UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd Pokroky v diagnostice onemocnění prostaty Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc. Hradec Králové 2011 KRISTÝNA KRASULOVÁ

2 Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného kvalifikačního titulu. datum podpis

3 Děkuji Doc. RNDr. Vladimíru Semeckému, CSc. a RNDr. Lence Němečkové za odbornou pomoc a ochotu při řešení mé bakalářské práce.

4 OBSAH ABSTRAKT... 5 ABSTRACT... 6 ZADÁNÍ CÍL PRÁCE ÚVOD - TEORETICKÁ ČÁST Anatomie a funkce prostaty Nemoci prostaty BENIGNÍ HYPERPLAZIE PROSTATY BHP NÁDORY PROSTATY Epidemiologie Histopatologie Etiologie Klinické příznaky Léčba Diagnostika PRAKTICKÁ ČÁST Histologické a imunohistochemické vyšetření Pouţitý materiál a přístroje Rozbor pacientů Výsledky DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 48

5 ABSTRAKT Kristýna Krasulová Pokroky v diagnostice onemocnění prostaty Bakalářská práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotnická bioanalytika Zdravotní laborant Cíl práce: V diagnostice nádoru prostaty jsme se zaměřili na imunohistochemické vyšetření bioptických vzorků prostaty, zejména na průkaz protilátek proti vysokomolekulárním cytokeratinům (HMW CK). Zjišťovali jsme, zda určité biochemické hodnoty prostatického specifického antigenu (PSA) odpovídají jednotlivému Gleasonovu skóre, určenému dle výsledku imunohistochemického barvení. Metody: Hodnoty PSA byly změřeny v Oblastní nemocnici Náchod a.s. na přístroji Immulite Tento analyzátor pracuje na principu sekvenční enzymové chemiluminiscenční imunochemické reakce v pevné fázi. Imunohistochemické preparáty byly značené protilátkami proti HMW CK. Byla pouţita myší monoklonální protilátka anti-high molecular weight cytokeratin (klon 34βE12). Jádra byla dobarvena hematoxylinem Gill III. K dokumentaci preparátů byla pouţita počítačová obrazová analýza: NIS-ELEMENTS AR , kamera ProgRes CT 3 (JENOPTIK) firmy NIKON. Výsledky: Imunohistochemické značení umoţní určit nádorová loţiska pomocí průkazu absence bazálních buněk. Mezi Gleasonovým skórem určeným dle biopsie a hladinami PSA neexistuje korelace. PSA neurčuje stupeň malignity. Závěry: Vysoká hladina PSA bývá podmětem k indikaci biopsie. Následné histologické a doplňkové imunohistochemické vyšetření odliší benigní hyperplazii od nádorové proliferace a popřípadě určí rozsah nádorového loţiska pomocí Gleasonova skóre. Ukázalo se, ţe dané hodnoty PSA nekorelují s Gleasonovým skórem. V současné době se hledají další nádorové markery, které by předčily PSA a sníţily počet biopsií. 5

6 ABSTRACT Kristýna Krasulová Progression in the diagnostics of prostate disorders Bachelor thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Healthcare bioanalytics - Medical Laboratory Technician Background: The Bachelor thesis deals with the diagnostics of prostate disorders. It is focused on immunohistochemistry of prostatic biopsy especially on the proof of the antidote against high molecular weight keratins (HMW CK). It was been discovering if certain biochemical values of the prostatic specific antigen comport with the Gleason Score, which is determined according to the result of the immunohistochemistry. Methods: The values of PSA were measured in Oblastní nemocnice Náchod a.s. thanks to their gadget Immulite The analyzer works on the principle of sequential enzymatic chemiluminiscence immunoassay reaction in the solid phase. Preparates for immunohistochemistry were signed by antidotes against HMW CK. The mouse monoclonal antibody anti-high molecular weight cytokeratin (klon 34βE12) was used. The cell nucleuses were stained by heematoxylin Gill III. The Imaging Software NIS-ELEMENTS AR , camera ProgRes CT 3 (JENOPTIK) by NIKON was used to document the preparates. Results: The immunohistochemical marking enables to determine tumour cells thanks to the proof of the absence of basal cells. There is no correlation between the Gleason Score and levels of the PSA. The PSA do not determine the level of the malignity. Conclusions: The high level of the PSA is used to be an impulse for the biopsy indication. The consequential histological and additional immunohistochemical investigation distinguishes benign hyperplasia from tumor proliferation. Eventually, it can also specify the range of tumour trough the use of the Gleason Score. It turned out that the assigned values of the PSA do not correlate with the Gleason Score. Other tumor markers, which would surpass the PSA and reduce the number of biopsies, are still searched nowadays. 6

7 ZADÁNÍ CÍL PRÁCE Karcinom prostaty patří k nejčastějším nádorům diagnostikovaných u muţů. Toto onemocnění zaujímá v České Republice třetí příčku úmrtnosti. Naprostá většina malignit pochází z prostatických acinů a duktů. Jedná se o multifaktoriální chorobu, přičemţ riziko výskytu vzrůstá se stoupajícím věkem. Včasné podchycení nádorové proliferace je zásadní pro dobrou prognózu pacienta. U karcinomu prostaty tvoří základ diagnostiky vyšetření pacienta per rektum a biochemické stanovení nádorového markeru, prostatického specifického antigenu (PSA). Při zneklidňujících výsledcích se indikuje biopsie. Získaná tkáň je vyšetřována histologicky. Hlavním problémem při diagnostice nádoru, je rozlišení benigní hyperplazie prostaty od maligní transformace. K tomuto účelu se začalo pouţívat doplňkové imunohistochemické vyšetření. Tato práce je zaměřena zejména na průkaz protilátek proti vysokomolekulárnímu cytokeratinu (HMW CK), které slouţí k označení bazálních buněk. Právě absence těchto buněk je důkazem nádorové proliferace. Cílem této práce je ukázat současné diagnostické postupy u maligních onemocnění prostaty. Zaměřili jsme se na imunohistochemickou diagnostiku bazálních buněk a souvislost mezi hladinami PSA a výsledky biopsie. Imunohistochemické vyšetření bylo prováděno na Patologickém oddělení Oblastní nemocnice Náchod a.s. 7

8 1. ÚVOD - TEORETICKÁ ČÁST 1.1. Anatomie a funkce prostaty Prostata je přídatná pohlavní ţláza muţe, která obklopuje část močové trubice (pars prostatica urethrae). Velikost normální prostaty se pohybuje okolo 4cm x 3,5cm x 2cm, váha 29-40g. Je uloţená těsně pod močovým měchýřem. Do vnitřního stroma, tvořeného hladkou svalovina a vazivem, je zanořeno 30 aţ 50 tuboalveolárních ţláz. Prostata má tvar kuţele, na kterém rozlišujeme bazi prostaty, která přiléhá k močovému měchýři a hrot prostaty mířící dopředu dolů. Od baze k apexu probíhá úsek močové trubice. Toto umístění umoţňuje méně invazivní chirurgickou transurethrální resekci prostaty (TURP). Dále je zde přední plocha (fascies anterior), boční plochy (facies inferolateralis dextra et sinistra) a zadní plocha (fascies posterior) přes kterou je hmatatelná prostata per rektum. Na povrchu je prostata obalena tuhým vazivovým pouzdrem (capsula prostatica), které je sloţeno ze dvou vrstev vaziva. Parenchym rozdělujeme na lobus dexter, sinister et medius. V klinické praxi se pouţívá dělení prostaty dle McNeala na 4 zóny. [23] Obrázek 1 Zonální anatomie prostaty 1. Modře - periferní zóna 2. Ţlutě - přední fibromuskulární stroma 3. Světle zeleně - centrální zóna 4. Tmavě zeleně - přechodná zóna Červeně - uretra 8

9 Tuboalveolární ţlázy tvoří jednořadý aţ víceřadý, plochý aţ cylindrický epitel. Tvar buněk se odvíjí od sekreční aktivity, stáří muţe a hormonální situace. Cylindrické buňky jsou aktivní ţlázové buňky, obsahují sekreční granula a vakuoly s enzymy (kyselá fosfatáza, 5-α-reduktáza a argináza). Hlavní funkcí prostaty je tvorba sekretu, který tvoří 15-30% objemu tekutiny ejakulátu. Jedná se o bezbarvou, kyselou tekutinu, která obsahuje zinek, kyselinu citrónovou, prostaglandiny, polyaminy (spermin, spermidin), imunoglobuliny, kyselou fosfatázu a proteázy. [22, 23, 24] 1.2. Nemoci prostaty Onemocnění prostaty můţe být celá řada. Patologie zahrnuje záněty, benigní hyperplazii prostaty a nádory. Se stoupajícím věkem dochází k fyziologické atrofii, co se týče kardiovaskulárního oběhu, můţe se objevit infarkt. Dále se vyskytují malé prostatické kameny, takzvané prostatolity. Záněty prostaty, prostatitis, mohou mít bakteriální původ, typickým původcem je E. coli. Ale nejběţnějším typem jsou záněty bez bakteriální příčiny. [26] BENIGNÍ HYPERPLAZIE PROSTATY BHP Jedno z nejčastějších onemocnění doprovázející stárnutí muţů je nemaligní zvětšení prostaty. Histologicky se jedná o progresivní hyperplazii stromálních a ţlázových buněk. Incidence onemocnění stoupá s věkem, přičemţ jiţ u 8 % třicetiletých muţů můţeme nalézt histologické změny. O dvacet let později, tedy u padesátníků je rozvinuta okolo 42 %, v další dekádě se vyskytuje aţ u 70 % muţů a nad 85 let dokonce u 90 %. Ne všichni muţi s BHP mají však klinické příznaky, nejedná se sice o ţivot ohroţující onemocnění, ale můţe značně sníţit kvalitu ţivota. [3, 6] Rozlišujeme dvě stádia průběhu BHP a to stádium patologické a klinické. První stádium je charakterizováno mikroskopickými změnami, které později přechází v makroskopické, doprovázené zvětšením objemu. Pro klinické stádium jsou typické příznaky dolních močových cest, tzv. LUTS (Lower Urinary Track Symptoms), mezi které, patří častá potřeba močení, slabý, přerušovaný 9

10 proud, pocit neúplného vyprázdnění. Tyto symptomy mohou vést k závaţnějším komplikacím. [1, 4] Pří nárůstu objemu prostaty dochází k zuţování lumen uretry, tím je ztíţen průtok moči a zesílen tlak, nakonec můţe dojít k hypertrofii detrusoru močového měchýře, trabekulaci a tvorbě divertikula. Moč v neúplně vyprázdněném močovém měchýři stázuje, coţ vede k rozvoji infekcí a můţe docházet k tvorbě močových kamenů. [29] Podle světové zdravotnické organizace WHO dochází ke standardizaci symptomatologie pomocí dotazníku IPSS (International Prostate Syndrom Score). Podle dotazníku rozlišujeme dva základní typy příznaků. Patří sem evakuační neboli obstrukční příznaky. Mezi ně můţeme zařadit například slabý proud při močení, retenci moče, pocit neúplného vyprázdnění. Druhým typem obtíţí jsou mikční neboli iritační, kam patří rozvoj urgentní inkontinence, časté noční močení nebo časté močení obecně. [22, 29] BHP vzniká z několika příčin. Určitou roli hraje prostředí, strava a genetické faktory. Největší vliv na vývin BHP mají funkční varlata a stoupající věk. Právě varlata produkují testosteron, který se pomocí enzymu 5-α-reduktázy mění na dihydrotestosteron. Ten interaguje se stromálními receptory prostaty a aktivuje proliferaci buněk. [28, 25] K lepším výsledkům léčby přispívá včasná diagnostika. Mezi základní postupy při diagnostice BHP patří vyplněný dotazník IPSS, který umoţní stanovit úroveň závaţnosti symptomů. Dále zjišťujeme anamnézu, zda se nevyskytuje karcinom prostaty u rodinných příslušníků. Základním fyzickým vyšetřením je vyšetření per rektum. Hmatem lékař zjišťuje velikost prostaty, která můţe být u BHP aţ několikanásobně zvětšená. Dále se zaměřuje na symetrii a povrch prostaty, můţe být normální, ale vyskytuje se i uzlovitá přestavba tkáně. Objem prostaty můţeme také zjistit ultrasonografií, která upřesní rozměr a charakter tkáně. Provádí se i některá urodynamická vyšetření, která zkoumají schopnost vyprazdňování a jímací potíţe. Mezi laboratorní vyšetření patří stanovení sérové hladiny PSA, kreatininu a močového sedimentu. Hladinu kreatininu kontrolujeme, abychom předešli renální insuficienci, nebo sledujeme dilataci horních močových cest. Vyšetřením močového sedimentu můţeme zjistit přítomnost erytrocytů, leukocytů, krystalky nebo bakterie. Vyšetření moči provádíme, abychom vyloučili jiné příčiny vzniku 10

11 LUTS, například infekci. Sérová hladina prostatického specifického antigenu bývá zvýšená u % pacientů s BHP. U většiny ovšem nepřekročí 4 ng/ml. V rozmezí 4 aţ 10 ng/ml PSA existuje takzvaná šedá zóna, kdy je obtíţné rozlišit karcinom prostaty od hyperplazie. K tomuto účelu slouţí některé parametry vypočítané z PSA. Patří sem PSA denzita, velocita a poměr volné a vázané frakce, viz kapitola o diagnostice nádoru prostaty. Léčba benigní hyperplazie prostaty se odvíjí od klinického stádia nemoci. V posledních letech dochází ke zlepšování technik, místo chirurgických zákroků se častěji přiklání k medikaci a minimálně invazivním technikám. Hlavním cílem léčby je redukovat příznaky LUTS a tím zlepšit kvalitu ţivota pacientů. Pokud příznaky pacienta nikterak neobtěţují, přiklání se k metodě pozorného sledování, kdy se pacient monitoruje a je mu doporučena změna ţivotního stylu. Co se týče medikamentózní léčby, obvykle se vybírá ze tří typů léčiv. Při malých obtíţích se mohou uţívat pouze extrakty z rostlin, tzv. fytoterapeutika. Mechanismus účinku není znám, ale vykazují určité účinky. Dalším typem jsou inhibitory 5-α-reduktáz, které sniţují hladinu DHT, aniţ by ovlivnily testosteron. Při medikaci těmito léky klesá hladina PSA. Ke zlepšení obstrukce hrdla močového měchýře a prostatického pouzdra se předepisují alfablokátory. Tyto léky sníţí tonus hladké svaloviny, eliminují tak obstrukci a zajistí volný průtok moče. Obstrukce se můţe také zmírnit pouţitím permanentních stentů nebo spirál. V tomto případě se zavede do prostatické části uretry těleso, které dilatuje uretru a umoţňuje volný průchod moče. [1, 16, 22] U pacientů s těţkými příznaky se přistupuje k chirurgické léčbě. Jedná se pak o TURP transuretrální resekci prostaty, TUIP transuretrální incizi prostaty nebo otevřenou prostatektomii. V posledních letech se stále častěji vyuţívají minimálně invazivní techniky. Nejlepší výsledky vykazuje pouţití holmiového laseru nebo termoterapie. TUNA (Terapie vysokofrekvenčními vlnami) je typ termoterapie, kdy dodáváme do prostatické tkáně nízkofrekvenční radiové vlnění penetrující do tkáně a způsobující nekrózu. [16, 22] 11

12 NÁDORY PROSTATY Epidemiologie V současné době představuje karcinom prostaty po karcinomu kůţe druhý nejčastěji diagnostikovaný nádor v západních zemích. V roce 2007 pocházelo 72 % nově diagnostikovaných případů z rozvinutých zemí. Rakovina prostaty souvisí se západním ţivotním stylem. Nejvyšším rizikovým faktorem je však věk, patří mezi ně i etnický původ. Zvýšený výskyt je u černošské populace, naopak nejmenší riziko mají asiaté. [13, 14] Incidence stále mírně stoupá. V roce 1995 tvořil 8,2 % ze všech nádorů. Toto číslo narostlo v roce 2000 na 9,2 %. V roce 2008 tvoří jiţ 13,6 %. Vyššímu výskytu se připisuje prodluţování délky lidského ţivota a aktivnímu preventivnímu přístupu, kam patří zejména stanovení PSA. [11,18,20] Mortalita se stále drţí na nízké úrovni. Především proto, ţe postihuje muţe ve vyšším věku, kdy nemocní trpí jiţ jinými onemocněními, zejména kardiovaskulárními chorobami. Mají tedy větší pravděpodobnost úmrtí na některou civilizační nemoc neţ na karcinom prostaty. V ČR se karcinom prostaty umístil na třetím místě úmrtí. Mortalita stoupá se zhoršujícím se stupněm diferenciace. U pacientů s hodnotou GS 2-4 umírá 4-7% pacientů. U postiţených s vyšším GS 8 10 je to uţ 60 80%. [15] Tabulka 1 Incidence a mortalita karcinomu prostaty v ČR [17] 12

13 Odhadovaná čísla (v tisících) Případy Úmrtí Svět Vyspělé země Rozvojové země WHO Africký region WHO Americký region WHO Oblast východního středomoří 12 9 WHO Evropa WHO Oblast jihovýchodní Asie WHO Oblast západního tichomoří USA Čína Indie Evropská Unie Tabulka 2 Incidence a mortalita karcinomu prostaty ve světě, 2008 [18] Histopatologie Více neţ 95 % malignit prostaty představují adenokarcinomy z prostatických acinů nebo duktů. Okolo 4 % rakovin prostaty se vyvine z epitelu močové trubice v prostatické části. Minimum vzniká jako endokrinní. Rozlišujeme několik typů adenokarcinomů: acinózní, duktální, mucinózní, malobuněčný nebo neuroendokrinní. [19] Ve většině případů vzniká rakovina ve více loţiskách, ale podle zón můţeme říct, ţe okolo 70 % vzniká v periferní zóně, % vzniká v centrální a asi 10 aţ 15 % se poprvé objeví v přechodné zóně. [19] Prostatický epitel se skládá z různorodých buněčných typů. Sekretorické buňky (Secretory luminal cells) jsou buňky nacházející se v blízkosti bazální membrány bez moţnosti proliferace. Jsou charakteristické výskytem androgenních receptorů a produkcí PSA. Na tyto buňky navazuje vrstva proliferujících buněk, které podle zralosti také obsahují PSA i androgenní receptory. Mezi těmito buňkami se mohou nacházet neuroendokrinní buňky. [14] Rozvoji rakoviny předcházejí histologické změny. Jedním z histologických prekurzorů je prostatická intraepiteliální neoplasie (PIN). Je definována jako zvýšená proliferace doprovázená buněčnými atypiemi ve struktuře. Hlavními diagnostickými znaky PIN jsou atypická jádra, nepřítomnost bazální membrány 13

14 a chybná architektonika buňky. Můţeme rozlišit 3 základní typy. V prvním případě jsou normální epitelové ţlázky nahrazeny PIN buňkami a zachována zůstává jen vrstva bazálních buněk. V druhém případě PIN buňky přerůstají stěny duktů nebo acinů. Pokud buňky PIN rostou mezi bazálními buňkami, mluvíme o třetím typu. Pokud při biopsii nalezneme PIN, můţeme předpovídat pozdější % šanci na výskyt rakoviny. [8, 14, 23] Obrázek 2 Benigní hyperplazie prostaty s loţisky PIN [23] Mezi ukazatele rakovinotvorného procesu patří také proliferativní zánětlivá atrofie (PIA). V nálezu najdeme současně s atrofií epitelií chronický zánět typický přítomností zánětlivého infiltrátu. PIA představuje 20 % šanci výskytu rakoviny v následujících 5 letech. [14] Obrázek 3 Vznik adenokarcinomu, zleva: normální prostata, atrofie se zánětem, PIN, nádorová proliferace bez bazálních buněk [13] 14

15 Histologický obraz má vztah s biologickou povahou nádoru a se stupněm malignity. Existuje několik systémů pro určování tzv. gradingu. Nejpouţívanějšími jsou Gleasonovo a Mostofiho skóre. Gleasonovo skóre bylo poprvé pouţito v roce 1966 a vyvíjelo se do roku 1977, poslední změna nastala v roce K nejvýznamnějším změnám došlo ve 3. a 4. GG. Podle stupně diferenciace jsou nádory klasifikovány do 5 stupňů. Nejméně diferenciovanému histologickému obrazu byla přidělena 1 a nejvíce 5. Konečný Gleasonovo skóre tvoří součet prvních dvou nejčastěji se vyskytujících stupňů. Rozsah je tedy od 2 po 10. [10, 11] GG Konvenční Modifikovaný 1 Středně velké, pravidelně uspořádané ţlázky okrouhlého tvaru, vystlány světlým epitelem, dobře ohraničené Pravidelný tvar i velikost ţlázek, ohraničení méně zřetelné, světlý epitel, ţlázky odděleny stromatem. Variabilní velikost i tvar ţlázek, jsou však menší a mají bazofilnější epitel neţ u GG 1-2. Mikroacinární, papilární, kribriformní ţlázky, splývají v loţiska, nezřetelné hranice, epitel tmavý (varianta A) nebo světlý (varianta B). Tubulárně uspořádaný a disociovaný karcinom prostaty, solidní loţiska komedonového typu. Tabulka 3 Gleasonův grade [2] Ohraničený uzlík z nahromaděných, oddělených stejných kulatých aţ oválných acinů o střední velikosti Stejně ohraničené jako u GG 1, na okraji uzlíku nádoru můţe být minimální infiltrace. Ţlázy jsou uspořádány volněji a nejsou všechny stejně veliké jako u GG 1. Diskrétní glandulární jednotky, obvykle menší velikosti neţ u GG 1 a 2. Infiltruje mezi nonneoplazmatické aciny. Výrazně se liší ve velikosti a tvaru. Jemně ohraničené kribriformní uzlíky tumoru. Rozptýlené mikroacinární ţlázky, špatně definované ţlázky se špatně vytvořeným lumen. Nepravidelně ohraničené kribriformní ţlázky. Ţádná glandulární diferenciace tvořená pevnými listy a pruhy nebo samostatnými buňkami. Komedokarcinom s centrální nekrózou obklopený papilární, kribriformní nebo solidní masou. 15

16 Obrázek 4 Schéma konvenčního (a) a modifikovaného (b) gradingu [11] TNM klasifikace spojuje charakterizaci primárního tumoru (T), postiţení lymfatických uzlin (N) a metastatické postiţení (M). Je zaloţena na klinickém vyšetření, endoskopii, biopsii a biochemických testech. Od jejího vzniku v roce 1958 klasifikace prošla několika úpravami. T - kategorie - primární nádor TX Primární nádor nelze posoudit T0 bez známek primárního nádoru nádor není zřejmý klinickým vyšetřením, hlavně palpací a zobrazovacími metodami zjištěn náhodně histologicky v < 5% resekované tkáně po T1a T1 TURP T1b postihuje náhodně histologicky v > 5% resekované tkáně po TURP T1c zjištěn punkční jehlovou biopsií na základě elevace PSA nádor omezený na prostatu T2 T2a postihuje maximálně polovinu laloku T2b postihuje více neţ polovinu laloku, ne však oba laloky T2c postihuje oba laloky nádor prorůstá pouzdro prostaty T3 T3a prorůstá pouzdro jedno nebo oboustranně T3b prorůstá do semenných váčků T4 nádor je fixovaný nebo prorůstá do okolních struktur, jiných neţ semenných váčků, např. hrdle močového měchýře, zevního svěrače, rekta a dalších 16

17 Patologická klasifikace (pt) omezení na orgán pt2a jednostranné postiţení postihující polovinu laloku nebo méně pt2 jednostranné postiţení postihující více neţ polovinu laloku pt2b nebo oba laloky pt2c oboustranné postiţení extraprostatické šíření pt3 pt3a extraprostatické šíření pt3b invaze semenných váčků pt4 šíření do močového měchýře a varlat Pozn. pt1 neexistuje N kategorie - regionální uzliny NX regionální mízní uzliny nelze hodnotit N0 bez metastáz N1 metastázy v regionálních lymfatických uzlinách M kategorie - vzdálené metastázy MX přítomnost vzdálených metastáz nelze přisoudit M0 ţádné vzdálené metastázy přítomnost vzdálených metastáz M1 M1a metastázy mimo regionální lymfatické uzliny M1b kostní metastázy M1c metastázy v jiných orgánech Histopatologický grading - G GX stupeň diferenciace nelze hodnotit G1 dobře diferenciovaný (lehká anaplazie; Gleason 2-4) G2 středně diferenciovaný (střední anaplazie; Gleason 5-6) G3-4 málo diferenciovaný aţ nediferenciovaný (významná anaplazie; Gleason 7-10) Tabulka 4 TNM klasifikace, 6. Revize 2006 [2] Etiologie Karcinom prostaty je multifaktoriální onemocnění. Riziko nádoru prostaty stoupá s věkem. Existuje ale mnohem více rizikových faktorů. Jedním z nich je rasa. Je prokázáno, ţe mladí afroameričané produkují aţ o 15% více testosteronu, jejich 5alfa reduktáza je aktivnější. Z těchto důvodů mají afroameričané vyšší riziko výskytu nádoru prostaty, jejich nádory bývají agresivnější neţ u bílé rasy. Nejméně ohroţení jsou Asiaté. Tento fakt souvisí pravděpodobně se sloţením jídelníčku. V porovnání se západními zeměmi, typická asijská strava není tak bohatá na tuky a nese sebou menší riziko, protoţe omega-6 mastné kyseliny obsaţené ve stravě stimulují růst nádoru. Naopak protektivně působí antioxidant vitamin E a selen. Rizikovým faktorem je 17

18 také nedostatek vitaminu D. Na druhou stranu zvýšené hladiny vitaminu A podporují proliferaci a diferenciaci. [19] Výskyt karcinomu prostaty je ovlivněn také genetickými predispozicemi. Familiární typ nádoru prostaty tvoří okolo %. Tento typ je dán zejména stejnými rodinnými zvyklostmi a působením podobného vlivu prostředí. Dědičná forma není tak častá, jen asi 5 10 %, příčinou jsou vzácné alely genů. V současné době probíhá v této oblasti výzkum. První geny, které mají spojitost s nádorem prostaty, jsou umístěny na chromosomu 1: HPC1 gen (Hereditary prostate cancer) a PCAP gen (Predisposing for cancer of the prostate gland). [19, 20] Příčinou vzniku nádoru je změna protoonkogenu na onkogen, pokud se tyto změny hromadí společně se selháním dalších mechanismů, jako je apoptóza nebo antionkogeny, normální buňka se zvrhne v nádorovou, pro kterou je typická nekontrolovatelná proliferace. U rakoviny prostaty bylo v roce 2005 zjištěno několik genů, jejichţ mutací začíná kancerogeneze. U většiny nádorů je zvýšená exprese transkripčních faktorů ERG či ETV1. Jedná se o proteiny z rodiny ETS, které mají přes 200 cílových genů. Plní zde regulační funkce v procesu diferenciace, proliferace, hematopoézy, apoptózy a dalších. K jejich aktivaci dochází translokací promotoru z genu TMPRSS2 (Transmembránová serin-2 proteáza), který obsahuje část regulovanou androgeny. Vznikají různé fůzní geny, varianty ERG onkogenu. Aktivní TMPRSS2 můţe například aktivovat PAR-2 receptor zodpovědný za tvorbu metastáz. TMPRSS2 je exprimován jak v normální prostatě, tak v nádoru, ale zde velmi výrazněji. Translokace TMPRSS2 se vyskytuje u % pacientů s primárním karcinomem prostaty. Dalším genem je CDKN1b (p27) kódující cyklin-dependentní kinázový inhibitor, který tlumí nádorovou proliferaci. [20] K rozvoji nádoru prostaty můţe dojít i změnou genové exprese bez poruchy DNA sekvence, tzv. epigenetické změny. S více neţ 90% je nejběţnější sníţená transkripce genu pro glutation-s-transferázu π1 (GSTP1). Funkcí této transferázy je ochrana DNA před působením reaktivních oxidantů a některých metabolitů karcinogenů. Místa DNA, které by mohly tyto působky ovlivňovat, konjuguje s glutationem. Při nádoru dochází ke sníţení exprese enzymu a nechráněná místa jsou metylována. Při BHP nikdy nedochází k těmto 18

19 změnám. U karcinomu bez metastáz je pouze 36% průkaznost, ale u metastatické formy nádoru prostaty je výskyt GSTRP1 spolehlivý. [20] Adenokarcinom prostaty je hormonálně dependentní. Normální i patologický růst prostaty závisí na funkci a expresi androgenních receptorů (AR). Funkční AR jsou exprimovány během stádií kancerogeneze, od PIN aţ po tvorbu metastáz. Ligandem pro AR je testosteron, který se dostane do prostaty krevním oběhem, pomocí 5-α-reduktázy je redukován na dihydrotestosteron. Po navázání ligandu nastane fosforylace AR a komplex ligandu s receptorem se přesune do jádra, kde se váţe na specifické sekvence DNA. Tato sekvence můţe být například gen pro PSA. Prostata se vyvíjí celý ţivot a růst závisí na androgenech. Nejvíce AR je situováno na epitelech, které produkují růstové modulátory (např. epidermální růstový faktor EGF, IL-6 a další). Tyto modulátory nepřímo ovlivňují přes androgeny diferenciaci, proliferaci, metabolismus prostaty. Proto při androgenní deprivaci nastává inhibiční účinek, kdy normální i nádorové buňky citlivé na androgeny podléhají urychlené apoptóze. [21] Klinické příznaky Ve většině případů je karcinom prostaty asymptomatický. Pokud se objeví příznaky, jedná se většinou o podobné jako symptomy u benigní hyperplazie prostaty. Lokální symptomy se projeví mikčními příznaky (jímací i vypuzovací), uvádí se hematurie i hemosperma, rektální obstrukce. Šíření karcinomu prostaty probíhá plynule do okolí, krevním oběhem a lymfaticky. Lokální šíření postihuje další části prostaty a šíří se aţ do močového měchýře a rekta. Krevní cestou se roznáší metastázy především do kostí, ale i do jiných orgánů, například do plic, jater, ledvin a nadledvin. Metastázy ve skeletu způsobují bolesti, anémie, mohou způsobit i diseminovanou intravaskulární koagulaci. Obecné příznaky pro tvorbu metastází jsou ztráta hmotnosti, únava, nechutenství, kachexie. [19, 22, 26] 19

20 Léčba Rozhodnutí o léčbě je závislé na více faktorech. Bere se v potaz klinické stádium nádoru, histologický nález, tedy Gleasonovo skóre, dostupnost léčby, ale především také přání pacienta. Moţnosti léčby jsou rozsáhlé, přes chirurgii, radioterapii či hormonální léčbu. Ovšem ne kaţdá metoda je vhodná pro všechny pacienty. Pokud má pacient ranou formu karcinomu prostaty (GS 2 4 ) nebo ti, kteří nejsou vhodnými kandidáty na operaci, mohou být jen v reţimu tzv. watchful waiting. Jedná se o pravidelné monitorování hladin PSA, vyšetření per rektum a biopsie prostaty. Pokud se zjistí, ţe nádor nabývá na agresivitě, lékař s pacientem se dohodnou na dalším postupu léčby. V případě lokalizovaného karcinomu prostaty se nejčastěji, pokud to dovolí zdravotní stav pacienta, volí chirurgická cesta. Operace představuje nejlepší řešení pro muţe pod 70 let, kteří jsou schopní přeţít celkovou anestezii. Jedná se o radikální prostatektomii (RAPE) kdy je odstraněna celá prostata i její pouzdro. Podmínkou pro pouţití této metody je lokalizovaný nádor, který nezasáhl ani pouzdro ani okolí prostaty. RAPE, můţeme provést několika způsoby: otevřenou operací, méně invazivně pouţitím laparoskopie nebo pomocí robota. Operace sebou nese riziko komplikací, mezi nejčastější se řadí inkontinence moči a erektilní dysfunkce. [15, 27, 22, 29] Alternativu k radikální prostatektomii tvoří transuretrální resekce prostaty (TRUS). Tato technika se volí u nemocných s obstrukcí dolních močových cest způsobenou pokročilým karcinomem. [15] Další metodou uţívanou pro léčbu lokálního karcinomu je kryochirurgie. Podstatou metody je perikutánní zavedení pěti sond do prostaty. V sondách se vytvoří pomocí tekutého dusíku nízká teplota okolo -20 C, která se aplikuje na místo zasaţené nádorem a destruuje nádorové buňky. Pouţívá se u těch pacientů, u kterých není moţné pouţít prostatektomii nebo u pacientů, u kterých proběhl relaps nemoci po jiţ provedené primární terapii. Stejně jako u RAPE, patří k nejčastějším komplikacím inkontinence, erektilní dysfunkce a tvorba uretrorektálních pištělí. [15] 20

21 K novinkám terapie patří High-intensity focused ultrasound (HIFU). Původně byl testován pro léčbu benigní hyperplazie prostaty, ale v dnešní době představuje jednu z nových moţností zabíjení nádorových buněk. Transrektálně se zavede ultrazvuk, který se zaostří na malou oblast karcinomu, takţe vyvine teplotu aţ 100 C, která zničí nádorové buňky. [27] Pokud pacient nemůţe nebo nechce podstoupit radikální prostatektomii, jeho další moţností je pouţití radioterapie. Jsou dvě základní moţnosti, buď zevní ozáření, nebo je zářič přímo zaveden do nádoru. Zevní radioterapie je vhodná pro nádory klasifikované jako T1a T2b N0 M0. Nejdříve dochází k ozařování pánevních lymfatických uzlin a prostaty, pouţívají se dávky okolo Gy. Jelikoţ dávky nad 70 Gy mají sice lepší léčebné účinky, nicméně také větší neţádoucí účinky, pouţívá se několik způsobů jak ochránit zdravou tkáň, aby mohlo být pouţito i vyššího ozáření. Jednou z moţností je vyuţití hypoxie. Normální hypoxie nádorových buněk je chrání před zářením, pokud se vytvoří umělá hypoxie ve zdravé tkáni, je chráněna také. V dnešní době se pouţívá kombinace radioterapie s počítačovým tomografem. CT slouţí k přesné lokalizaci nádoru a nasměrování paprsků přímo na nádor, není tudíţ tolik zasaţená okolní zdravá tkáň. Mezi komplikace, které se mohou objevit, patří mikční obtíţe, bolesti konečníku, chronická proktitida nebo průjmy. U nádorů s malým objemem se pouţívá intersticiální brachyterapie. Radioaktivní zrna jodu nebo palladia jsou implantovány přímo dovnitř nádoru. Jelikoţ došlo k nárůstu nově diagnostikovaných karcinomů prostaty, stoupl i zájem o relativně šetrnou léčbu. Pouţití brachyterapie nenese tak velká rizika komplikací jako zevní radioterapie. [31, 22, 15] Mezi základní terapie patří také hormonální léčba, jeţ vyuţívá závislost karcinomu na hormonech, zejména androgenech. Více neţ 80 % karcinomů prostaty je hormon dependentních, pouze 20 % je hormon independentních. Hormonální léčba se uţívá u pokročilých stádií karcinomu prostaty. Nejdůleţitějším androgenem je testosteron, produkovaný Lyedigovými buňkami varlat. Pomocí enzymu 5-α- reduktázy je testosteron přeměněn na dihydrotestosteron, který má velkou afinitu na androgenní receptory v prostatě. Na signální cestu androgenních receptorů navazuje fosforylační kaskáda, která vede k proteosyntéze nebo dělení buňky. Cíleným zásahem do signální 21

22 kaskády navodíme apoptózu buňky. Principem hormonální léčby je tedy úplné nebo částečné vyřazení androgenů z jejich funkce. Eliminaci androgenů můţeme provést dvěma cestami a to buď chirurgicky, nebo farmakologicky. Pouţitím chirurgické kastrace, orchiektomie, odstraníme hormonálně aktivní varlata, tím sníţíme hladinu testosteronu aţ na 5 % z původní hodnoty. Bohuţel orchiektomie vede k rozvoji syndromu z nedostatku androgenů. Projevuje se rozvojem osteoporózy, anemie, metabolického syndromu, abdominální obezity, má velký dopad na psychiku pacienta, který ztrácí libido, stává se impotentním. Pacientům, kteří chtějí zůstat sexuálně aktivní, se mohou podávat k omezení symptomů antiandrogeny. Shodný efekt jako kastrace má podání LHRH analogů, antagonistů, estrogenů nebo vysokodávkovaných steroidních antiandrogenů. V ČR je povoleno pouţívání jen LHRH analogů (hormon uvolňující luteinizační hormon). Pracují na principu zpětnovazebné regulace systému hypotalamus hypofýza nadledviny varlata prostata. Podání těchto analogů hyperstimuluje hypofýzu s následnou ztrátou receptorů pro LH a RH, dochází k poklesu sekrece LH, RH a testosteronu. Jelikoţ se nádorové buňky mohou adaptovat na nedostatek androgenů a léčba potom přestane zabírat, pouţívá se intermitentní androgenní suprese (IAS), kdy se přeruší kontinuální absence androgenů. Pouţívání této metody má zabránit vzniku hormon-independentních buněk nádorů. [32, 31] Léčba hormon independentních nádorů je obtíţná, víceméně, jedná se spíše o léčbu, která má potlačit subjektivní potíţe pacienta, protoţe tento typ nádoru je v podstatě nevyléčitelný. Prognóza pro přeţití se odhaduje na 23 aţ 25 měsíců. Mezi dostupné moţnosti léčby řadíme pouţití chemoterapie nebo hormonální léčby druhé řady, kdy vedle primární kastrace podáváme ještě antiandrogeny. Léčba pokročilých stádií však můţe prodlouţit ţivot pouze o několik měsíců. [15, 22, 31] 22

23 Diagnostika Mezi tři základní diagnostické procesy při hledání rakoviny prostaty patří vyšetření per rektum, měření hladiny PSA v séru a transrektální ultrasonografie (TRUS). Vzorek k histologickému vyšetření získáme při operaci nebo biopsií. Pokud je jiţ detekována přítomnost karcinomu, určuje se stádium nemoci, k tomu nám slouţí scintigrafie skeletu, RTG snímky, počítačová tomografie a magnetická resonance Vyšetření per rektum (DRE digital rectal examination) Toto vyšetření hraje důleţitou roli při screeningu u muţů nad 50 let. Jedná se o jednoduché, nebolestivé fyzické vyšetření. Pomocí něj můţeme zjistit přibliţnou velikost prostaty a její tvar. Nevýhodou je, ţe palcipitačně lze vyšetřit jen asi třetinu ţlázy. Při vyšetření se hodnotí změny konzistence, přítomnost hmatných uzlů, tuhost prostaty, jakékoliv asymetrie, ohraničení nebo mobilita rektální sliznice. Nález jakýchkoliv abnormalit vede lékaře k dalším vyšetřením, zejména určení hladiny PSA. [15, 22, 31] PSA prostatický specifický antigen Marker karcinomu prostaty, který slouţí ke stanovení diagnózy, monitoringu úspěšnosti léčby, progrese choroby a ke screeningu. Jedná se o glykoprotein, kódovaný na 19. chromosomu. Serinová proteáza, podobná proteázám účastnících se hemostázy. Úkolem PSA je rozpouštět koagula spermatu štěpením proteinů semenných váčků na seminoglobin I. a II. a tím pomáhá zkapalnění spermatu. Tento protein je specifický pro prostatu, tvoří jej jak zdravá, tak maligní i benigní tkáň ţlázy. V největší míře se nachází ve spermatu. Zdrojem jsou ţlázy a prostatický epitel, odkud se můţe dostat i do séra. Pokud při infekci, zánětu či rakovině dojde k poškození bazální membrány, stromatu prostaty a endotelu kapiláry, uniká PSA do cirkulace a zvyšuje tak svou sérovou hladinu. Zvýšená hladina PSA v séru tedy neznamená zvýšenou produkci, ale poškození bariér mezi krví a buňkami prostaty. [27] 23

24 PSA byl objeven roku 1979, ale test na něj byl zaveden do klinické praxe aţ roku 1986 a znamenal revoluci v diagnostice nádoru prostaty. Původně nebyl určen k diagnóze rakoviny prostaty, ale poté co proběhl screening u velké skupiny muţů, kterým byl diagnostikován karcinom prostaty, se zjistila jeho uţitečnost. Před érou PSA nově diagnostikovaní pacienti měli v 70 % rozvinuté metastáze. Dnes, díky markeru, v čase diagnózy má méně neţ 3 % metastáze a 75 % případů má karcinom palpitačně nehmatný při vyšetření per rektum. [27, 31] V séru se vyskytuje ve dvou formách. Většina (65 95 %) je vázána na α- 2-makroglobulin (AMG) a α-1-antichymotrypsin. Zbytek (5 35 %) tvoří volný PSA. Jeho hladina koreluje s věkem a objemem prostaty, zejména u muţů nad 50 let, kdy je běţnější výskyt BHP, prostatitis i karcinomu prostaty. Aby se zvýšila sensitivita detekce u mladších muţů a specifita u starších, byly nastaveny věkově specifické hodnoty. Podle 95 % muţské populace se hladiny sérového PSA pohybují u muţů ve věku let okolo 2,5 ng/ml, ve věku ,5 ng/ml, ve věku ,5 ng/ml a u muţů ve věku ,5 ng/ml. Cílem bylo zabránit zbytečným biopsiím, nicméně později se ukázalo, ţe podle věkově specifického PSA se nepřišlo na 20% z 60 % případů karcinomu. Z tohoto důvodu nebylo toto nastavení akceptováno. [27] Studie ukázaly, ţe PSA můţe vzrůstat aţ desítky let před rozvinutím rakoviny. Muţi s hladinou nad 2 ng/ml by měli být sledováni. Nad hodnoty 4 ng/ml by se měla provádět biopsie. Obecně platí, ţe se stoupající hodnotou hladiny PSA se zvyšuje riziko nádoru. Stanovení poměru volného a vázaného PSA zvyšuje specifitu. Pro karcinom prostaty je charakteristická niţší hladina fpsa a poměr f/tpsa pod 18 %. Hladina PSA z části souvisí s klinickým a patologickým stádiem nemoci. Nepřesnost je dána překrýváním hodnot mezi jednotlivými stádii a faktory, které ovlivňují mnoţství PSA, patří sem například velikost prostaty. Můţeme říct, ţe hodnoty niţší neţ 10 ng/ml téměř vylučují diseminaci, naopak, u hodnot nad 100 ng/ml je téměř jistá. Vylučující hodnotou pro metastázu v uzlinách je hladina PSA nepřesahující hodnotu 5 ng/ml. [33] Mezi další charakteristiky patří PSA denzita (PSAD), tvoří ji podíl celkového PSA a objemu prostaty v cm 3. Pokud dělíme celkovou hladinu PSA 24

25 objemem přechodné zóny, získáme denzitu přechodné zóny PSAD-TZ. Pacienti s nádorem mají tyto hodnoty vyšší. Při dlouhodobém monitoringu hladiny PSA se sleduje velocita, která vyjadřuje zvýšení hladiny v určitém časovém období. Neměla by přesahovat vzestup o 0,75 ng/ml za rok. Poslední modifikací je PSA doubling time PSADT. Představuje čas, během kterého se zdvojnásobí koncentrace PSA v séru. Všechny tyto hodnoty mohou pomoci odlišit karcinom od BHP, zejména v rozmezí 4-10 ng/ml, které představuje tzv. šedou zónu. Při naměření těchto hodnot je velmi nízká specifita, dá se špatně rozpoznat, zda se jedná o karcinom nebo hyperplazii. [10, 22, 27] Prostatický specifický antigen je dobrý ukazatel, ale není dokonalý. Především se nejedná přímo o nádorový marker, ale jeho zvýšenou hladinu mimo rakovinu způsobuje u BHP a záněty prostaty. Chybí mu tedy specifita a selektivity. V současné době také probíhají dohady, zda provádět hromadný PSA screening. Zejména proto, ţe roste počet diagnostikovaných pacientů s nádory, které rostou pomalu, nebo mají částečně benigní charakter a nevyţadují tedy okamţitou razantní léčbu. Pacienti s ţivot neohroţujícím onemocněním pak nemusí podstupovat léčebné metody, které jim mohou způsobit sexuální dysfunkce nebo potíţe s močením. [27] Další markery Jelikoţ vykazuje stanovení PSA nízkou specifitu, v současné době probíhá stálý výzkum dalších biomarkerů, které by se mohly pouţít pro diagnostiku a určení prognózy karcinomu prostaty. Bylo objeveno relativně velké mnoţství ukazatelů typických pro prostatickou tkáň. Bohuţel zatím nejsou k dispozici ţádné molekulární markery pouţitelné pro praxi, jako má třeba kolorektální tumor.ví se o spoustě onkogenů účastnících se vývoje rakoviny prostaty, ale ţádný z nich není indikátorem začínající kancerogeneze. [27] Jako marker kostního postiţení se pouţívá alkalická fosfatáza (ALP). Při nálezu ALP do 20 ng/ml se současnou hodnotou PSA také do 20% máme stoprocentní jistotu, ţe nádor nemetastazoval do kostí. 25

26 Lidský prostatický glandulární kalikrein (KLK2 Human kallikrein-related peptidase 2) Serinová proteáza ze stejné skupiny jako PSA, produkovaný zdravou prostatickou tkání, ale při nádorovém bujení hladina stoupá. Prostatický specifický membránový antigen (PSMA) KLK11 PCA3 (Prostate cancer antigen3) EPCA/EPCA-2 (Early prostate cancer antigen) AMACR (α-metylacyl-coaracemáza) TMPRSS2:ERG/ETV1 TGF-β 1 EZH2 Ras onkogen E-cadherin a α/β-catenin Annexin A3 PSCA Enzym glutamát karboxypeptidáza, vyskytuje se v CNS, tenkém střevě a prostatě. V nádorové tkáni je exprimován aţ o 90 % více neţ ve zdravé tkáni nebo BHP, zvýšená produkce předpovídá horší prognózu, nyní ve výzkumu pro terapii karcinomu prostaty (jako antigen pro vazebné proteiny nesoucí terapeutikum). V séru společně s PSA předpovídá výskyt karcinomu. Vyskytuje se pouze v prostatě a jeho exprese stoupá u více neţ 95% nádorů prostaty. Měří se v močovém sedimentu, můţe zlepšit selektivitu a senzitivitu diagnostiky. Protein jaderné matrix, pouţívá se k imunochemickému detekování kancerogeneze, je zaznamenán více v nádorové tkáni, slouţí také k odlišení lokální od metastatické formy rakoviny. Enzym, který se účastní oxidativního metabolismu. Poruchou genu pro AMACR, vzniká forma enzymu typická pro karcinom prostaty, protilátky proti AMACR se pouţívá v imunohistochemii k odlišení karcinomu od BHP, slouţí také jako prognostický faktor. viz kapitola o etiologii Růstový faktor účastnící se mnoha procesů, s jeho koncentrací souvisí stádium nemoci a vývoj metastází, k jeho měření se pouţívá ELISA. Je více exprimován v maligní tkáni neţ benigní, je aktivován zejména ve vyšších stádiích nemoci, jeho přítomnost značí tedy horší prognózu. Protoonkogen kódující GTPázu, účastní se přenosu signálu do buňky, bodovými mutacemi se mění v onkogen a způsobuje permanentní proliferaci. Adhezivní molekuly, u karcinomů dochází ke sníţení jejich exprese, souvisí se stádiem nemoci. Sníţená produkce v nádorové tkáni znamená horší prognózu. Marker spojený s Gleasonovým skórem a stádiem, probíhá výzkum na jeho pouţití v terapii. Hepsin Můţe slouţit k imunohistochemickému odlišení PIN a nádoru od benigní hyperplazie. IL-6 V pozdních stádiích rakoviny prostaty se vyskytuje jeho zvýšená hladina. Tabulka 5 Přehled některých dalších nádorových markerů [27, 30] 26

27 TRUS Transrektální ultrasonografie Vyšetření slouţí k určení objemu prostaty a nádorového loţiska. Můţeme posoudit penetraci nádoru do okolí a odhadnout prognózu. Tumor bývá nejčastěji hypoechogenní, ale můţe být i izo a hyperechogenní. Transrektální ultrasonografie se provádí zavedením sondy a hraje nezastupitelnou roli při cílené biopsii a při implantaci radioaktivních zrn při radioterapii. Jako alternativa techniky TRUS můţe slouţit CT nebo NMR malé pánve, ale pomocí těchto metod nezjistíme penetraci tumoru do okolí. [15, 22] Obrázek 5 Provedení TRUS [35] Biopsie prostaty Pouţívá se k definitivnímu stanovení diagnózy. Je předepisována při nálezu abnormalit při vyšetření per rektum, zvýšené hladině PSA nebo zvýšené velocitě. Provádí se transrektální cestou nebo méně často perineální cestou. K odebrání vzorků slouţí jehel a ultrazvuková kontrola. Je to individuální. Pokud je nádor lokalizován jiţ před biopsií, odebírá se tkáň jen z těchto míst. Pokud se neví, kde by se nádor mohl vyskytovat, provádí se systematické mapování prostaty. Dříve se pouţívalo odběru 6 vzorků, tzv. sextantová biopsie, ale podle studií se touto metodou přehlédlo aţ 15% tumorů. Pokud je nález z biopsie negativní, ale PSA stále roste nebo se histologicky 27

28 dokáţou místa s PIN, indikuje se rebiopsie. Provádí se při působení lokálních anestetik, po zákroku se můţe objevit infekce, hemosperma, krvácení z rekta nebo močových cest [10, 22] K dalším vyšetřením patří provedení scintigramu skeletu, který detekuje kostní metastáze. Pouţívá se zejména před radikální prostatektomií a v reţimu watchful waiting. Z hlediska odhadu prognózy má význam stanovení kyselé fosfatázy. Její nízká hladina a naopak vyšší hladina testosteronu představuje lepší prognózu a také lepší ovlivnitelnost nádoru hormonální manipulací. [15] 28

29 2. PRAKTICKÁ ČÁST V této části práce jsme se zaměřili na ukázku imunohistochemického vyšetření bazálních buněk pomocí protilátek proti HMW CK. Cílem je zjištění korelace hladin PSA s imunohistochemickým vyšetřením. Zda určité hodnoty hladin PSA odpovídají jednotlivému Gleasonovu skóre, určenému podle výsledků imunohistochemického barvení. Do praktické části byly zahrnuty výsledky pacientů vyšetřených v ONN Histologické a imunohistochemické vyšetření Histologická vyšetření slouţí k mikroskopickému vyšetření tkáně. V medicíně má úlohu zkoumání patologických změn tkáně. Imunohistochemické techniky slouţí k průkazu přítomnosti látek ve tkáních pomocí specifických protilátek. [5] V diagnostice nádorů prostaty se zasílají nejčastěji vzorky prostatické tkáně získané jehlovou biopsií. Ta je pacientům indikována při zvýšené nebo rostoucí hladině PSA. Cílem je potvrdit nebo vyvrátit výskyt karcinomu a při pozitivním nálezu určit histologický typ nádoru a odhadnout Gleasonovo skóre. K histologickému zpracování je také zasílán materiál získaný radikální prostatektomií, aby se definitivně potvrdila diagnóza. Zásadním úkolem tohoto vyšetření je odlišit hyperplastické změny ve tkáni od nádorové přestavby, coţ bývá nelehký úkol. K tomuto účelu slouţí doplňkové imunohistochemické vyšetření na průkaz bazálních buněk. Problémem je ale neúplný přehled tkáně při jehlové biopsii. Lékař nemusí při biopsii zasáhnout nádorové loţisko, a proto musí být odběr někdy zopakován. [8] Pro základní histologické vyšetření se pouţívá barvení hematoxylin- eozin (H&E). Jádra jsou obarvená hematoxylinem a cytoplazma eozinem. [2] 29

30 Obrázek 6 Ţlázová atypie, Gleasonovo skóre 6, barvení H&E, zvětšení 100x Cílem imunohistochemického vyšetření je znázornění lokalizace konkrétní molekuly v buňce nebo tkáni pomocí specifických protilátek. Principem celé reakce je vazba mezi antigenem a protilátkou. Protilátky mohou být dvojího typu, polyklonální nebo častěji pouţívané monoklonální. Detekce můţe být také dvojí. Pokud je značená přímo protilátka, mluvíme o přímé metodě. Při častěji pouţívané nepřímé metodě je značená druhá protilátka navázaná aţ na komplexu antigenu s první protilátkou. [5] Vzorek před vyšetřením prochází řadou příprav. Probíhá šetrná fixace tkáně, tak aby byl zachován antigen. Pokud jsou epitopy přítomné na antigenu zakryty, probíhá další úprava vzorku, tak aby byly opět dostupné pro reakci. Můţe se pouţít tepelná úprava nebo proteolytické štěpení enzymem. Pro lepší přehlednost se vytváří kontrast dobarvením jader. Můţe také docházet, například úpravou ph, k blokování nespecifických a neimunních vazeb mezi nabitými protilátkami a tkáněmi s nábojem. [2] Protoţe normálním H&E barvením nelze poznat přítomnost bazálních buněk, pouţíváme imunohistochemii. Rozlišení karcinomu od hyperplazie probíhá na základě přítomnosti bazálních buněk. Vyuţíváme cytokeratiny o 30

31 vyšší molekulové hmotnosti (HMW CK) produkované bazálními buňkami. Prostatické ţlázky naopak exprimují cytokeratiny jednoduchých epitelií. [2] HMW CK jsou známy asi 30 let. Diagnóza karcinomu prostaty je opřena o negativní výsledek imunohistochemie, proto musíme pouţívat negativní a pozitivní kontrolu. Pokud tedy v nálezu chybí HMW CK značí to nepřítomnost bazálních buněk. Takovou tkáň určujeme jako imunohistochemicky negativní a výsledek poukazuje na nádorové bujení. Obrázek 7 Bazální buňky,hmw CK, zvětšení 100x Další protilátkou pouţívanou k potvrzení karcinomu je α-metylacyl-coaracemáza (AMACR). Jedná se o produkt poruchy AMACR genu. Pozitivitu vykazuje 80 aţ 100% nádorů prostaty. Jsou známy další protilátky pouţívané jako doplňkové vyšetření. Uvedla jsem ve své práci právě tyto dvě, protoţe byly vyzkoušeny na Patologickém oddělení Oblastní nemocnice Náchod a.s. (ONN). [2,7] 31

32 Obrázek 8 Středně diferenciovaný adenokarcinom prostaty, vyšetření AMACR prokazuje nepřítomnost bazálních buněk, zvětšení 100x 3.2. Použitý materiál a přístroje Hodnoty PSA byly změřeny v Oblastní nemocnici Náchod a.s. na přístroji Immulite Analyzátor pracuje na principu sekvenční enzymové chemiluminiscenční imunochemické reakce v pevné fázi. Analytická citlivost PSA je 0,04 ng/ml a PSUL je 0,003 ng/l. Dokumentace histologických preparátů byla provedena na Katedře biologických a lékařských věd FAF UK. Byla pouţita počítačová obrazová analýza: NIS-ELEMENTS AR pomocí kamery ProgRes CT 3 (JENOPTIK) firmy NIKON, reţim ţivého snímání. Imunohistochemické preparáty byly značené protilátkami proti HMW CK. Byla pouţita myší monoklonální protilátka anti-high molecular weight cytokeratin (klon 34βE12) od firmy Dako, ředění 1:100. Jádra byla dobarvena hematoxylinem Gill III. Jako detekční systém slouţil EnVision TM + Dual Link System HRP od firmy Dako. Výsledek byl znázorněn chromogenem Liquid 32

33 DAB + Substrate Chromogen Systém od firmy Dako. Pozitivní zbarvení se jeví jako hnědé. Při imunohistochemickém vyšetření byla dále pouţita protilátka proti AMACR. Jednalo se o králičí monoklonální protilátku anti-human P504S (klon 13H4) od firmy Dako, ředění 1:50. Byl pouţit stejný detekční systém a chromogen jako u HMW CK. [2, ,slovní sdělení] Vyšetřované tkáně byly dodány do laboratoře v 10 % neutrálním formalínu. Fixace probíhala 16 aţ 23 hodin. Poté byly vzorky zpracovány a zality do parafínu. Pro imunohistochemické vyšetření byly vytvořeny řezy o síle 3 µm a následně byly hodinu sušeny při 58 ºC v termostatu. Před samostatným barvením byla u některých vzorků provedena předběţná úprava tkáně a blokace endogenní peroxidázy. Po speciálním imunohistochemickém barvení byla pro lepší hodnocení dobarvena jádra hematoxylinem Gill III. Konečné úpravy vzorku zahrnovaly odvodnění, projasnění a zamontování. [2] 3.3. Rozbor pacientů Pacient č. 1 č.1 datum PSA (µg/l) PSUL (µg/l) PSAV (µg/l) qpsa (1) Nar , , , ,22 0,33 0, ,65 0,3 0, ,45 0,43 0, ,14 0,36 0, ,67 0,28 0, ,18 0,29 0, ,22 0,32 0, ,36 0,4 0, , <0,04 0, , , , , ,048 33