandejsovo nám. 1219/1, Praha 6-Suchdol Vyšlo v roce: 2012 Kontakt na autory: bkokoskova@vurv.cz; mraz@umbr.cas.cz Autoři fotografií: B. Kokošková, J. Fousek Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2012

40

41

42 Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i ISBN: