Ústav molekulární biologie rostlin BC AV ČR České Budějovice Oddělení rostlinné virologie CVIČENÍ Z ROSTLINOLÉKAŘSKÉ BAKTERIOLOGIE

Transkript

1 Ústav molekulární biologie rostlin BC AV ČR České Budějovice Oddělení rostlinné virologie CVIČENÍ Z ROSTLINOLÉKAŘSKÉ BAKTERIOLOGIE Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 1

2 Téma: PŘÍPRAVA ŢIVNÉHO MÉDIA PRO BAKTERIE, AUTOKLÁVOVÁNÍ, ODBĚR PLETIV K IZOLACI BAKTERIÁLNÍCH KULTUR, OČKOVÁNÍ BAKTÉRIÍ DO TEKUTÉHO MÉDIA. Příprava a autoklávování materiálu (zkumavky, zátky, pinzety, skalpely atd.). Příprava ţivného média masopeptonového agaru s glukosou (MPAg) pro baktérie. Masopeptonový agar s glukosou (MPAg) - mnoţství pro 250 ml půdy Živný agar č. 2 Kvasničný autolyzát (bacto yeast extract) Glukosa (nebo sacharosa) - 10,0 g - 1,3 g - 2,5 g Upravit ph pomocí 1 N NaOH na hodnotu 7,2 agar - 5,0 g (1-2%) Autoklávovat 20 min. při C. Nejvhodnějším místem pro odběr pletiv k izolaci baktérií je rozhraní mezi nekrotickým a živým pletivem (v těchto místech nekrogenní fytopatogenní baktérie nejlépe přežívají). Na v plameni vyžíhaném hodinovém sklíčku ve sterilní destilované vodě pomocí dvou skalpelů rozmacerujeme (rozdrtíme) rostlinné pletivo (list, kůra, květ atd.) předtím omyté ve vodě a lihu a poté tuto suspenzi vysejeme na bakteriální živnou půdu (MPAg) v Petriho misce. Inkubujeme v termostatu při C po dobu hod. Výroba zátek. Zásady a pravidla při práci ve flow boxu. Očkování bakteriálních kultur do tekutého živného média (C-medium), kultivace na třepačce při pokojové teplotě (cca 24 hodiny) pro následné zamražení v eppendorfkách v C s přídavkem glycerolu (15% objemových - např. 850 ul media s bakt. kulturou ul autoklávovaného - sterilního glycerolu). Nalévání Petriho misek, rovných a šikmých agarů ve zkumavkách. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 2

3 Téma: OČKOVÁNÍ BAKTÉRIÍ, ZPŮSOBY UCHOVÁVÁNÍ BAKTÉRIÍ, LYOFILIZACE, LYOFILIZAČNÍ PŘÍSTROJ. Příprava tekutého C-média pro lyofilizaci. C - médium (Dreier et al., 1995) pro koryneformní baktérie - množství pro 250 ml půdy Trypton (pepton, bactopepton) Kvasničný autolyzát NaCl glukosa agar - 2,50 g - 1,25 g - 1,25 g - 1,25 g - 5,00 g (1-2%) - nepřidáváme Upravit ph pomocí 1 N NaOH na hodnotu 7.2, autoklávovat 20 min. při C. Příprava ampulek pro lyofilizaci (autoklávování, výroba popisek). Rozpipetování narostlé bakteriální kultury v tekutém médiu (cca 850 ul) z minulého cvičení do eppendorfek, přidání 15% objemových sterilního glycerolu (cca 150 ul) a zamražení v C v mrazicím boxu. Zásady a pravidla při očkování bakteriálních kultur na živná média ve flow boxu. Očkování bakteriálních kultur na Petriho misky (plošný roztěr, křížový roztěr, hady), na šikmé a rovné agary ve zkumavkách. Způsoby uchovávání bakteriálních kultur (Petriho misky, šikmé a rovné agary ve zkumavkách, zamražení v C v tekutém médiu s 15% glycerolu, kryozkumavky s korálky, lyofilizace). Příprava bakteriální kultury pro lyofilizaci - naočkování Petriho misek plošný roztěr. Lyofilizace je vymrazování, pochod při němž se materiál zmrazí a ve vakuu se z něj odpařuje voda. Používá se k sušení kávy, mléka, masa nebo zeleniny, ale i k uchování biologických materiálů (tkání). Příprava lyofilizačního přístroje, vysvětlení funkce, obsluha přístroje. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 3

4 Téma: LYOFILIZACE BAKTERIÁLNÍCH KULTUR, PŘÍPRAVA TZV. VKLÁDACÍHO PUFRU PRO NANÁŠENÍ VZORKŮ NA AGAROSOVÝ GEL PŘI ELEKTROFORESE, DOPLNĚNÍ GLYCEROLU NA ROVNÉ AGARY VE ZKUMAVKÁCH Příprava lyofilizačního přístroje. Viz podrobný návod u lyofilizátoru. Příprava bakteriální kultury k lyofilizaci smytí baktérií tekutým C-médiem z misek se živným médiem do lyofilizačních ampulí, zamražení v C po dobu 1 hod. Vlastní lyofilizace bakteriálních vzorků. Lyofilizace bakterií probíhá přibližně po dobu 24 hodin. Příprava tzv. Loading Buffer (vkládacího pufru) pro elektroforesu. Na 10 ml vkládacího pufru smíchat 3 ml glycerolu, 200 l 0,5% Bromphenol Blue, 200 l 0,5% Xylen Cyanol a doplnit pufrem 1 x TE (lze zakoupit již hotový 100 x TE Buffer, ph 8.0, a následně vhodným naředěním získáme pufr o požadované koncentraci) do objemu 10 ml. Do 0,5 ml této směsi přidat 0,5 l barviva Sybr Green (Sigma Aldrich), kterým se zviditelňuje DNA. Takto připravený vkládací pufr lze uchovávat v lednici v dobrém stavu přibližně jeden týden. Po této době je potřeba připravit pufr nový. Doplnění sterilního glycerolu na rovné agary ve zkumavkách po nárůstu bakteriální kultury. Glycerol se doplní do vrstvy o výšce cca mm, hrdlo zkumavky i uzávěr se ožehnou před uzavřením v plameni nad kahanem. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 4

5 Téma: LYOFILIZACE BAKTÉRIÍ POKRAČOVÁNÍ, KONTROLA RŮSTU BAKTÉRIÍ Zatavování lyofilizačních ampulí nad sklářským kahanem. Kontrola otevření zatavené lyofilizační ampule, přidání 1 ml fyziologického roztoku (0.85% NaCl), výsev na MPAg misky, po 2-4 dnech kontrola nárůstu bakteriálních kultur na miskách. Kontrola nárůstu bakteriálních kultur naočkovaných na MPAg misky ze zamrazeného ţivného média s přídavkem glycerolu. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 5

6 Téma: RŮZNÉ ZPŮSOBY POUŢITÍ BAKTERIÁLNÍ KULTURY (CELÉ BUŇKY, BAKTERIÁLNÍ LYZÁT, DNA), IZOLACE GENOMOVÉ DNA Z BAKTERIÁLNÍ KULTURY Pro další práci lze použít bakteriální kulturu ve 3 různých variantách: 1) Bakteriální kulturu bez jakýchkoliv úprav odebranou z misky sterilním párátkem nebo kličkou přidat přímo do namíchané PCR reakce. 2) Bakteriální kulturu lyzovat pomocí NaOH, získaný bakteriální lyzát použít v PCR. 3) Použít vyizolovanou genomovou (bakteriální) DNA V současné době existuje více možností pro izolaci genomové (bakteriální) DNA z bakteriální kultury. Izolaci můžeme provést pomocí kitů - např. Wizard SV Genomic DNA Purification System, InstaGene Matrix aj. Pro izolaci bakteriální DNA z čerstvého nebo sušeného rostlinného materiálu existuje rovněž několik kitů - např. DNeasy Plant Mini Kit, Nucleo Spin Plant II aj. Po izolaci bakteriální DNA je vhodné zkontrolovat výsledný stav (množství získané DNA) na elektroforetickém gelu s následnou dokumentací - vyfocením. Izolace genomové (bakteriální) DNA z bakteriální kultury za pouţití InstaGene Matrix 1) Odebrat z misky párátkem bakteriální kulturu, resuspendovat párátkem v eppendorfce v 1 ml sterilní destilované vody. 2) Centrifugovat cca 1 min. při g. 3) Vylít vodu. 4) K sedimentu přidat 200 ul InstaGene Matrix, resuspendovat na vortexu. 5) Eppendorfky umístit na heat blok při 56 C na dobu min. 6) Vortexovat silně 10 sec. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 6

7 7) Eppendorfky dát na 8 min. do vodní lázně nebo na heat blok při teplotě 100 C. 8) Vortexovat silně 10 sec. 9) Centrifugovat cca 3 min. při g. 10) Použít 20 ul vzniklého supernatantu pro 50 ul PCR reakci (tj. cca 6 ul supernatantu pro 15 ul PCR reakci). 11) Před novým použitím supernatantu zopakovat kroky 8) a 9). 12) Supernatant nutno zamrazit a skladovat v -20 C. Nebo lze pouţít postup Izolace bakteriální (genomové) DNA z bakteriální kultury pomocí kitu Wizard SV Genomic DNA Purification System (s centrifugou) 1) Odebrat párátkem minimální množství bakteriální pasty, přenést do 500 µl 1x TE (v případě potřeby přidat 100 µl roztoku lysozymu zásobní roztok pro 10 vzorků připravit smísením 0,03 g lysozymu ul sterilní destilované vody - vţdy připravovat čerstvý). 2) Inkubovat při 20 C po dobu 10 min. 3) Centrifugovat 2 min. při RPM, supernatant odebrat (vylít, odpipetovat). 4) Přidat 150 µl Lysis Buffer, dát na 5 min. na heat blok při 55 C. 5) Suspenzi zvortexovat a přenést do kolonek. 6) Nasadit kolonky na 2 ml eppendorfky dodávané s kitem a centrifugovat 30 sec. při RPM, vylít, co proteklo. 7) Napipetovat 800 µl Wash Solution, centrifugovat, vylít, co proteklo (zopakovat 4x). 8) Po posledním promytí centrifugovat 2 min. při RPM, vylít, co proteklo. 9) Nasadit kolonku na novou 1,5 ml eppendorfku, napipetovat 250 µl Nuclease Free Water, počkat 2 min. a centrifugovat 2 min. při RPM. 10) Proteklý eluát s DNA zamrazit a skladovat v -20 C. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 7

8 Téma: IZOLACE BAKTERIÁLNÍ DNA Z ROSTLINNÉHO PLETIVA POMOCÍ KITU DNEASY PLANT MINI KIT 1) Přidat 400 ul pufru AP1 a 4 ul RNase A (koncentrace 100 mg/ml) k maximálně 100 mg rozdrceného vlhkého (100 ul macerátu) nebo ke 20 mg vysušeného rostlinného pletiva a silně vortexovat. Nemíchat pufr AP1 a RNase A před pouţitím. 2) Inkubovat vzniklou směs 10 min. při 65 0 C. Během inkubace 2-3x obrátit zkumavku dnem vzhůru. Během tohoto kroku se lyzují buňky. 3) Přidat 130 ul pufru AP2 k lyzátu, zamíchat a inkubovat 5 min. na ledu. V tomto kroku se sráţí proteiny a polysacharidy. Moţno centrifugovat lyzát 5 min. při g (cca RPM) - dobrovolně. 4) Přemístit lyzát do QIA shredder Mini Spin Column (kolonek) umístěných ve 2 ml sběracích eppendorfkách a centrifugovat 2 min. při g ( RPM). 5) Přemístit proteklou frakci z kroku 4) do nové eppendorfky (není dodávána) bez porušení rozbitého buněčného sedimentu. 6) Do pufru AP3/E přidat před použitím etanol. Přidat 1,5 objemu (V) pufru AP3/E, lyzát se vyjasní a vzniklou směs ihned promíchat pipetováním. 7) Dát 650 ul vzniklé směsi včetně precipitátu (který se může utvořit) z kroku 6) do DNeasy Mini Spin Column - kolonek - umístěných ve 2 ml sběracích eppendorfkách (dodávány). Centrifugovat 1 min. při minim g (8.000 RPM pro většinu mikrocentrifug) a odstranit - vylít - co proteklo. Ponechat si sběrné eppendorfky. 8) Opakovat krok 7) se zbylým vzorkem. Vylít opět vodnou fázi - to co proteklo - a vyhodit sběrné eppendorfky. 9) Do pufru AW nutno přidat etanol. Umístit DNeasy Mini Spin Column (kolonky) do nových 2 ml sběrných eppendorfek (dodávány), přidat 500 ul pufru AW do kolonek a centrifugovat 1 min. při minim g (minim RPM). Vyhodit proteklou vodnou fázi a opět pouţít sběrací eppendorfky v kroku 10). 10) Přidat 500 ul pufru AW do kolonky a centrifugovat 2 min. při g (cca RPM) až do vysušení membrány v kolonce. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 8

9 11) Přendat kolonku do 1,5 nebo 2,0 ml eppendorfky (nedodávány) a napipetovat 100 ul pufru AE přímo na membránu v kolonce. Inkubovat 5 min. při pokojové teplotě (15 až 25 0 C) a potom centrifugovat 1 min. při minim g (cca RPM) až do vyprázdnění kolonky. 12) Opakovat krok 11). Do 1,5 ml eppendorfky by nemělo vytéci více neţ 200 ul, jinak by kolonka přišla do kontaktu s eluátem. 13) Získaný eluát naředit 100 x, 1 ul 100 x naředěného eluátu dát do reakce PCR. 14) Eluát - vyizolovanou DNA nutno zamrazit a skladovat v -20 C. Nebo lze pouţít postup Izolace bakteriální DNA z rostlinného pletiva pomocí kitu Nucleo Spin Plant II Před začátkem izolace nahřát eluční pufr PE ve vodní lázni nebo inkubátoru na 65 C, před samotnou elucí ustálit na teplotě 70 C. 1) Přidat 400 ul pufru PL1 k maximálně 100 mg rozdrceného vlhkého (100 ul macerátu) nebo ke 20 mg vysušeného rostlinného pletiva a důkladně vortexovat. Lyzují se buňky. 2) Přidat 10 ul RNase A roztoku a vzorek důkladně zamíchat. 3) Inkubovat vzniklou směs 10 min. při 65 0 C. Pro některý rostlinný materiál je výhodné zvýšit dobu inkubace na min. 4) Přemístit NucleoSpin Filter (fialové kroužky) do nové 2 ml sběrací eppendorfky (Collection Tube) a vylít lyzát do kolonky. Centrifugovat 2 min. při g ( RPM), uchovat, co proteklo a vyhodit NucleoSpin Filter. Pokud přes filtr neproteklo vše, opakovat tento krok. 5) Je-li v eluátu viditelný sediment, přenést čistý supernatant (vodnou fázi) do nové 1,5 ml eppendorfky (není dodávána). 6) Přidat 450 ul PC pufru a důkladně zamíchat pomocí nasátí pipetou (5x) nebo vortexováním. 7) Umístit NucleoSpin Plant II column (zelený kroužek) do nové 2 ml sběrací eppendorfky a nalít maximálně 700 ul vzorku. Centrifugovat 1 min. při g ( RPM), vyhodit, co proteklo. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 9

10 8) Přidat 400 ul PW1 pufru do NucleoSpin Plant II column. Centrifugovat 1 min. při g ( RPM), vyhodit, co proteklo. 9) Ujistit se, zda byl přidán etanol do koncentrátu pufru PW2. Přidat 700 ul pufru PW2 do NucleoSpin Plant II column. Centrifugovat 1 min. při g ( RPM), vyhodit, co proteklo. 10) Přidat dalších 200 ul pufru PW2 do NucleoSpin Plant II column. Centrifugovat 2 min. při g ( RPM), vyhodit, co proteklo a vysušit kompletně silikonovou membránu. 11) Umístit NucleoSpin Plant II column do nové 1,5 ml eppendorfky (nedodávána). Na membránu napipetovat 50 ul pufru PE (ohřátý na 70 C). Inkubovat NucleoSpin Plant II column 5 min. při teplotě 70 C. Centrifugovat 1 min. při g ( RPM). Pufr s DNA uchovat. 12) Opakovat krok 11) s dalšími 50 ul pufru PE (70 C) a slít do eppendorfky z předchozího kroku s 50 ul pufru PE s DNA. Máme tedy celkem 100 ul vyizolované DNA. 13) Eluát - vyizolovanou DNA nutno zamrazit a skladovat v -20 C. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 10

11 Téma: PŘÍPRAVA AGAROSOVÉHO GELU PRO ELEKTROFORESU, HORIZONTÁLNÍ VERTIKÁLNÍ ELEKTROFORESA (ELFO), VYSVĚTLENÍ PRINCIPU ELFO, ZAPOJENÍ ELFO, PŘÍPRAVA PUFRU PRO ELFO. Příprava vzorků a agarosového gelu pro elektroforesu. Jeden l směsi vkládacího pufru (příprava viz cvičení č. 3) se Sybr Green smícháme s příslušným množstvím vyizolované genomové DNA (dle použitého izolačního kitu) a nanášíme na zpravidla 1 % agarosový gel umístěný v horizontální elektroforese. Pro přípravu agarosového gelu používáme agarosu SeaKem LE Agarose. Velikost hřebenů a agarosového gelu volíme dle počtu analyzovaných vzorků. Příslušné množství agarosy s vhodným pufrem (např. TBE, TE aj.) rozvaříme v mikrovlnné troubě. Orientace běhu vzorků na gelu je od minus pólu k plus pólu. Pufr pouţívaný v elektroforese jako elektrolyt (např. 1x TE) musí být shodný s pufrem pouţitým pro přípravu agarosového gelu. Jako marker pro zjištění velikosti amplifikátů používáme v tomto případě tzv. stovkový velikostní standard (marker) bp DNA Ladder, který nanášíme v množství 1,0-1,5 l ve směsi s 1 l vkládacího pufru se Sybr Green. Pro každou elfo (dle velikosti gelu, množství elektrolytu) používáme již odzkoušenou velikost napětí a proudu, kterou nastavíme na napájecím zdroji. Rovněž je nutné dodržet dobu běhu (čas) vzorků, aby nedošlo k vyputování analyzovaných vzorků z gelu. Vysvětlení činnosti a ovládání dokumentačního přístroje, kontrola gelu s vyizolovanou bakteriální DNA po ukončení běhu na elfo na dokumentačním UV přístroji, zhotovení dokumentačních fotografií získaných výsledků. Objednávání primerů (oligonukleotidů) pomocí internetu. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 11

12 Téma: PŘÍPRAVA BAKTERIÁLNÍHO LYZÁTU, PCR S POUŢITÍM CELÝCH BAKTERIÁLNÍCH BUNĚK, BAKTERIÁLNÍHO LYZÁTU A VYIZOLOVANOU GENOMOVOU DNA, POROVNÁNÍ DOSAŢENÝCH VÝSLEDKŮ Bakteriální lyzát se připraví následujícím způsobem: Připravit čerstvý 50 mm NaOH Sterilní kličkou o objemu 1 l přenést 24 hodinovou bakteriální kulturu kultivovanou při cca 28 0 C (platí pro gram negativní bakterie) do 1,5 ml eppendorfky se 100 l čerstvě připraveného 50 mm NaOH a řádně vortexovat Směs na heat bloku zahřívat 5-10 min. (gram negativní bakterie) při C, pak rychle zchladit na ledu K tomuto alkalickému lyzátu přidat 900 l sterilní destilované vody a vortexovat Bakteriální lyzát uchovávat na ledu Přidat 1 l lyzátu do namíchané PCR reakce Při kaţdé nové přípravě bakteriálního lyzátu je nutné připravit nový 50 mm NaOH. PCR (polymerázová řetězová rekace, Polymerase Chain Reaction) Princip polymerázové řetězové reakce (PCR) PCR je metoda, která umožňuje amplifikaci specifických DNA sekvencí in vitro bez klonování. Součástí reakce jsou 1) oligonukleotidové primery, které se po denaturaci DNA specificky připojí ke komplementární sekvenci ohraničující amplifikovanou oblast a 2) termostabilní polymeráza, která v přítomnosti volných dntp katalyzuje syntézu podle templátového řetězce. Primery jsou orientovány tak, že každý na opačném vlákně je prodlužován směrem k druhému. Opakování cyklu: 1. denaturace templátu, 2. připojení primerů, 3. syntéza nových řetězců DNA vede k exponenciální amplifikaci oblasti mezi primery. PCR je dosud nejcitlivější detekční metoda, vzhledem k tomu, že lze teoreticky z jediné molekuly DNA namnožit řádově nanogramová množství čisté DNA během několika hodin. Primery jsou syntetické oligonukleotidy a jejich připojení ve druhém kroku PCR cyklu závisí na komplementaritě vazeb v oblasti primer templát. Hybridizační teplotu pro přisedání primeru k templátovému jednořetězci DNA je možné přibližně určit podle vzorce: Tan = 4(G + C) + 2(A + T) - 5 EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 12

13 Čím vyšší je teplota annealingu, tím je PCR reakce zpravidla specifičtější. Polymeráza. Automatizaci PCR umožnilo použití termostabilního enzymu izolovaného z extrémně termofilních baktérií. Nejčastěji je používána Taq DNA polymeráza získaná z bakterie Thermus aquaticus. Optimální polymerázovou aktivitu má při 72 o C, poločas inaktivace při 95 o C je cca 60 min. Reakční směs PCR. PCR reakci zcela postačuje provádět v celkem 15 l reakční směsi. Místo jednotlivých komponentů (polymeráza, nukleotidy, pufr, MgCl 2 aj.) je vhodné používat tzv. PPP Master Mix, kde jsou výše zmiňované komponenty vyváženě zastoupeny. Používané primery skladujeme obvykle jako zásobní roztok v koncentraci 200 pmol/ l v mrazícím boxu při teplotě C, před použitím je pak ředíme 10x, tj. na koncentraci 20 pmol/ l. Tyto zbylé naředěné primery skladujeme co nejkratší dobu opět v mrazícím boxu. Používané balení PPP Master Mix skladujeme v lednici, ostatní balení v zásobě pak v mrazícím boxu také při teplotě C. Příprava amplifikační směsi s primery pea1 a pea2 s pouţitím PPP Master Mix PPP Master Mix Primer pea1 (20 pmol/ul) Primer pea2 (20 pmol/ul) Bakteriální DNA Sterilní destilovaná voda Celkem 7,5 ul 0,5 ul 0,5 ul 1,0 ul 5,5 ul 15,0 ul Příklad PCR programu pro primery pea1, pea2 Úvodní denaturace: 5 min C (1) Denaturace: 1 min C (2) Doba a teplota annealingu: 40 sec C (3) Syntéza DNA: 1 min C (4) Krok (2) až (4) opakovat 35x (5) Syntéza řetězce: 15 min C (6) Chlazení při 4 0 C (7) EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 13

14 Nested a seminested PCR (hnízdové) Pouţití více neţ 2 ks primerů. Modifikace PCR, která značně zvyšuje citlivost reakce a může eliminovat její nespecifické produkty. První dvojice primerů ohraničuje větší oblast DNA, která je amplifikována jako první za standardních podmínek. Následně je přidán primer nebo primery hybridizující uvnitř té části DNA, která byla amplifikována první dvojicí primerů. Varianta seminested PCR - do druhé amplifikace je přidán jen jeden vnitřní primer (často používáno pro metodu gene walking, když je známa sekvence templátové DNA pouze k jednomu z primerů). Zásady při navrhování primerů, ukázka navrhování primerů na PC. Primery by měly: 1) Obsahovat alespoň 50% zastoupení G a C vzhledem k větší pevnosti vazby páru G C než A T. 2) Mít na 3 - konci poslední 2 nukleotidy G nebo C. 3) Být bez sekundárních struktur (palindromy) a netvořit navzájem dimery. 4) Mít délku alespoň 15 nukleotidů. 5) Rozdíl Tan obou primerů by měl být nejvýše 5 o C, při větších rozdílech v hybridizačních teplotách primerů je vhodné použít v cyklu dvě různé Tan. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 14

15 Téma: REP-PCR (REPETITIVE SEQUENCE BASED PCR) Konzervované repetitivní elementy (ERIC, BOX, REP). Jsou to vysoce konzervativní repetitivní sekvence vyskytující se v mnoha kopiích v genomech většiny gram-negativních a několika gram-pozitivních bakterií. Tyto sekvence byly rozděleny do třech skupin. Jsou to bp dlouhé repetitivní extragenické palindromické (REP) sekvence, bp velký enterobakteriální repetitivní intergenový consensus (ERIC) a 154 bp velké BOX elementy. Od těchto úseků odvozené primery jsou používány při metodách tzv. genomického fingerprintingu založených na PCR (rep-pcr). Pomocí nich lze odlišit prokaryotní organismy aţ na úroveň bakteriálních kmenů. Metoda rep-pcr je založena na amplifikaci úseků mezi konzervativními repetitivními oblastmi pomocí dvou různých dvojic primerů (REP, ERIC) a jednoho samostatného primeru (BOX), které byly na jejich základě odvozeny. Výsledkem reakce je pro danou bakterii specifické spektrum PCR produktů tvořené současně rozdílnou velikostí jednotlivých amplifikačních produktů i jejich celkovým počtem. Po elektroforetickém rozdělení těchto fragmentů získáme vysoce specifické tzv. DNA otisky. Tyto otisky se dále za účelem přesné identifikace organismu porovnávají s databází a na základě vzájemných podobností jsou vyhodnoceny. Otisky se ale mohou také porovnávat přímo mezi sebou. To se provádí zejména v případech, kdy je potřeba zjistit genetickou příbuznost v určité skupině izolátů nebo u vyšších taxonomických stupňů. Příprava amplifikační směsi pro rep-pcr s primerem BOXA1R PPP Master Mix Primer BOXA1R (20 pmol/ul) Bakteriální DNA (bakteriální kultura) Sterilní destilovaná voda Celkem 7,5 ul 2,0 ul 1,5 ul 4,0 ul 15,0 ul EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 15

16 Příprava amplifikační směsi pro rep-pcr s primery ERIC 1R, ERIC 2 a primery REP 1, REP 2 PPP Master Mix Primer ERIC 1R resp. REP 1(20 pmol/ul) Primer ERIC 2 resp. REP 2 (20 pmol/ul) Bakteriální DNA (bakteriální kultura) Sterilní destilovaná voda Celkem 7,5 ul 2,0 ul 2,0 ul 2,0 ul 1,5 ul 15,0 ul Příklad PCR programu pro rep PCR s primery BOXA1R a ERIC 1R, ERIC 2 Úvodní denaturace: 5 min C (1) Denaturace: 1 min C (2) Doba a teplota annealingu: 1 min C (3) Syntéza DNA: 2,5 min C (4) Krok (2) až (4) opakovat 35x (5) Syntéza řetězce: 15 min C (6) Chlazení při 4 0 C (7) EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 16

17 Téma: VYSVĚTLENÍ PRINCIPU DOT BLOT A S - BLOT HYBRIDIZACE, POUŢITÝ MATERIÁL A PŘÍSTROJE, DEMONSTRACE S - BLOT HYBRIDIZACE Podstatou dot blot hybridizace je hybridizace (párování) komplementárních jednovláknových úseků DNA. K detekci komplementárních úseků DNA testovaného (cílového) organismu se používá tzv. molekulární sonda (probe). Sondou je různě dlouhá molekula značené dsdna, ssdna nebo RNA o známé sekvenci. Je to definovaný, čili známý oligonukleotid nebo polynukleotid připravený z DNA známého definovaného kmene bakterie. Sonda hybridizuje pouze s denaturovanými řetězci nukleové kyseliny, které jsou komplementární. Hybridizace je omezena jen na ty oblasti, kde DNA sondy a DNA testovaného vzorku sdílejí homologní pořadí nukleotidů. Hybridizaci sond DNA s fragmenty testované DNA lze detekovat autoradiograficky na rentgenovém filmu v případě použití radioaktivníhch sond, nebo pomocí kolorimetrických nebo chemiluminiscenčních systémů při použití neradioaktivně značených sond (digoxigenin, biotin). Přenos podle Southerna - S blot hybridizace. Slouží k přenesení molekul DNA z gelu na membránu, ke které je pak lze různými způsoby přichytit. Jde o velmi jednoduchý postup, používající kapilárního vzlínání tzv. přenosového pufru. Membrána je přiložena na horní plochu gelu, dolní plocha gelu je prostřednictvím houby nebo jiného savého materiálu spojena se zásobníkem přenosového pufru. Horní plocha membrány je poté pokryta větším množstvím buničité vaty nebo jiného savého materiálu. Pro lepší kontakt všech vrstev je soustava přiměřeně zatížena závažím. Přenosový pufr vzlíná kapilární silou ve směru šipek na obrázku nahoru přes houbu, gel a membránu do buničité vaty. Přitom vymývá z gelu molekuly DNA a přenáší je na membránu. Ta je pro molekuly DNA nepropustná, takže tyto ulpí na dolní ploše membrány, přiléhající ke gelu, v přesně stejných polohách, v jakých se nacházely v gelu po roztřídění gelovou elektroforézou. Přenosový pufr obsahuje chemikálie, které narušují stabilitu vodíkových můstků v molekule DNA, takže dochází k její denaturaci (tzv. denaturační pufr). DNA je proto během přenosu denaturována (je jednovláknová) a připravená k hybridizaci se sondou. Přenos podle Southerna (angl. Southern blot) byl nazván podle výzkumníka, který ho vyvinul. Postup byl později upraven pro přenos molekul RNA a jako slovní hříčka nazván Northern blot. Analogický postup pro přenos bílkovin z gelu byl nazván Western blot. Pro S -blot lze rovněž použít vertikální elektroforetický přístroj - vertikální elektroforesu (používaná v laboratoři oddělení rostlinné virologie ÚMBR), kde přenos DNA z gelu na membránu je zajištěn tokem elektrického proudu v elektrolytu od minus k plus polu. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 17

18 EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 18

19 Téma: PŘÍPRAVA NERADIOAKTIVNĚ ZNAČENÉ SONDY (DIGOXIGENINEM) PRO DOT BLOT (S - BLOT) HYBRIDIZACI 1) 18 ul vyizolované bakteriální DNA (popř. amplifikátu - příprava v předchozích cvičeních) denaturovat 10 min. při 100 o C. 2) Ochladit na ledu s NaCl po dobu cca 10 min. 3) Do eppendorfky s DNA na ledu přidat: 4 ul hexanucleotide mixture 4 ul dntp mixture, doplnit objem do 38 ul sterilní redestil. vodou (12 ul) 2 ul Klenow enzyme 4) Opatrně centrifugovat a inkubovat minim. 60 min. při 37 o C (delší inkubace do 20 hod. může zvýšit výtěžek značené DNA). 5) Přidat 4 ul roztoku 0,2 M EDTA, ph 8,0 k zastavení reakce. 6) Precipitace (srážení) značené DNA s 5 ul 4 M LiCl a 150 ul předchlazeného 96% etanolu (-20 o C), řádně promíchat. 7) Uložit na minim. 30 min. do -70 o C nebo na 2 hod. do -20 o C. 8) Centrifugace při ot./min., 4 o C po dobu 30 min. 9) Peletu (sediment) promýt v 50 ul chladného 70% etanolu a následně (po vylití etanolu) vysušit ve vakuu. 10) Promytou a vysušenou peletu rozpustit v 50 ul 1 x TE pufru. 11) Připravenou sondu skladovat 24 hod. v lednici, pak zamrazit v -20 o C. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 19

20 Téma: DOT BLOT HYBRIDIZACE Postup při dot blot hybridizaci (viz samostatný podrobný návod) A: Nakapání vzorků v blotovacím zařízení na nylonovou membránu B: Odsátí vody z membrány pomocí vývěvy C: Fixace vzorků na membráně teplem (v peci), popř. pomocí UV D: Prehybridizace E: Denaturace sondy F: Vlastní hybridizace G: Navázání antičástic (Anti Digoxigenin AP - Konjugát) H: Vymytí nenavázaných antičástic (antičástice konjugát) I: Inkubace membrány se vzorky v NBT/BCIP roztoku do vývoje barevné reakce J: Promytí membrány se vzorky ve stabilizačním pufru K: Vyhodnocení barevné reakce na membráně se vzorky L: Uložení a skladování membrány Dot blot hybridizace - podrobný návod 1) Nylonová membrána (cca 7 x 5 cm) napuštěná pufrem 2 x SSC se umístí do bloku na dot blot hybridiazci. žlutá houbička se rovněž napustí pufrem 2 x SSC. Podle plánku se nakapou vzorky DNA po 15 ul, pak se pomocí vodní vývěvy odsaje vlhkost (cca 30min). 2) Zorientovat nylonovou membránu (šipky) a dát na 30 min do pece fixace vzorků na membránu při teplotě 120 C. 3) Prehybridizace ve 20 ml hybridizačního pufru (bez formamidu) 1 hod při 68 C. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 20

21 4) Denaturace 15 цl sondy cca 5-10 min při C, pak rychle zchladit ve směsi ledu s NaCl po dobu cca 5-10 min. 15 цl sondy denaturované přidat do 7 ml hybridizačního pufru. Hybridizovat přes noc (nejméně 6 hod) při 68 C (bez formamidu). 5) Po hybridizaci filtr promývat 2 x 5 min při pokojové teplotě v minimálně 50 ml 2 x SSC pufru (na 100 cm 2 filtru) a 2 x 15 min při 68 C v 0,1 x SSC pufru. Krok 6) a 7) se provádí pouze při přerušení postupu filtr nesmí oschnout 6) Filtr vysušit mezi dvěma filtračními papíry a dát do igelitového sáčku uzavřeného, skladovat v lednici při cca 4 C. 7) Při oživení filtru je membrána ponořená asi 10 min v 50 ml 0,1 x SSC pufru při pokojové teplotě. 8) Filtr pak promývat 1 min v pufru 1 + Tween 20 (promývací pufr) při pokojové teplotě na třepačce. 9) Inkubace 30 min ve 100 ml pufru 2 na třepačce při pokojové teplotě. 10) Anti-Digoxigenin-AP-Konjugát (lahvička 3 v DIG Nucleic Acid Detection Kitu) rozředit v poměru 1:5000 v pufru 2 (2 цl konjugátu přidat do 10 ml pufru 2). Tyto částice jsou stabilní v roztoku jen asi 12 hod při 4 C. 11) Filtr inkubovat 30 min v 10 ml tohoto roztoku (antičástice konjugát) na třepačce při pokojové teplotě. 12) Nenavázané částice (antičástice-konjugát) vymýt po dobu 2 x 15 min ve 100 ml pufru 1 při pokojové teplotě na třepačce. 13) Membránu stabilizovat promytím ve 20 ml pufru 3 po dobu 2 min při pokojové teplotě na třepačce. 14) Připravit barvivo musí být vždy čerstvé: smíchat 45 цl NBT roztoku (lahvička 4) a 35 цl X fosfát roztoku (lahvička 5) s 10 ml pufru 3. Odměrný válec zabalit do alobalu citlivé na světlo. 15) Filtr inkubovat v 10 ml barevného roztoku v uzavřené mýdelnici, která je ještě uzavřena v igelitovém sáčku v temnu, v klidu, bez třpání. Vývoj barev se ukončí během 1 dne (postačující jsou i 2 hodiny). 16) Když je vývoj barev ukončen (doty - tečky jsou jasně rozeznatelné na membráně), promývat membránu v 50 ml pufru 4 (ustalovací pufr) po dobu 5 min. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 21

22 17) Možnost scanování membrány v průhledných omyvatelných deskách na počítači. Pak vysušit membránu při pokojové teplotě nebo při 80 C. Pak je možné membránu uložit. 18) Při opětovném použití nylonové membrány - filtru s analyzovanými vzorky, je vhodné filtr namočit do pufru 4, dojde tak ke zvýraznění barev. Téma: SEKVENOVÁNÍ, VYSVĚTLENÍ PRINCIPU, UKÁZKA AUTOMATICKÉHO SEKVENÁTORU ABI 3130 Amplifikace - PCR - genomové (bakteriální) DNA - viz cvičení č. 8. Přečištění PCR produktu pro sekvenační PCR pomocí Gen Elute PCR Clean - Up Kit popř. Gen Elute Minus EtBr Spin Columns. Sekvenační PCR - sloţení sekvenační PCR reakce, program pro sekvenační PCR. Přesráţení PCR produktu po sekvenační amplifikaci pomocí izopropanolu. Vlastní sekvenování - metoda dle Sangera (1977), sekvenátor ABI 3130 s kapilárou 50 cm (součástí vybavení ÚMBR, laboratoře genomiky, použit ABI PRISM Big Dye Terminator 1.1 Cycle Sequencing Kit a sekvenační polymer POP 7). Cvičení zajišťováno ve spolupráci s pracovníky laboratoře genomiky, ÚMBR BC AV ČR. Elektronový a rastrovací mikroskop, vysvětlení činnosti, příprava vzorků, pozorování částic v mikroskopu. Cvičení zajišťováno ve spolupráci s pracovníky oddělení rostlinné virologie ÚMBR a laboratoře elektronové mikroskopie PAÚ BC AV ČR. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 22