DETERMINATION OF STRUCTURAL FORMS OF P53 PROTEIN BY FLOW INJECTION ANALYSIS WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION
|
|
- Otakar Švec
- před 8 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 DETERMINATION OF STRUCTURAL FORMS OF P53 PROTEIN BY FLOW INJECTION ANALYSIS WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION STANOVENÍ STRUKTURNÍCH FOREM PROTEINU P53 POMOCÍ PRŮTOKOVÉ INJEKČNÍ ANALÝZY S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ Potěšil D. 1,2), Babula P. 1,3), Masařík M. 4), Vojtěšek B. 5), Průša R. 6), Petrlová J. 1), Kizek R. 1) 1) Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika, 2) Katedra analytické chemie, PřF MU v Brně, Kotlářská 2, Brno, 3) Ústav přírodních léčiv, FaF VFU Brno, Palackého 1/3, Brno, 4) Laboratoř biofyzikální chemie a molekulární onkologie, BFÚ AV ČR, Královopolská 135, Brno, 5) Základna experimentální onkologie, MOÚ Brno, Žlutý kopec 7, Brno , 6) Ústav klinické biochemie a pathobiochemie, 2. LF UK Praha, V Úvalu 84, Praha. weiclav@seznam.cz ABSTRACT In 1993, protein p53 was hailed as the Molecule of the year by Science journal. It is not surprising that nowadays the protein p53 is the most studied object in molecular oncology area. Tetramers of the protein are made at cell stress. Tetramers subsequently bind to DNA and here they regulate proteins synthesis, thereby control reparation process. Structural form of the protein has significant influence on bond between p53 and damaged DNA. Three protein forms (native, denatured and aggregated) were studied by flow injection analysis with electrochemical detection (FIA-ED). The very sensitive method for native p53 form determination was developed; detection limit (LOD) 45.8 amol. FIA-ED technique was applied on study of protein p53 structural changes (formation of denatured and aggregated form). Denatured protein gives higher electrochemical response (protein structure release) and aggregated a smaller one (protein folding) in comparison with native form. Key words: aggregation, denaturation, electrochemical detection, FIA, FIA-ED, p53, p53con, flow injection analysis, p53 structural forms, p53 binding ABSTRAKT V roce 1993 byl časopisem Science vyhlášen protein p53 molekulou roku. Není proto divu, že v současné době je protein p53 nejstudovanějším objektem v oblasti molekulární onkologie. Při buněčném stresu vznikají tetramery proteinu p53, které se váží na DNA a zde regulují
2 syntézu mnoha proteinů, čímž řídí samotné buněčné reparační procesy. Významný vliv na vazbu proteinu p53 na DNA má strukturní forma proteinu p53. Byly studovány tři strukturní formy proteinu p53 (nativní, denaturovaná a agregovaná) pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickým detektorem (FIA-ED). Byla vyvinuta velmi sensitivní metoda pro stanovení nativní formy proteinu p53; limit detekce (LOD) 45,8 amol proteinu. Technika FIA-ED byla dále aplikována na studium a rozlišení strukturních změn proteinu p53 (vznik denaturované a agregované formy). Denaturovaný protein p53 poskytoval větší elektrochemickou odezvu (rozvolnění struktury proteinu) a agregovaný protein p53 nižší odezvu (sbalení proteinu) v porovnání s nativní formou proteinu p53. Klíčová slova: agregace, denaturace, elektrochemická detekce, FIA, FIA-ED, p53, p53con, průtoková injekční analýza, strukturní formy p53, vazba p53 ÚVOD Protein p53 je považován za jeden z nejdůležitějších regulátorů buněčného stresu. Protein vzniká translací genu TP53. Množství proteinu p53 v buňce je za běžných, nestresových podmínek udržováno na nízké hladině pomocí degradační dráhy, zahrnující degradaci proteasomem 26S za účasti zpětného regulátoru proteinu MDM2 (mouse double minute 2) [1]. Pokud je buňka vystavena buněčnému stresu, který představuje např. poškození DNA, zablokuje se tato degradační dráha a dojde ke zvýšení jaderné koncentrace p53. Protein se dále posttranslačně upravuje a oligomerizuje na tetramery, které mají vysokou afinitu k DNA, na kterou se následně váží. Protein p53 se může na DNA vázat několika způsoby, především však sekvenčně specifickou vazbou [2]. Tato vazba vzniká mezi centrální doménou proteinu a částí dvoušroubovicové DNA, tzv. p53con [2]. Po vazbě na DNA se protein p53 projevuje jako transkripční faktor. To znamená, že reguluje transkripci cílových genů, souhrnně nazývaných a označovaných jako PIGs (p53 inducible genes). Prozatím bylo popsáno více než 60 cílových genů [3]. Výsledkem regulace jejich exprese je především zástava buněčného cyklu v G 1 fázi [4], reparace DNA [5], případně spuštění programované buněčné smrti (apoptózy) [6]. Svým působením si protein p53 vysloužil přezdívku strážce genomu [1], neboť velkou měrou ve své aktivní tetramerní formě přispívá k opravě poškozeného genomu a zamezení šíření poškozené genetické informace do dceřinných buněk, které by jinak vedlo ke zvýšené proliferaci a vzniku nádorů. Je známo, že u proteinu p53 se objevuje velké množství bodových mutací a delecí části genu TP53. Bodové mutace nemusí bezpodmínečně vést k nefunkčnosti proteinu p53, bylo zjištěno, že záleží na lokalizaci bodové mutace [7]. Bylo ovšem prokázáno, že poškození
3 genu TP53 je velmi častým důvodem nedostatečné odolnosti buněk vůči poškození, které může vést k replikaci poškozené DNA; statistiky uvádějí, že gen proteinu p53 je postižen bodovou či deleční mutací u více něž 50 % nádorových buněk. V případě rakoviny plic, tvoří mutace proteinu p53 dokonce 70% ze všech případů (Obrázek 1). Mimo mutace genu TP53 může vést k nefunkčnosti proteinu p53 také změna konformace jeho nativní formy. U p53 byla popsána denaturovaná (rozvolněná struktura díky absenci vodíkových vazeb) a agregovaná forma (větší množství monomerních jednotek spojených v jeden celek, agregát). postižený orgán plíce tlusté střevo močový měchýř hlava/krk žaludek jícen mízní uzliny prostata prs játra leukémie mutace p53 70% 65% 61% 60% 45% 44% 30% 30% 30% 25% 10% počet případů v tisících Obrázek 1: odhadovaný počet nových případů nádorového bujení na světě za rok a podíl nádorů s mutacemi proteinu v % u jednotlivých nádorových onemocnění (upraveno dle [8]). Seřazeno podle procentuální mutace proteinu p53. V současné době se protein p53, jeho strukturní formy a schopnost vazby na DNA studují převážně gelovou elektroforézou s různými modifikacemi [9,10], ELISA metody [11] a také elektrochemické stacionární metody [12-14]. Na všechny metody je kladem stále větší tlak na zvýšení rychlosti, citlivosti, selektivity a snížení detekčních limitů. Nejinak je tomu i u metod, které hrají klíčovou roli při získávání informací o mechanismu vzniku rakoviny, způsobu působení antikancerostatik a jiných nejen s rakovinou spojených poznatků. Cílem této práce bylo vyvinutí nové metody využívající průtokovou injekční analýzu
4 s elektrochemických detektorem pro aplikaci na detekci velmi malých množství proteinu p53 a studium jeho strukturních forem, denaturované a agregované. METODIKA Chemikálie Acetonitril pro HPLC byl pořízen od firmy Merck (Darmstadt, Německo). Ostatní chemikálie byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich Chemical Corp. (USA). Všechny roztoky, není-li uvedeno jinak, byly připravovány v ACS deionizované vodě (Sigma Aldrich). Fosfátový pufr (1/15 mol/l) o příslušných ph hodnotách byl míchán z denně připravovaných roztoků hydrogen- a dihydrogenfosforečnanu sodného. Zásobní roztok močoviny o koncentraci 7 mol/l byl uchováván v temnu při 4 C. Lidský protein p53 byl purifikován na Masarykově onkologickém ústavů v Brně z eukaryotického expresního systému hmyzích buněk Sf6 transfekovaných bakulovirovým vektorem [10]. Čistota a koncentrace proteinu byla zjištěna gelovou elektroforézou. Pracovní roztoky proteinu p53 byly připravovány ze zásobního roztoku (0,7 mg/ml) obsahující proti nežádoucí oxidaci proteinu redukční činidlo dithiotreitol (DTT). Zásobní roztok proteinu byl uchováván při 80 C. Přístroje Průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí Systém průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí (FIA-ED) je složen ze dvou chromatografických pump (Model 582, ESA, USA), směšovače mobilních fází (ESA, USA), regulátoru pulzů (ESA, USA), dávkovacího obtokového kohoutu (ESA, USA), 1 m dlouhé reakční smyčky a osmi-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor obsahuje osm porézních grafitových elektrod (samotná měrná elektroda je konstruována tak, že roztok prochází skrz póry materiálu elektrody), které jsou uloženy ve dvou průtočných analytických komůrkách (Model 6210, ESA, USA). Každá komůrka (blok) obsahuje čtyři indikační elektrody. Na každou indikační elektrodu navíc připadají dvě referentní a dvě pomocné elektrody. Směšovač mobilních fází, regulátor pulzů, obtokový kohout, reakční smyčka a elektrochemický detektor jsou termostatovány (30 C). Vzorek (5 µl) byl injektován manuálně přes dávkovací ventil.
5 ph metr Pro měření ph byl použit ph metr WTW inolab Level 3 s terminálem Level 3 (Weilheim, Německo), byl řízen počítačem pomocí programu (MultiLab Pilot). Pro měření byla použita elektroda (ph-electrode SenTix, ph 0..14/ C/3mol/l KCl; Weilheim, Německo), která se před každým měřením kalibrovala pomocí sady kalibračních WTW roztoků (Weilheim, Německo). Denaturace proteinu p53 Denaturace proteinu p53 probíhala v prostředí fosfátového pufru (1/15 M; ph 7,0) a jako denaturační agens bylo použito močoviny o různých koncentracích. Denaturace probíhala po 24 hodin při teplotě 20 C a za konstantního nepřetržitého míchání (350 rpm; Thermomixer 5355, Ependorf, Německo). Paralelně se připravovaly i slepé vzorky které neobsahovaly protein p53. Upravené roztoky byly dávkovány přes obtokový kohout (5 µl) na reakční smyčku. Konečná hodnota se získala odečtením signálu slepého vzorku od signálu vzorku. Agregace proteinu p53 Agregace se v této práci dosahovalo působením močoviny v bezfosfátovém prostředí a při teplotě 37 C. Protein byl agregačním podmínkám vystaven po dobu 24 hodin při nepřetržitém míchání (350 rpm; Thermomixer 5355, Ependorf, Německo). VÝSLEDKY A DISKUZE V teoretickém úvodu byla nastíněna funkce proteinu p53 a také význam jeho stanovení a detekce, která by umožnila při rozlišení různých forem proteinu (nativní a denaturované, respektive vázající a nevázající se na DNA) studium vazby p53 na vazebnou sekvenci DNA a dále možnost studia ovlivnění této vazby různými látkami či fyzikálními faktory. V současné době se tyto studie provádí především pomocí gelové elektroforézy a ELISA technik, které jsou však časově náročné [11]. Naproti tomu průtokový systém s elektrochemickou detekcí nabízí velmi rychlou a díky elektrochemickému detektoru také velmi citlivou alternativu zmíněných metod. Prozatím byl ovšem používán pouze pro stanovení nízkomolekulárních látek (molekulová hmotnost přibližně do 10 kda), a proto je lidský protein p53 s 43 kda první vysokomolekulární látkou, která byla v průtokovém systému s elektrochemickým detektorem studována.
6 Optimalizace metody Složení mobilní fáze Pro studium nativního proteinu je potřebné zajistit vhodné vodné prostředí, aby nedocházelo např. k denaturačním či jiným strukturním změnám. Z tohoto důvodu byl použit pro průtokovou analýzu 1/15 M fosfátový pufr (ph 7,0) jako součást mobilní fáze. V tomto definovaném prostředí byly získány velmi dobře vyvinuté elektrochemické signály proteinu p53 o koncentraci 7 µg/ml. Bylo testováno, zda přítomnost organické složky mobilní fáze - acetonitrilu (ACN) ovlivní proudovou odpověď detektoru. Je známo, že ACN je často používanou součástí mobilní fáze při separaci na kolonách, proto je důležité znát jeho vliv na elektrodový děj probíhající v elektrochemickém průtokovém detektoru. Z tohoto důvodu byl hledán vhodný poměr fosfátového pufru a ACN. Nejlépe vyvinutý signál o nejvyšší proudové intenzitě (výška píku) byl získán při použití mobilní fáze složené z 98 % fosfátového pufru a 2 % acetonitrilu (při čistém fosfátu byl signál přibližně 96%; při vyšších koncentracích ACN lineárně klesal až na 80% při 10% ACN). Negativní vliv vyšší koncentrace ACN na studovaný signál proteinu je pravděpodobně způsoben změnou struktury p53, případně negativním vlivem organické složky na transport látky k detektoru nebo na vlastní detekci p53 na povrchu pracovní elektrody. Průtok mobilní fáze Významným parametrem ovlivňující charakter odezvy ve FIA-ED systému je celkový průtok mobilní fáze. Při studiu proteinu p53 se testoval průtok mobilní fáze v rozsahu od 0,1 do 0,8 ml/min. Z důvodu sledování možného rozmývání zóny analytu byla vyhodnocována nejen výška, ale i plocha a šířka získaného signálu. Maximální výšky i plochy píku bylo dosaženo při průtoku 0,5 ml/min (závislost pro výšku je na Obrázku 2A). Nárůst plochy píku nebyl při nízkých hodnotách průtoku tak razantní, jak je v případě výšky vidět na obrázku 2A, naopak při vyšším průtoku se plocha snižovala se zápornější směrnicí než-li výška (není ukázáno). Šířka píku se snižovala spolu se zvyšující se rychlostí průtoku v celém testovaném rozmezí průtoku, nejvyšší pokles byl zaznamenán při nižších hodnotách průtoku (není ukázáno). To nasvědčuje tomu, že s rostoucím průtokem dochází ke zmenšování zóny analytu, ale na druhou stranu také dochází vlivem zkracování času, kdy je roztok analytu v dostatečně blízkém okolí elektrody, k menší prekoncentraci proteinu na povrchu pracovních elektrod, což má za následek oxidaci menšího množství molekul proteinu a tedy i nižší analytický signál. Jako optimální byl vybrán průtok mobilní fáze 0,5 ml/min.
7 A B C proudová odezva (µa) 100 [900 mv] 60 [800 mv] 2 µa [700 mv] [600 mv] [500 mv] [400 mv] [300 mv] 1 min 20 [200 mv] 0 0,3 0,6 0,9 průtok mobilní fáze (ml/min) relativní kumulativní proudová odezva (%) nekumulativní kumulativní aplikovaný potenciál (mv) 50 0 relativní proudová odezva (%) Obrázek 2: A: analytický signál elektrochemického detektoru v závislosti na velikosti průtoku mobilní fáze. B: ukázka signálů proteinu p53 v závislosti na jeho koncentraci; průtok 0,5 ml/min. C: závislost relativní proudové odezvy a relativní kumulativní proudové odezvy na potenciálu elektrody (hydrodynamické voltampérogramy); průtok 0,5 ml/min. Společné podmínky: koncentrace proteinu 7 µg/ml; nástřik vzorku 5 µl; mobilní fáze 1/15 M fosfátový pufr (ph 7.0):acetonitril, 98:2; teplota detektoru a reakční smyčky 30 C. Potenciál pracovních elektrod Dále byl studován vliv velikosti potenciálu pracovní elektrody na intenzitu odezvy elektrochemického detektoru. Pro nalezení maximální odpovědi byl na grafitové porézní elektrody detektoru vkládán potenciál 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 a 900 mv. Proudová odpověď na jednotlivých elektrodách detektoru je ukázána na Obrázku 2B. Pro volbu vhodného analytického potenciálu se vychází z hydrodynamického voltampérogramu (Obrázek 2C), který se sestrojí vynesením závislosti relativní proudové odezvy nebo relativní kumulativní proudové odezvy na potenciálu elektrody. Jako nejvhodnější se volí potenciál z oblasti největšího proudového rozdílu a nejmenšího potenciálového rozdílu. Tomuto kriteriu nejlépe vyhovoval potenciál 900 mv vkládaný na poslední pracovní elektrodu detektoru. Kalibrační závislost proteinu p53 V naší další práci jsme studovali závislost proteinu p53 na koncentraci při optimálních FIA-ED podmínkách. Pro sestrojení závislosti byla ze zásobního roztoku proteinu p53 (c = 0,7 mg/ml) připravena postupným ředěním ACS deionizovanou vodou sada pěti roztoků proteinu p53 o koncentracích 7; 3,5; 1,75; 0,87 a 0,437 µg/ml. Závislost proudové odezvy elektrochemického detektoru na koncentraci byla striktně lineární (R 2 = 0,9998; y = 1,1682x
8 0,0101; Obrázek 3). Na insetu Obrázku 3 jsou ukázány signály (detekční potenciál 900 mv) při rozdílných koncentracích p53. Limit detekce (limit detekce = 3 hodnota šumu koncentrace p53 ; šum detektoru 0,3 na; počítáno z nejnižší hodnoty výška signálu kalibračního grafu) proteinu p53 byl roven 0,767 ng/ml, neboli při nástřiku vzorku 5 µl 3,84 pg respektive 45,8 amol proteinu p53. Pro porovnání, mez detekce gelové elektroforézy bývá v desetinách µg proteinu nanášeného na gel. Ze získaných výsledků jasně vyplývá, že námi vypracovaná metoda je rychlá a velmi senzitivní pro analýzu velmi malého množství vzorku. Obrázek 3: kalibrační závislost proudové odezvy na koncentraci proteinu. Průtok mobilní fáze (fosfát:acetonitril 98:2) 0,5ml/min; nástřik vzorku 5µl; potenciál ; teplota 30 C 9 y = 1,1682x - 0,0101 Proudová odezva (µα) 6 3 R 2 = 0, µa 1 min Koncentrace p53 (µg/ml) Studium strukturních změn proteinu p53 Studium strukturních změn proteinů má značný biologický význam. Porovnávali jsme tři rozdílné formy proteinu p53, nativní, denaturovanou a agregovanou. Denaturovaná i agregovaná forma proteinu p53 je neaktivní, neboť dochází ke změně struktury proteinu [15]. Studium různých forem proteinu se běžně provádí většinou pomocí gelové elektroforézy [16], ale je také možné využívat fluorescenčních metod [15]. Denaturace proteinu Proteiny jsou v nativním stavu udržovány v konformaci pomocí nekovalentních vazeb a iontových interakcí. Při denaturaci proteinů dochází účinkem tepla, chemické látky (např. soli) nebo vlivem ph ke změně rovnováhy těchto nevazebných interakcí, která vede ke změně
9 sekundární struktury [17]. Denaturovaná sekundární struktura je díky absenci většiny intramolekulárních interakcí mnohem méně uspořádaná než nativní forma proteinu [18]. V denaturované formě se protein stává biologicky neaktivním. Denaturace centrální domény proteinu p53 (p53cd, aminokyseliny 102 až 292) byla studována v práci [15]. Míra denaturace zde byla sledována spektrofotometricky a závislost míry denaturace proteinu byla testována v závislosti na koncentraci močoviny, která za specifických podmínek způsobuje denaturaci proteinu. V této práci bylo testováno, zda-li se projeví denaturace močovinou na velikosti signálu celého proteinu p53 (fl-p53). Ve studii denaturačních změn u centrální domény proteinu p53 [15] byl testován vliv koncentrace močoviny 0 až 6 mol/l. Získaná závislost měla sigmoidní charakter (Obrázek 4B) a maximum podílu denaturované formy proteinu bylo pozorováno při koncentraci močoviny přibližně kolem 4 mol/l. Z tohoto důvodu byla pro účel zjištění vlivu denaturace na elektrochemickou odezvu proteinu p53 vybrána koncentrace močoviny 4 mol/l. Denaturace se testovala pro dvě koncentrace proteinu p53 7 µg/ml a 3,5 µg/ml. Protein p53 byl denaturován močovinou ve 1/15 M fosfátovém pufru o ph 7,0 po 24 hodin při 20 C a 350 rpm. Získaný denaturovaný protein p53 byl studován pomocí optimalizované metody FIA-ED. Ukázka získaných signálů je na obrázku 4A, kde je záznam jednoho FIA-ED stanovení (první tři signály patří nativní formě proteinu p53, která nebyla podrobena denaturaci a další dva jsou signály roztoku po denaturaci; signál slepého vzorku byl přibližně 2 % ze signálu denaturovaného proteinu o koncentraci 7 mg/ml). Z obrázku je patrné, že signál denaturovaného proteinu je přibližně třikrát větší než signál nedenaturovaného a to u obou studovaných koncentrací (7 a 3,5 µg/ml) proteinu. Tento nárůst souvisí pravděpodobně v samotném způsobu vzniku oxidačního signálu, za který u proteinu p53 na elektrochemickém detektoru pravděpodobně odpovídá oxidace aminokyselinových zbytků proteinu p53, konkrétně tyrosinu a tryptofanu. Molekula proteinu přitom obsahuje jen 9 molekul tyrosinu a 4 molekuly tryptofanu z celkového počtu 363 aminokyselin [19], a proto se dá očekávat, že proudový signál vznikající oxidací těchto aminokyselin bude velmi závislý na jejich přístupnosti na povrch elektrody. Denaturovaná sekundární struktura proteinu p53 tedy pravděpodobně umožňuje lepší přístup tyrosinu a tryptofanu k povrchu elektrody a tím i přibližně trojnásobné zvýšení elektrochemické odezvy na elektrochemickém detektoru.
10 A denaturovaný protein p53 nativní p µg/ml 7 µg/ml 7 µg/ml 3.5 µg/ml [900 mv] 7 µg/ml B procenta denaturované formy (%) koncentrace močoviny (mol/l) [800 mv] [700 mv] [600 mv] [500 mv] [400 mv] [300 mv] [200 mv] 4 µa C relativní proudová odezva (%) min koncentrace močoviny (mol/l) Obrázek 4: A: Signály nativního a denaturovaného proteinu p53 při dvou koncentracích proteinu 7 a 3,5 µg/ml. První tři signály patří nativní formě proteinu p53, která nebyla podrobena denaturaci a další dva jsou signály roztoku po denaturaci. Signál blanku je zanedbatelný (přibližně 2 % ze signálu denaturovaného proteinu o koncentraci 7 µg/ml). B: závislost procentuelního zastoupení denaturované formy na koncentraci močoviny. Sestaveno dle [15] C: naměřená závislost relativní proudové odezvy ED v závislosti na koncentraci močoviny. Odečítáno z poslední elektrody, na kterou byl aplikován potenciál 900mV. Denaturační podmínky: protein byl denaturován 4M močovinou v přítomnosti fosfátového pufru při teplotě 20 C po 24 hodin. Závislost denaturace na koncentraci močoviny Po zjištění, že je významný rozdíl elektrochemického chování denaturované a nativní formy proteinu p53 (fl-p53) byla proměřena také závislost denaturačních změn v závislosti na koncentraci močoviny. Pro experiment se připravilo 6 roztoků o totožné koncentraci proteinu (7 µg/ml) a koncentraci močoviny 1, 2, 3, 4, 5 a 6 mol/l. Získaná závislost procentuelní relativní výšky píku na koncentraci močoviny je uvedena na Obrázku 4C. Minimální hodnota na ose y při nulové koncentraci močoviny odpovídá nedenaturované, maximální hodnoty (při koncentraci močoviny 4, 5 a 6 mol/l) naopak denaturované formě. Jak je vidět, námi naměřená závislost je podobná denaturační křivce v práci [15]; porovnej obrázek 4B a 4C. Obě křivky dosahují maxima při koncentraci močoviny 4 mol/l, rozdíl je pouze v první části křivky, kdy v případě p53cd (obrázek 4B) je nárůst denaturace záležitostí pouze úzkého pásu koncentrací močoviny, kdežto u fl-p53 se denaturace projevuje již při nejnižší koncentraci močoviny. Toto může být způsobeno např.
11 větší náchylností fl-p53 k denaturaci močovinou, ale mohou také plynout z rozdílnosti použitých detekčních metod. V práci [15] (Obrázek 4B) se denaturace určuje na základě měření fluorescence, která má pro denaturovanou a nativní formu jinou závislost intenzity fluorescence tryptofanových reziduí na vlnové délce excitace. V této naší práci studujeme denaturaci proteinu p53 v závislosti na výšce oxidačního signálu proteinu, která je, jak již bylo zmíněno, pravděpodobně velmi silně závislá na prostorovém uspořádání proteinu p53. Získaná závislost (Obrázek 4C) tedy naznačuje, že s pomocí optimalizované metody FIA-ED je možné rozlišit nativní a denaturovanou formu proteinu fl-p53. Agregace proteinu Po prokázání možnosti rozlišení nativní a denaturované formy proteinu p53 na elektrochemickém detektoru v průtokovém systému (FIA-ED), se dalo očekávat, že bude možné rozlišit i další formy proteinu p53. Proto jsme se v naší práci dále zabývali rozlišením agregované formy p53 pomocí optimalizované FIA-ED metody. Agregát představuje shluk monomerních jednotek proteinu navzájem propojených intermolekulárními vazbami. V případě centrální domény proteinu p53 jde konkrétně o prstencovité, zrnité nebo fibrilární struktury v závislosti na agregačních podmínkách a času agregace [20]. Ve zde již citovaných pracích byly tvorba agregátů centrální domény p53 (p53cd) zajištěna zvýšenou teplotou, případně tlakem [20] a nebo mírnějšími denaturačními podmínkami (koncentrace močoviny 1 až 2 mol/l, přítomnost EDTA vyvazující atom zinku), nebo působením močovinou bez přítomnosti fosfátového pufru při teplotě 37 C [15]. V této naší práci, kde bylo studováno chování celého proteinu p53 (fl-p53), bylo na protein působeno močovinou o koncentraci v intervalu 1 až 6 mol/l, bez přítomnosti fosfátového pufru a při teplotě 37 C. Protein byl vystaven popsaným podmínkám po 24 hodin. relativní proudová odezva (%) koncentrace močoviny (mol/l) Obrázek 5: závislost relativní proudové odezvy ED v závislosti na koncentraci močoviny. Pokles signálu zřejmě souvisí tvorbou shluků monomerních jednotek proteinu, u
12 kterých je horší přístup oxidovatelných aminokyselin k povrchu pracovní grafitové elektrody. Podmínky agregace: koncentrace proteinu 7 µg/ml, teplota 37 C, doba indukce 24 hodin. Získanou závislost výšky píku proteinu p53 na koncentraci močoviny ukazuje obrázek 5. Jak je vidět, naměřená závislost je sigmoidního charakteru a ve své první polovině klesá až na téměř 50 % výšky signálu neagregovaného proteinu (koncentrace močoviny 3 mol/l). Pokles hodnoty oxidačního signálu proteinu je zřejmě způsoben charakterem struktur detekovaných na elektrochemickém detektoru. Ty jsou objemnější než samotný monomer (první hodnota je výška signálu neagregovaného proteinu). Tím dochází k zmenšení počtu molekul proteinu, které se dostanou do dostatečné blízkosti k elektrodě a u kterých dojde k oxidaci aminokyselinových zbytků. To má za následek menší proudovou odezvu. V práci [20] jsou popsány agregáty centrální domény proteinu p53. Jejich tvar je závislý na délce působení a charakteru daných agregačních podmínek (teplota, tlak). Tvar agregátů byl prstencový (indukovaný vyšším tlakem; po 24 hodinách), granulovitý (indukce vyšší teplotou; 24 hodin) nebo fibrilární (indukované tlakem; po jednom měsíci). Při našem experimentu by teoreticky mohly vznikat objekty podobné granulovitým útvarům vzhledem k charakteru agregačních podmínek a časovému intervalu expozice proteinu. Na Obrázku 5 je možné si také povšimnout mírného nárůstu elektrochemické odezvy. Tato situace nastává při vyšších koncentracích močoviny (3 mol/l a výše), kdy může hypoteticky docházet k více rozdílným dějům ovlivňující oxidaci tyrosinových a tryptofanových reziduí. Teoreticky možné je vysvětlení, že se při vyšších koncentracích močoviny v nepřítomnosti fosfátového pufru a při vyšší teplotě tvoří v prvé řadě agregáty proteinu fl-p53, ovšem delším působením vyšších koncentrací močoviny následně dochází k povrchové denaturaci (rozrušení povrchové struktury) agregátu (schematicky zobrazeno na Obrázku 6). Toto vysvětlení by odpovídalo zvyšující se proudové odezvě, která ovšem ani při nejvyšších koncentrací močoviny nedosahuje hodnot výšek nativního proteinu. agregace vyšší koncentrací močoviny agregace vyšší koncentrací močoviny po delší dobu neinteragující monomery p53 agregát agregát s porušenými postranními řetězci
13 Obrázek 6: hypotetický model vysvětlující agregační závislost na koncentraci močoviny. Na začátku máme monomerní jednotky proteinu p53. Účinkem vysoké koncentrace močoviny bez přítomnosti fosfátového pufru za vyšší teploty (37 C) dochází nejdříve k seskupování monomerních jednotek do agregátů, delším účinkem však dochází k narušování postranních řetězců se zachováním agregované formy. Tato forma poté poskytuje vyšší signál než-li agregovaná forma, ovšem díky stabilnímu agregátu nedostaneme natolik vysoký signál jako v případě denaturace. ZÁVĚR Protein p53 je v posledních několika dekádách velice studovanou molekulou díky svému výjimečnému antiproliferativnímu chování, díky kterému je stále zvažován jako marker výskytu rakovinového onemocnění. Vazbou na DNA reguluje expresi mnoha proteinů a brání tak vzniku nádorového bujení. Velkou roli při jeho aktivitě hraje jeho struktura. V této práci byla optimalizována metoda pro stanovení proteinu p53 (limit detekce 45,8 amol p53), která byla dále aplikována na studium strukturních forem (nativní, denaturovaná a agregovaná) p53. Bylo zjištěno, že denaturovaná forma poskytuje vyšší signál než nativní a agregovaná naopak menší. Poděkování Příspěvek vznikl za podpory grantů FRVŠ 164/2004, IGA MZLU 3/2004, GAČR č. 525/04/P132, IGA FaF VFU IG LITERATURA [1] D.P. Lane, Nature 385 (1992). [2] W.S. El-Deiry, S.E. Kern, J.A. Pietenpol, K.W. Kinzler, B. Vogelstein, Nat. Genet. 1 (1992) 45. [3] J. Šmardová, J. Šmarda, J. Koptíková, Biol. Listy 69 (2004) 191. [4] C.J. Sherr, Science 274 (1996) [5] M.L. Smith, I.T. Chen, Q.M. Zhan, I.S. Bae, C.Y. Chen, T.M. Gilmer, M.B. Kastan, P.M. O'Connor, A.J. Fornace, Science 266 (1994). [6] S. Bates, K.H. Vousden, Cell. Mol. Life. Sci. 55 (1999) 28. [7] P. Hainaut, T. Soussi, B. Shomer, M. Hollstein, M. Greenblatt, E. Hovig, C.C. Harris, R. Montesano, Nucleic Acids Res. 25 (1997). [8] V. Brázda, E. Paleček, Biol. Listy 64 (1999) 161.
14 [9] S. Bosari, A. Marchetti, F. Buttiatta, D. Graziani, G. Borsani, M. Loda, G. Bevilacqua, G. Coggi, Diagn. Mol. Pathol. 4 (1995) 249. [10] V. Brázda, J. Paleček, S. Pospíšilová, B. Vojtěšek, E. Paleček, Biochem. Bioph. Res. Co. 267 (2000) 934. [11] E. Jagelská, V. Brázda, S. Pospíšilová, B. Vojtěšek, E. Paleček, J. Immunol. Methods 267 (2002) 227. [12] M. Brázdová, R. Kizek, L. Havran, E. Paleček, Bioelectrochemistry 55 (2002) 115. [13] R. Kizek, L. Trnková, E. Paleček, Anal. Chem. 77 (2001) [14] L. Trnková, R. Kizek, J. Vacek, Bioelectrochemistry 56 (2002) 57. [15] A.N. Bullock, J. Henckel, B.S. DeDecker, C.M. Johnson, P.V. Nikolova, M.R. Proctor, D.P. Lane, A.R. Fersht, P. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997). [16] R.M. Wartell, S. Hosseini, S. Powell, J. Zhu, J. Chromatogr. A 806 (1998). [17] D. Voet, J.G. Voet, Biochemie, Victoria Publishing, Praha, [18] C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern, Biochemistry, San Francisco, [19] in. [20] D. Ishimaru, L.R. Andrade, L.S.P. Teixeira, P.A. Quesado, L.M. Maiolino, P.M. Lopez, Y. Cordeiro, L.T. Costa, W.M. Heckl, G. Weissmüller, D. Foguel, J.L. Silva, Biochemistry 42 (2003) 9022.
Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny)
Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny) 1. Přímé měření: analyzovaná kapalina většinou odvětvena + vhodný detektor 2. Kapalinová chromatografie (HPLC) Stanovení po předchozí separaci 3.
VíceANALYSIS OF CYSTEINE, GLUTATHIONE AND PHYTOCHELATINS BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION
ANALYSIS F CYSTEINE, GLUTATHINE AND PHYTCHELATINS BY HIGH-PERFRMANCE LIQUID CHRMATGRAPHY WITH ELECTRCHEMICAL DETECTIN ANALÝZA CYSTEINU, GLUTATHINU A FYTCHELATINU PMCÍ VYSK-ÚČINNÉ KAPALINVÉ CHRMATGRAFIE
VíceSarkosin jako jednoduchý test na rakovinu prostaty analytická studie přednášky Natalia Cernei
Název: Školitel: Sarkosin jako jednoduchý test na rakovinu prostaty analytická studie přednášky Natalia Cernei Datum: 20.1.2011 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce
VíceOPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI
Středoškolská technika 212 Setkání a prezentace prací středoškolských studentů na ČVUT OPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI Eliška Marková
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip
Více1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I
1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené
VíceDerivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra
Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Teorie: Derivační spektrofotometrie, využívající derivace absorpční křivky, je obecně používanou metodou pro zvýraznění detailů průběhu záznamu,
VíceMikrofluidní systémy a možnosti jejich automatizovaného a vzdáleného řízení
SPOLEČNĚ PRO VÝZKUM, ROZVOJ A INOVACE CZ/FMP.17A/0436 Mikrofluidní systémy a možnosti jejich automatizovaného a vzdáleného řízení Ondřej Zítka 09. 04. 2015, 13:00 13:20 h Laboratoř metalomiky a nanotechnologií,
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v koncentračním
VíceCS Úřední věstník Evropské unie L 54/89
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89 c) při vlnové délce mezi 230 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra
VíceLABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie
LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) C Použití GC-MS spektrometrie Vedoucí práce: Doc. Ing. Petr Kačer, Ph.D., Ing. Kamila Syslová Umístění práce: laboratoř 79 Použití GC-MS spektrometrie
VíceSpecifická izolace microrna pomocí magnetizovatelných mikročástic
Název: Školitel: Specifická izolace microrna pomocí magnetizovatelných mikročástic Veronika Vlahová Datum: 21. 3. 214 Reg.č.projektu: CZ.1.7/2.3./2.148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti
VíceMonitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin
Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Ing. Kateřina Tmejová, Ph. D.,
VíceL 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie
L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 8. Výsledky kruhových testů V rámci ES byly provedeny kruhové testy, při nichž až 13 laboratoří zkoušelo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho
VíceZajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu
Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu Š.Dušková, I.Šperlingová, L. Dabrowská, M. Tvrdíková, M. Šubrtová duskova@szu.cz sperling@szu.cz Oddělení pro hodnocení expozice chemickým látkám
VíceVYUŽITÍ BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLENU. Anna Hamplová
VYUŽITÍ BEZKOTAKTÍ VODIVOSTÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLEU Anna Hamplová Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie Albertov 6, 128 43
VíceIZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek
IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení
VíceSTANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ
STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ 1 Úkol Separovat a metodou kalibrační křivky stanovit azobarviva (methyloranž - MO, dimethylová žluť - DMŽ) ve směsi metodou
VícePokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii
Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1/1 Proč biofyzikální metody? Biofyzikální metody využívají fyzikální principy ke studiu biologických systémů Poskytují kvantitativní
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení nepovolených doplňkových látek Zn-bacitracinu,
VíceAnalýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie
Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován
VíceUrčení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách
Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho
VíceVysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Teorie HPLC Praktické
VíceMINIATURIZACE PRŮTOKOVÝCH ELEKTROCHEMICKÝCH CEL PRO GENEROVÁNÍ TĚKAVÝCH SLOUČENIN. Jakub Hraníček
MINIATURIZACE PRŮTOKOVÝCH ELEKTROCHEMICKÝCH CEL PRO GENEROVÁNÍ TĚKAVÝCH SLOUČENIN Jakub Hraníček Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 6, 128 43 Praha 2 E-mail:
VíceAplikace AAS ACH/APAS. David MILDE, Úvod
Aplikace AAS ACH/APAS David MILDE, 2017 Úvod AAS: v podstatě 4atomizační techniky: plamenová atomizace (FA), elektrotermická atomizace (ETA), generování těkavých hydridů (HG), určené pro stanovení As,
VíceMetody separace. přírodních látek
Metody separace přírodních látek (5) Chromatografie; základní definice a klasifikace ruzných metod; kapalinová chromatografie, plynová chromatografie, přístrojová technika. Chromatografie «F(+)d» 1897
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu metodou HPLC
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÉHO A VOLNÉHO TRYPTOFANU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení vinylthiooxazolidonu (dále VOT) v krmivech.
VíceKALIBRACE. Definice kalibrace: mezinárodní metrologický slovník (VIM 3)
KALIBRACE Chemometrie I, David MILDE Definice kalibrace: mezinárodní metrologický slovník (VIM 3) Činnost, která za specifikovaných podmínek v prvním kroku stanoví vztah mezi hodnotami veličiny s nejistotami
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení dekochinátu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení fumonisinů B 1 a B 2 v krmivech. 2 Princip Fumonisiny
VíceLABIFEL: Laboratoře Biofyzikální Chemie a Elektrochemie
LABIFEL: Laboratoře Biofyzikální Chemie a Elektrochemie doc. RNDr., CSc. doc. Jan Hrbáč, Dr., Mgr. Libor Gurecký, Bc. Aneta Večeřová, Markéta Bosáková CO? JAK? Protonační a komplexotvorné rovnováhy DNA,
VíceČIŠTĚNÍ A PŘEDÚPRAVA PROCESNÍCH A ODPADNÍCH VOD Z VÝROBY PAPÍRU ELEKTROCHEMICKÝM - FENTONOVÝM PROCESEM
ČIŠTĚNÍ A PŘEDÚPRAVA PROCESNÍCH A ODPADNÍCH VOD Z VÝROBY PAPÍRU ELEKTROCHEMICKÝM - FENTONOVÝM PROCESEM Barbora Vystrčilová Libor Dušek Jaromíra Chýlková Univerzita Pardubice Ústav environmentálního a chemického
VíceAbsorpční spektroskopie při biologické analýze molekul
Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 8.11.2007 7 1 UV spektroskopie DNA a proteinů Všechny atomy absorbují v UV oblasti
VíceSeminář izolačních technologií
Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html
VíceMumie versus Zombie: na koho si vsadit v případě jaderné katastrofy
Mumie versus Zombie: na koho si vsadit v případě jaderné katastrofy Čeněk Malík* Tereza Baštová** Marie Dohnalová*** Gymnázium Litoměřická, Litoměřická 726, Praha 9* Gymnázium Česká Lípa, Žitovská 2969,
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu selenu v minerálních krmivech a premixech metodou optické emisní spektrometrie
Více(molekulární) biologie buňky
(molekulární) biologie buňky Buňka základní principy Molecules of life Centrální dogma membrány Metody GI a MB Interakce Struktura a funkce buňky - principy proteiny, nukleové kyseliny struktura, funkce
VíceCOSY + - podmínky měření a zpracování dat ztráta rozlišení ve spektru. inphase dublet, disperzní. antiphase dublet, absorpční
y x COSY 90 y chem. posuv J vazba 90 x : : inphase dublet, disperzní inphase dublet, disperzní antiphase dublet, absorpční antiphase dublet, absorpční diagonální pík krospík + - - + podmínky měření a zpracování
VíceMá tajemný clusterin u dětí v septickém stavu aktivitu chaperonu? J. Žurek, P.Košut, M. Fedora
Má tajemný clusterin u dětí v septickém stavu aktivitu chaperonu? J. Žurek, P.Košut, M. Fedora Klinika dětské anesteziologie a resuscitace, Lékařská fakulta MU, Fakultní nemocnice Brno DNA transkripce
VíceVýuka genetiky na PřF OU K. MALACHOVÁ
Výuka genetiky na PřF OU K. MALACHOVÁ KATEDRA BIOLOGIE A EKOLOGIE BAKALÁŘSKÉ STUDIJNÍ PROGRAMY Experimentální Systematická Aplikovaná (prezenční, kombinovaná) Jednooborová Dvouoborová KATEDRA BIOLOGIE
VíceAutomatická potenciometrická titrace Klinická a toxikologická analýza Chemie životního prostředí Geologické obory
Automatická potenciometrická titrace Klinická a toxikologická analýza Chemie životního prostředí Geologické obory Titrace je spolehlivý a celkem nenáročný postup, jak zjistit koncentraci analytu, její
VíceCo nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno
Co nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno Brno, 17.5.2011 Izidor (Easy Door) Osnova přednášky 1. Proč nás rakovina tolik zajímá?
Více2) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.
CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)
VíceLékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce
Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce 1. Máte pufr připravený smísením 150 ml CH3COOH o c = 0,2 mol/l a 100 ml CH3COONa o c = 0,25 mol/l. Jaké bude ph pufru, pokud přidáme 10 ml
VíceMolekulární diagnostika
Molekulární diagnostika Odry 11. 11. 2010 Michal Pohludka, Ph.D. Buňka základní jednotka živé hmoty Všechny v současnosti známé buňky se vyvinuly ze společného předka, tedy buňky, která žila asi před 3,5-3,8
VíceGENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI
GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i.
VícePříprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 16 Iontová chromatografie Iontová chromatografie je speciální technika vyvinutá pro separaci anorganických iontů a organických
VíceIzolace nukleových kyselin
Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 v krmivech. 2 Princip
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS 1 Účel a rozsah Tento postup specifikuje podmínky pro stanovení vitamínu D3 v krmivech metodou LC/MS. 2 Princip Zkušební
VíceStanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů
Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu,
VíceInterakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk
MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk
VíceDeterminanty lokalizace nukleosomů
METODY STUDIA CHROMATINU Topologie DNA a nukleosomů Struktura nukleosomu 1.65-1.8 otáčky Struktura nukleosomu 10.5 nt 1.8 otáčky 10n, 10n + 5 146 nt Determinanty lokalizace nukleosomů mechanické vlastnosti
VíceKonfirmace HPLC systému
Mgr. Michal Douša, Ph.D. Obsah 1. Měření modulové... 2 1.1 Těsnost pístů tlakový test... 2 1.2 Teplota autosampleru (správnost a přesnost)... 2 1.3 Teplota kolonového termostatu... 2 1.3.1 Absolutní hodnota...
VíceOptimalizace podmínek měření a práce s AAS
S (KT & Geochemie) Optimalizace podmínek měření a práce s S Teoretický základ úlohy: 1: OPTIMLIZCE PRCOVNÍCH PODMÍNEK Jedním z prvních úkolů při práci s atomovým absorpčním spektrometrem (S) je vždy nalezení
VíceSpektroskopické é techniky a mikroskopie. Spektroskopie. Typy spektroskopických metod. Cirkulární dichroismus. Fluorescence UV-VIS
Spektroskopické é techniky a mikroskopie Spektroskopie metody zahrnující interakce mezi světlem (fotony) a hmotou (elektrony a protony v atomech a molekulách Typy spektroskopických metod IR NMR Elektron-spinová
VíceKalibrace a limity její přesnosti
Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie Kalibrace a limity její přesnosti Semestrální práce Licenční studium GALILEO Interaktivní statistická analýza dat Brno, 2015
VícePojem management Standardní operační postup (SOP) Management potravinářské laboratoře
Pojem management Standardní operační postup (SOP) Management potravinářské laboratoře 1.roč. nav. MSP LS 2013/2014 Mgr. Kateřina Járová FVHE VFU Brno POJETÍ MANAGEMENTU Ačkoli pojem management v naší běžné
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení maduramicinu a semduramicinu v krmivech a premixech.
VíceFluoroSpheres Kód K0110
FluoroSpheres Kód K0110 6. vydání Kalibrační kuličky pro denní monitorování průtokového cytometru. Činidla obsažená v kitu lze použít pro 40 kalibrací. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 1/9 Obsah
VíceUNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie. Nám. Čs. Legií 565, Pardubice.
UNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie Nám. Čs. Legií 565, 532 10 Pardubice 15. licenční studium INTERAKTIVNÍ STATISTICKÁ ANALÝZA DAT Semestrální práce VYUŽITÍ TABULKOVÉHO
VíceMETODY STUDIA PROTEINŮ
METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová vlasta.furstova@tiscali.cz OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání
VícePLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC)
PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) Dělení látek mezi stacionární a mobilní fázi na základě rozdílů v těkavosti a struktuře (separované látky vykazují rozdílnou chromatografickou afinitu) Metoda vhodná pro látky:
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MBIO1/Molekulární biologie 1 Tento projekt je spolufinancován
VíceVYUŽITÍ TEPELNÉHO ZMLŽOVAČE V AAS
1 VYUŽITÍ TEPELNÉHO ZMLŽOVAČE V AAS JAN KNÁPEK Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta MU, Kotlářská 2, Brno 611 37 Obsah 1. Úvod 2. Tepelný zmlžovač 2.1 Princip 2.2 Konstrukce 2.3 Optimalizace
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení diclazurilu, halofuginonu, lasalocidu, maduramicinu, monensinu, narasinu, nikarbazinu, robenidinu,
VíceDETEKTORY pro kapalinovou chromatografii. Izolační a separační metody, 2018
DETEKTORY pro kapalinovou chromatografii Izolační a separační metody, 2018 Detektory v kapalinové chromatografii Typ detektoru Zkratka Měřená veličina Refraktometrický detektor RID index lomu Spektrofotometrický
VíceSIMULTANEOUS DETERMINATION OF THIOL COMPOUNDS BY LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF THIOL COMPOUNDS BY LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION SOUČASNÉ STANOVENÍ THIOLOVÝCH SLOUČENIN POMOCÍ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální
VíceHybridizace nukleových kyselin
Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních
Více"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy
"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy 1/75 Genetika = věda o dědičnosti Studuje biologickou informaci. Organizmy uchovávají,
Vícevzorek1 0.0033390 0.0047277 0.0062653 0.0077811 0.0090141... vzorek 30 0.0056775 0.0058778 0.0066916 0.0076192 0.0087291
Vzorová úloha 4.16 Postup vícerozměrné kalibrace Postup vícerozměrné kalibrace ukážeme na úloze C4.10 Vícerozměrný kalibrační model kvality bezolovnatého benzinu. Dle následujících kroků na základě naměřených
VíceElektrochemická analýza metalothioneinu u pacientů s onkologickým onemocněním
Blok: Nádorové markery Elektrochemická analýza metalothioneinu u pacientů s onkologickým onemocněním René Kizek 1,2*, JiříSochor 1,2, David Hynek 1,2, Soňa Křížková 1,2, Vojtěch Adam 1,2, Tomáš Eckschlager
VíceVyužití metod strojového učení v bioinformatice David Hoksza
Využití metod strojového učení v bioinformatice David Hoksza SIRET Research Group Katedra softwarového inženýrství, Matematicko-fyzikální fakulta Karlova Univerzita v Praze Bioinformatika Biologické inspirace
Více2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.
CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)
VíceSekvenční injekční analýza laboratoř na ventilu (SIA-LOV) (Stanovení obsahu heparinu v injekčním roztoku)
Sekvenční injekční analýza laboratoř na ventilu (SIA-LOV) (Stanovení obsahu heparinu v injekčním roztoku) Teorie: Sekvenční injekční analýza (SIA) je další technikou průtokové analýzy, která umožňuje snadnou
VíceU = E a - E k + IR Znamená to, že vložené napětí je vyrovnáváno
Voltametrie a polarografie Princip. Do roztoku vzorku (elektrolytu) jsou ponořeny dvě elektrody (na rozdíl od potenciometrie prochází obvodem el. proud) - je vytvořen elektrochemický článek. Na elektrody
VíceÚvod do koroze. (kapitola, která bude společná všem korozním laboratorním pracím a kterou studenti musí znát bez ohledu na to, jakou práci dělají)
Úvod do koroze (kapitola, která bude společná všem korozním laboratorním pracím a kterou studenti musí znát bez ohledu na to, jakou práci dělají) Koroze je proces degradace kovu nebo slitiny kovů působením
VíceUrychlení úpravy krvetvorby poškozené cytostatickou terapií (5-fluorouracil a cisplatina) p.o. aplikací IMUNORu
Urychlení úpravy krvetvorby poškozené cytostatickou terapií (5-fluorouracil a cisplatina) p.o. aplikací IMUNORu Úvod Myelosuprese (poškození krvetvorby) patří mezi nejčastější vedlejší účinky chemoterapie.
VíceNázev: Stanovení železa ve vzorcích krve pomocí diferenční pulzní voltametrie
Název: Stanovení železa ve vzorcích krve pomocí diferenční pulzní voltametrie Školitel: MVDr. Ludmila Krejčová Datum: 24.2. 2012 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce
VíceIzolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..
Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich
VíceVysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové
Více7. Regulace genové exprese, diferenciace buněk a epigenetika
7. Regulace genové exprese, diferenciace buněk a epigenetika Aby mohl mnohobuněčný organismus efektivně fungovat, je třeba, aby se jednotlivé buňky specializovaly na určité funkce. Nový jedinec přitom
VíceExperiment s dlouhodobou selekcí krav na ukazatele produkce a zdravotního stavu v Norsku Ing. Pavel Bucek, Českomoravská společnost chovatelů, a.s.
Experiment s dlouhodobou selekcí krav na ukazatele produkce a zdravotního stavu v Norsku Ing. Pavel Bucek, Českomoravská společnost chovatelů, a.s. Z chovatelské praxe a z celé řady vědeckých experimentů
VíceLABORATOŘ OBORU I. Příprava diagnostického testu na bázi lateral flow immunoassay ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111)
LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) C Příprava diagnostického testu na bázi lateral flow immunoassay Vedoucí práce: Ing. Aram Zolal Ing. Lukáš Filip Umístění práce: laboratoř S58 1. Úvod
VíceÚstav experimentální medicíny AV ČR úspěšně rozšířil přístrojové vybavení pro vědce z peněz evropských fondů
Ústav experimentální medicíny AV ČR úspěšně rozšířil přístrojové vybavení pro vědce z peněz evropských fondů Ústav úspěšně dokončil realizaci dvou investičních projektů s využitím prostředků z Operačního
VíceOdměrná analýza, volumetrie
Odměrná analýza, volumetrie metoda založená na měření objemu metoda absolutní: stanovení analytu ze změřeného objemu roztoku činidla o přesně známé koncentraci, který je zapotřebí k úplné a stechiometricky
VíceChemická reaktivita NK.
Chemické vlastnosti, struktura a interakce nukleových kyselin Bi7015 Chemická reaktivita NK. Hydrolýza NK, redukce, oxidace, nukleofily, elektrofily, alkylační činidla. Mutageny, karcinogeny, protinádorově
VíceHODNOCENÍ ROZDÍLNÝCH REŽIMŮ PŘI PROCESU SPALOVÁNÍ
HODNOCENÍ ROZDÍLNÝCH REŽIMŮ PŘI PROCESU SPALOVÁNÍ Radim Paluska, Miroslav Kyjovský V tomto příspěvku jsou uvedeny poznatky vyplývající ze zkoušek provedených za účelem vyhodnocení rozdílných režimů při
Víceanalýzy dat v oboru Matematická biologie
INSTITUT BIOSTATISTIKY A ANALÝZ Lékařská a Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Komplexní přístup k výuce analýzy dat v oboru Matematická biologie Tomáš Pavlík, Daniel Schwarz, Jiří Jarkovský,
VíceCHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní).
CHROMATOGRAFIE ÚOD Existují různé chromatografické metody, viz rozdělení metod níže. Společný rys chromatografických dělení: vzorek jako směs látek - složek se dělí na jednotlivé složky působením dvou
VíceAnalytické znaky laboratorní metody Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality
Analytické znaky laboratorní metody Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality RNDr. Alena Mikušková FN Brno Pracoviště dětské medicíny, OKB amikuskova@fnbrno.cz Analytické znaky laboratorní metody
Více