Masarykova univerzita Lékařská fakulta. Zavedení vyšetření [-2]proPSA do rutinní laboratorní diagnostiky karcinomu prostaty

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta Zavedení vyšetření [-2]proPSA do rutinní laboratorní diagnostiky karcinomu prostaty Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: Ing. Petr Matějka Autor: Markéta Vlčková Brno, duben 2014

2 Jméno a příjmení autora: Markéta Vlčková Název bakalářské práce: Zavedení vyšetření [-2]proPSA do rutinní laboratorní diagnostiky karcinomu prostaty Pracoviště: RNDr. Zdeněk Čecháček s.r.o., imunoanalytická laboratoř, Brno Vedoucí bakalářské práce: Ing. Petr Matějka Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Karcinom prostaty je třetí nejčastější příčinou smrti u mužů na nádorové onemocnění v ČR. V současné době se v rámci laboratorní diagnostiky karcinomu prostaty standardně používá stanovení celkového a volného PSA v séru pacienta. Novým perspektivním markerem je izoforma volného PSA [-2]proPSA. Její koncentrace se vyhodnocuje v podobě parametru PHI jako indexu zdraví prostaty (prostate health index). Předmětem této práce je zavedení stanovení [-2]proPSA a parametru PHI do rutinního provozu laboratoře, včetně ověření jejich přínosu pro diagnostiku karcinomu prostaty. Doplňkovým cílem práce je odzkoušení možnosti výpočtu rizika karcinomu prostaty a jeho možné uplatnění v praxi. Klíčová slova: [-2]proPSA, PHI, karcinom prostaty, diagnostika, benigní hyperplazie prostaty Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Ing. Petra Matějky a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne

4 Touto cestou bych ráda poděkovala především mému vedoucímu bakalářské práce Ing. Petru Matějkovi za jeho ochotu, odborné vedení a cenné rady při zpracování této práce. Děkuji MUDr. Petru Tomaštíkovi, MUDr. Igoru Motilovi a MUDr. Ctiboru Markovi za spolupráci v klinické oblasti. Dále děkuji Laboratoři imunodiagnostiky z FN Plzeň za poskytnuté vzorky a informace, práce byla v této části podpořena projektem OPVK CZ.1.07/2.3.00/ Rovněž bych chtěla poděkovat i celému kolektivu laboratoře RNDr. Zdeněk Čecháček s.r.o. za podporu a trpělivost.

5 Obsah Úvod Teoretická část Klinická část Anatomie prostaty Molekulární podstata vzniku nádoru Epidemiologie Etiologické faktory Stanovení diagnózy karcinomu prostaty Stručný popis jednotlivých markerů karcinomu prostaty Terapie In vitro Diagnostika Preanalytická fáze Analytická fáze Popis parametrů verifikace Použité statistické výpočty Postanalytická fáze Odhady rizika karcinomu prostaty Speciální část Cíle a hypotézy Popis použitých analytických metod Popis použité reagencie [-2]proPSA, PSA a fpsa Popis použitého analyzátoru Popis experimentu Použitý materiál... 37

6 2.5.2 Postup experimentu Výsledky experimentu Diskuze Analytická část verifikace Klinická část verifikace Závěr Seznam použité literatury Příloha č. 1 Příloha č. 2

7 Seznam použitých zkratek ACP ALP BCL -2 BPH BIAS BPSA CNS cpsa Cut off CV ČSKB DNA DRE EIA EKK FIA FPSA Hk3 IKK IVD KP LIA/CLIA P53 PACP Tartarát labilní frakce Alkalická fosfatáza Onkogen související s lymfomem B - buněk Benigní hyperplazie prostaty Odchýlení výsledku od skutečné hodnoty Izoforma volného PSA Centrální nervová soustava Celkový PSA Mezní hodnota Variační koeficient Česká společnost klinické biochemie Deoxyribonukleová kyselina Digitální rektální vyšetření Enzymová imunoanalýza Externí kontrola kvality Fluorescenční imunoanalýza Volný prostatický specifický antigen Human kalikrein Interní kontrola kvality In vitro diagnostika Karcinom prostaty Luminiscenční imunoanalýza/chemiluminiscenční imunoanalýza Protein p53 Prostatická kyselá fosfatáza PCA3 Prostate cancer gene 3 PCR Polymerázová řetězová reakce

8 PHI [-2]proPSA PSA PTEN QC RIA ROC SD SHBG TNM TRUS Index zdraví prostaty Izoforma volného PSA Prostatický specifický antigen Homolog fosfatázy a tenzinu Kontrola kvality Radioimunoanalýza (kompetitivní) Křivka ukazující vztah mezi specificitou a senzitivitou Směrodatná odchylka Sexuální hormony vázající globulin Klasifikace zhoubných nádorů Transrektální ultrasonografie prostaty

9 Úvod Mezi základní vyšetření při podezření na karcinom prostaty patří DRE (digitální rektální vyšetření). Jedná se o vyšetření konečníkem. Pro včasnou detekci karcinomu prostaty je významným nádorovým markerem PSA (prostatický specifický antigen). Na základě vyšších hodnot PSA nebo při suspektním nálezu DRE indikuje ošetřující urolog transrektální ultrasonografii (TRUS) a následnou biopsii. Včasná diagnostika karcinomu prostaty může v dlouhodobém důsledku vést k prodloužení přežívání pacientů. Stanovení PSA je běžným laboratorním vyšetřením v diagnostice prostatických onemocnění. K lepšímu rozlišení benigních prostatických nádorů slouží poměr fpsa vůči PSA = % fpsa. Nedostatečná specificita celkového PSA vede k nadbytečnému provádění biopsií prostaty. PSA může být pozitivní i z jiných než z nádorových příčin při zánětech prostaty, zvětšení prostaty či při zánětech močových cest. Ke zlepšení diagnostiky karcinomu prostaty byla v současné době identifikována izoforma [-2]proPSA, u níž se předpokládá větší specificita pro karcinom prostaty. Přínos tohoto markeru má význam v kombinaci s hodnotami PSA celkového a PSA volného (fpsa), toto je vyjádřeno indexem zdraví prostaty PHI (Prostate Health Index). Stanovení [-2]proPSA výrazně zlepšuje diagnostiku karcinomu prostaty u pacientů s hodnotami celkového PSA 2-10 µg/l. V první části této práce se budu zabývat teorií karcinomu prostaty a jeho diagnostiky. V experimentální části provedu analytickou verifikaci metody. U několika pacientů bylo stanoveno [-2]proPSA a vyhodnocen index PHI, některá naměřená data bylo možné porovnat s klinickým stavem pacienta, který nám byl poskytnut od ambulantních urologů. Cílem mé práce je zavést další specifičtější nádorový marker [-2]proPSA do běžné laboratorní diagnostiky a nabídnout tak urologům po PSA a fpsa další nástroj pro včasný záchyt karcinomu prostaty, případně redukci biopsií. 9

10 1 Teoretická část 1.1 Klinická část Anatomie prostaty Prostata je svalový žláznatý orgán a významně přispívá k tvorbě ejakulátu. Tvarem a velikostí ho můžeme přirovnat ke kaštanu. Konečné velikosti dosahuje kolem puberty. Je 4 cm široká a 3,5 cm vysoká (Obr. 1). Hmotnost má okolo 8 g (Petrovický, 1995). Na prostatě rozlišujeme: Bázi basis prostatae - přiléhá k močovému měchýři Hrot apex prostatae - směřuje ventrokaudálně a dosahuje až k diafragma urogenitale (svaly pánevního dna) Plochu přední facies anterior Plochu zadní facies posterior - otočenou směrem k rektu, skrz jehož stěnu je prostata hmatná. Prostata je uložena pod močovým měchýřem. Je rozdělena na přední část, kde se nachází spatium retropubicum (štěrbina mezi močovým měchýřem a břišní stěnou) a na zadní část, v níž se nachází vazivové septum fascia rectovesicalis (Petrovický, 1995). Na horním okraji plochy, blízko báze prostaty je vkleslina, do které vstupují ductus ejaculatorii (vypuzovací kanálky). Zadní část prostaty je pomocí ductus ejaculatorii dělena na kraniální úsek tzv. střední lalok prostaty lobus medius a úsek kaudální. Boční plochy prostaty se nazývají facies inferolaterales (Petrovický, 1995). Povrch prostaty pokrývá tenké vazivové pouzdro capsula propria, na které navazují fibromuskulární septa. Koncový úsek zadní části je rozdělen septem na dva laloky. Směrem k zevní části vazivového pouzdra je žilní pleteň. Vývody žláz prostaty se spojují ve ductuli prostatici (žlázové vývody prostaty ústící do uretry). Zvětšení periurethalních žlázek v oblasti lobus medius může způsobit potíže při močení dysuria, až obstrukci vnitřního ústí uretery. Ve vyšším věku se vyskytuje hypertrofie žláz 10

11 prostaty, nejčastěji ve vnitřní zóně (adenom prostaty). Hypertrofie neboli benigní zvětšování objemu vede k poruchám močení, oproti tomu karcinom prostaty postihuje spíše zónu zevní. Sekret prostaty tvoří až 30% ejakulátu. Obsahuje látky důležité pro výživu spermií. Funkce i stavba prostaty je ovlivňována hormony a mění se v průběhu života (Petrovický, 1995). Obr. 1 (upraveno dle U.S. National Institutes of Health) 11

12 1.1.2 Molekulární podstata vzniku nádoru Příčinou deregulace buněčné proliferace vedoucí k nekontrolovanému množení buněk je mutace genů kódujících proteiny. Maligní transformaci buňky mohou způsobit chromozomové translokace, které způsobí nesprávnou expresi genů, které tvoří nové funkční vlastnosti (Thompson, 2004). Mutaci buněk způsobují faktory biologické, chemické, fyzikální a také hormonální (Dvořáčková, 2012). Nejdůležitější somatickou změnou je vznik onkogenu z protoonkogenu (Štern, 2008). Rozlišujeme tři skupiny genů: Protoonkogeny jejich normální funkcí je stimulace růstu a diferenciace buněk, pomocí retrovirů a kancerogenů jsou přeměňovány v onkogeny Tumor supresorové geny regulační geny kontrolující buněčné dělení, jejich mutace může vést ke zhoubným důsledkům Mutátorové geny jejich funkcí je oprava poškozené DNA (Dvořáčková, 2012, Pacík, 2007) Hledání specifického onkogenu pro KP bylo řadu let neúspěšné. V roce 2005 bylo zjištěno, že u většiny prostatických nádorů jsou exprimovány transkripční faktory ERG a ETV1. Tyto faktory patří do skupiny ETS transkripčních proteinů, které regulují geny hrající roli v buněčné proliferaci, diferenciaci, hematopoéze, apoptóze atd. Hlavní příčinou aktivace těchto onkogenů je translokace promotoru, který pochází z genu TMPRSS2 (Transmembránová serin - 2 proteáza), který obsahuje složku regulovanou androgeny. Dochází k deleci proměnlivého úseku DNA mezi TMPRSS2 a ERG na stejném chromozomu. TMPRSS2 je exprimována v normální prostatické tkáni a silně exprimována v tkáni prostatického nádoru. Somatické změny se týkají kromě uvedeného genu, také genu GSTP1 a genu PTEN (homolog fosfatázy a tenzinu), (Štern, 2008). 12

13 Onemocnění prostaty: Hyperplazie Myoadenomatosní hyperplazie prostaty Časté onemocnění mužů po 40. roce věku, probíhá zde množení žlázek a stromatu prostaty. Hyperplazie má uzlovitý charakter. Růst stromatu je pod vlivem estrogenů a androgenů. Dochází ke zbytnění prostaty, to vede k zúžení prostatické části uretry, stagnaci moči v močovém měchýři, a tím stoupá riziko zánětů (Dvořáčková, 2012). Nádory prostaty karcinom prostaty Druhý nejčastější karcinom u mužů, který vede ke smrti pacientů. Na vzniku se podílejí hormonální vlivy a vlivy prostředí. Metastazuje do kostí. Nádor produkuje PSA - prostatický specifický antigen. Slouží k odhalování časných lézí v rámci screeningu. Z histologického hlediska se jedná o adenokarcinom (Dvořáčková, 2012) Epidemiologie Incidence karcinomu prostaty ve světě kolísá. V USA je u mužů nejčastějším zhoubným nádorem. V Evropě je častý např. ve Francii. Vzácněji se vyskytuje u východní populace Japonsko, Korea, Indie a Čína (Povýšil, Šteiner, 2007). Novorozenec (mužské pohlaví) má 16 % pravděpodobnost, že se u něj v budoucnu vyskytne KP a 3 % pravděpodobnost, že na toto onemocnění zemře (Štern, 2008). Významnou roli hraje věk, rasové faktory, hormonální vlivy a genetické predispozice. Nádor postihuje muže nad 50 let a s vyšším věkem jeho incidence stoupá. Toto onemocnění postihuje především starší muže, proto není srovnání s civilizačními chorobami, jako jsou například ischemická choroba srdeční apod., na které je mortalita vysoká i v relativně nízkém věku (Adam, Vorlíček, aj., 2002). Karcinom prostaty vzniká nejčastěji v periferní oblasti žlázy, konkrétně v zadní části a v periferní zóně - přibližně 75% případů. Primární nádor je asymptomatický. Při vyšetření per rektum může být patrný pohmatem. Diagnóza vychází z biochemického stanovení nádorového markeru PSA. Zobrazovací metody a mikroskopická biopsie prostaty jsou navazující vyšetření na stanovení koncentrace PSA (Povýšil, Šteiner aj., 2007). 13

14 Rozšiřování karcinomu prostaty se děje především krevní cestou, lymfatiky a per continuitatem (šíření do okolí). Šíří se do měkkých tkání a také do semenných váčků. Karcinom prostaty metastazuje lymfatickou cestou do regionálních lymfatických uzlin. Krevní cestou především metastazuje do kostí, pánve, do páteře, lebky. V konečných stádiích onemocnění mohou být významné metastázy do jater a plic (Povýšil, Šteiner aj., 2007). Zásadní prognostický význam v klinické praxi mají vyšetření hladiny PSA, stanovení skóre podle Gleasona a určení stádia onemocnění podle mezinárodní klasifikace maligních nádorů TNM (Povýšil, Šteiner aj., 2007, Procházková-Študentová, 2012) Etiologické faktory Genetické vlivy - Na genetickém podkladě vzniká zhruba 9% karcinomů prostaty, pravděpodobně se jedná o autozomálně dominantní dědičnost. Věk Výskyt v 8. dekádě je 208/1000 proti 8/1000 v 6. dekádě. Dietické návyky Vyšší výskyt koreluje s vyšším příjmem nasycených mastných kyselin a nižší výskyt koreluje s vyšším příjmem zeleniny. Etnické vlivy Výskyt u Číňanů, Indiánů a Židů je nižší než u Indoevropské populace. Profesionální expozice U pracovníků s ionizujícím zářením můžeme sledovat ne příliš vysoké riziko. Záleží na dávce ionizujícího záření a na zářiči se kterým pracujeme. Jediný případ, kde bylo zjištěno dvojnásobné riziko, je u farmářů. Hormonální vlivy Androgeny jsou podmínkou vzniku karcinomu, ne však jeho příčinou. Hlavní zástupce androgenů představuje testosteron vznikající v Leydigových buňkách varlat, v 10% jsou zastoupeny dehydroepiandrosteronem a androstendionem produkovanými nadledvinami. 98% testosteronu je vázáno na bílkoviny krevní plazmy SHBG (sex hormon binding globulin), (Adam, Vorlíček, aj., 2002). 14

15 1.1.5 Stanovení diagnózy karcinomu prostaty Při podezření na KP je třeba zjistit, jedná li se skutečně o tento typ onemocnění. Potvrdí - li se podezření, je třeba stanovit charakter a rozsah karcinomu. Diagnóza je založena na vyhodnocení anamnézy, vyšetření vzorku krve a moči, vyšetření konečníkem, použití zobrazovacích metod a vyšetření vzorku tkáně prostaty (Jarolím, 2000). 1) Anamnéza Je třeba zjistit informace o předešlých zdravotních stavech a nemocech. Sledují se specifické příznaky pro dané onemocnění, které mohou být ve vztahu k jiným onemocněním. Je důležité zjistit stádium onemocnění a informace o celkové tělesné kondici a změnách tělesné hmotnosti (Jarolím, 2000). 2) Laboratorní vyšetření Pro laboratorní vyšetření potřebujeme krevní vzorek, ze kterého získáme potřebné informace o funkci ledvin (hodnoty kreatininu a močoviny). Stanovení alkalické fosfatázy (ALP) informuje o kostních metastázách (Jarolím, 2000). Jako prvním markerem diagnostiky KP bylo stanovení PAP (Prostatic acid phosphatase), enzymu produkovaného prostatou, nacházejícím se ve vyšším množství u mužů trpících KP. V současné době je nejvýznamnějším nádorovým markerem PSA, glykoprotein, který je produkován epiteliálními buňkami zdravé tkáně i buňkami nádorové prostatické tkáně. PSA není specifický pro karcinom prostaty. Hodnoty PSA mohou být zvýšené i při nemaligních onemocnění. K lepšímu rozlišení benigních prostatických nádorů slouží poměr fpsa vůči PSA= % fpsa (Lukeš, 2009, Štern, 2008). Mezi nově stanovované markery patří PCA3 a [-2]proPSA. V případě PCA3 se jedná o molekulárně genetické vyšetření moče nemocného po předchozí masáži prostaty. Pro jeho stanovení byla vyvinuta a popsána realtime fluorescenční PCR (Klečka, 2008, Stolz, 2013). [-2]proPSA je izoforma volného PSA (viz dále). Pro jeho hodnocení se používá index zdraví prostaty PHI, který kombinuje koncentraci [-2]proPSA s hladinami PSA celkového a volného (fpsa), (Beckman Coulter, 2009). Tento marker odráží i agresivitu nádoru (Fuchsová aj., 2014). 15

16 3) Digitální rektální vyšetření (DRE) Je potřeba provádět digitální rektální vyšetření, protože některé typy nádorů nezvyšují hladinu PSA. Pomocí tohoto vyšetřením získáme orientační představu o lokálním rozsahu nádoru (stádium T). Normální prostata má elastickou konzistenci, jiná konzistence je podezřelá. Nádor prostaty je při pohmatu tvrdý a značně hrbolatý (Pacík, 2007, Minařík, 2012). Jedná se o subjektivní vyšetření, jehož provedení i hodnocení závisí na zkušenostech lékaře (Obr. 2). Při jakémkoliv i sebemenším podezření na KP je jasnou indikací k biopsii prostaty (Pacík, 2007, Minařík, 2012). Součástí DRE je i změření objemu prostaty, který je rovněž považován za rizikový faktor, u menšího objemu prostaty lze předpokládat vyšší riziko KP (Brigantiat et al., 2007, Xiaoye Zhu, et al., 2011). Obr. 2 DRE (převzato z www. nytimes.com) 4) Transrektální biopsie prostaty Pokud je hladina PSA zvýšena nebo pokud je fyzikální vyšetření prostaty suspektní, urolog indikuje transrektální ultrasonografii prostaty (TRUS) a následnou biopsii (Čechová aj., 2006). Vzorek tkáně prostaty se odebírá tenkou jehlou zavedenou ultrazvukovou sondou konečníkem (Jarolím, 2000). Odběr trvá zhruba 3-10 minut. Minimální počet odebraných vzorků je deset. Odebrané biopsie vyšetřuje patolog, který v bioptickém vzorku hledá 16

17 nádorové buňky. TRUS lze využít také k výpočtu objemu prostaty (Jarolím, 2000, Minařík, 2012). 5) Histologický průkaz Na přesném stanovení rozsahu onemocnění se podílí podrobné histopatologické vyšetření resekované prostaty. Patolog popisuje vlastnosti tkáně, zda se jedná o zbytnění prostaty, zánět prostaty či samotný karcinom. Při podezření na diagnózu KP se hodnotí tzv. Gleasonovo skóre, které vyjadřuje agresivitu nádoru na základě stupnice Záleží na stavbě celých žlázek. Čím vyšší skóre, tím je nádor agresivnější. Odběr množství vzorků tkáně k bioptickému posouzení odebrané části je nezbytný pro histologické vyšetření a závěrečnou diagnózu (Povýšil, Šteiner aj., 2007, Minařík 2012, Hes, 2006), (Obr. 3). Obr. 3 (převzato z 17

18 1.1.6 Stručný popis jednotlivých markerů karcinomu prostaty PSA (prostatický specifický antigen), fpsa (volná frakce PSA) PSA je serinová proteináza produkovaná buňkami prostaty. Patří do skupiny kalikreinů, označovaný také hk3 (human kalikrein). Může se podílet na ztekucení ejakulátu. Zvýšená hladina se nachází v séru při karcinomu prostaty. Bývá zvýšena i za jiných okolností, jako je benigní hyperplazie prostaty, katetrizace močového měchýře, nebo i delší jízda na kole. Zásadní je rozlišení benigní hyperplazie od karcinomu prostaty. PSA v séru existuje ve třech formách: 1. Vázaný na alfa antichymotrypsin (70 90%) 2. Vázaný na alpha makroglobulin, postrádá imunoreaktivitu 3. Volný PSA První a třetí forma se imunologicky detekují a označují se souhrnně jako celkový PSA (Obr. 4), (Beckman Coulter 2009, Štern, 2008). Volný PSA má tři izoformy: 1. [-2]proPSA- zvýšený výskyt v tumorové tkáni prostaty 2. BPSA - zvýšený výskyt v nodulární tkáni 3. Intaktní PSA Cut - off PSA se mění v souvislosti s věkem, důležité je i vztažení kvantity PSA k objemu prostaty tzv. denzita PSA, rychlost růstu koncentrace PSA (PSA velocity). Stanovení poměru volného a celkového PSA tzv. free/total PSA slouží pro odlišení malignity a benigní hyperplazie prostaty. Free PSA u nemocných s karcinomem má zpravidla nižší hodnotu. Podíl volné frakce ubývá (>25% menší pravděpodobnost KP, <10% roste pravděpodobnost KP), (Král, 2008). 18

19 Obr. 4 Formy PSA (převzato z Satoshi, H., et al. From prostate specific antigen (PSA) to precursor PSA (ProPSA) isoforms: a review of the emerging role of propsa in the detection and management of early prostate cancer, 2012). Prostatická kyselá fosfatáza (PACP) Stanovuje se jako ACP (tartarát - labilní frakce). Stanovuje se imunochemicky. Citlivost ve srovnání s PSA je značně menší. Aktivita PACP se při KP v krvi zvyšuje, avšak v nádorových buňkách se výrazně snižuje (Štern, 2008). [-2]proPSA ProPSA a BPSA představují rozdílné formy fpsa, které vykazují větší asociaci s onemocněním než PSA, fpsa nebo cpsa samotné. Ukázalo se, že zkrácené formy propsa jsou zvýšené v periferní zóně tkáně karcinomu prostaty v porovnání s tkáněmi BHP. ProPSA byl zvýšený ve tkáni tumoru prostaty, zatímco BPSA byl zvýšený v nodulární tkáni přechodové zóny (Beckman Coulter, 2009). ProPSA: [-7]proPSA [-5]proPSA [-4]proPSA [-2]proPSA (Satoshi, 2012) Nejvíce pozornosti se věnuje [-2]proPSA, protože jde o primární formu nalezenou v extraktech z tumorů a vykazuje vyšší imunobarvení v tumoru prostaty než v benigní tkáni. 19

20 Kromě toho in vitro je nejstabilnější z pěti identifikovaných forem propsa (Obr. 5). (Beckman Coulter 2009). Obr. 5 Molekulární formy PSA kolující v krvi (převzato z Kallikrein related peptidases, Novel cancer related biomarkers, Magdolen, Sommerhoff, 2012) Terapie Léčba karcinomu prostaty je závislá na závažnosti onemocnění, histopatologickém nálezu (Gleasonovo skóre), PSA a předpokládané době života (Lukeš, 2009). Terapie KP záleží na umístění nádoru. Nachází - li se nádor uvnitř prostaty (T1-T2 karcinom lokalizovaný), onemocnění je možné vyléčit odstraněním celé prostaty (radikální prostatektomie). Tvoří - li nádorové buňky metastázy v jiných orgánech například v kostech, CNS (T3-T4 pokročilý karcinom), je třeba v léčbě použít prostředky, působící v celém těle (Jarolím, 2000). U pokročilejšího onemocnění se provádí oboustranná orchiektomie (odstranění varlat). Androgenní ablace má své nežádoucí účinky, jako je pocení, 20

21 návaly horka, ztráta libida (pohlavní pud), ztráta potence, úbytek kostní a svalové hmoty (Lukeš, 2009). 1.2 In vitro Diagnostika Podstata in vitro diagnostiky je měření množství určité látky v krvi (nebo v jiné tělní tekutině), dále měření fyzikálních vlastností vzorku a podobně. Je důležité určení stádia, kdy pacient nepociťuje žádné příznaky. Díky laboratorním metodám, lze zachytit onemocnění v době, kdy je poškození organismu ještě vratné a snadněji léčitelné. Pod pojmem IVD můžeme chápat nástroj, zařízení, různé typy analyzátorů určených pro použití za účelem stanovení diagnózy, monitorování choroby a léčby. In vitro diagnostický proces se dělí na tři základní části: preanalytická fáze, analytická fáze a postanalytická fáze (Zima, 2007) Preanalytická fáze Preanalytická fáze je důležitou součástí laboratorního vyšetření, podílí se z velké části na jeho správnosti. Nejvíce chyb vzniká právě v této fázi. Zahrnuje následující postupy a operace: Požadavek na vyšetření Příprava vyšetřovaného na odběr Odběr biologického materiálu + uchování a transport do laboratoře Příjem vzorku v laboratoři Příprava vzorku na zpracování (centrifugace) Řada faktorů preanalytické fáze může ovlivnit výsledek vyšetření, proto je snahou tyto faktory eliminovat (Zima, 2007). Požadavky na odběr vzorku [-2]proPSA, fpsa a PSA: 1. Vyšetření PSA a fpsa se provádí pouze ze séra, není tedy potřeba zvláštní odběr. 2. Vzorky pro testování [-2]proPSA je nutné odebrat před manipulacemi s prostatou jako je například DRE, masáž prostaty, prostatická biopsie a transrektální ultrazvuk. 21

22 3. Mezi biopsií a odběrem vzorků [-2]proPSA, fpsa a PSA by měla být dodržena šestitýdenní čekací doba. 4. Je dobré se zdržet aktivit, jako jsou například jízda na kole či na koni. Tyto faktory mohou způsobit přechodné zvýšení [-2]proPSA, fpsa a PSA. 5. Vzorky plazmy by se neměly používat. Vzorky je nutné zpracovat (odstředit) a dát do chladničky během 3 hodin od odběru krve. Na delší dobu uložit při -20 ºC. 6. Interferencí je hemolýza. 7. Je nutné stanovení fpsa, PSA, [-2]proPSA na stejném analyzátoru (Beckman Coulter 2009, Štumr, 2013) Analytická fáze Vlastní analytický proces probíhá manuálním či automatizovaným provedením jednotlivých biochemických metod. Je prováděn v souladu se správnou laboratorní praxí. Zahrnuje systém vnitřní a vnější kontroly kvality, který by měl minimalizovat chyby analytické fáze (Zima, 2007). Zavedení (nové) metody 1. Validace Validace je ověřování, že specifikované požadavky jsou přiměřené pro zamyšlené použití. Validace potvrzuje, že měřící postup je schopen plnit požadavky na ně kladené. Validaci výrobků provádí výrobce diagnostik, tj. souprav a měřících systémů, (Friedecký, 2010), (Obr. 4). 2. Verifikace Laboratoř ověřuje, že daný analytický měřící postup je plně funkční. Analytickou metodu je potřeba verifikovat jak analyticky tak klinicky. Při verifikaci je zapotřebí ověřit základní a funkční charakteristiky analytické metody. Poskytuje objektivní důkaz, že daná metoda splňuje specifikované požadavky. Posuzuje se shoda zjištěných hodnot s hodnotami zjištěnými při validaci. Nejsou - li tyto informace k dispozici, určuje si laboratoř kritéria sama (Friedecký, 2010), (Obr. 6). 22

23 Validace Verifikace Opakovatelnost Opakovatelnost Mezilehlá preciznost Mezilehlá preciznost Vychýlení (bias) Vychýlení (bias) Pracovní rozsah/linearita/recovery Pracovní rozsah/linearita/recovery Mez detekce a mez stanovitelnosti Ověření referenčních mezí / cut-off Srovnání s referenční metodou, je- li k dispozici Stanovení referenčních mezí nebo cut-off Ostatní (interference, srovnáni s jinou metodou, robustnost, výtěžnost) Obr. 6 Výkonnostní parametry validace a verifikace (upraveno dle Doporučení k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích ČSKB). Rutinní analytický proces 1. Kalibrace Kalibrátory Access Hybritech p2psa se dodávají v šesti hladinách, a to 0, 10, 20, 50, 500 a 5000 ng/l. Stanovují se v duplikátech. Z výsledné kalibrační křivky se odečítá koncentrace analytu ve vzorku (Beckman Coulter, 2009). 2. Stanovení kontrolních vzorků a jejich vyhodnocení Kontrolní vzorky se stanovují stejným způsobem jako stanovované pacientské vzorky. Cílem jejich analýzy je ověření správnosti použité kalibrace. Obvykle se sledují tři různé hladiny. Pro vyhodnocení naměřených hodnot kontrolních vzorků se používají statistické metody, například založené na Westgardových pravidlech (Obr. 7) nebo odvozené z výkonnostních charakteristik metody (přesnost) a biologické variability daného analytu. Westgardova pravidla používají 5 rozdílných kontrolních pravidel pro posouzení přijatelnosti analytické série, kdy se hodnotí odchylka naměřené hodnoty kontrolního 23

24 vzorku od dlouhodobého průměru a porovnává se s dlouhodobou směrodatnou odchylkou. (Dostupné na: Obr. 7 Westgardova pravidla (převzato z 3. Pravidelné ověření charakteristik analytického procesu Pravidelné ověřování charakteristik analytického provozu zahrnuje jednak účast v systému externího hodnocení kvality (EHK), je-li k dispozici a pravidelné opakování verifikace vyšetření. To obvykle v omezenějším rozsahu než při zavádění nové metody (opakovatelnost, mezilehlá preciznost a bias), často s využitím dat získaných v rámci operativní kontroly kvality (IKK), (Bartoš aj., 2013) Popis parametrů verifikace Opakovatelnost Cílem parametru je kvantifikace náhodné chyby měření v jedné sérii, v co nejkratším čase, stejný měřící systém, stejný obslužný personál a stejné pracovní podmínky. Stanovuje se hodnota směrodatné odchylky v sérii 20 měření. Opakovatelnost se vyhodnocuje jako variační koeficient (%CV), (Friedecký, 2010). Mezilehlá preciznost Cílem parametru je kvantifikace náhodné chyby měření, v delším časovém intervalu, stejný měřící systém, během více měřících sérií (Friedecký, 2010). 24

25 Vychýlení (bias) metody Cílem je odhad systematické chyby měření pomocí referenčního nebo kontrolního materiálu, pokud existuje (Friedecký, 2010). Požadavky na vychýlení a přesnost se odvozují od hodnot biologických proměnlivostí příslušného analytu. V jiném případě požadavky určují odborné společnosti, mezinárodní doporučení, organizátoři EHK (Dastych, Breinek, 2008). Hodnotu vychýlení (Bias) [-2]proPSA není možno stanovit z důvodu nedostupnosti referenčního materiálu. Bias = x x 0 Bias (%) = 100 x [(x x 0 )/ x 0 ] Pracovní rozsah/linearita Cílem tohoto úkonu je ověřit pracovní rozsah v podmínkách konkrétní laboratoře a potvrdit, že platí výrobcem deklarované a validované hodnoty. V případě imunoanalytických metod se tento bod verifikace obvykle ověřuje ředěním vzorku (je - li výrobcem dovoleno) s koncentrací vzorku v horní části kalibrační křivky (Bartoš aj., 2013). Tím získáme přehled o správnosti stanovení v celém kalibračním rozsahu (diluční test). Dále se ověřuje, zda kalibrace odpovídá reálným vzorkům, toto lze provést následujícími způsoby: Přípravou směsi vzorku o vysoké a nízké koncentraci. Metodou standardního přídavku (recovery), kde se jedná o výtěžnost měření zjištěná po přídavku interferentu ke vzorku měřeného biologického materiálu (Friedecký 2010, Dastych 2008). R (Recovery) = 100 x (výsledek měření / teoretická hodnota), (ČSKB) Pro splnění toho bodu verifikace bylo v experimentální části práce provedeno ověření kalibrace metodou standardního přídavku (viz kapitola ). Ověření referenčních mezí/cut- off Ověření referenčních intervalů se provádí na základě dokumentu C28 A3. Měří se 20 vzorků prokazatelně zdravých probandů (např. ověřených předcházející metodou). Referenční interval je ověřený, pokud alespoň 19 výsledků leží uvnitř referenčního intervalu. Pokud je nalezeno pouze 18 výsledků uvnitř referenčního intervalu, opakuje se měření 25

26 s novými 20 vzorky, pro něž platí stejné kritérium devatenácti výsledků uvnitř referenčního intervalu (Friedecký, 2010) Použité statistické výpočty 1. Průměr 2. Směrodatná odchylka opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti 3. Variační koeficient opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti %CV = 26

27 1.2.5 Postanalytická fáze Zahrnuje soubor činností, které zajišťují přeměnu analytického výsledku na informaci podloženou důkazy. Součástí postanalytické fáze je komunikace mezi klinikem a laboratoří (Jabor, 2013). Postanalytická fáze zahrnuje: Výpočty Klinickou intepretaci výsledků vztaženou k: o referenčním intervalům o hodnotě cut - off Odborné konzultace s klinikem Pro správnou interpretaci výsledků je důležité brát ohled na předchozí výsledky pacienta, souvislost s dalšími vyšetřeními a celkový obraz pacienta. Pro potřebu doplnění dalších vyšetření, nebo pro zopakování analýzy (např. při nesouladu výsledku s klinickým stavem) se vzorky alikvotují a uchovávají v zamraženém stavu (Dastych, Breinek 2008, Friedecký 2010). Referenční intervaly Referenční intervaly, vymezují soubor populace, ve které se nachází 95% zdravých jedinců. U parametrů, které mají normální rozložení (Gausovo) je tento interval definován dvěma parametry - střední hodnotou a rozptylem (Jabor, 2013). Tento interval se stanoví jako průměr +/- 2 směrodatné odchylky. U parametrů, které nevykazují normální rozložení hodnot, je nutné použít neparametrickou metodu. Z hodnot velkého souboru zdravých osob se vyloučí 2,5 % vysokých naměřených hodnot a 2,5% nízkých naměřených hodnot (Dastych 2008, ČSKB). Cut - off hodnoty V populaci zdravých a nemocných osob se výsledky vyšetření částečně překrývají. Volí se proto cut - off hodnota, která slouží k rozlišení normálního a patologického nálezu. Volba cut - off závisí na charakteru onemocnění. V případě závažného onemocnění se volí 27

28 cut - off tak, aby zachytila všechny nemocné. Cut - off hodnoty určují poměr mezi diagnostickou senzitivitou a specificitou (Dastych 2008, Jabor, 2013). Diagnostická citlivost (senzitivita) Diagnostická citlivost udává pravděpodobnost, že výsledek testu bude pozitivní, je - li vyšetřovaný pacient nemocný (Racek, 2006). Diagnostická specificita Diagnostická specificita udává pravděpodobnost, že výsledek testu bude negativní, je - li vyšetřovaný pacient zdráv (Racek, 2006). Hodnoty cut - off PSA Cut - off pro PSA byl určen na základě kalibrace Hybritech Tandem s hodnotou 4 µg/l. Pokud je koncentrace pod 4 µg/l je výsledek považován za negativní. V rozmezí 4-20 µg/l je stanoveno fpsa (%), (podrobněji níže). V případě koncentrace nad 20 µg/l je výsledek považován prakticky za patologický. Následující tabulka ilustruje rozložení hodnot PSA v populaci mužů (tabulka č. 1) Klinická kategorie N 0-4,00 4,01-10,0 10,01-20,0 20,01-40 > 40 Zdraví jedinci Muži < 40 let Muži > 40 let Muži celkem Rakovinná onemocnění Celkem Benigní hypertrofie prostaty Různá močopohlavní Nerakovinná onemocnění < Tab. 1 Distribuce hodnot PSA (µg/l) v % (upraveno dle Beckman Coulter, 2006). 28

29 Nové studie ukazují, že pravděpodobnost karcinomu prostaty je poměrně vysoká i v případě hodnot < 4 µg/l, jak ukazuje následující tabulka č. 2. To je důvodem, že v aktuálních studiích autoři vyšetřují fpsa a p2psa již od hladiny PSA 2 µg/l. PSA (µg/l) Pravděpodobnost KP Pravděpodobnost KP, Gleason >7 KP 0-0,5 6,60% 0,80% 0,6-1 10,10% 1,00% 1,1-2 17,00% 2,00% 2,1-3 23,90% 4,60% 3,1-4 26,90% 6,70% Tab. 2 Pravděpodobnost KP u hodnot PSA < 4 µg/l, převzato z Guidelines on Prostate Cancer (Heidenreich A., et. al, 2013). fpsa Procento volného PSA pomáhá při posouzení relativního rizika karcinomu prostaty, lze použít jak k posouzení rizik u individuálních pacientů, tak i jako pomůcku při rozhodování o dalším postupu. Posouzení rizika u individuálních pacientů Procento volného PSA s hodnotami PSA mezi 4-10 µg/l může rozdělit riziko u mužů, u nichž výsledky DRE byly negativní. Nižší hodnoty procenta fpsa ukazují na vyšší riziko KP (Beckman Coulter, 2006). PSA Pravděpodobnost KP 0-2 µg/l 1% 2-4 µg/l 15% 4-10 µg/l 25% >10 µg/l >50% procento fpsa Pravděpodobnost KP 0-10 % 56% % 28% % 20% % 16% > 25 % 8% Tab. 3 Pravděpodobnost KP, podle výsledků PSA a % fpsa (převzato z návodu Beckman Coulter, 2006) 29

30 Jediná cut - off hodnota Hraniční hodnota má vztah k senzitivitě (procento odhalených karcinomů) a specificitě (procento předešlých biopsií u mužů bez karcinomu). Výrobce udává na základě klinické studie cut - off pro %fpsa = 25. Hodnoty nad cut - off lze považovat za negativní. PHI V návodu na použití firma Beckman Coulter neuvádí žádnou hodnotu cut - off, prezentuje jednak informaci o pravděpodobnosti karcinomu prostaty pro určité hladiny PHI (tab. 4), jednak tabuluje klinickou specificitu a sensitivitu pro konkrétní hodnoty PHI (tab. 5). Rozsah PHI Pravděpodobnost karcinomu ,4% ,0% > 40 44,0% Tab. 4 Pravděpodobnost KP pro Beckman Coulter PHI pacientů s PSA 2-10µg/l (upraveno dle návodu na použití Beckman Coulter, 2006) Hodnota cut - off PHI % Klinická senzitivita % Klinická specificita 21, ,2 39, ,1 59, ,5 Tab. 5 Klinická senzitivita a specificita pro různé hodnoty cut - off PHI Odhady rizika karcinomu prostaty Pro odhad rizika karcinomu prostaty se používají nomogramy případně kalkulátory, vyhodnocující kromě analytických výsledků i další rizikové faktory. Dílčím cílem práce je snaha přiblížit stanovení p2psa klinické praxi. K tomu jsme zvolili vyhodnocení rizika karcinomu pomocí nomogramu dle Lugezzaniho (Obr. 8 a). 30

31 Nomogram s PHI (PSA, fpsa, p2psa) Obr. 8a Nomogram pro odhad rizika KP (převzato z Development and Internal Validation of a Prostate Health Index Based. Nomogram for Predicting Prostate Cancer at Extended Biopsy, Giovanni Lughezzani et al. 2012). Abychom si ověřili případný přínos stanovení p2psa rozhodli jsme se použít pro odhad rizik karcinomu ještě nomogram využívající pouze hodnot PSA a fpsa (Karakiewicz et al., 2005), (Obr. 8b) a dále i kalkulátoru ProstataClass (Stephan, 2008), dostupného na webových stránkách: class/ (Obr. 8c). 31

32 Nomogram PSA, fpsa Obr. 8b Nomogram pro odhad rizika KP (převzato z Karakiewicz et al., 2005). Popis použití nomogramů Na jednotlivé osy se umístí pacientské variabilní hodnoty (věk, DRE, rebiopsie, objem prostaty a PHI). Pomocí vertikální osy se každá variabilní hodnota vynese na osu Points. Poté se sečtou body pro všechny proměnné. Celková suma se vynese vertikálně na osu Total point a odečte se individuální pravděpodobnost karcinomu prostaty v procentech. Kalkulátor sám spočítá riziko karcinomu prostaty na základě dat do něj vložených a vytiskne výsledek. 32

33 Kalkulátor ProstataClass: Obr 8c Okno kalkulátoru ProstataClass s vyhodnocenými výsledky Parametr Nomogram PHI (Lughezzani) Nomogram PSA, fpsa (Karakiewicz) Kalkulátor ProstataClass (Stephan) Věk X X X DRE X X X Rebiopsie X X Objem prostaty X X PSA fpsa PHI X X p2psa X X Tab. 6 Sumarizuje použití různých faktorů v jednotlivých nomogramech a kalkulátoru při výpočtu rizika karcinomu prostaty. 33

34 2 Speciální část 2.1 Cíle a hypotézy KP postihuje muže ve věku převážně po padesátém roce života a zaujímá u mužů druhé místo ve výskytu nádorových onemocnění. Základním předpokladem je včasné rozpoznání choroby. Rozpoznání choroby je založeno na laboratorním vyšetření PSA a popřípadě jeho volné frakce fpsa. PSA se však zvyšuje i z nemaligních příčin a dochází k nadbytečnému provádění biopsií. Stanovení nového markeru [-2]proPSA a z něj odvozená hodnota PHI významně přispívá k zpřesnění diagnózy mezi BHP a KP. Bakalářská práce si dává za cíl verifikovat metodu [-2]proPSA pro rutinní použití v laboratoři a dále rovněž ověřit, zda stanovení [-2]proPSA a z něj odvozené hodnoty PHI může znamenat přínos pro včasné rozpoznání nemoci případně i snížit počet neopodstatněných biopsií. V práci je provedeno vyšetření PSA, fpsa, a [-2]proPSA u několika desítek pacientů. Je u nich vypočítáno PHI a pravděpodobnost KP pomocí dvou nomogramů a kalkulátoru. Stanovené a vypočtené výsledky jsou porovnány s diagnózou určenou lékařem. Cílem je co největší přiblížení vyšetření [-2]proPSA a PHI klinikovi. Vyšetření je však poměrně drahé a dosud není hrazeno z prostředků zdravotního pojištění. 34

35 2.2 Popis použitých analytických metod 1. [-2]proPSA Access Hybritech [-2]proPSA je dvoukrokové imunoenzymatické - sendvičové stanovení. Vzorek se přidává do reakční nádobky s konjugátem myší monoklonální protilátky proti PSA s alkalickou fosfatázou a paramagnetickými částicemi, které jsou pokryty myší monoklonální anti-[-2]propsa a blokační reagencií. Ve vzorku se [-2]proPSA váže na monoklonální anti-[-2]propsa na pevné fázi a současně reaguje konjugát monoklonální anti - PSA s alkalickou fosfatázou s různými antigenními místy na molekule [-2]proPSA. Látky v reakční kyvetě nenavázané na pevnou fázi se po inkubační době odstraní promytím. Poté se do reakční kyvety přidá chemiluminiscenční substrát Lumi-Phos* 530. Jako detektor vyzařovaného světla se používá luminometr. Produkce světla je přímo úměrná koncentraci [-2]proPSA ve vzorku. Koncentrace ve vzorku se stanoví z vícebodové kalibrační křivky (Beckman Coulter, 2009). 2. PSA/fPSA Stanovení PSA a fpsa je sendvičové imunoenzymatické stanovení na bázi chemiluminiscence. Vzorek se přidává do kyvety s konjugátem myší monoklonální protilátky proti PSA/fPSA s alkalickou fosfatázou a paramagnetickými částicemi potaženými druhou monoklonální protilátkou proti PSA/fPSA (Beckman Coulter, 2006). Postup je dále totožný se stanovením [-2]proPSA. 3. Vyhodnocení indexu PHI Samotné hodnoty [-2]proPSA nejsou k efektivní léčbě pacienta ideální. Je potřeba stanovit koncentrace celkového PSA, fpsa a [-2]proPSA ze stejných sérových vzorků a na stejném analyzátoru. Poté vzorky použít pro výpočet Beckman Coulter PHI (Beckman Coulter, 2009). [ ] 35

36 2.3 Popis použité reagencie [-2]proPSA, PSA a fpsa Soupravy pro stanovení [-2]proPSA, PSA a fpsa obsahují 2 kazety (100 stanovení, 50 testů/1 kazeta). Reagencie se dodávají k okamžitému použití. Skladují se při teplotě 2-10ºC. Jsou stabilní až do data expirace uvedeného na štítku. Po prvním použití je obsah reagencie stabilní 28 dní při teplotě 2-10ºC (Obr. 9). Katalogové číslo PSA fpsa p2psa A49752 Obr. 9 Hybritech p2psa reagent pack (převzato z Beckman Coulter, 2009). 2.4 Popis použitého analyzátoru UniCelDxI800 - Beckman Coulter Je analyzátor s přímým přístupem vzorků (random access). Maximální výkon analyzátoru je 400 testů za hodinu pro jednokrokové metody. Analyzátor si vytváří vlastní alikvot, který je skladován po celou dobu zpracování a primární zkumavka je uvolněna dále 36

37 do provozu. Principem metody je chemiluminiscence s využitím paramagnetických mikročástic potažených monoklonální protilátkou (dostupné na Popis experimentu Popis experimentu zahrnuje popis použitého materiálu, postup, jakým byl experiment proveden, účel experimentu a výsledkovou část, ve které jsou uvedeny analyzované vzorky a jejich vyhodnocení Použitý materiál U metodiky byly analyzovány pacientské vzorky s různou hladinou [-2]proPSA a kontrolní materiály Access Hybritech p2psa QC a Biorad. Kontrolní materiály Kontrolní materiál Výrobce Katalogové číslo Lot Hybritech p2psa QC Lyphochek Imunoassay Plus Control, Level 1, 2, 3 Beckman Coulter A BIORAD 371, 372, Kontrolní materiály Access Hybritech p2psa se dodávají k okamžitému použití. Lahvička je při teplotě 2-10 ºC použitelná 60 dní po prvním použití. Kontrolní materiály Biorad byly rozděleny do alikvotů a zamraženy při -20 ºC. Před použitím byly alikvoty rozpuštěny, promíchány a neprodleně analyzovány. Pacientské vzorky Soubor vzorků pro klinické ověřování představoval celkově 163 pacientských sér. Jejich evidence a sběr probíhal od cca června roku Klíčovým momentem byla akce 37

38 Movember v listopadu (až prosinci) sponzorovaná firmou Beckman Coulter. V rámci této akce bylo vyšetření [-2]proPSA nabídnuto veřejnosti i klinikům bezplatně. Pro Movember byla připravena speciální žádanka. Několik vzorků bylo vybráno z pacientských sér zaslaných do laboratoře pro vyšetření PSA a fpsa, protože u nich byla známa diagnóza. Pacientské vzorky se stanovovaly souběžně s kontrolními vzorky podle návodu ke zpracování metody po řádném označení, centrifugaci a alikvotaci vzorku. Při zpracování byly respektovány požadavky na preanalytickou fázi (viz. kapitola ) Postup experimentu Experiment zahrnuje postupy při zavedení nové metody [-2]proPSA do laboratorního provozu. Byla provedena analytická verifikace, která obsahovala stanovení opakovatelnosti, mezilehlé preciznosti, výtěžnosti (recovery) a ověření referenčních mezí/cut - off. Byly použity základní statistické výpočty pro výpočet průměru, směrodatné odchylky (SD) a variačního koeficientu (%CV). Ověření referenčních mezí spočívá ve vyhodnocení indexu PHI a porovnáním těchto hodnot s klinickým stavem pacienta, získaným od ošetřujícího lékaře. Opakovatelnost Opakovatelnost byla provedena 10x s náhodným vzorkem. Použití jediného vzorku a deseti replikátů je z důvodu vysoké ceny vyšetření. Mezilehlá preciznost Mezilehlá preciznost byla stanovována průběžně v rámci interní kontroly kvality s kontrolními vzorky o třech různých hladinách Hybritech [-2]proPSA č. lotu (9 krát) Biorad Lyphochek Immunoassay Plus Control č. lotu

39 Výtěžnost (recovery) K pěti pacientským sérům o různé koncentraci byl přidán přídavek kalibrátoru p2psa o koncentraci 500 ng/l, a to v poměru 9 dílů vzorku + 1 díl přídavku. Koncentrace kalibrátoru byla ověřena na aktuální kalibrační křivku. Recovery bylo vyhodnoceno jako podíl naměřené a očekávané hodnoty přídavku. Ověření referenčních mezí/cut - off U každého pacientského vzorku byla stanovena hladina PSA, free PSA, p2psa a vyhodnocen index PHI. Vzhledem k tomu, že výrobce diagnostiky neuvádí jednoznačnou hodnotu cut - off, bylo rozhodnuto pro ověření klinického přínosu p2psa porovnat hodnoty PHI se známým klinickým stavem pacienta (diagnózou). Odhad rizika karcinomu prostaty Aby bylo možné vypočítat riziko karcinomu prostaty s použitím nomogramů a kalkulátoru popsaných v kapitole , byla připravena pro spolupracující kliniky speciální žádanka (Obr. 10), Nomogramy byly převedeny do excelovské tabulky, což zjednodušilo výpočet, kalkulátor byl používán přímo. Obr. 10 Žádanka o laboratorní vyšetření - diagnostika karcinomu prostaty 39

40 2.5.3 Výsledky experimentu STANOVENÍ OPAKOVATELNOSTI Náhodně vybraný vzorek s původně naměřenou hodnotou [-2]proPSA 15,5 ng/l. Tab. 7: opakovatelnost Opakování ng/l 1 14,0 2 14,6 3 16,0 4 15,3 5 15,0 6 15,4 7 15,5 8 15,3 9 15, ,6 průměr 15,2 SD 0,5 %CV 3,6% Kriterium (z návodu diagnostiky) Průměr 22,8 %CV 4,8 Tab. 7 Ukazuje stanovení opakovatelnosti s náhodným vzorkem s hodnotou [-2]proPSA 15,5 ng/l. U vzorku byl stanoven průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Z návodu na použití je pro porovnání uvedeno kritérium pro variační koeficient. 40

41 MEZILEHLÁ PRECIZNOST A) Kontroly Hybritech p2psa QC 1, 2, 3 (ng/l) Kontrola 1 (17,88 20,78) ng/l Tab. 8: Číslo lotu Kontrola 2 (164,03-190,63) ng/l Kontrola 3 (843,57-980,37) ng/l 1 20,3 177,8 1093,8 2 20,9 182,7 991,4 3 19,2 159,8 985,3 4 17,9 168,0 926,1 5 19,5 171,9 985,6 6 19,3 170,5 1017,7 7 18,0 174,8 949,3 8 20,8 174,6 988,3 9 20,1 186,1 928,0 Průměr 19,6 174,0 985,1 SD 1,1 7,9 51,2 %CV 5,6% 4,5% 5,2% Kriterium (z návodu diagnostiky) Průměr 22,8 108,2 1179,7 %CV 4,8% 4,7% 4,5% Tab. 8 Ukazuje stanovení kontrol Hybritech p2psa o třech různých hladinách. Kontroly byly stanoveny v devíti po sobě následujících pracovních dnech. Byl u nich vypočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Z návodu na použití je pro porovnání uvedeno kritérium pro variační koeficient. 41

42 B) Kontroly Biorad Lyphochek Immunoassay Plus Control 1, 2, 3 (ng/l) Tab. 9: Číslo lotu Kontrola 1 (ng/l) Kontrola 2 (ng/l) Kontrola 3 (ng/l) 1 5,9 24,1 165,6 2 6,4 19,4 166,5 3 5,9 22,4 161,7 4 5,9 22,2 145,5 5 6,4 20,7 148,9 6 6,6 20,1 149,0 7 5,3 20,6 154,3 8 6,1 23,4 149,5 9 6,6 22,1 162,8 10 6,4 23,3 169,5 11 5,5 23,3 137,8 12 6,7 24,1 153,8 13 6,2 24,4 166,9 14 6,4 22,0 15 6,0 24,7 16 6,0 19,9 17 6,0 21,1 18 6,0 23,0 19 5,3 25,8 Průměr 6,1 22,5 156,3 SD 0,4 1,8 9,9 %CV 6,7% 8,0% 6,3% Kriterium (z návodu diagnostiky) Průměr 8,6 22,8 106,6 %CV 6,1% 4,8% 6,0% Tab. 9 Ukazuje stanovení kontrol Biorad Lyphochek Immunoassay Plus Control o třech různých hladinách. Kontroly byly stanoveny v časovém rozmezí od do Byl u nich vypočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Z návodu na použití je pro porovnání uvedeno kritérium pro variační koeficient. 42

43 VÝTĚŽNOST (recovery) Výchozí koncentrace Očekávaná koncentrace s přídavkem Teoretický přídavek Naměřená koncentrace Zjištěný přídavek Recovery ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l Vzorek 1 10,0 53,4 44,3 44,6 35,5 80,2% Vzorek 2 21,0 63,4 44,3 52,4 33,3 75,2% Vzorek 3 78,4 115,5 44, ,7 107,8% Vzorek 4 33,6 74,8 44,3 69,6 39,1 88,2% Vzorek 5 126,1 158,9 44,3 133,5 18,9 42,6% Kalibrátor 487 Kriterium (z návodu diagnostiky) % pro přídavek Tab. 10 Ukazuje výsledky stanovení výtěžnosti u pěti vzorků metodou standardního přídavku. Ověření referenčních mezí/cut - off Sumarizace všech naměřených výsledků PSA, fpsa, p2psa, včetně vypočítané hodnoty PHI, ověřeného klinického stavu, včetně případných dalších klinických informací i případně vyhodnoceného rizika karcinomu prostaty jsou uvedeny v příloze č. 1. Na obr. 11 jsou seřazeny výsledky vzestupně dle hodnoty PHI a barevně jsou odlišeny vzorky s karcinomem prostaty, s negativní biopsií a bez informace o klinickém stavu. 43

44 KP Negativní Bez info Obr. 11 Porovnání hodnot PHI s diagnózou. V uvedeném grafu jsou zahrnuty všechna naměřená data, včetně neuzavřených diagnóz, u kterých nebylo možné z časových důvodů získat informaci o klinickém stavu. Odhad rizika karcinomu prostaty V příloze č. 1 je prezentováno rovněž 46 vzorků, pro něž jsme obdrželi veškeré informace potřebné pro výpočet rizika karcinomu pomocí nomogramů Lughezzani, Karakiewicz a kalkulátoru ProstataClass. 44

45 3 Diskuze 3.1 Analytická část verifikace Pro zavedení metody byla provedena její verifikace, která zahrnovala stanovení opakovatelnosti, mezilehlé preciznosti a ověření pracovního rozsahu/linearity. Hodnotu BIAS (vychýlení) u [-2]proPSA není možno stanovit z důvodu nedostupnosti referenčního materiálu. OPAKOVATELNOST Námi zjištěná hodnota variačního koeficientu deseti opakování 3,6% dobře odpovídá údajům výrobce z validace metody, uvedeným v návodu na použití diagnostika: 3,08 4,90% Jediný vzorek a 10 opakování je důsledkem vysoké ceny vyšetření. MEZILEHLÁ PRECIZNOST Mezilehlá preciznost byla stanovena jednak pomocí kontrol výrobce diagnostiky Hybritech p2psa a dál i s použitím kontrol Biorad Lyphochek Immunoassay Control o třech různých hladinách. V případě kontrol Hybritech p2psa naměřené a vypočítané hodnoty se pohybují v rozmezí 4,5% - 5,6%. Výrobce uvádí rozsah 4,46% 6,11% a pro koncentrační hladiny našich kontrol pak interval 4,5% - 4,8%. Námi získané výsledky jsou prakticky shodné. To, že naše variační koeficienty jsou nepatrně vyšší lze přičíst na vrub metodice jejich stanovení. Výrobce zřejmě prováděl stanovení kontrol minimálně v duplikátu po dobu 20 dní (dle směrnice CLSI EP5-A2), zatímco my jsme stanovovali kontroly devět dnů v singletu. Kontroly Biorad byly stanovovány, protože jejich hladiny lépe korespondují s reálnými vzorky a jsou nezávislé na výrobci diagnostiky. Vypočítané variační koeficienty se pohybují v rozsahu 6,3% - 8,0%. Výrobce pro analogické hladiny uvádí rozsah 4,8% - 6,1%. Na vyšším rozptylu se v tomto případě mohla podepsat kromě metodiky i případná nižší stabilita kontrol, nespecifikovaná pro p2psa. Dále také skutečnost, že výsledky byly získávány v delším časovém období, interval mezi sériemi byl zpravidla 1 týden. 45

46 VÝTĚŽNOST (recovery) Námi zjištěné hodnoty výtěžnosti se pohybovaly v intervalu 42,6-107,8 %. Výrobce v návodu na použití uvádí pro recovery průměrnou hodnotu 93% (individuální hodnoty %). Naše výsledky se tedy plně neshodují s údaji z návodu. Pokud bychom vyloučili z hodnocení vzorek č. 5, byla by námi zjištěná průměrná hodnota recovery 87,9 % (individuální hodnoty 75,2% - 107,8 %), což je již přijatelnější. Ne zcela uspokojivé výsledky výtěžnosti mohly být způsobeny redukovaným rozsahem našeho experimentu, který jsme dále neověřovali vzhledem k ceně diagnostik. Výrobce diagnostik pro ověření recovery přidával k vzorkům 6 přídavků ( ng/l) čištěného [-2]proPSA, zatímco my jsme použili [-2]proPSA z kalibrátoru. 3.2 Klinická část verifikace a) Ověření referenčních mezí/cut - off Jak již bylo vysvětleno výše, výrobce diagnostiky neuvádí jednoznačnou hodnotu cut off, takže jsme experimentem ověřovali, jak hodnoty PHI korelují s klinickým stavem pacienta. Bakalářská práce obsahuje soubor 163 vzorků. Z toho u 80 vzorků jsme získali informace o klinickém stavu pacienta. Těžiště experimentu z hlediska počtu vzorků byla akce Movember v listopadu (až prosinci). Naše výsledky jsou postupně využívány pro další diagnostický postup včetně biopsií a histologického hodnocení odebraných vzorků. Celý proces je časově náročný a vyžaduje souhlas pacienta, proto jsou naše informace neúplné. V následující tabulce č. 11 je uvedena sumarizace výsledků. Parametr Mediány (min. max.) PCa pozitivní Negativní Bez informace Počet vzorků PSA (µg/l) 9,05 (2,93-16,6) 5,44 (0,90 20,2) 5,43 (0,65 18,5) %fpsa 8,1 (3,8 18,1) 17,6 (4,7 47,1) 14,4 (3,6 54,5) [-2]proPSA 15,5 (5,6-74) 13,8 (4,90 126) 12,2 (2,0 96,4) PHI 74,9 (44,3 183) 37,8 (19,1 281) 39,1 (9,7 127) Tab. 11 Sumarizace experimentů při klinické verifikaci metody [-2]proPSA 46

47 Následující graf porovnává hodnotu PHI s ověřeným klinickým stavem (Obr. 12) KP Negativní Obr. 12 Porovnání hodnot PHI s ověřeným klinickým stavem Jak je vidět, diagnóza karcinomu prostaty byla potvrzena u vzorků s PHI > 40 a lze říci, že s rostoucí hodnotou PHI riziko karcinomu roste, byť na řádné statistické hodnocení by bylo potřeba větší počet vzorků. Naše výsledky dobře korespondují s výsledky studie provedené ve FN Plzeň (Fuchsová aj., 2014) - viz obr. 13. Obr. 13 Přehled hodnot PHI dle výsledku biopsie (převzato z Ces Urol 2014) 47

48 Na základě našich zjištění jsme upravili v laboratoři hodnocení PHI následovně: PHI < 30 snížené riziko, PHI hraniční riziko, PHI > 40 zvýšené riziko. b) Pravděpodobnost karcinomu pomocí nomogramů Jak bylo rozebráno v teoretické části, klinik musí při diagnostice karcinomu prostaty kromě hladiny PSA brát do úvahy i další rizikové faktory, jako je věk pacienta, objem prostaty, výsledek DRE atd. Pomůckou pro objektivnější rozhodování jsou nomogramy a kalkulátory, které umožňují převedení příspěvků jednotlivých faktorů do jediného čísla, pravděpodobnosti KP. Další dílčím cílem bakalářské práce bylo proto ověření přínosu použití výpočtu rizika KP pomocí nomogramu využívajícího hodnot PHI - Lughezzani. Abychom mohli vyhodnotit přínos [-2]proPSA, rozhodli jsme se pro porovnání vypočítat pravděpodobnost KP i pomocí nomogramu, který je založen jen na hodnotě PSA a fpsa (Karakiewicz), resp. analogického kalkulátoru (ProstataClass). Klinické údaje jsme získali ze speciální žádanky - celkem 46 vzorků. Následující obrázky 14 a 15 ukazují vzájemný vztah mezi rizikem karcinomu prostaty vypočítanými všemi třemi způsoby. 100% 80% 60% 40% 20% 0% Lughezzani Karakiewicz Obr. 14 Porovnání nomogramů Lughezzani a Karakiewicz 48

49 100,0% 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Lughezzani ProstataClass Obr. 15 Porovnání nomogramu Lughezanni a kalkulátoru ProstataClass (Stephan) Na obou obrázcích jsou hodnoty získané nomogramem Lughezanni seřazeny vzestupně (červené sloupce) a k nim je připojen výsledek nomogramu Karakiewcz (modré sloupce) a kalkulátoru ProstataClass (zelené sloupce). Jsou na nich patrné zřetelné a někdy i docela významné rozdíly v pravděpodobnostech KP. Tyto mohou mít příčinu v přidané hodnotě [-2]proPSA, resp. PHI, ale mohou odrážet i různý přístup jednotlivých nomogramů a kalkulátoru k některým faktorům, například k věku. Pravděpodobnost karcinomu roste s věkem muže a toto zohledňují oba nomogramy, zatímco ProstataClass (Stephan) zřejmě spojuje zjištěnou koncentraci PSA s věkem, tzn., stejná hodnota představuje vyšší riziko u mladšího muže, než u staršího. Tento přístup může být přínosný při detekci agresivních forem karcinomů u mladších pacientů. Pro ilustraci uvádíme v tabulce č. 12, jak by se měnilo vypočítané riziko karcinomu prostaty s věkem např. u našeho vzorku č. 6, který měl po biopsii pozitivní nález: č. vzorku Věk Biopsie Objem PSA (µg/l) p2psa (ng/l) fpsa (µg/l) %fpsa PHI 6 67 Ne 30 14,7 10,7 0,7 5,2% 53,9 49

50 Věk Lughezanni Karakiewicz ProstataClass 40 24,2% 51,5% 94,3% 50 39,3% 57,4% 93,7% 60 58,4% 62,8% 92,6% 67 69,5% 66,1% 91,5% 70 73,7% 67,5% 90,8% 80 85,3% 71,9% 88% Tab. 12 Porovnání závislosti rizika karcinomu prostaty na věku u nomogramů Lughezzani a Karakiewcz a kalkulátoru ProstataClass. Jak lze vyčíst z tabulky č. 12, vliv věku je u nomogramu Lughezzani poměrně výrazný a může se zdát až přehnaný. Vzhledem k vzájemné provázanosti jednotlivých faktorů, není úplně korektní hodnotit pouze jediný z nich odtrženě od ostatních. V době finalizace výsledků bakalářské práce jsme u 46 vzorků, které jsme nomogramy a kalkulátorem vyhodnocovali, získali informace o klinickém stavu pacientů jen zcela ojediněle. Aby bylo možné nomogramy a kalkulátor nějak porovnat z hlediska jejich přínosu pro diagnostiku, navázali jsme spolupráci s Laboratoří imunodiagnostiky Fakultní nemocnice Plzeň, odkud jsme získali 75 vzorků s potřebnými klinickými informacemi a ověřeným klinickým stavem. Tyto jsme pak vyhodnotili pomocí nomogramů Lughezzani a Karakiewicz i kalkulátorem ProstataClass - viz příloha č. 2 Na obrázcích jsou prezentovány výsledky pro oba nomogramy a kalkulátor s rozlišením ověřeného klinického stavu. Výsledky jsou vždy seřazeny vzestupně a barevně jsou odlišeny podle diagnózy 50

51 100% 80% 60% 40% 20% 0% PCA_L Neg_L Obr. 16 Pravděpodobnost podle nomogramu Lughezzani - vzorky FN Plzeň 100% 80% 60% 40% 20% 0% PCA_K Neg_K Obr. 17 Pravděpodobnost podle nomogramu Karakiewicz - vzorky FN Plzeň 100% 80% 60% 40% 20% 0% PCA_S Neg_S Obr. 18 Pravděpodobnost podle kalkulátoru ProstataClass - vzorky FN Plzeň 51