MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA ÚSTAV MORFOLOGIE, FYZIOLOGIE A GENETIKY ZVÍŘAT IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU POMOCÍ METODY PCR Diplomová práce Brno 2010 Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Hana Pitrunová 1

2 2

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Identifikace živočišných druhů v krmivu pomocí metody PCR vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MU v Brně. V Kelči dne 24. dubna

4 Poděkování Děkuji svému vedoucímu práce panu prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za umožnění vypracování diplomové práce a Ing. Michaele Nesvadbové za laboratorní vedení a odborné rady při zpracování. 4

5 Abstrakt Na kvalitu krmiv pro psy jsou kladeny stále větší požadavky. Optická mikroskopie je v současné době uznána v zemích Evropské unie jako jediná referenční metoda pro detekci živočišného proteinu v krmivech. Touto metodou nelze přesně identifikovat jednotlivé živočišné druhy, a proto jsou stále více používány přesnější metody založené na analýze DNA. Tato práce byla zaměřena na identifikaci jednotlivých živočišných druhů v krmivu pro psy pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Byla ověřována specifita primerů pro PCR reakci, které byly převzaty ze tří publikací, na DNA z kura domácího, krůty, skotu, prasete, koně, ovce, makrely a lososa. Pouze jedna sada primerů byla vhodná pro specifickou identifikaci druhů, protože vytvářela specifický produkt pouze s těmi druhy DNA, pro které byla určena. Tyto primery byly následně použity k testování krmiv pro psy. U většiny krmiv odpovídala detekovaná DNA složení, které uvádí výrobce na obalu. Přesto u některých krmiv bylo zjištěno porušení deklarované receptury výrobcem, náhradou jakostního druhu masa za suroviny méně hodnotné. Ve 20 testovaných krmivech byla nejčastěji přítomná DNA kura domácího (95 %), dále DNA prasete (70%), skotu (60%), ovce (25%) a DNA koně nebyla detekována u žádného z testovaných vzorků. Klíčová slova: PCR, druhově specifické primery, mitochondriální DNA, krmiva, živočišný druh 5

6 Abstract There are ever-increasing demands for higher quality feedstuffs. At the current time, the classic microsophy method is considered to be the only reference method for the identification of animal protein in feedstuffs. This method cannot be used for an exact identification of animal species and that is why more accurate methods based on DNA analysis are now available for use. The aim of this work was to identify animal species in dogs` feedstuffs using the polymerase chain reaction (PCR) method. The specifity of primers taken from three different manufacturers have been tested with DNA extracted from chicken, turkey, cattle, pig, horse, sheep, scomber and salmon. Only one set of primers was suitable for species identification because of providing specific product only with that species for which was determined. These primers were used for dogs` feedstuffs testing. In the majority of feedstuffs tested, the detected DNA was in agreement with the consitituent composition specified by the manufacturers. However, the composition of a small number of feedstuffs were found to differ from those specified by manufacturers where high quality meat was replaced with less valuable material. Out of 20 tested feedstuffs the most present was the DNA of chicken (95 %), then the DNA of swine (70 %), bovine (60 %), ovine (25 %). Horse DNA was not detected in any of them. Key words: Polymerase chain reaction, species specific primers, mitochondrial DNA, feedstuffs, animal species 6

7 Obsah 1 Úvod Cíl práce Literární přehled Výroba krmiv pro psy v České republice Granulovaná krmiva Konzervovaná krmiva Důvody detekce živočišných druhů v krmivu Metody používané k detekci živočišných bílkovin v krmivu Metody založené na proteinové analýze Klasická mikroskopie Blízké infračervené zobrazování Blízká infračervená mikroskopie (NIRM) Blízká infračervená spektroskopie Detekce pomocí imunoesejí Chromatografické metody Olfaktometrické metody Metody založené na DNA analýze Metody založené na DNA hybridizaci Metody založené na PCR Sekvenování PCR produktu založené na mtdna Restrikční štěpení PCR produktů Druhově specifické PCR primery Analýza konformačního polymorfismu jednořetězců Náhodná amplifikace polymorfní DNA Použití aktin multigenové rodiny Použití mikrosatelitních markerů Array technologie a mikročipy Real time PCR Multiplex PCR

8 3.5.3 Ostatní metody Metoda založená na elektrochemických biosenzorech Kvalitativní a kvantitativní možnosti identifikace živočišných druhů Materiál a metodika práce Izolace genomové DNA z krmiva kolonkovou metodou a elektroforéza Koncentrace DNA Ověřování specifity primerů Detekce živočišných druhů v krmivech 45 5 Dosažené výsledky a diskuse Výsledky izolace DNA Výsledky koncentrace DNA Specifita primerů Výsledky detekce živočišných druhů v krmivech Závěr Seznam použité literatury Seznam tabulek Seznam obrázků

9 1 Úvod Základem při výrobě krmiv je zachování jejich nutriční hodnoty a kvality surovin. Zahrnutí jednotlivých komponent do směsí bylo založeno na přirozených krmných požadavcích karnivorů, omnivorů i herbivorů. Psi jsou sice domestikováni již tisíce let, ale genetická rozdílnost mezi psem a vlkem je méně než 0,3 %. Pes je masožravec a jeho trávící soustava je uzpůsobena ke zpracování masité potravy. Trávicí ústrojí psa je poměrně krátké a potrava jím tak prochází rychle. Tudíž masožravci nejsou schopni využít nebílkovinné živiny z potravy jako býložravci. Na druhé straně je pes schopen pozřít velké kusy masa, a v tomto stavu je i trávit. V průběhu domestikace se trávicí trubice prodloužila a pes je dnes schopen strávit i potravu rostlinného původu. Maso je však pro psa velmi důležité a jeho úplná absence v potravě má za následek nedostatečný příjem živin. Přesto bylo zjištěno, že hodně granulovaných krmiv je složeno z obilovin a rostlinného materiálu, což jejich požadavkům neodpovídá. Proteiny živočišného původu obsahují více esenciálních aminokyselin než rostlinný materiál, který je z větší části pro karnivory nestravitelný. Do krmiv pro psy jsou obiloviny přidávány, protože jsou levnější než produkty z masa a mají schopnost vázat dohromady všechny přísady v krmné surovině. Zákazníci se nyní začínají více zajímat o složení krmiv, které pro své zvířata nakupují a kladou se větší požadavky na kvalitu kupovaných krmiv než tomu bylo doposud. Z tohoto důvodu se zvyšuje i význam laboratorních kontrol hodnotících složení krmných směsí. Kvůli obavám o kvalitu potravin a krmiv se stále zvyšuje potřeba přesných a spolehlivých metod pro identifikaci živočišných druhů. Díky rozvoji molekulární biologie bylo objeveno mnoho metod, které umožňují detekci živočišných druhů téměř v jakémkoli organickém substrátu. Stále se zavádí nové regulace splňující ochranné standardy v potravním řetězci, proto lze očekávat, že metody pro ověřování potravin a krmiv se budou nadále vyvíjet vzhledem k jejich vyšší efektivnosti, přesnosti a finanční nenáročnosti. 9

10 2 Cíl práce Diplomová práce byla zaměřena na využití molekulární biologie pro DNA analýzu vybraných granulovaných a konzervovaných psích krmiv. Hlavním cílem diplomové práce bylo otestování specifity primerů převzatých od třech různých autorů na vyizolovaných osmi živočišných druzích DNA. Dále použití vhodných primerů pro identifikaci pěti živočišných druhů (kur domácí, skot, ovce, prase a kůň) ve 20 testovaných krmivech metodou PCR. Následné porovnání efektivnosti PCR metody s použitím druhově specifických primerů s dalšími metodami využívanými k detekci živočišných druhů v krmivu. A v neposlední řadě také srovnání výsledků se složením uvedeným výrobci na obalech. 10

11 3 Literární přehled 3.1 Výroba krmiv pro psy v České republice Český trh s krmivy pro domácí zvířata má velký potenciál dalšího růstu. Granulované a konzervované krmivo pokrývá pouze 40 % výživových potřeb domácích zvířat na rozdíl od západních zemích, kde se tato hranice pohybuje okolo 60 %. V nejvyspělejších zemích je podíl průmyslově vyráběné stravy v porovnání s domácí ještě vyšší. Prodej průmyslově vyráběné potravy pro psy a kočky minulý rok rostl co do objemu i hodnoty. Někteří zákazníci se však začínají více ohlížet na cenu výrobků a nakupují krmiva v hypermarketech a diskontních prodejích. Avšak čím dál více chovatelů se začíná zaměřovat na kvalitní suroviny a přídavky, které se používají při výrobě prémiových a superprémiových krmiv. Kvalitním prémiovým krmivům dávají přednost chovatelé větších plemen a výstavních zvířat. Takoví zákazníci mají zájem o segmentaci výrobků specielně podle plemene a zatížení. Granule upřednostňují především chovatelé větších plemen a konzervovaná krmiva zase chovatelé malých plemen. V domácnostech narůstá počet psů malých plemen, a proto se předpokládá zvýšení prodeje konzervovaných krmiv. Nicméně největší objem prodeje bude stále v krmivech suchých díky jejich nenáročnosti na přípravu, skladování a ekonomické výhodnosti oproti konzervovaným krmivům. V současné době se začíná také hovořit o syrové stravě stylu BARF Bones And Raw Food (kosti a syrová strava), která by měla vycházet z nejpřirozenějšího životního stylu psa. Přesto i tato strava má své negativní stránky, jako zajištění zdravotní nezávadnosti, ekonomickou a časovou náročnost na přípravu krmiv (KOUCKÁ, 2008). Technologicky vyráběná krmiva poskytují velké množství výhod oproti doma připravovaným krmivům, jako je např. stálá receptura složení živin, vitaminů, minerálů a dalších látek. Předpokládá se, že se v budoucnu bude zvětšovat zájem o průmyslová krmiva, jelikož nyní pouze tři zákazníci z deseti kupují tyto výrobky oproti západní Evropě, kde je to sedm zákazníků z deseti (ANONYM, 2010). 11

12 3.1.1 Granulovaná krmiva Granulovaná krmiva se vyrábí procesem extruze za pomocí extrudéru, který je vyroben z intaktní nerezové oceli, aby nedocházelo ke kontaminaci zpracovávaného materiálu. Extruze je tepelná úprava krmiv založená na HTST (high temperature short time) vysoká teplota po krátký čas, což bývá ke zpracovanému krmivu šetrné. Jde o tepelné a mechanické působení na suroviny jako jsou obiloviny, maso, tuky, oleje a doplňkové látky. Dnes je povinností, aby každá vstupní surovina měla číslo šarže výroby a své označení. Granule vyráběné v České republice používají systém kontroly jakosti ISO Postup extruze: smíchání obvykle velkého objemu surovin (některé suroviny se před mícháním rozmělňují mletím). Rovnoměrná velikost surovin ovlivňuje další zpracování absorpci vody, pasáž přes extrudér, vaření, vzhled a stravitelnost krmiva, míchání ingrediencí, hnětení těsta, kynutí a vaření probíhá v extrudéru, který svým šroubem žene, míchá a vaří hmotu, vaření a krájení směs je protlačována otvory přes formu na konci extrudéru. Při průchodu formou hmota dosahuje až 200 C při vlhkosti 25 %, sušení a chlazení probíhá v sušičce, snížení vlhkosti na 10 %, pokrytí vrstvou ochucovadla (ANONYM, 2009a). Podle KOUBALOVÉ (2009) se granule vyrábí při tlaku atmosfér a C. Suroviny používané jako zdroj bílkovin v krmivu musí obsahovat nejméně 20 % bílkovin v sušině. Do granulovaných krmiv se používá drůbeží maso, jehněčí maso, ryby, vedlejší suroviny živočišného původu, sója, kukuřice, rýže, vejce atd Konzervovaná krmiva Konzervovaná krmiva jsou většinou lépe přijímána zvířaty, ale složením nemusejí být o nic hodnotnější než granulovaná. Jsou obvykle zpracovávaná pasterizací ve vodní lázni do 100 C, nebo v autoklávech sterilizací v horké páře s teplotou pohybující se mezi C. Při výrobě konzervovaných krmiv se jako zdroj bílkovin používají játra, 12

13 vedlejší živočišné produkty, hovězí a kuřecí maso, sladkovodní a mořské ryby. Nevýhoda u konzervovaného krmiva je cena, přičemž konzerva obsahuje vysoký podíl vody (až 80 %) v krmivu (ANONYM, 2009a). 3.2 Důvody detekce živočišných druhů v krmivu Všeobecně u krmiv jakýchkoliv hospodářských zvířat je nutná kontrola jejich složení. V současné době, kdy přibývá chovatelů různě prošlechtěných plemen psů se zvyšují i nároky na kvalitu psích granulovaných a konzervovaných krmiv a tudíž je velmi důležitá zpětná identifikace složení uvedeného na obalu (ANONYM, 2010). LOCKLEY a BARDSLEY (2000) uvádějí jako hlavní důvod kontroly složení krmiv u hospodářských zvířat výskyt bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) a geneticky modifikovaných organismů (GMO). Zákaz výskytu živočišného proteinu v krmivu pro hospodářská zvířata vedl ke značné redukci BSE, jak uvádí FUMIERE et al. (2009), s čímž souhlasí i BELLAGAMBA et al. (2001), podle nichž riziko výskytu BSE je výsledkem nejen infikovaných zvířat, ale také důsledkem používání koncentrovaných krmiv, jejich doplňků, savčího masa a kostní moučky. JIA-QIN et al. (2008) dále upřesňuje, že příčinou lidské creutzfeld-jakobovy choroby (CJD) je BSE. Současný výzkum ukazuje, že krmení živočišné bílkoviny bez tepelného ošetření přežvýkavcům může způsobit BSE a jeho následné rozšíření. Konečným produktem při zpracování krmiv je konverze živočišného odpadu do masokostních mouček, což zahrnuje tukovou a proteinovou frakci, která může být nositelem jakékoli infekční složky přítomné v syrovém materiálu, která nebyla zničena tepelným procesem. Proto protein od přežvýkavců byl od roku 1998 zakázán v krmivu pro přežvýkavá zvířata. Rozhodnutí rady 94/381/EC zakazovalo v členských státech krmení proteinem pocházejícím ze savčího materiálu ruminantům. Nicméně tatáž komise povolovala krmení proteinů od jiných druhů než přežvýkavců. BAI et al. (2009) se zabývali složením potravin, jejichž výzkum se v posledních letech zaměřil na detekci různých živočišných druhů. Hlavním důvodem jsou obavy konzumentů z BSE, slintavky a kulhavky a ptačí chřipky. Je zájem o pravdivé značení 13

14 produktů, a proto je velký požadavek na rychlou a přesnou druhovou identifikaci masa. Propuknutí BSE donutilo Evropskou unii k určitým rozhodnutím, aby nedocházelo k přenosu této nemoci přes potravní řetězec. Používání živočišné bílkoviny je kontrolováno Evropskou unií. Nařízeni EC 999/2001 zakazuje krmení savčího proteinu ruminantům a EC 1774/2002 seznamuje s několika opatřeními, které hlavně uvádí: zákaz krmení zvířat bílkovinou stejného druhu, klasifikaci vedlejších živočišných produktů do 3 kategorií odrážejících různé ochranné úrovně včetně rizika kvůli transmisivní spongiformní encefalopatii. Jen materiál z třetí kategorie, který je vhodný pro lidskou spotřebu, může být použit pro krmení hospodářských zvířat. Zavedení těchto praktik vyžaduje použití analytických metod umožňujících druhově specifickou identifikaci. Regulace z roku 2003/1234/EC pozměňuje výše uvedené nařízení v tom smyslu, že všechen živočišný protein pocházející z hospodářských zvířat je zakázán přidávat do krmiva jakýmkoliv hospodářským zvířatům, kvůli nedostatku specifických detekčních metod. Mléko a mléčné produkty jako syrovátka, vejce a produkty z vajec jsou povoleny ke krmení hospodářských zvířat. Rybí moučka je jediným oprávněným zdrojem živočišné bílkoviny pocházejícím z masa pro krmení prasat a drůbeže. Krmení odpadního materiálu vznikajícího při zpracování ryb je v současné době povoleno u ryb s vyjímkou materiálu ze sádek, kterým nemůžou být krmeny ryby stejného druhu. V současné době není žádný legislativně stanovený limit pro podávání zpracovaného živočišného proteinu do krmiv (RAAMSDONK et al., 2007). V roce 2006 EFPRA (European Fat Processors and Renderers Association) navrhla navrácení určitých živočišných bílkovin do krmiv za stálého dodržování regulace EC 1774/2002. EFPRA také požadovala nulovou toleranci, což znamená, že krmiva obsahující stopy živočišné bílkoviny jiné než rybí moučku nemohou být použity k výživě zvířat. EFPRA také doporučuje 2 % limit živočišné bílkoviny v krmivech pro ruminanty. Pokud bude jakákoliv výše živočišné bílkoviny v krmivu akceptována, budou dále požadovány kontrolní nástroje pro dodržování těchto hodnot. STRATFEED projekt byl založený Evropskou unií pro vyhnutí se dalším problémům s výskytem BSE a CJD jako důsledkem zkrmováním masokostních mouček 14

15 hospodářským zvířatům. Projekt byl vytvořen pod názvem Nové metodologie pro detekci a kvantifikaci nelegálního přidávání savčích materiálů do krmiv. Mimo jiné řeší ekonomický vliv zpracování živočišných vedlejších produktů z jatek. Ročně se v Evropské unii vyrobí 16 milionů tun vedlejších produktů. Naprostý zákaz používání masokostních mouček by měl za následek vysoké finanční náklady na likvidaci vedlejších produktů a dále na nahrazení živočišného proteinu rostlinným. Proto bylo navrženo stanovit podmínky pro prezenci živočišného materiálu v krmivech se striktními kontrolami pomocí metod, které zajistí spolehlivost přes tepelné opracování a dodržování druhových bariér. Projekt byl složen z 10 partnerů z 8 evropských zemích včetně výzkumných center, univerzit, oficiálních laboratoří a soukromých společností. Hlavním cílem STRATFEED projektu je poskytnout metody pro detekci a kvantifikaci masokostních mouček v krmivech, použitelné v jakýchkoliv laboratořích zabývající se kontrolou kvality krmiv. Kromě mikroskopie jsou zde studovány metody NIRS, NIRM a PCR (popsané níže v textu) (DARDENNE, 2000). 3.3 Metody používané k detekci živočišných bílkovin v krmivu Na základě výše uvedených důvodů podle BELLAGAMBA et al. (2001) se zavedla druhová identifikace živočišných druhů prováděná pomocí různých metod, které jsou založeny zejména na analýze určitých biomolekul, jako jsou proteiny elektroforéza, izoelektrická fokusace, imunochemie a HPLC metody nebo jsou zaměřeny na určení pomocí mikroskopie. V poslední době byly rozvinuty DNA analýzy genetického materiálu používající PCR techniky, přímé DNA hybridizace nebo sekvenování. V současné době je klasická optická mikroskopie jedinou referenční metodou pro detekci zpracovaného živočišného proteinu a je používána jako oficiální kontrola dle nařízení komise 2003/126/EC (FUMIERE et al., 2009), což potvrzuje ve své studii i PINOTTI (2009). Legislativa také umožňuje použití jiných metod, které mohou být aplikovány navíc, pokud budou poskytovat více informací o původu živočišného materiálu. Většina studií byla zaměřena na schopnosti technik detekovat přítomnost živočišného proteinu od 0.1 % obsahu v krmivu. 15

16 BAI et al. (2009) rozdělil metody pro analýzu živočišných druhů takto: 1 Metody založené na proteinové analýze: elektroforéza, chromatografie, imunologické techniky a další techniky podle RAAMSDONKA et al. (2007), NIRS blízká infračervená spektroskopie (near-infrared spectroscopy), NIRM blízká infračervená mikroskopie (near infrared microscopy), blízké infračervené zobrazování (near infrared imaging) a olfaktometrické techniky (oflactometry techniques). Avšak tyto metody nejsou natolik citlivé, aby přesně detekovaly živočišné druhy, které jsou obsaženy v potravině nebo krmivu, jsou časově náročné, inadekvátní a drahé. S tímto souhlasí i MARTÍN et al. (2007), který dodává, že v případě imunologických technik jen protilátky použité proti tepelně stabilním biomarkerům můžou být využity pro detekci masokostních mouček v krmivech živočišného původu. Proteiny po smrti zvířete ztrácejí svou biologickou aktivitu, a tak jejich přítomnost a vlastnosti závisí na typu buněk. Mnoho z nich je také tepelně labilních, jak uvádí HUANG et al. (2006). LOCKLEY a BARDSLEY (2000) vysvětluje, že v minulosti se živočišné druhy v krmivu testovaly za pomocí různých imunologických a elektroforetických metod. Tyto metody se setkávaly s problémy, jako je zahřívání při zpracování krmiv, což způsobuje denaturaci proteinů. Velké množství komerčních metod bylo navrženo k detekci plasmatických proteinů, což mohlo vést k scestným výsledkům kvůli náhodné kontaminaci masa krví jiných druhů zvířat. Proto se testování živočišných druhů posunulo k výzkumu DNA. 2 Metody založené na DNA analýze: PCR amplifikace - polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction), RAPD-PCR - náhodná amplifikace polymorfní DNA (random amplified polymorphic DNA), PCR-RFLP - polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism), 16

17 real-time PCR - PCR v reálném čase, PCR AFLP - polymorfismus v délce amplifikovaných fragmentů (amplified fragment length polymorphism), SSCP - analýza konformačního polymorfismu jednořetězců (single strand conformation polymorphism), multiplex PCR, sekvenování, nested primer PCR a mikrosatelity, jak dodává MURUGAIAH et al. (2009). Tyto metody jsou jednodušší, rychlejší a specifické, ale mají horší reprodukovatelnost, nebo nižší efektivnost při souběžné detekci všech zkoumaných živočišných druhů. Na rozdíl od proteinů má DNA vyšší termální stabilitu, je přítomná ve většině buňkách a umožňuje detekci živočišného druhu bez ohledu na původ tkáně. PCR techniky můžou teoreticky amplifikovat jednu kopii cílené DNA, proto detekční limit je obvykle nižší než u proteinových technik (BALLIN et al., 2009). MARTÍN et al. (2007) popisuje, že mnoho metod založených na detekci DNA pomocí PCR nemůže být použito pro detekci masokostních mouček v krmivu. Kvůli použité vysoké teplotě při jejich zpracování jsou vysoce degradované, a proto spoléhají na amplifikaci jen krátkých sekvencí DNA Metody založené na proteinové analýze Klasická mikroskopie Rozdělení metod podle FUMIERE et al. (2009). Je zde realizována kvantitativní část detekce a jen částečně kvalitativní ze získaných vzorků původního krmného materiálu nebo po pomletí. Pro sedimentaci se používají buď konické eppendorfovy zkumavky, nebo nálevky. Nezpracovaný koncentrovaný materiál musí přejít přes síto. Pro přípravu preparátu k mikroskopování jsou používány média jako glycerol, nebo parafinový olej. Také se používají různé barvící reagenty např. alizarinová červeň a cystin pro zvýraznění některých struktur jako jsou kosti, rybí kostra nebo srst a peří. Podle PINOTTIHO (2009) se využívají mikroskopy v několika zvětšeních k identifikaci hlavně kostních příměsí. Od 10 násobného zvětšení a více jsou viditelné částečky 17

18 savčích kostí. Vypadají jako zakulacené kousky obsahující eliptické až zakulacené mezery. Drůbeží kosti jsou tmavší s ostrými konci. Nyní je větší zaměření na masové frakce, kdy se dá určit, zda maso pochází ze savců nebo ptáků. Přesnost, kvalitativní a kvantitativní ohodnocení pomocí mikroskopických metod je závislá hlavně na zkušenosti analyzátorů, přičemž kvantitativní stanovení je vždy jen odhadem. Regulace 1774/2002/EC vyžaduje identifikaci původu živočišného materiálu ve vyšších taxonomických úrovních, než tomu bylo v minulosti. Nicméně savčí původ je obtížné identifikovat, jelikož se jejich charakteristiky snadno překrývají. Pracovníci mají k dispozici softwarový program ARIES (Animal Remains Identification and Evaluation System), který obsahuje všechny doposud známé znázornění živočišných materiálů v krmivu, což napomáhá jak k zdokonalování pracovníků, tak k běžné denní praxi. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) také popisují metodu mikroskopie, která při současném použití sedimentační analýzy může detekovat části živočišného původu v krmivu v koncentraci nižší než 0,1 %. DALMASSO et al. (2004) zmiňuje, že tato metoda vyžaduje specializované pracovníky a umožňuje jen detekci zoologických tříd (savci, ptáci a ryby), zatímco původ druhů zůstává neurčen Blízké infračervené zobrazování Snímky se získávají v digitální formě na počítači, což umožňuje se zaměřit na detail a vyhodnotit nález. Přesto takovéto zobrazení není dokonalé a dále se pracuje na zlepšování dalších parametrů. Použití mikroskopické metody společně s počítačovou vizualizací k identifikaci živočišného zdroje v krmivu je slibnou metodou, avšak má několik limitujících bodů, jako je určení materiálu ve vyšší taxonomické jednotce než je třída. Vylepšení této metody by mělo spočívat v: dostatečně velkém a representativním datovém souboru, identifikaci klíčových popisujících znaků a použití lépe definovaných statistických metod k podpoře přiblížení obrazu. 18

19 3.4.3 Blízká infračervená mikroskopie (NIRM) Principem této metody je měření absorpce infračerveného záření o různé vlnové délce při průchodu vzorkem. Používá se tam, kde se zaměřujem na prostorově rozlišené vlastnosti, efekty a při možnosti sledování ohraničených změn odlišných materiálů v obtížně rozdělitelných směsích. Infračervená mikroskopie napomáhá rozlišit původ krmných složek ve vzorku. Tato metoda byla vylepšena zaměřením se na sedimentační část vzorku, která obsahuje hlavně hustší částice, jako jsou např. kosti. Zobrazení pomocí blízké infračervené mikroskopie umožňuje analýzu částic jednorázově a tím významně snižuje čas analýzy. Je technikou, která může být použita dohromady s dalšími metodami. Pracuje jak se surovým materiálem, tak se sedimentem. Nicméně vybavení pro tuto metodu je cenově náročné a proto není tolik rozšířená. RAAMSDONK et al. (2007) popisuje NIRM a blízké infračervené zobrazování jako techniky, které dovolují zaznamenání blízkého infračerveného spektra z individuálních částic s možností jejich identifikace. Hladina detekce je nižší než 1g/kg. BAETEN et al. (2005) uvádí, že tato technika může být používána pro detekci DNA v krmivu v koncentraci 0,05 % a je ekvivalentní optické mikroskopii. Na rozdíl od optické mikroskopie tato metoda nevyžaduje vysoce vyškolené pracovníky v určování druhů živočišného původu, protože částice jsou identifikovány automaticky podle jejich infračerveného spektra Blízká infračervená spektroskopie Při infračervené spektroskopii prochází zkoumaným vzorkem infračervené elektromagnetické záření o rozsahu vlnových délek 10-6 m až 10-3 m, jehož vlnová délka se plynule mění (VACÍK et al., 1999). Je jednou z nejrozšířenějších analytických metod založená na absorpci světla v různých vlnových délkách elektromagnetického spektra organických molekul nacházejících se ve vzorku. Nevýhodou této metody je vyšší než 1 % limit detekce. Přesto se používá jako první metoda pro detekci bílkoviny s následným upřesněním dalších metod. Podle RAAMSDONKA et al. (2007) je to důvěryhodná metoda, která může být využitelná pro rutinní analýzu u rostlinných krmiv, ale detekční limit je hodně vysoký pro aplikování v oficiálních kontrolních laboratořích. 19

20 3.4.5 Detekce pomocí imunoesejí Principem této metody je interakce mezi protilátkou v testu a antigenem ve vzorku, který představuje specifickou zpracovanou živočišnou bílkovinu. Nyní se nejvíce používá ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a měřící tyčinky. Některé výzkumy však poukazují na velmi nízkou odezvu ELISY na krmivo ošetřené vyšší teplotou, než vyžaduje sterilizace. Reagenty se vylepšovaly a jsou schopny spolehlivě determinovat obsah 0,5 % živočišné bílkoviny, avšak nikdy nedosáhnou hodnoty 0,1 % citlivosti. Imunoeseje jsou dobré prověřovací metody, ale nesplňují požadavek vysoké citlivosti a specifity. Proto musí být následně potvrzeny jinými metodami jako je např. PCR. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) popisují, že konvenční imunoenzymatické metody pro druhovou identifikaci masokostních mouček selhávají u tepelně ošetřeného proteinu. Dále se zmiňují, že u testování touto metodou ve více laboratořích jen jedna z nich dovedla vývoj imunoeseje tak daleko, že detekovala protein od ruminantů a prasat v koncentraci 0,125 % u masokostní tepelně ošetřené moučky při 130 C Chromatografické metody Chromatografie je metoda selektivního dělení složek směsi, založená na odlišných vlastnostech jednotlivých komponent (rozpustnosti, adsorpci, velikosti částic, chemické afinitě atd.). K oddělení složek směsi dochází při pohybu mobilní fáze stacionární fází. (VACÍK et al., 1999). Tato metoda je také potenciální k nalezení živočišné bílkoviny. RAAMSDONK et al. (2007) popisuje LC (liquid chromatography), jako metodu založenou na detekci a následném zjištění podílu různých polypeptidů. HPLC (high performance liquid chromatography) a plynová chromatografie jsou metody schopné separace a detekce téměř jakéhokoliv typu molekuly přítomné ve vzorku. HPLC může detekovat sloučeniny jako proteiny, aminokyseliny, fenolické látky a karbohydráty, zatímco plynová chromatografie je vhodnější na analýzu tekutých a polotekutých molekul. Nevýhodou těchto metod je zpracování analytických dat, což je časově náročné a vyžaduje zkušené pracovníky. BALLIN et al. (2009) popisuje HPLC jako metodu schopnou detekovat živočišný materiál v množství okolo 0,5 %. 20

21 3.4.7 Olfaktometrické metody Elektronický nos je technologie založená na detekci poloselektivních plynových senzorů tekutých složek přítomných v krmivu. Výhodou této techniky je nutnost pouze nízkého množství zkoumaného vzorku a rychlost analýzy. Nicméně senzory nejsou vysoce selektivní k určitým zkoumaným složkám, proto tato technika není vhodná pro zjišťování znehodnocovaného krmiva (REID et al., 2006). Kombinace metod NIRM může detekovat části masa a kostní moučky jen obecně, bez možnosti určení živočišného druhu. Zavedly se strategie kombinující NIRM, která detekuje a izoluje částečky masokostní moučky společně s DNA extrakcí umožňující druhovou identifikaci pomocí real time PCR. Cílem je vyextrahovat dostatečné množství DNA z malého množství materiálu. Byly založeny druhově specifické databáze, které se nyní používají k nalezení druhově specifického spektra markerů. Stále se řeší nedostatky v čištění materiálu od kontaminující DNA, aby DNA extrakty pocházely jen ze zkoumaného materiálu a ne ze zbytků krmiva přichyceného na testovaný vzorek. 3.5 Metody založené na DNA analýze DNA je velice stabilní biologickou molekulou. LOCKLEY a BARDSLEY (2000) popisují, že DNA je více termostabilní než jiné proteiny, a proto úspěšnost analýzy není tolik odkázaná na znehodnocení během zpracování krmiv. Navíc DNA je přítomná ve většině buněk organismu, tudíž usnadňuje identifikaci jakéhokoliv vzorku bez ohledu na jeho původ. DNA může potenciálně poskytnout více informací než protein, díky degenerování genetického kódu a přítomnosti mnoha nekódujících oblastí. Kvalita DNA vyjadřuje průměr molekulární váhy DNA, která je v délce individuálních dvojitých řetězcích vyjádřená v číslech párů bazí (bp). DNA degradace je výsledkem snížení délky molekul, obvykle beze změny bp sekvence (MEYER a CANDRIAN, 1996). DNA tání je proces, kterým jsou interakce mezi vlákny dvojité šroubovice narušeny a vznikají dvě vlákna DNA. Vazby mezi vlákny dvoušroubovice jsou slabé, snadno oddělitelné zahříváním, enzymy nebo působením fyzikálních sil. Této schopnosti DNA se využívá při PCR (ANONYM, 2008). 21

22 Izolace genomové DNA z živočišných tkáních Cílem purifikace je získat nukleovou kyselinu v nativním stavu, dostatečném množství a čistotě. Při izolaci DNA se využívá rozdílné rozpustnosti makromolekul, adsorpce na pevný podklad nebo ultracentrifugace v gradientních roztocích. Jde především o následující metody: homogenizaci třecími nástroji, minikuličkami, zmrazováním v tekutém dusíku, lýzí buněk a tkání stěny živočišných buněk se rozrušují jemnými metodami jako př. slabými neiontovými detergenty, deproteinizaci použitím enzymů jako proteináz, celuláz, fenolu, chloroformu, koncentrování a přečištění DNA vysrážením v 70 % ethanolu, rozpuštění v pufru (TE) nebo v H 2 O, odstranění zbytku RNA působením ribonukleázy (Rnázy) (ŠMARDA, et al., 2008). Běžným limitním činitelem pro PCR metody je selhávání amplifikace kvůli přítomnosti inhibičních látek ve vzorku. Tyto látky zahrnují hemové složky v krvi, vodnaté a sklovité humorální látky, heparin, moč a polyaminy (HUANG et al., 2006). PINTO et al. (2007) popisuje PCR metodu jako vysoce specifickou, schopnou reprodukce, sensitivní a charakteristickou svojí vysokou rozlišovací schopností. Přesto PCR inhibitory jako jsou polysacharidy, huminové kyseliny jsou v krmivech hojné a během extrakce se je často nepodaří úplně odstranit. Tudíž mohou zasahovat do reakce v několika úrovních, což vede ke snížení a dokonce ke kompletní inhibici DNA polymerázové aktivity. Proto DNA metody jsou vysoce závislé na DNA extrakci a purifikačních technikách. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) vyvinuli rychlou, sensitivní a důvěryhodnou metodu založenou na PCR procedurách pro demonstraci bovinního, ovčího, prasečího a kuřecího masokostního materiálu v krmivech. DNA izolovali pomocí metod založených na jejím vázání s SiO 2 za přítomnosti guanidin thiokianatu. Tato metoda se potvrdila jako efektivní pro izolaci DNA, protože odstraňuje inhibitory PCR reakce, je rychlá a dává dostatečný výnos. 22

23 Kity používané pro izolaci DNA Pro izolaci DNA se používájí různé protokoly a v poslední době se začínají často používat komerčně vyráběné soupravy kity. Existuje řada komerčně dostupných kitů pro izolaci DNA z krmiv a potravin, které se liší podle výchozího materiálu z kterého chceme DNA získat. Např. kity pro exktraci plasmidové DNA, RNA, pro lidské tkáně a buňky, buňky kvasinek, virové nukleové kyseliny, pro krev a biologické tekutiny, genomickou DNA z tkání a buněk, genomickou DNA z forenzních vzorků, z rostlin a vzorků z životního prostředí a genomickou DNA z potravin a krmiv. Pro izolaci genomové DNA z krmiv a potravin je komerčně vhodný např. kit NukleoSpin Food pro svou výbornou schopnost odstranit PCR inhibitory a purifikovat i malé množství částečně degradované DNA s velikostí vzorku do 200 mg. Při zkoumání efektivnosti Nukleospinu na bovinní DNA byla prokázána vysoká senzitivita a specifita i u vysoce zpracovaného krmiva a potravin, jako je tepelné ošetření masa při 133 C. Dalším používaným kitem je Invisorb Spin Food Kit I byl vyvinutý pro extrakci DNA z malého množství krmiva živočišného původu. Mezi jeho přednosti patří rychlá lýze buněk bez mechanické homogenizace, DNA extrakce a purifikace z vysoce zpracovaných potravin a krmiva, vysoký zisk a kvalita vyextrahované DNA. Poskytuje vysoký výnos i z malého množství počátečního materiálu. U rostlinného materiálu má schopnost odstranit buněčné zbytky a nelýzovaný materiál pomocí přefiltrování, odstranění kontaminujících látek a enzymových inhibitorů (WAGNER, 2010). V současné době se používá několik extrakčních metod jako např. Wizard, NucleoSpin, GenomicPrep a CTAB. V experimentu CHAPELA et al. (2007) byla čistota extrahované DNA u CTAB metody z poměru absorbancí 260/280 nm vlnových délek v různých konzervovaných produktech tuňáka okolo 2. Extrakce DNA pomocí této metody poskytuje produkty s velice nízkým obsahem kontaminujících proteinů (VODRET et al., 2007). Elektroforéza Elektroforéza je nejpoužívanější separační technikou při izolaci DNA a bílkovin. Jde o pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. DNA má záporný náboj, a proto se 23

24 v elektrickém poli pohybuje od katody k anodě. Rychlost pohybu závisí na vlastnostech DNA jako je molekulová hmotnost, elektrický náboj a prostorové uspořádání, a také na vlastnostech gelu, prostředí (pufru) a na přivedeném napětí. Elektroforéza se nejčastěji provádí na polyakrylamidovém nebo agarózovém gelu, které vytváří síťovou strukturu polymerních molekul s póry. Agarózové gely se používají pro separaci molekul nukleových kyselin o velikosti od 100 bp po 50 kb. Zatímco polyakrylamidové gely se využívají pro separaci menších molekul od 10 do 1000 bp. Molekuly větší velikosti a složitější prostorové struktury procházejí gelem pomaleji, než menší molekuly. Pro stanovení velikosti molekul DNA se používají hmotnostní standardy, což jsou většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů s přesným určením velikosti pomocí sekvenování DNA (ŠMARDA et al., 2008) Metody založené na DNA hybridizaci LOCKLEY a BARDSLEY (2000) popisují, že DNA hybridizace zahrnuje získání DNA extrakcí a purifikací. Označené DNA sondy jsou hybridizovány ke vzorku genomické DNA kovalentně připojené k nylonové membráně v mezerovitém nebo tečkovitém formátu. Sondy obsahující značenou genomickou DNA od určitého druhu hybridizují k DNA získaného z testovaného vzorku. Při použití této metody byly s vysokou přesností zjišťovány vzorky obsahující DNA kura domácího a prasete. Sondy pro DNA z kozy, ovce a krávy byly zjištěny s určitým stupněm nespecifického nasedání sond na jinou DNA (cross-reactivity). Takovéto výsledky jsou odrazem různého stupně homologních sekvencí satelitní DNA u různých druhů zvířat. Tato závada se částečně napravila u úzce příbuzných druhů díky přidání neznačené DNA tam, kde docházelo k mezidruhové kontaminaci. U ovcí a koz se dlouhou dobu řešil tento problém, jelikož jejich satelitní DNA je vysoce homologní. Postupně se tato metoda vylepšovala a lze ji nyní použít pro identifikaci masa hovězího, zvěře, vepřového, kuřecího, krůtího, králičího, ovčího a kozího. Navíc lze tuto metodu použít i k odlišení různých plemen skotu. DNA hybridizační metody jsou časově náročné, kdy sondy mohou být značeny radioaktivně, což je negativní stránkou této metody. Hybridizace umožňuje identifikovat mnoho živočišných druhů i z degradované DNA, avšak je zapotřebí relativně velkého množství purifikované DNA. 24

25 3.5.2 Metody založené na PCR ŠMARDA et al. (2008) popisuje, že metoda PCR byla zavedena v roce 1985 Kary B. Mullisem. Tato metoda umožňuje získat požadovanou sekvenci genomové DNA bez jejího předchozího klonování ve vektorech. Její podstatou je enzymová, cyklicky se opakující syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA (dsdna) ve směru 5-3 zprostředkována DNA polymerázou. Daný úsek je vymezen připojením dvou primerů, které se vážou na protilehlé řetězce DNA. Reakce probíhá v termocykleru (viz obr. 1), což je programovatelný termostat schopen rychlého a přesného přechodu mezi jednotlivými teplotami (RUMLOVÁ, 2003). Metoda PCR zahrnuje tři kroky, které se mnohokrát v cyklech opakují. denaturace dsdna (92 95 C), nutnost kompletní denaturace obou vláken, jinak by mohlo dojít k renaturaci, což by zabránilo specifickému připojení primerů, annealing (30 65 C), připojení primerů k jednořetězcové DNA (ssdna), teplota závisí na délce oligonukleotidu a na zastoupení A-T a G-C párů (G-C páry zvyšují stabilitu a tím i denaturační teplotu), elongace (65 75 C), syntéza nových řetězců ve směru 5-3 DNA-polymerázou. Obr. 1 Termální cykler PTC 200 (MU) Výchozí koncentrace templátové DNA rozhoduje o počtu cyklů, který se většinou pohybuje mezi Příliš vysoký počet cyklů zvyšuje množství nespecifických produktů PCR. Výsledným produktem PCR jsou amplikony, úseky DNA definované délky o velikosti desítek až tisíců bp. Výsledek reakční směsi se obvykle prokáže stanovením jejich velikosti elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Z jedné dvoušroubovice DNA vzniknou po jednom replikačním cyklu dvoušroubovice dvě. Po 30 cyklech vznikne více než miliarda kopií sekvence DNA. Termální cyklery mění 25

26 teplotu automaticky a amplifikují velké množství vzorků, díky čemuž se tato metoda stala relativně jednoduchou. Jednou z nevýhod PCR je zanášení chyb do amplifikovaných kopií DNA. Taq- polymeráza 3-5 nemá korekční aktivitu a tím při replikaci produkuje chyby s vyšší četností. Další nevýhodou Taq-polymerázy je, že úseky DNA delší než několik tisíc nukleotidových párů (nad 35 kb) amplifikuje neúčinně (SNUSTAD a SIMMONS, 2009). Úspěšnost PCR při amplifikaci určité sekvence DNA je závislá na pečlivém návrhu obou primerů. Jsou to krátké sekvence DNA nebo RNA, z kterých se iniciuje replikace DNA. Primery by měly být nukleotidů dlouhé, s obsahem G+C %, rovnoměrně rozdělené páry G/C a A/T, teplota tání primeru by měla být alespoň 50 C, neměly by se na vazebném místě vyskytovat nespecifická vazebná místa, komplementární sekvence a vnitřní sekundární struktury (vlásenky) (ŠMARDA et al., 2008). Tab. 1 Citlivost PCR metod podle AHEME, (2004) DNA Limit detekce ( ng/µl) Ptáci 10-7 Ryby 10-3 Savci 10-3 Podle FREZZA et al. (2008) při použití metody konvenční PCR byla sensitivita druhově specifických primerů 0,2 %, 0,5 % a 1 % a to ve vzorcích krmiva u hovězí, ovčí, vepřové a kuřecí masokostní moučky. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) popisují, že molekulárně biologické techniky umožňují demonstraci DNA i po její tepelné úpravě. Také mohou být použity pro druhově specifickou identifikaci DNA v masokostních moučkách a složených krmivech. Poprvé k těmto účelům byla popsána PCR metoda při amplifikaci bovinní mitochondriální DNA jako markeru pro prezenci bovinní tkáně v krmivu. 26

27 Důležité parametry byly zváženy k vylepšení efektivnosti těchto testů: mitochondriální DNA (mtdna) je hlavním zájmem pro identifikaci živočišných druhů, jelikož obsahuje mnoho kopií sledovaného vzorku v buňce, snadná detekce krátkých frekvencí DNA ve vzorku. V některých interlaboratorních studiích většina různých PCR technik selhala v požadované sensitivitě a specifitě. Jen PCR vyvinutá uvnitř STRATFEED projektu přinesla přijatelné výsledky a jeví se jako potenciální alternativní metoda pro detekci živočišné bílkoviny v krmivu. Bylo zjištěno, že bílkovina upravená nad teplotu požadovanou legislativou pro sterilizaci je stále detekovatelná v množství 0,1 % hmotnosti krmiva. Různé laboratoře zlepšily jejich PCR techniky pro detekci živočišné bílkoviny ve stopovém množství v krmivu. Důležitý limit pro použití PCR je skutečnost, že živočišná DNA (patřící k určitému druhu nebo druhové skupině) detekovaná ve vzorku krmiva nemusí vždy pocházet z živočišné bílkoviny. Mohou tam být stopy mléka, krve, tuku, hydrolyzovaného proteinu z kůže ruminantů nebo vaječné produkty, které můžou kontaminovat hledanou DNA. Identifikace živočišných druhů pomocí PCR reakce Podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000) testy založené na PCR pro druhovou identifikaci mohou být prováděny s mnohem nižším množstvím počátečního materiálu díky amplifikaci, kterou tato metoda umožňuje. RAAMSDONK et al. (2007) uvádí, že u PCR metody bylo vyvinuto sestavení primerů tak, aby amplifikovaly DNA sekvenci kratší než 100 nukleotidů. Současné výsledky různých studií indikují, že specifická DNA a metody detekce proteinů můžou nalézt od 1g zpracovaného živočišného proteinu na 1 kg materiálu. Tepelné procesy nad 100 C mohou způsobit spontánní fragmentaci DNA, což je důležitým měřítkem pro spolehlivost testů. Mikroskopické metody jsou důvěryhodné také ve vysoce zpracovaném krmivu se zanechanými morfologickými strukturami, i když je genetický materiál vysoce degradovaný. Na druhou stranu PCR techniky poskytují alternativní analýzu vzorků s genomickým materiálem i bez prezence morfologických částic (WEINER a KWIATEK, 2008). PCR metoda se ukázala jako levná a snadná na provedení, poskytující spolehlivé výsledky. Tato metoda umožňuje rychlou replikaci sledovaných úseků DNA, která je 27

28 v poslední době čím dál častěji používanou metodou pro identifikaci živočišných druhů v potravinách i krmivu. Patří mezi nejvíce senzitivní metody, které byly kdy vynalezeny. Jedinou kompetiční metodou pro PCR je v současné době použití DNA čipů se zvyšující se senzitivitou, které by mohly v budoucnu převzít hlavní roli v identifikaci živočišné DNA (ANONYM, 2004) Sekvenování PCR produktu založené na mtdna Další metody analýzy DNA po provedené PCR amplifikaci podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000). Cílem sekvenování DNA je stanovení pořadí nukleotidů v molekulách DNA. Nejčastěji se používá enzymatická metoda u které se syntéza zprostředkuje enzymem polymerázou a reakce je upravena tak, že v určitých místech dochází k ukončení syntézy, když se v templátovém vlákně vyskytne určitý nukleotid. Délka nedokončeného úseku se zjišťuje elektroforézou na gelu a odpovídá vzdálenosti od začátku vlákna. Sekvenování je přímým způsobem získání informace z PCR produktu. Mitochondriální DNA (mtdna) (viz obr. 2) se vyznačuje několika výhodami nad jadernou DNA: mtdna je maternálně děděna tak, že jedinci nesou jen jeden typ alely v genu. Tím se vyhne dvojsmyslnosti sekvence pocházející od heterozygotního genotypu, relativně vysoká četnost mutací oproti jaderným genům má za příčinu nahromadění dostatečného množství bodových mutací umožňujících odlišení i blízce příbuzných jedinců. Přesto i práce s mtdna musí být opatrná, protože se objevuje intraspecifická variabilita. Podle MURUGAIAH et al. (2009) se mtdna vyvíjí mnohem rychleji než jaderná DNA a její sekvence je více různorodá, a proto usnadňuje identifikaci blízce příbuzných druhů. Sekvenační techniky vyžadují dobrou kvalitu DNA pro analýzu, protože frakce denaturované DNA by mohly produkovat zavádějící výsledky. Navíc sekvenování může vést k nejednoznačným výsledkům u vzorků obsahujících více živočišných druhů. DNA sekvenační techniky jsou časově náročné a zdají se být těžko proveditelné pro rutinní analýzy (HAEZEBROECK, 2001). 28

29 Restrikční štěpení PCR produktů Metoda PCR-RFLP (polymorfismus v délce restrikčních fragmentů) je široce používána jako úspěšná identifikace mnoha živočišných druhů. Jedná se o naštěpení genomové DNA určitou restrikční endonukleázou v polymorfních místech typických pro určité druhy a detekování rozdílů ve velikosti restrikčních fragmentů gelovou elektroforézou. HAEZEBROECK et al. (2001) dále dodává, že rozdíly v délce fragmentů mezi jednotlivci jsou dány jak jednonukleotidovými polymorfismy, tak inzercí nebo delecí DNA uvnitř fragmentu, které vedou ke ztrátě štěpícího místa nebo ke tvorbě nového. MURUGAIAH et al. (2009) se zmiňuje o výhodách PCR RFLP oproti přímému sekvenování. Tato technika je ekonomicky efektivní pokud se provádí ve velkém rozsahu, např. pro rutinní analýzu potravin. Také poskytuje přesnější detekci u vícedruhové analýzy produktů. Při pokusu sekvenování DNA pocházející z ovce a kozy, PCR produkty vykazovaly 92 % homologii. Nicméně byly nalezeny 4 restrikční místa podle kterých lze tyto dva druhy rozeznat. U ovčího produktu restriktáza naštěpila amplifikovanou DNA na fragmenty, které nebyly rozštěpeny u kozího produktu, což se vizualizovalo pomocí gelové elektroforézy. RFLP analýza PCR produktů je široce používána pro rozlišení jednotlivých druhů. Jeden pár primerů může produkovat fragment, který může být použit pro identifikaci více druhů s rozumným výběrem restrikčních enzymů. Tato metoda má nevýhodu v nedokonalém naštěpení, které se může příležitostně vyskytnout a intraspecifická variance může vymazat nebo vytvořit další restrikční místa. SALAH, et al. (2009) identifikoval oslí a koňské maso metodou PCR-RFLP za použití mtdna genu pro cytrochrom b o velikosti 359 bp. Pomocí restrikčního enzymu AluI se podařilo nalézt 3 rozdílná místa, která se naštěpila jen u koňské DNA. MARTÍN et al. (2009a) také dodává, že PCR-RFLP technika je současně nejvíce používanou pro identifikaci koňského masa v krmivu. Nicméně analýza tepelně upraveného krmiva nese v sobě fragmentovanou DNA, což není vyhovující pro RFLP, která díky restrikčním enzymům vyžaduje delší fragmenty. Jinak může docházet ke štěpení na nespecifickém místě. Kromě toho aplikace PCR-RFLP metodiky může být limitována při analýze smíšených vzorků, protože výsledky mohou vykazovat různorodé restrikční štěpení u vyskytujících se druhů. 29

30 Druhově specifické PCR primery Detailní informace o sekvenci DNA jsou dostupné pro mnoho druhů, proto mohou být identifikovány i jednonukleotidové polymorfismy, které umožňují vytvoření druhově specifických primerů. Neselektivní primer je založen na sekvenci, která je běžná všem studovaným druhům. Jeho přesná lokalizace v genu může být použita k určení velikosti amplifikovaného produktu. Použitím druhově specifických primerů je možné testovat v jedné reakci přítomnost více živočišných druhů současně. Navíc touto metodou je možné detekovat nahrazení levnějších masových přídavků a různé příměsi. U této metody je nevyhnutelná předchozí znalost sekvence. Pokud jsou primery sestaveny na mitochondriálních genech může se stát, že amplifikace bude ovlivněna intraspecifickou variací. Také během evoluce kopie mitochondriálních genů můžou být přemístěny do jaderného genomu a tyto nukleární pseudogeny můžou nasměrovat primery přímo k mitochondriálním sekvencím. Tato skutečnost se vyskytla při identifikování různých druhů zvěře. MARTÍN et al. (2007) použil pro druhovou identifikaci a detekci přežvýkavců mitochondriální gen kódující 12S rrna. Testoval specifitu u tří druhově specifických primerových párů získaných ze svalových vzorků 30 druhů zvířat (13 savců, 12 ryb a 5 ptáků) a 5 druhů rostlin. Nebyla pozorována žádná mezidruhová amplifikace. Z hlediska jakékoliv možné kontaminace krmiv různými živočišnými druhy autor navrhuje, že každá diagnostická technika by měla být testována pro mezidruhovou reaktivitu k zabránění falešných pozitivních výsledků. Zjištěný detekční limit při použití bovinního specifického primeru byl 0,1 %, který neovlivnila ani prodloužená doba ohřevu (50 a 120 ). Použití druhově specifické PCR pro přítomnost příměsí DNA přežvýkavých zvířat v krmivu může být zavedeno pro provádění rutinních kontrolních testů. Prokázalo se, že jsou vysoce sensitivní, rychlé (méně než jeden pracovní den) a schopné ověřovat jak syrový, tak denaturovaný materiál. Obr. 2 Mitochondriální DNA (Wikipedia) 30

31 Analýza konformačního polymorfismu jednořetězců Tato metoda je založena na tvorbě rozdílných sekvenčně specifických intramolekulárních struktur ssdna nebo ssrna. Tyto rozdíly mají vliv na mobilitu ssdna v nedenaturujících elektroforetických podmínkách. K přípravě ssdna molekul se používá formamid nebo tepelné ošetření a jejich rozdělení se uskutečňuje elektroforézou v nedenaturačním gelu (ŠMARDA et al., 2008). SSCP byla použita k identifikaci různých druhů ryb a k rozlišení vepřového masa od černé zvěře. PCR amplifikuje stejnou oblast DNA různých druhů, obecně část mitochondriálního genu cytochromu b. Jednořetězcová DNA se začne spojovat s komplementární sekvencí, konformačně se mění a vykazuje různou mobilitu na polyakrylamidovém gelu. Pomocí této metody jsou patrné rozdíly i v jednotlivých bázích sekvence. Tato analýza je více náročná, jelikož je závislá na odlišnostech sekundární struktury, která se objeví na gelu. Tyto rozdíly jsou výhradně závislé na teplotě během analýzy produktu. Problémem této metody je i její reprodukovatelnost. Mezi další nevýhody této metody podle TELETCHEA (2009) patří: nutnost aplikace vzorků vedle sebe na stejném gelu závislé na podmínkách nativní PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza), intraspecifická variace může být důsledkem různé konformace vedoucí k špatným výsledkům a možnost vizualizace více než dvou produktů odlišujících se svou intenzitou Náhodná amplifikace polymorfní DNA RAPD metoda spočívá v použití náhodných primerů o velikosti okolo 10 bází. Amplifikuje se mnoho fragmentů s různou délkou a detekuje se velké množství polymorfizmů. Tato metoda se používá k identifikaci ptačího, savčího i rybího masa. RAPD metoda nevyžaduje předešlou znalost sekvence DNA, ale je nepraktická při identifikaci živočišného původu v produktech obsahujících více druhů dohromady. Také tato metoda není adekvátní při analýze vysoce degradovaného materiálu, protože je velmi citlivá k mírným změnám u cílené DNA (TELETCHEA, 2009). RAPD 31