UNIVERZITA J. E. PURKYNĚ

Transkript

1 UNIVERZITA J. E. PURKYNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA BIOLOGIE GENETIKA STUDIJNÍ OPORA JAN IPSER Ústí nad Labem

2 ÚVODNÍ POZNÁMKA Studijní opora Genetika je určena pro posluchače studijního oboru biologie Přírodovědecké fakulty Univerzity J. E. Purkyně v Ústí nad Labem. Záměrem autora bylo vytvořit učební text, který by obsahoval podstatné informace k tematickým celkům, přednášeným v základním kurzu genetiky. Snahou autora zároveň bylo omezit na nezbytné minimum ty partie, které jsou probírány podrobně v jiných předmětech studijního programu biologie na uvedené fakultě Univerzity J. E. Purkyně, aby bylo zamezeno nadměrné duplicitě. Do tohoto učebního textu proto nebyly zařazeny samostatné kapitoly z oblasti evoluční genetiky, genetiky prokaryot, hub, rostlin, živočichů a člověka, neboť jsou náplní kurzů biologie prokaryotické buňky a speciální genetiky. Z obdobných důvodů byl rozsah některých dalších kapitol redukován. Studijní opora tedy není koncipována jako učebnice pokrývající proporcionálně všechny stěžejní oblasti genetiky, ale jako studijní materiál, který je kompatibilní s příbuznými předměty zmíněného studijního programu biologie a tvoří s nimi jednotný celek. Dovoluji si upozornit, že elektronická verze studijní opory Genetika je určena výhradně pro vaše osobní studijní účely a nesmí být dále rozšiřována (kopírována). Přeji vám hodně úspěchů ve studiu zvoleného oboru. V případě potřeby se neostýchejte využít všech dalších obvyklých a dostupných forem komunikace s vyučujícími (elektronické, telefonické, osobní) nad rámec uskutečněných konzultací. Autor 1

3 OBSAH I. Informační biomakromolekuly 5 I.1. Nukleové kyseliny 6 I.1.1. Kyselina deoxyribonukleová - DNA 9 I.1.2 Chromatin 20 I.1.3 Polymorfizmus DNA 25 I.1.4 Kyseliny ribonukleové - RNA 29 I Mediátorová ribonukleová kyselina mrna 29 I Transferová ribonukleová kyselina trna 30 I Ribozomání ribonukleová kyselina rrna 32 II. Genetická informace a genetický kód 33 III. Koncepce genu 38 IV. Replikace DNA 43 IV.1 Replikace prokaryotického chromozomu 45 IV.2 Replikace plazmidové DNA 46 IV.3 Replikace chromozomové DNA eukaryot 48 IV.4 Replikace mitochondriální DNA (mtdna) 51 IV.5 Replikace chloroplastové DNA (ctdna) 55 V. Transkripce 56 V.1 Transkripce v prokaryotické buňce 59 V.2 Transkripce v eukaryotické buňce 62 V.3 Transkripce mitochondriální a chloroplastové DNA 66 V.4 Posttranskripční úpravy 66 VI. Translace 76 VI.1 Translace v prokaryotické buňce 80 VI.2 Translace v eukaryotické buňce 85 VI.3 Translace v mitochondriích 92 VI.4 Translace v chloroplastech 93 VI.5 Kotranslační a posttranslační úpravy 93 VII. Regulace genové exprese 95 VIII. Rozmnožování a přenos genetické informace 101 VIII.1 Buněčné dělení 101 VIII.1.1 Binární dělení 102 VIII.1.2 Mitóza 102 VIII.1.3 Meióza 105 2

4 VIII.1.4 Amitóza 108 VIII.2 Rozmnožování 109 VIII.2.1 Nepohlavní rozmnožování (amixe) 109 VIII Binární dělení 109 VIII Fiziparie 109 VIII Gemiparie 109 VIII Vegetativní rozmnožování 109 VIII.2.2 Pohlavní rozmnožování (amfimixe) 109 VIII.2.3 Apomixe 110 VIII Partenogeneze 110 VIII Gynogeneze 110 VIII Androgeneze 110 VIII Apogametie 111 VIII Adventivní embryonie 111 IX. Princip segregace a kombinace vloh. Hybridizmus 112 X. Genové interakce 119 X.1 Reciproká interakce 119 X.2 Dominantní epistáze 120 X.3 Recesivní epistáze 121 X.4 Inhibice 123 X.5 Komplementarita 124 X.6 Duplicita (multiplicita) nekumulativní 125 X.7 Duplicita (multiplicita) kumulativní s dominancí 126 X.8 Duplicita (multiplicita) kumulativní bez dominance 127 XI. Vazba genů 130 XII. Dědičnost a pohlaví 150 XII.1 Chromozomové a genotypové určení pohlaví 150 XII.2 Znaky pohlavně vázané 157 XII.3 Znaky pohlavně ovládané 159 XII.4 Znaky pohlavně ovlivněné 160 XIII. Mutační genetika 162 XIII.1 Klasifikace mutací 163 XIII.1.1 Genové mutace 168 XIII.1.2 Chromozomální aberace 169 XIII.1.3 Genomové mutace 180 XIII.2 Klasifikace mutagenů 187 XIII.2.1 Fyzikální mutageny 187 XIII.2.2 Chemické mutageny 192 3

5 XIII.2.3 Biologické mutageny 198 XIII.3 Detekce mutací 199 XIII.4 Vztahy: mutageneze karcinogeneze teratogeneze 203 XIII.5 Reparace mutačních změn 206 XIII.6 Transpozice 212 XIV. Biochemická genetika 216 XV. Dědičnost kvantitativních znaků 218 XVI. Genetika populací 226 XVI.1 Populace panmiktická 227 XVI.1.1 Hardy-Weinbergova rovnováha 227 XVI.1.2 Systematické procesy rušící Hardy-Weinbergovu rovnováhu 231 XVI Migrace 231 XVI Mutace 231 XVI Selekce 232 XVI.1.3 Disperzivní proces 236 XVI.1.4 Inbrídink 238 XVI.2 Populace autogamní 240 XVII. Mimojaderná dědičnost 242 XVIII. Genové manipulace 246 XVIII.1 Transdukce 246 XVIII.2 Transformace 250 XVIII.3 Konjugace 253 XVIII.4 Klonování DNA 256 XVIII.5 Genové knihovny 262 XVIII.6 Molekulárně genetické metody 262 XVIII.6.1 Izolace nukleových kyselin 262 XVIII.6.2 Hybridizace nukleových kyselin 263 XVIII.6.3. Polymerázová řetězová reakce (PCR) 266 XVIII.6.4 Ligázová řetězová reakcezová REAKCE (LCR) 269 XVIII.6.5 Sekvenování DNA 270 XVIII.7 Molekulárně genetický polymorfizmus 271 XVIII.8 Transgenoze 275 Doporučená studijní literatura a další zdroje 278 4

6 I. INFORMAČNÍ BIOMAKROMOLEKULY Za makromolekuly jsou obvykle označovány molekuly o relativní molekulové hmotnosti M r v rozsahu řádů V biologických systémech patří mezi základní makromolekuly (tzv. biomakromolekuly) polysacharidy, proteiny a nukleové kyseliny. Každá z těchto tří skupin organických látek představuje určitý typ polymerů. Polymer je makromolekula složená z mnoha kovalentně spojených nízkomolekulárních podjednotek (monomerů). Jsou-li tyto jednotky shodné chemickým složením, jedná se o homopolymery, liší-li se navzájem chemickým složením, jedná se o heteropolymery. Polymery, které se vyskytují v biologických systémech a tvoří jejich látkovou podstatu, jsou nazývány biopolymery; mezi ně náleží především nukleové kyseliny a proteiny. Nukleové kyseliny lze v tomto smyslu označit za specifický druh heteropolymerů, tvořených polynukleotidovými řetězci (tj. polymery nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovými vazbami); v případě DNA jsou to polydeoxyribonukleotidové řetězce (polydeoxyribonukleotidy) s deoxyribonukleotidy (damp, dgmp, dtmp, dcmp) jako monomery, v případě RNA jsou to polyribonukleotidové řetězce (polyribonukleotidy) s ribonukleotidy (AMP, GMP, UMP, CMP) jako monomery. Proteiny (bílkoviny) představují specifický druh heteropolymerů sestávajících z jednoho nebo více polypeptidových řetězců, což jsou polymery tvořené aminokyselinami jako monomery, navzájem spojenými peptidovými vazbami. Pojmem informační molekuly se označují ty (bio)makromolekuly, které zprostředkují uchování a přenos genetické informace v souladu s centrálním dogmatem molekulární biologie (tj. obecně ve směru DNA DNA a DNA RNA proteiny). Tomuto vymezení vyhovují polymery, jakými jsou nukleové kyseliny a proteiny; právě z polymerního charakteru těchto látek je možno vyvozovat jejich schopnost působit jako informační makromolekuly. Nukleové kyseliny a proteiny tak představují základní složky všech živých systémů s evolučně etablovanými, těsnými, vzájemně propojenými strukturně-funkčními vztahy determinujícími a zprostředkujícími na základě vnitřní jednoty autoreprodukci, autoregulaci a metabolismus (homeostázu) jako základní atributy živé hmoty i umožňujícími na základě vnitřní rozpornosti vývoj jak ve smyslu ontogenetickém, tak fylogenetickém. V další části tohoto učebního textu je pojednáno pouze o nukleových kyselinách, problematika ostatních biomakromolekul je probírána v jiných předmětech. I.1. NUKLEOVÉ KYSELINY 5

7 Nukleové kyseliny jsou makromolekuly tvořené polynukleotidovými řetězci. Podle druhu polynukleotidového řetězce se rozlišují dva základní typy nukleových kyselin: 1. ribonukleové kyseliny (RNA) jsou to nukleové kyseliny (heteropolymery) složené z jednoho polyribonukleotidového řetězce, nebo ze dvou komplementárních polyribonukleotidových řetězců (obsahujících jako monomery AMP, GMP, UMP, CMP) spojených vodíkovými vazbami. 2. deoxyribonukleové kyseliny (DNA) jsou to nukleové kyseliny (heteropolymery) složené z jednoho deoxyribonukleotidového řetězce, nebo ze dvou komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců (obsahujících jako monomery damp, dgmp, dtmp, dcmp) spojených vodíkovými vazbami. Stavební složky nukleových kyselin tvoří: 1. sacharid 2. kyselina fosforečná (zbytek) 3. dusíkaté báze pyrimidinové (C cytozin, T tymin, U uracyl) a purinové (A adenin, G guanin) Zastoupení těchto jednotlivých stavebních složek v DNA a RNA je uvedeno v následující tabulce. Tab.: Složky nukleových kyselin. SLOŽKA DNA RNA Sacharid β-d-2 -deoxyribóza β-d-ribóza (cyklická furanóza) Fosfát estericky vázaný zbytek H 3 PO 4 estericky vázaný zbytek H 3 PO 4 pyrimidinové tymin (T) uracyl (U) Dusíkaté cytosin (C) cytosin (C) báze purinové adenin (A) adenin (A) guanin (G) guanin (G) Vytvořením N-glykozidové vazby mezi atomem C1 ribózy a atomem dusíku N1 pyrimidinové báze nebo atomem dusíku N9 purinové báze vznikne příslušný ribonukleozid (uridin U nebo Urd, cytidin C nebo Cyd, adenozin A nebo Ado, guanozin G nebo Guo). Vytvořením N-glykozidové vazby mezi atomem C1 deoxyribózy a atomem dusíku N1 pyrimidinové báze nebo atomem dusíku N9 purinové báze vznikne příslušný deoxyribonukleozid (deoxytymidin dt nebo dthd, deoxycytidin dc nebo dcyd, deoxyadenozin da nebo dado, deoxyguanozin dg nebo dguo). V důsledku pseudorotace ribofuranózového kruhu se může sacharidová složka nukleozidů vyskytovat v nukleových kyselinách v konformaci C3 - endo (tzn. že oproti koplanárním atomům C1 - O C4 leží atomy C3 - C5 - N v jedné rovině, odlišné od roviny, ve které leží atom C2 ), nebo v konformaci C2 - endo (tzn. že oproti koplanárním atomům C1 - O C4 leží atomy C2 - C5 - N v jedné rovině, odlišné od roviny, ve které leží atom C3 ). N-glykozidová vazba mezi sacharidem a pyrimidinovou bází je antiklinální, kdežto N- 6

8 glykozidová vazba mezi sacharidem a purinovou bází může být antiklinální nebo synklinální. Popsané jevy se tak spolupodílejí na výsledné konformaci nukleových kyselin. Vytvořením esterické vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a OH-skupinou, vázanou na atom uhlíku C5 ribózy ribonukleozidu, vznikne příslušný ribonukleotid-5 monofosfát, resp. zkráceně ribonukleotid (uridinmonofosfát UMP, cytidinmonofosfát CMP, adenozinmonofosfát AMP, guanozinmonofosfát GMP). Vytvořením esterické vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a OH-skupinou, vázanou na atom uhlíku C5 deoxyribózy deoxyribonukleozidu, vznikne příslušný deoxyribonukleotid-5 -monofosfát, resp. zkráceně deoxyribonukleotid (deoxytymidinmonofosfát dtmp, deoxycytidinmonofosfát dcmp, deoxyadenozinmonofosfát damp, deoxyguanozinmonofosfát dgmp). V RNA se vytváří fosfodiesterová vazba mezi C3 jednoho ribonukleotidu a C5 následujícího ribonukleotidu. Postupným lineárním napojováním dalších ribonukleotidů prostřednictvím této vazby se kondenzačními reakcemi syntetizuje polyribonukleotidový řetězec. Obdobně se vytváří fosfodiesterová vazba v DNA mezi C3 jednoho deoxyribonukleotidu a C5 následujícího deoxyribonukleotidu a postupným lineárním napojováním dalších deoxyribonukleotidů se jejím prostřednictvím syntetizuje polydeoxyribonukleotidový řetězec. Syntéza polyribonukleotidového řetězce (RNA) i polydeoxyribonukleotidového řetězce (DNA) se v biologických systémech uskutečňuje ve směru 5 3 (je orientovaná); to znamená, že vždy následující ribonukleotidfosfát, resp. deoxyribonukleotidfosfát se za vzniku fosfodiesterové vazby připojí svým fosforylovaným 5 - koncem k 3 - konci předcházejícího (v řetězci již zabudovaného) ribonukleotidu, resp. deoxyribonukleotidu. Obr.: Dusíkatá báze, nukleozid, nukleotid. Zdroj: 7

9 Obr.: Dusíkaté báze a (deoxy)ribonukleotidy. Zdroj: Obr.: Rozdíly ve struktuře RNA a DNA Zdroj: 8

10 I.1.1. KYSELINA DEOXYRIBONUKLEOVÁ - DNA DNA je obsažena v buňkách všech organizmů a virových částicích kromě RNAvirů. Vyskytuje se v nich v různých formách, a tak může být podle zvolených kritérií klasifikována do několika základních skupin: 1. podle počtu deoxyribonukleotidových řetězců DNA jednořetězcová = ssdna (single-stranded DNA): sestává z jednoho polydeoxyribonukleotidového řetězce DNA dvouřetězcová = dsdna (double-stranded DNA): sestává ze dvou komplementárních, antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců V izolované douřetězcové DNA bylo opakovaně zjištěno, že: (a) molární množství purinových bází je rovno molárnímu množství pyrimidinových bází (A+G = T+C), (b) molární množství adeninu je rovno molárnímu množství tyminu (A=T) a molární množství guaninu je rovno molárnímu množství cytozinu (G = C). Tyto vztahy jsou známy jako tzv. Chargaffovo pravidlo. Později, v souvislosti s objasněním dvoušroubovicové struktury DNA, bylo prokázáno, že v dvouřetězcové molekule DNA se vytvářejí páry bází (v konfiguraci cis) spojené vodíkovými vazbami, přičemž: (a) vždy jedna z bází daného páru je purinová a jedna pyrimidinová, (b) se páruje adenin (v aminoformě) s tyminem (v oxoformě) dvěma vodíkovými vazbami (A = T) a guanin (v oxoformě) s cytozinem (v aminoformě) třemi vodíkovými vazbami (G C). Popsaný princip párování bází v dvouřetězcové molekule DNA, jehož důsledkem je vznik komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců (resp. téměř komplementárních, neboť případný vznik chyby při párování bází nelze nikdy vyloučit), popisuje tzv. Watsonovo Crickovo pravidlo. Toto pravidlo lze též aplikovat při replikaci nukleových kyselin, při syntéze mrna (primárního transkriptu) podle templátu v průběhu transkripce, při hybridizaci nukleových kyselin a při interakci kodonu s antikodonem v průběhu translace; o těchto procesech je pojednáno dále. Z Watsonova Crickova pravidla existují některé výjimky. Mezi ně patří paralelní řetězce dsdna s bázemi v postavení trans a stejně orientovanými fosfodiesterovými vazbami, úseky dsdna, ve kterých jsou vodíkovými vazbami spárovány stejné báze (A-A, T- T, C-C, G-G) a více než dvouřetězcové (třířetězcové, čtyřřetězcové) DNA, resp. triády a tetrády bází. Výskyt takovýchto útvarů je omezen na specifické úseky nukleových kyselin, resp. na specifické molekulárně genetické procesy, a jejich vznik je podmíněn fyzikálněchemickými vlastnostmi jednotlivých komponent DNA. S ohledem na mechanizmus syntézy polydeoxyribonukleotidových řetězců lze na každém z nich rozeznat 5 - konec a 3 - konec. V dvouřetězcové DNA (dsdna) jsou fosfodiesterové vazby obou řetězců navzájem opačně orientované a proto proti 5 - konci jednoho řetězce leží 3 - konec druhého řetězce a naopak (proti 3 - konci jednoho řetězce leží 5 - konec druhého řetězce). Oba řetězce jsou tedy vůči sobě orientovány antiparalelně. 9

11 Obr.: Schéma antiparalelního uspořádání řetězců DNA Zdroj: 2. podle tvaru DNA kružnicová jednořetězcová: nemá volné konce - dvouřetězcová a) kovalentně uzavřená kružnice (CCC, covalently closed circle): nemá volné konce, ani zlom v řetězcích b) otevřená kružnice (OC, open circle): má volné konce a alespoň jeden zlom v jednom řetězci DNA lineární jednořetězcová: má volné konce 5 a 3 - dvouřetězcová: má volné konce 5 a 3 3. podle lokalizace v buňce DNA jaderná (ndna): je součástí chromozomů eukaryot. Jejím analogem u prokaryot je nukleoid (prokaryotický chromozom). - mimojaderná mitochondriální (mtdna): v mitochondriích - chloroplastová (ctdna): v chloroplastech - plazmidová: v plazmidech 10

12 DNA se může vyskytovat ve více strukturních úrovních: 1. PRIMÁRNÍ STRUKTURA DNA Primární strukturou DNA se rozumí sekvence deoxyribonukleotidů v řetězci DNA. Jednotlivé deoxyribonukleotidy (damp, dgmp, dtmp, dcmp) nejsou rozloženy v polydeoxyribonukleotidových řetězcích DNA rovnoměrně, náhodně, a proto můžeme v rámci genomu (resp. i jediné molekuly DNA či jednotlivých chromozomů) rozlišit určité typy dílčích sekvencí. Sekvence, které se v haploidním genomu vyskytují pouze jednou, označujeme jako sekvence unikátní; většinou jsou lokalizovány ve strukturních genech. Sekvence, které se v haploidním genomu vyskytují ve více kopiích, označujeme jako sekvence repetitivní (opakující se). Repetitivní sekvence mohou sestávat z různého, avšak pro danou repetici konstantního počtu deoxyribonukleotidů, který vyjadřuje délku repetice; zastoupení jednotlivých nukleotidů, jejich pořadí a počet v dané repetitivní sekvenci se označuje jako jednotka repetice a počet jednotek repetice v haploidním genomu jako četnost repetice. Repetitivní sekvence (repetice) lze klasifikovat v rámci genomu do několika dílčích typů: (1) krátké tandemové repetice: jednotky repetice jsou v nich uspořádány za sebou, např. ATGCATGC, obecně (ATGC) n, kde n = četnost repetice (2) přímá repetice: opakuje se na jednom řetězci DNA, avšak jednotlivé jednotky repetice jsou přerušovány jinými úseky nuleotidového řetězce, např....atgc...atgc...atgc...atgc... (3) rozptýlené repetice: jejich repetitivní jednotky jsou v genomu rozloženy na různých chromozomech haploidního genomu (4) obrácené repetice: jsou vůči sobě komplementární, např....atgcgcat... nebo...atgc...gcat...; přiléhají-li komplementární úseky obrácené repetice bezprostředně k sobě (v našem případě...atgcgcat...), nazývají se palindromy (osově symetrické sekvence). Obrácené repetice umožňují párováním bází na jednom řetězci nukleové kyseliny tvorbu vlásenky bez smyčky (spárováním komplementárních bazí v palindromu, v našem případě...atgcgcat...), nebo vlásenky se smyčkou (spárováním komplementárních bází v rámci obrácené repetice přerušené jiným úsekem nukleotidového řetězce, v našem případě...atgc...gcat...). Obdobně párováním komplementárních bází v rámci obrácených repetic na obou řetězcích nukleové kyseliny vzniká křížová struktura. Vlásenky a křížové struktury jsou však již útvary vyšší, sekundární struktury DNA (resp. RNA). (5) dlouhá terminální repetice (= LTR-sekvence): vyskytuje se na obou koncích téhož řetězce DNA, přičemž konce takové sekvence jsou navzájem komplementární, např. ATGC...GCAT V primární struktuře DNA všech organizmů (kromě RNA-virů) je zakódována genetická informace, kterou se rozumí informace o primární struktuře proteinů (polypeptidů), ribonukleových kyselin typu rrna a trna a o vazbě specifických proteinů k určitým sekvencím DNA. Primární struktura DNA je tedy určující pokud jde o obsah genetické informace, její reprodukci (replikaci), přepis (transkripci) a následně též překlad (translaci). Konvenčně se sekvence deoxyribonukleotidů (bází) v řetězci DNA uvádí od 5 konce. 11

13 2. SEKUNDÁRNÍ STRUKTURA Dvouřetězcová DNA může vytvářet vyšší, sekundární strukturu. Nejčastěji se vyskytující formou sekundární struktury je dvoušroubovice (helix), jejíž základní model lze popsat následujícími znaky: sestává ze dvou komplementárních antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců ovíjejících společnou osu a uspořádaných tak, že páry bází (spojené vodíkovými vazbami podle Watsonova - Crickova pravidla) směřují dovnitř šroubovice a oporná pentózafosfátová (přesněji deoxyribózafosfátová) kostra na povrch šroubovice. V důsledku otáčení řetězců kolem osy dvoušroubovice dochází jednak v rámci jednotlivých komplementárních párů bází ke změně jejich vzájemné polohy v prostoru (tzv. vrtulový zkrut) a tím k posunu rovin proložených jednotlivými bázemi každého komplementárního páru bází o úhel zkrutu, který se udává pro C1 - atomy komplementárních deoxyribonukleotidů, jednak rotací párů bází kolem osy dvoušroubovice dochází ke změně jejich poloh (tzv. rovinný zkrut). Vzájemným obtáčením komplementárních řetězců se vytváří dvoušroubovicové vinutí, které může být pravotočivé nebo levotočivé. Protože jednotlivé páry bází jsou posunuty o určitou vzdálenost od osy dvoušroubovice, spojnice C1 - atomů příslušejících deoxyribózovým zbytkům jednotlivých komplementárních párů bází obvykle nejsou kolmé na osu dvoušroubovice a neprocházejí jí, vytváří povrch dvoušroubovice reliéf, na kterém se rozlišují dva žlábky: menší a větší; ve žlábcích se některé skupiny atomů komponent polydeoxyribonukleotidových řetězců mohou účastnit interakcí s dalšími látkami, zejména proteiny. Obr.: Schéma struktury dsdna Zdroj:

14 V závislosti na konkrétní deoxyribonukleotidové sekvenci a na vlastnostech prostředí (vlhkost, iontová síla apod.) může DNA vytvářet na úrovni sekundární struktury konformace energeticky adekvátní daným podmínkám. Konformace B se v živých buňkách vyskytuje nejčastěji (je přítomna ve všech buněčných organizmech a DNA virech) a představuje konformaci dvoušroubovice, popsané Watsonem a Crickem. Další základní konformací je konformace A, která je dobře známá z podmínek in vitro; v buňkách se vyskytuje za nižší vlhkosti (ve sporách mikroorganizmů). Konformace B a konformace A mohou v sebe navzájem přecházet. Vinutí u konformace A i B je pravotočivé. Třetí základní konformací DNA je konformace Z, která se uplatňuje při procesu rekombinace, některých regulacích genové exprese (např. při aktivaci určitých genů) a víceméně specifických molekulárněbiologických procesech; na rozdíl od předchozích dvou konformací je vinutí konformace Z levotočivé. Jednotlivé typy konformací DNA se liší v řadě znaků, z nichž hlavní jsou uvedeny v následující tabulce a schematicky zobrazeny na následujícím obrázku. Tab.: Konformace DNA ZNAK DVOUŠROUBOVICE DNA PŘI KONFORMACI B A Z Vinutí pravotočivé pravotočivé levotočivé Počet bp/závit 10, Zvýšení na 1 závit [nm] 3,4 2,5 4,6 Zvýšení na 1 bp [nm] 0,34 0,23 0,38 Větší žlábek široký, hluboký úzký, mělký mělký Menší žlábek úzký, hluboký široký, mělký úzký, hluboký Osa šoubovice vede přes Páry bází větší žlábek menší žlábek Konformace deoxyribózy C2 - endo C3 - endo Konformace glykozidové vazby anti anti C anti, G - syn 13

15 Obr.: Konformace DNA Zdroj: Obr.: Struktura DNA krystalografie (paprsky X) Významné informace o strukruře DNA byly získány krystalografickým studiem pomocí paprsků X (X-ray crystallography), které prováděli Maurice Wilkins a Rosalind Elsie Franklin. Zjistili, že molekula DNA má helikální tvar s opakujícími se vzdálenostmi 0,34 nm, 2 nm a 3,4 nm. Zdroj: 14

16 Sekundární struktura DNA (dvoušroubovice) může přecházet ve strukturu primární a naopak v závislosti mimo jiné na fyzikálně-chemických podmínkách prostředí. Účinek vyšších teplot nebo některých chemických látek (např. močoviny v dostatečně vysokých koncentracích v alkalickém prostředí) na dvoušroubovici DNA se může projevit přerušením vodíkových vazeb spojujících oba komplementární řetězce a přechodem dvoušroubovicové struktury v samostatné polydeoxyribonukleotidové řetězce. Takový proces se označuje jako denaturace (tepelná, resp. chemická). Průběh denaturace odráží nukleotidové složení konkrétní molekuly DNA, resp. relativní podíl deoxyribonukleotidových párů G-C v ní. Při tepelné denaturaci obecně platí, že se zvyšujícím se podílem párů G C se zvyšuje teplota denaturace. Příčinou je spojení bází v každém páru G C třemi vodíkovými vazbami, kdežto bází v každém páru A T pouze dvěma vodíkovými vazbami a tudíž tomu odpovídající větší spotřeba energie na rozrušení tří vodíkových vazeb než dvou. Grafickým vyjádřením závislosti míry denaturace na teplotě je sigmoidální křivka. Praktický význam má teplota tání T m (melting temperature) definovaná jako teplota, při které zdenaturuje 50% dvoušroubovicových molekul DNA; poskytuje orientační informaci o složení konkrétní dsdna, uplatňuje se při analýze DNA (např. při přípravě ssdna pro PCR nebo sekvenování), hybridizaci nukleových kyselin, blotingu apod. Je třeba podotknout, že kromě nukleotidového složení DNA závisí T m na řadě dalších faktorů (jako je ph, iontová síla roztoku, přítomnost kationtů). Pominou-li podmínky pro denaturaci dvoušroubovicové DNA (např. povlovným poklesem teploty), mohou se oddělené polynukleotidové řetězce znovu komplementárně spojit a obnovit výchozí dvoušroubovicovou strukturu; takový proces se označuje jako renaturace. Je však třeba upozornit, že stav po renaturaci nemusí být zcela identický s původním stavem molekuly DNA před denaturací; jednou z příčin určité odchylky v těchto případech může být ne zcela důsledné dodržení principu komplementarity v průběhu renaturace. Reverzibilita přechodů z jedné strukturální úrovně DNA na jinou, popsatelná v termínech denaturačně-renaturační kinetiky, se uplatňuje v základních molekulárněgenetických procesech, jakými jsou replikace DNA a transkripce genetické informace a je rovněž využívána v řadě metod (technik) aplikovaných při genových manipulacích. K postižení průběhu denaturace a renaturace DNA a stanovení T m se obvykle používá (1) metoda založená na měření UV absorbance při λ = 260 nm (= absorpční maximum DNA) v závislosti na měnící se teplotě prostředí. Metoda je založena na využití hyperchromního efektu, který se projevuje se zvýšením absorbance při denaturaci dvouřetězcové DNA (viz následující obrázek). 15

17 Obr.: Denaturace DNA a stanovení teploty tání (T m ) na základě UV absorbance Legenda: červená DNA s nižším obsahem párů G C, zelená DNA s vyšším obsahem párů G C; OD 260 absorbance při λ = 260 nm. Zdroj: (2) metoda založená na měření fluorescence DNA značené vhodným fluoroforem (např. SYBR Green I). Fluorescence se při denaturaci dvouřetězcové DNA snižuje (viz následující obrázek). Tato metoda nachází široké využití při hodnocení průběhu amplifikace DNA, realizované metodou PCR v reálném čase (real-time PCR). Obr.: Denaturace DNA a stanovení teploty tání (T m ) na základě měření fluorescence SYBR Green I Zdroj: 16

18 3. TERCIÁRNÍ STRUKTURA Fyzikálně-chemické vlastnosti sekundární struktury lineární i kružnicové DNA typu dvoušroubovice umožňují ještě její další vinutí (nadšroubovicové) do vyššího stupně spiralizace za vzniku nadšroubovice (superhelixu). Přechod šroubovice DNA (sekundární struktura) nadšroubovice (terciární struktura) je reverzibilní; jestliže sekundární struktura nebo primární struktura DNA vznikla relaxací terciární struktury, označuje se jako relaxovaná. Nadšroubovicové vinutí může být dvojího typu: (1) záporné, které se realizuje mechanismem odvíjení řetězců DNA. Toto odvíjení rezultuje v redukci vodíkových vazeb mezi řetězci DNA, což souběžně indukuje pnutí ve dvoušroubovici, které může být uvolněno vytvořením nadšroubovicových závitů (nadšroubovice). Záporné vinutí vede k vytvoření záporných nadšroubovicových závitů a záporné nadšroubovice. Záporným vinutím tak z relaxované kružnicové pravotočivé dsdna vznikne buď pravotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s levotočivými smyčkami; analogicky z relaxované kružnicové levotočivé dsdna vznikne buď levotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s pravotočivými solenoidovými smyčkami. (2) kladné, které se realizuje mechanismem svinování řetězců DNA. Toto svinování rezultuje ve zvětšení počtu závitů ve dvoušroubovici DNA, což souběžně indukuje pnutí ve dvoušroubovici, které může být uvolněno vytvořením nadšroubovicových závitů (nadšroubovice). Kladné vinutí vede k vytvoření kladných nadšroubovicových závitů a kladné nadšroubovice. Kladným vinutím tak z relaxované kružnicové pravotočivé dsdna vznikne buď levotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s pravotočivými solenoidovými smyčkami; analogicky z relaxované kružnicové levotočivé dsdna vznikne pravotočivá nadšroubovice anebo kružnicová dsdna s levotočivými solenoidovými smyčkami. Předpokladem vzniku nadšroubovicového vinutí v lineární molekule dsdna je fixace jejích konců (v případě chromozomů eukaryot k proteinovému lešení). Mechanismus spiralizace dvoušroubovice je pak obdobný jako v případě dsdna a rezultuje v nadšroubovicovou lineární DNA s nadšroubovicovými závity v podobě solenoidových smyček. Z výše uvedeného je zřejmé, že neexistuje pouze jediný, přesně definovaný typ nadšroubovice, ale může se jich vytvářet celá škála. K přesnější charakteristice konkrétní nadšroubovice (molekuly DNA) je možno využít topologické parametry: (l) celkové číslo vinutí (L) udává počet závitů v nadšroubovici, resp. celkový počet překřížení jednoho řetězce DNA druhým v nadšroubovici (2) dvoušroubovicové číslo (T) udává počet závitů v dvoušroubovici, resp. celkový počet překřížení jednoho řetězce druhým v dvoušroubovici (3) nadšroubovicové číslo (W) udává celkový počet nadšroubovicových závitů v nadšroubovici, resp. celkový počet překřížení dvoušroubovice v nadšroubovici. 17

19 Mezi těmito topologickými parametry platí vztah: L = T + W přičemž čísla L a T konvenčně nabývají kladných hodnot (pro pravotočivou dvoušroubovici), číslo W nabývá záporných hodnot pro záporné nadšroubovicové závity (záporná nadšroubovice), kladných hodnot pro kladné nadšroubovicové závity (kladná nadšroubovice), nebo hodnotu 0 pro relaxovanou molekulu DNA. Prostřednictvím uvedeného vztahu můžeme posuzovat stupeň relaxace nebo nadšroubovicového vinutí určité molekuly DNA. K tomu lze rovněž využít komparace konkrétní hodnoty celkového čísla vinutí L s hodnotou celkového čísla vinutí L 0 udanou pro úplně relaxovanou molekulu DNA za daných podmínek. Obecně platí: je-li L = T (W = 0), jedná se o relaxovanou molekulu; je-li L < T, jedná se o zápornou nadšroubovici; je-li L > T, jedná se o kladnou nadšroubovici. Molekuly DNA, které se navzájem liší celkovým číslem vinutí L a molekuly DNA, jejichž celkové číslo vinutí L L 0, se označují jako topologické izomery. Na topologických proměnách molekul DNA (kladných i záporných nadšroubovic) participují topoizomerázy. Tyto enzymy jsou přítomny v buňkách prokaryotických i eukaryotických organismů. Podle mechanismu, kterým se realizuje změna celkového čísla vinutí dsdna, jsou klasifikovány do dvou základních skupin: Topoizomerázy I katalyzují v nadšroubovicové DNA přenos intaktního řetězce přes zlom ve druhém řetězci. Projevem jejich účinku na kružnicovou ssdna může být též vznik uzlů tím, že se volné konce v místě zlomu polydeoxyribonukleotidového řetězce provléknou a znovu spojí; proces vzniku uzlů se označuje jako zauzlení. Topoizomerázy II katalyzují přenos intaktní dsdna přes zlomy obou řetězců dvoušroubovice. U kružnicových dsdna mohou vést k vytvoření katenanů tím, že mezi dvěma či více takovými molekulami DNA katalyzují jejich vzájemné provlečení volnými konci v místech zlomů deoxyribonukleotidových řetězců, následované restitucí zlomů; proces vzniku katenanů se označuje jako katenace. Na doplnění: DNA supercoiling. 18

20 Obr.: Schéma vzniku terciární struktury DNA a katenanů Zdroj: Obr.: EM snímky DNA relaxované (první vlevo) a nadšroubovicové (ostatní) Zdroj: 19

21 I.1.2 CHROMATIN Chromatin je komplex dsdna a proteinů tvořící významnou složku buněčného jádra (chromozomů) eukaryot. Stav chromatinu se dynamicky mění v průběhu celého buněčného cyklu. Tyto změny se cytologicky projevují rozdílným stupněm spiralizace (kondenzace) chromatinových vláken (resp. chromozomů), který úzce souvisí především s realizací základních genetických procesů v buněčném jádru (replikace, transkripce), s karyokinezí, cytokinezí a s procesy diferenciace buněk. Elementární stavební jednotkou chromatinu je nukleozom; sestává z oktameru histonů (H2A, H2B, H3, H4), úseku DNA obtáčející histonový oktamer (necelé dva závity, délka přibližně 200 bp) a histonu H1, který není součástí histonového oktameru, ale z vnější strany se napojuje na koncové oblasti úseku DNA obtáčející histonový oktamer. Oktamer histonů je v úseku nukleozomu uspořádán jako soubor tetrameru (H3) 2 -(H4) 2 a dvou dimerů (H2A- H2B) 2. Z nukleozomu lze enzymaticky uvolnit histon H1 (při částečné degradaci DNA); vzniklý útvar se označuje jako jádro nukleozomu (= histonový oktamer + úsek DNA, která ho obtáčí). Obr.: Schéma struktury nukleozomu. Zdroj: Zpravidla se vymezují tři organizační úrovně chromatinu odpovídající třem stupňům jeho spiralizace: (1) nukleozomové řetězce (10 nm vlákno) Nukleozomový řetězec je tvořen souborem jader nukleozomů spojených molekulou lineární dsdna. Průměr tohoto řetězce je přibližně 10 nm a proto se též označuje jako 10 nm chromatinové vlákno; je typické pro interfázní buněčné jádro, představuje nejvyšší stupeň despiralizace chromozomů a strukturu, která umožňuje replikaci DNA i transkripci genetické informace. 20

22 (2) solenoid (30 nm vlákno) Na vzniku solenoidu participuje histon H1. Každá zúčastněná molekula histonu H1 se z vnější strany jedním svým fibrilárním koncem napojí na oktamer histonů jednoho nukleozomu v místě výstupu úseku DNA, která ho obtáčí a svou globulární (hydrofobní) částí na specifická místa úseku DNA, která leží mezi oběma sousedními nukleozomy (resp. jádry nukleozomů) nukleozomového řetězce. V důsledku takového připojení histonu H1 dochází k přiblížení a spiralizaci nukleozomů v nukleozomovém řetězci za vzniku solenoidu, ve kterém na jeden závit připadá šest nukleozomů. Průměr solenoidu je přibližně 30 nm a proto se též označuje jako 30 nm vlákno; toto vlákno se váže na tzv. proteinové lešení oblastí DNA označovanou jako SAR (scaffold attachment region), kdežto ostatní úseky DNA jsou uspořádány ve formě smyček jako tzv. chromatinové domény. Proteinové lešení je tvořeno řadou proteinů převážně nehistonového typu, které plní významné biologické funkce (např. polymerázy, topoizomerázy, proteiny HMG, některé transkripční faktory). 30 nm vlákno je útvarem, který umožňuje transkripci genetické informace v chromatinových doménách; vyskytuje se v interfázním jádře a v časných stadiích profáze. Histon H1, kromě zřejmě nezastupitelné funkce při formování solenoidu (spiralizaci nukleozomového řetězce), plní též funkci ochrany DNA před účinkem nukleáz. Histony nukleozonů mohou být modifikovány. Tyto modifikace se významně uplatňují při expresi genetické informace, včetně epigenetických procesů. Obr.: Modifikace nukleozomových histonů Zdroj: 21

23 (3) mitotický chromozom ( nm vlákno) Postupnou kondenzací 30 nm vláken v průběhu mitózy se vytvářejí nm chromatinová vlákna (chromatidy), charakteristická zejména pro metafázní chromozomy, v nichž stupeň spiralizace dosahuje maxima. Toto uspořádání chromatinu již neumožňuje replikaci DNA, ani transkripci genetické informace. Obr.: Schéma složení a uspořádání chromatinu Zdroj: 22

24 Chromatin chromozomů eukaryotických organismů lze rozdělit do dvou kategorií: (1) euchromatin je to chromatin dekondenzovaný, transkripčně aktivní (2) heterochromatin je to chromatin kondenzovaný, transkripčně inaktivní Heterochromatin, který je v některých částech chromozomů (telomery, centromery) obsažen trvale (tj. po celý buněčný cyklus, ve všech buňkách a ve všech ontogenetických stadiích) se označuje jako konstitutivní. Heterochromatin, který se v závislosti na stadiu ontogenetického vývoje může stát euchromatinem (a naopak), se označuje jako fakultativní. Molekulární mechanizmy přechodu chromatinu ze stavu heterochromatinového do stavu euchromatinového a ze stavu euchromatinového do stavu heterochromatinového je možné považovat za bazální mechanismy plnící zřejmě nezastupitelnou roli při realizaci diferenciačních a specializačních procesů v ontogenezi každého jedince. Právě jejich působením lze přijatelně vysvětlit časoprostorově přesně vymezené zapínání a vypínání zcela určitých genových oblastí v průběhu ontogenetického vývoje, resp. funkční zapojení pouze specifické množiny genů z komplexního (zpravidla diploidního) buněčného genomu v diferencované tkáni nebo orgánu mnohobuněčného organismu. Obr.: Rozdíly mezi euchromatinem a heterochromatinem Legenda: barevné značky označují místa modifikace histonů: žlutá metylace (CpG), zelená fosforylace (serin/treonin), modrá metylace lyzinu, fialová acetylace lyzinu, oranžová ubikvitinace (lyzinu), černá vlnovka molekuly nekódujících RNA (ncrna). Zdroj: 23

25 Obr.: Celkové schéma organizace chromozomu Zdroj: 24

26 I.1.3 POLYMORFIZMUS DNA Typy sekvencí DNA 1. Jedinečné sekvence tvoří převážně kódující DNA, nekódující DNA představuje pouze minoritní část. V lidském genomu činí méně než 5 % DNA. 2. Repetitivní sekvence jsou různě dlouhé sekvence DNA, které se v genomu vyskytují v mnoha kopiích a většinou nejsou transkribovány. Klasifikují se do dvou velkých skupin (tandemové repetice a rozptýlené repetice) a uvnitř každé z nich se rozlišují další skupiny: A. Tandemové repetice - jsou to úseky lineárně uspořádaných opakujících se sekvencí DNA a) satelitní DNA tvoří úseky DNA o celkové velikosti až několika Mb, sestávající z opakujících se repetitivních jednotek o rozsahu 20 bp řádově 10 3 bp. Nachází se zejména v oblasti centromer. Satelitní DNA se od ostatní DNA liší obsahem párů G+C a lze ji proto lze izolovat a detekovat ultracentrifugací v hustotním gradientu CsCl, kde představuje minoritní frakci (viz obrázek níže). Obr.: Detekce satelitní DNA po ultracentrifugami v hustotním gradientu CsCl. Zdroje: (obr. vlevo) (obr. vpravo) b) minisatelitní DNA tvoří úseky DNA o délce bp, které většinou nejsou transkribovány. Je charakteristická např. pro oblasti telomer. Obr.: Telomerní DNA. Zdroj: 25

27 c) mikrosatelitní DNA (viz obrázek níže) je nejčastější typ repetitivních, vysoce polymorfních sekvencí (cca 0,5% lidského genomu), sestávajících z úseků DNA o délce 1 10 bp (nejčastěji 2 3 bp) s různou lokalizací na chromozomech (avšak převážně v nekódujících oblastech a v intronech). Nejfrekventovanější dinukleotidové sekvence jsou (CA) n, resp. (TG) n na komplementárním řetězci; z mononukleotidových sekvencích se častěji vyskytuje A a T, než G a C. Počet mikrosatelitních repeticí v lidském genomu se odhaduje na Počet a struktura mikrosatelitních repeticí v konkrétní chromozomové oblasti je vysoce polymorfním znakem v populaci, avšak individuálně charakteristickým znakem, v zásadě neměnným v průběhu celého života jedince; z tohoto důvodu jsou mikrosatelitní repetice vhodným nástrojem (markerem) individuální identifikace biologického materiálu. Obr.: Mikrosatelitní DNA. Zdroj: B. Rozptýlené repetice DNA se vyskytují rozptýleně na různých místech genomu. Podle délky repetitivní jednotky je lze rozdělit do následujících skupin: a) SINE (Short Interspersed Nuclear Elements = krátké rozptýlené sekvence) jsou tvořeny repetitivními jednotkami, čítajícícmi kolem 300 bp. Jejich strukturu tvoří segmenty s vysokým zastoupením CG, oddělené segmenty s vysokým obsahem A. V lidském genomu se SINE vyskytují v počtu kolem ; mezi ně patří Alu-sekvence, které obsahují restrikční místo pro restriktázu AluI. Obr.: Schéma SINE v genomu. Zdroj: 26

28 b) LINE (Long Interspersed Nuclear Elements dlouhé rozptýlené repetice) jsou sekvence o délce kolem bp a více s vysokých obsahem A na 3 -konci. V lidském genomu se počet jejich kopií pohybuje mezi Obr.: Schéma LINE v genomu. Zdroj. Podrobná klasifikace repetitivní DNA je na následujícím obrázku: Obr.: Klasifikace repetitivní DNA Zdroj: 27

29 Hlavní příčinou polymorfizmu DNA jsou mutace, které nenarušují (nebo alespoň ne významně) reprodukční zdatnost nositele mutantního genotypu a mohou být proto předávány do další generace. O polymorfizmu se hovoří zpravidla tehdy, jestliže relativní četnost nové (mutantní) alely v populaci je alespoň 0,01. Většina genomové DNA eukaryot se obvykle nachází v nekódujících oblastech a proto v zásadě mutace v ní vzniklé nejsou selektovány, resp. jsou pod mírným selekčním tlakem. To je zřejmě příčinou častého výskytu interindividuálních rozdílů v délce a struktuře (většinou jednoduchých substitucí bází) těchto sekvencí DNA. Detekce a analýza variací v nukleotidové sekvenci DNA se významně uplatňuje například k identifikačním účelům ve forenzní genetice nebo v molekulárně genetické diagnostice dědičných chorob. Celkový klasifikační přehled typů DNA v eukaryotické buňce je uveden na následujícím schématu: Zdroj: Na doplnění: %C5%99%C3%AD%C4%8Diny Populační polymorfizmy a jejich příčiny. C5%99et%C4%9Bzc%C5%AF Polymorfizmus konformace jednoduchých řetězců. %ADch_fragment%C5%AF RFLP. 28

30 I.1.4 KYSELINY RIBONUKLEOVÉ - RNA Základní údaje o stavbě ribonukleových kyselin byly již uvedeny. Na tomto místě pouze připomeneme, že RNA může sestávat z jednoho nebo dvou polyribonukleotidových řetězců. Základními stavebními jednotkami RNA jsou ribonukleotidy (AMP, GMP, UMP, CMP) spojené fosfodiesterovou vazbou mezi atomy C3 a C5 dvou sousedních zbytků ribózy. Dusíkaté báze vytvářejí v dvouřetězcových molekulách RNA (resp. v dvouřetězcových úsecích molekul RNA) podle Watsonova - Crickova pravidla platného pro RNA komplementární páry, spojené vodíkovými vazbami (tedy páry A = U se dvěma vodíkovými vazbami a G C se třemi vodíkovými vazbami). Na základě principu komplementarity bází mohou vznikat hybridní molekuly mezi různými molekulami RNA ( hybrid RNA RNA), nebo mezi molekulou DNA a molekulou RNA ( hybrid DNA RNA). V buňkách prokaryot i eukaryot se vyskytují tři základní druhy RNA: mediátorová (informační) ribonukleová kyselina (mrna), ribozomová nukleová kyselina (rrna) a transferová ribonukleová kyselina (trna). RNA se může vyskytovat na třech strukturních úrovních: primární, sekundární, terciární. Primární strukturou RNA se rozumí sekvence ribonukleotidů v polyribonukleotidovém řetězci RNA. Sekundární struktura vzniká vytvořením dvouřetězcové molekuly RNA, resp. dvouřetězcových úseků v molekule RNA. Dalšími interakcemi mezi určitými oblastmi molekuly může vzniknout i struktura terciární, která je mnohdy nezbytná pro plnění biologické funkce příslušné makromolekuly. Jednotlivé základní druhy RNA vytvářejí různé typy sekundární a terciární struktury, v nichž se odráží zejména odlišný způsob syntézy a funkcí mrna, rrna a trna v buňce. Všechny základní druhy RNA se podílejí na realizaci (expresi) genetické informace, každý z nich specifickým způsobem. Kromě toho u RNA-organismů (RNA-viry) je RNA nositelkou genetické informace, zakódované v její primární struktuře. I MEDIÁTOROVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA mrna Mediátorová ribonukleová kyselina (mrna = messenger RNA, dříve též informační ribonukleová kyselina = irna) se syntetizuje v průběhu přepisu (transkripce) genetické informace podle matričního řetězce (templátu) DNA, příp. RNA (u některých RNA-virů). U prokaryotických organismů je produktem transkripce (tzv. primární transkript) přímo mrna, která je bezprostředně transportována (obvykle ještě před dokončením transkripce) na ribozomy (resp. polyribozom), kde se podílí na překladu (translaci) genetické informace z formy sekvence ribonukleotidů do formy sekvence aminokyselin (tj. do primární struktury) polypeptidového řetězce (proteinu) jednoznačně určené právě sekvencí ribonukleotidů mrna. U eukaryot bývá primárním transkriptem zpravidla premediátorová RNA (pre-mrna), která je posttranskripčně upravována. Chemické úpravy na jejích koncích (čepička na 5 - konci, polyadenylace na 3 - konci) souvisejí se stabilizací molekuly RNA, jejím transportem do cytoplazmy a částečnou ochranou před účinkem ribonukleáz (v buňce je mrna účinně enzymaticky hydrolyzována ribonukleázami; proto je její životnost většinou časově omezená a podíl na celkovém obsahu RNA velmi nízký). Sestřihem mohou být 29

31 z molekuly pre-mrna odstraněny určité úseky (tzv. introny), které se nepřekládají (netranslatují) do primární struktury polypeptidového řetězce. mrna je tedy tím druhem RNA, který vzniká transkripcí strukturních genů (tj. genů kódujících primární strukturu určitého polypeptidového řetězce či proteinu) a v průběhu translace plní funkci matrice při biosyntéze polypeptidového řetězce na ribozomu. I TRANSFEROVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA trna V buňce neexistuje pouze jeden typ transferové RNA, ale více. Teoreticky musí být přítomen minimálně jeden typ trna pro každou ze souboru 20 (resp. 21 včetně selenocysteinu) standardních aminokyselin, avšak ve skutečnosti je jednotlivých typů trna v buňce ještě více. Přes tuto různorodost existují obecné zákonitosti ve struktuře jednotlivých typů trna. Všechny molekuly trna sestávají z poměrně krátkých ribonukleotidových řetězců (kolem ribonukleotidů) a jejich relativní molekulová hmotnost je tudíž poměrně malá (kolem ). Kromě standardních bází (A, G, U, C) trna obsahují ještě několik nestandardních bází rezultujících z enzymatických modifikací již nasyntetizovaného polyribonukleotidu: jsou to pseudouridin, dihydrouridin, hypoxantin, inozin, ribotymidin, tiouridin, 5-metyl-2-tiouracyl, 1-metylguanozin, quenozin, N 6 - izopentenyladenozin, kyselina uracyl-5-octová nebo její metylester. Velká část polyribonukleotidového řetězce trna obsahuje komplementární báze a proto trna vytvářejí sekundární strukturu, která má charakteristickou podobu jetelového listu. Tento útvar sestává ze čtyř hlavních ramen (akceptorové, pseudouridinové, antikodonové, dihydrouridinové) a jedné variabilní smyčky (dlouhé nebo krátké). Akceptorové rameno zahrnuje 5 - i 3 -konec, přičemž přes OH-skupinu C2 nebo C3 zbytku ribózy AMP koncové sekvence CCA na 3 -konci se váže příslušná aminokyselina. Pseudouridinové rameno (TψC) vytváří smyčku obsahující pseudouridin. Dihydrouridinové rameno (DHU) vytváří smyčku obsahující dihydrouridin. Antikodonové rameno vytváří smyčku, ve které je lokalizován antikodon, což je triplet komplementární k příslušnému tripletu (kodonu) mrna. Variabilní smyčka se nachází mezi pseudouridinovým a antikodonovým ramenem; podle délky této smyčky (vyjádřené počtem ribonukleotidů, z nichž sestává) se trna dělí na dvě skupiny: na trna první třídy (s krátkou variabilní smyčkou) a trna druhé třídy (s dlouhou variabilní smyčkou). Četnými interakcemi a především vlivem vodíkových vazeb mezi bázemi ribonukleotidů smyčky dihydrouridinového ramena a variabilní smyčky se formuje terciární struktura trna. Tato struktura se uplatňuje, mimo jiné, při realizaci proteosyntézy na ribozomech. trna vznikají přepisem genů pro trna. 30

32 Obr.: Schéma sekundární struktury trna Zdroj: Obr.: Model terciární struktury trna. Zdroj: 31

33 I RIBOZOMÁLNÍ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA rrna Rovněž ribozomální ribonukleová kyselina existuje ve více typech, které vznikají přepisem (transkripcí) genů pro rrna, lokalizovaných většinou v jadérku. Zpravidla se charakterizují hodnotou sedimentační konstanty. Jednotlivé typy rrna se podílejí především na stavbě ribozomů a spoluúčastní se procesů, které se na nich realizují (proteosyntéza). Pokud se týče prokaryotických ribozomů (70S), jejich malá podjednotka (30S) obsahuje 16S rrna, velká podjednotka (50S) obsahuje 23S a 5S rrna. Eukaryotické ribozomy (80S) v malé podjednotce (40S) obsahují 18S rrna, ve velké podjednotce (60S) obsahují 28S, 5.8S a 5S rrna (viz obrázek). Obr.: Schéma struktury prokaryotického a eukaryotického ribozomu. Zdroj: 32

34 II. GENETICKÁ INFORMACE A GENETICKÝ KÓD Jak již bylo uvedeno výše, termínem genetická informace se rozumí informace determinovaná sekvencí deoxyribonukleotidů v DNA (resp. ribonukleotidů v RNA u RNAorganizmů) o primární struktuře proteinů, o primární struktuře trna a rrna (obecně funkčních RNA), o vazbě specifických proteinů k molekule DNA (resp. RNA) a v případě RNA-organizmů též o primární struktuře DNA. Mezi významné vlastnosti genetické informace patří vysoká stabilita, vysoký stupeň specifičnosti v rámci druhu, schopnost téměř bezchybné autoreprodukce (replikace) a přenosu směrem vertikálním (z generace na generaci) i horizontálním (např. při konjugaci, transdukci, transformaci nebo mitotickém dělení buněk mnohobuněčného organizmu); tyto vlastnosti jsou nezbytné pro zachování evolvovaných struktur a funkcí uspořádaných otevřených systémů, jakými organizmy na jakékoli úrovni fylogenetického vývoje jsou. Zároveň je však nukleovým kyselinám vlastní možnost změny nukleotidové sekvence (mutabilita) rezultující v adekvátní změnu genetické informace (mutace); mutabilita v nejobecnější rovině prezentuje další základní vlastnost DNA, jejímž prostřednictvím se vytváří nový materiál pro biologickou evoluci. Genetickou informaci lze charakterizovat jako vnitřně rozpornou, protikladnou: na jedné straně se projevuje jako konzervativní tím, že se reprodukuje, přenáší a exprimuje v nezměněné podobě (smyslu), na straně druhé se projevuje jako progresivní tím, že může být pozměněna následkem změny struktury jejího materiálního substrátu (DNA, resp. RNA) a ve změněné podobě, není-li tato ve svých důsledcích letální, následně zakonzervována. Je třeba podotknout, že ve způsobu řešení této dialektické rozpornosti genetické informace v interakci s faktory prostředí (environmentu) spočívají základní zákonitosti vývoje ve smyslu fylogenetickém i ontogenetickém. Uvědomění si a pochopení nerozlučitelnosti momentu konzervativního a progresivního při jejich současně relativní protikladnosti v případě genetické informace (resp. struktury nukleových kyselin) je východiskem pro pochopení vzájemnosti (vzájemné podmíněnosti a souvislosti) dědičnosti a proměnlivosti organizmů, respektive pro pochopení jednoty základních principů darwinizmu a mendelizmu. Je-li genetická informace obsažena v sekvenci nukleotidů DNA (popř. RNA) a determinuje-li tato sekvence nukleotidů sekvenci aminokyselin v polypeptidových řetězcích proteinů, pak je třeba se ptát: Jaký je vztah (kvantitativní i kvalitativní) mezi těmito dvěma kategoriemi sekvencí? Jak je genetická informace zakódována? Jaké jsou vlastnosti genetického kódu? Jak se genetická informace uchovává, jak se přenáší, jaký je její vnější (fenotypový) projev? Pokusme se tyto otázky zodpovědět. V polydeoxyribonukleotidových řetězcích DNA je jedinou reálnou variabilní komponentou jejich struktury pořadí (sekvence) deoxyribonukleotidů (zkráceně bází); jednotky deoxyribózafosfátové kostry jsou uniformní. Z definice genetické informace vyplývá, že soubor variant o určitém počtu nukleotidů determinuje soubor dvaceti (příp. jednadvaceti) standardních aminokyselin zabudovávaných při proteosyntéze do polypeptidových řetězců proteinů. Za předpokladu, že jedna báze DNA (A, G, T nebo C) určuje právě jednu aminokyselinu v polypeptidovém řetězci, byly by takto jednoznačně určeny pouze čtyři aminokyseliny, neboť jejich počet by byl dán počtem variací s 33

35 opakováním k-té třídy z n-prvků V k (n) = 4 1 = 4. Za předpokladu, že jednu aminokyselinu v polypeptidovém řetězci jednoznačně determinuje dvojice bází, pak by mohlo být determinováno 16 aminokyselin, neboť celkový počet variací s opakováním by v tomto případě byl V k (n) = 4 2 = 16. V obou uvažovaných případech je počet variací s opakováním nižší než počet standardních aminokyselin a proto předpoklady, že k jednoznačnému určení každé ze souboru standardních aminokyselin je postačující jedna báze nebo dvojice bází DNA, zamítáme. Za vyhovující lze přijmout až předpoklad, že každá ze souboru standardních aminokyselin je determinována trojicí bází; v tomto případě by počet variací s opakováním byl V k (n) = 4 3 = 64. Na základě takovéto deduktivní úvahy byla Watsonem a Crickem odvozena jedna ze základních vlastností genetického kódu, která byla experimentálně mnohokrát potvrzena: genetický kód je tripletový, to znamená, že je sestaven z třínukleotidových sekvenčních jednotek (z nichž každá determinuje určitou standardní aminokyselinu, anebo plní jinou funkci). Vzhledem k tomu, že počet možných variací tripletů za účasti čtyř různých bází je 64, lze připustit, že některé aminokyseliny jsou kódovány jednou variantou tripletu, jiné více variantami tripletů a že některé varianty tripletů nemusejí kódovat žádnou aminokyselinu. Experimentálně byly tyto předpoklady plně potvrzeny. Skutečnost, že některé varianty tripletů mohou kódovat stejný druh aminokyseliny a současně některé varianty tripletů nekódují žádnou aminokyselinu, se označuje jako degenerace genetického kódu a proto je genetický kód označován jako degenerovaný. Genetická informace se exprimuje prostřednictvím transkripce (přepisu) a translace (překladu). Transkripcí strukturních genů vzniká jako konečný produkt mrna, jejíž sekvence ribonukleotidů je komplementární (podle pravidla o párování bází) k sekvenci deoxyribonukleotidů toho řetězce DNA, který plnil funkci templátu (matrice). Triplety mrna jsou označovány jako kodony. O kodonech mrna, které determinují aminokyseliny v polypeptidovém řetězci říkáme, že mají smysl, kdežto o kodonech, které nekódují žádnou aminokyselinu, říkáme, že jsou nesmyslné nebo beze smyslu (nonsens); nesmyslné kodony signalizují začátek (iniciační kodon AUG) nebo konec syntézy polypeptidového řetězce (terminační kodony UAA, UAG, UGA). Při translaci (překladu genetické informace) se s jednotlivými kodony, jejichž pořadí v molekule mrna determinuje pořadí aminokyselin v konkrétním polypeptidovém řetězci, dočasně komplementárně spojují příslušné druhy trna takzvanými antikodony, tj. triplety lokalizovanými v jejich antikodonovém rameni. Každá trna, která se účastní procesu translace na ribozomu, má na svém akceptorovém rameni navázánu molekulu aminokyseliny odpovídající danému kodonu. Lineárním řazením jednotlivých molekul trna (s navázanými aminokyselinami) komplementárně k sekvenci ribonukleotidů mrna jsou při translaci vytvořeny na ribozomu podmínky pro vznik peptidové vazby mezi karboxylovou skupinou jedné aminokyseliny a aminoskupinou sousední (následující) aminokyseliny. Vzájemným uspořádáním molekul mrna, trna s navázanými aminokyselinami a specifických oblastí ribozomů je umožněna translace jako základní mechanizmus proteosyntézy. Genetický kód (tvořený celkem 64 kodony) tedy můžeme definovat jako systém pravidel, podle nichž jednotlivé kodony mrna určují řazení aminokyselin do polypeptidu. Standardní genetický kód je přehledně uveden v následující tabulce: 34

36 první ribonukleotid kodonu U C A G druhý ribonukleotid kodonu U C A G první ribonukleotid kodonu Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser Term. Term. (SeCys) A Leu Ser Term. Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Inic. /Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Zdroj: 35

37 Aminokyseliny kódované šesti různými kodony: arginin (Arg) CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG leucin (Leu) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG serin (Ser): UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Aminokyseliny kódované čtyřmi různými kodony: alanin (Ala) GCU, GCC, GCA, GCG glycin (Gly) GGU, GGC, GGA, GGG prolin (Pro) CCU, CCC, CCA, CCG treonin (Thr) ACU, ACC, ACA, ACG valin (Val) GUU, GUC, GUA, GUG Aminokyseliny kódované třemi různými kodony: izoleucin (Ile) AUU, AUC, AUA Aminokyseliny kódované dvěma různými kodony: asparagin (Asn) AAU, AAC tyrozin (Tyr) UAU, UAC cystein (Cys) UGU, UGC fenylalanin (Phe) UUU, UUC glutamin (Gln) CAA, CAG histidin (His) CAU, CAC kys. asparagová (Asp) GAU, GAC kys. glutamová (Glu) GAA, GAG lyzin (Lys) AAA, AAG Aminokyseliny kódované jedním typem kodonu: metionin (Met) AUG (též kodon iniciační) tryptofan (Trp) UGG selenocystein (Secys) UGA (též kodon terminační) Odlišné kodony se stejným smyslem jsou kodony synonymní a jak je patrné z tabulky standardního genetického kódu, je jich většina. Z nich ty, které se liší pouze ribonukleotidem ve třetí pozici, vytvářejí tzv. kodonovou rodinu. Některé další synonymní kodony lze seskupit do tzv. dvoukodonových sad, přičemž každá dvoukodonová sada sestává ze dvou synonymních kodonů, z nichž jeden má ve třetí pozici G a druhý A, anebo jeden má ve třetí pozici C a druhý U. Kodony nesmyslné lze z hlediska jejich funkce rozdělit do dvou skupin, z nichž jednu představují kodony terminační (UAA, UAG, UGA) a druhou skupinu představuje jeden kodon iniciační (AUG). Zde je však třeba poznamenat, že některé z těchto kodonů jsou bifunkční; jedná se o iniciační kodon AUG, který jednak signalizuje začátek syntézy 36

38 polypeptidového řetězce, jednak kóduje aminokyselinu metionin, a o terminační kodon UGA, který jednak signalizuje ukončení syntézy polypeptidového řetězce, jednak může kódovat aminokyselinu selenocystein. Při podrobnější analýze tabulky standardního genetického kódu je možno všech 64 variant kodonů rozdělit do těchto skupin: 8 kodonových rodin, 13 dvoukodonových sad (5 typu GA, 8 typu CU), 1 bifunkční iniciační kodon, 3 terminační kodony (z nichž 1 je bifunkční), 1 nesynonymní kodon (UGG pro tryptofan) a 1 kodon (AUA) pro izoleucin. Při vytváření vazby kodonu s antikodonem se neuplatňuje vždy Watsonovo-Crickovo pravidlo o párování bází zcela důsledně. Je-li totiž v prvním ribonukleotidu antikodonu guanin, může se párovat s uracylem nebo cytozinem ribonukleotidu ve třetí pozici kodonu; jeli v prvním ribonukleotidu antikodonu uracyl, může se párovat s adeninem nebo guaninem ribonukleotidu ve třetí pozici kodonu, případně je-li v prvním ribonukleotidu antikodonu hypoxantin, může se párovat s adeninem, uracylem nebo cytozinem ribonukleotidu ve třetí pozici. Tento jev se označuje jako kolísavé párování bází. V jeho důsledku může být počet molekulárních typů trna, postačujících k syntéze polypeptidových řetězců za využití souboru dvaceti různých aminokyselin, zredukován až na 32 (včetně iniciační trna ) z 61, jichž by bylo zapotřebí v případě striktního uplatnění pravidla o párování bází. Smysl jednotlivých kodonů je ve všech organizmech shodný (až na nečetné výjimky týkající se především odchylek v mitochondriálním genetickém kódu). Genetický kód (či přesněji standardní genetický kód, uvedený v tabulce) lze tudíž považovat za univerzální. Shrneme-li výše uvedené informace, můžeme konstatovat tři charakteristické znaky genetického kódu: je tripletový, degenerovaný a univerzální. 37

39 III. KONCEPCE GENU Genetická informace je strukturně a funkčně diferencovaná. Její základní jednotkou je gen. Gen lze definovat jako určitý úsek molekuly DNA (resp. RNA u RNA-virů), který obsahuje informaci o primární struktuře určitého polypeptidu (proteinu), trna, rrna, nebo o vazbě specifických molekul proteinů k molekule DNA. Geny, které kódují primární strukturu nějakého polypeptidu jako produktu translace, se označují jako geny strukturní. Geny, které kódují primární strukturu funkčních trna a rrna, tedy molekul RNA, které nejsou translatovány, se označují jako geny pro funkční RNA. Geny, které obsahují informaci nutnou pro rozpoznání specifickým proteinem, jsou označovány jako geny (nebo oblasti) regulační. Expresí genetické informace strukturních genů a genů pro funkční RNA vznikají určité vlastní produkty těchto genů (polypeptidy), kdežto expresí regulačních genů žádný vlastní produkt nevzniká. Vzhledem k tomu, že nukleotidy v řetězcích DNA (resp. RNA) jsou uspořádány lineárně, jsou též jednotlivé geny řazeny lineárně. Pořadí genů je, nebereme-li v úvahu mutační změny, konstantní a specifické pro každý druh. Jak víme, DNA jako nositelka genetické informace interaguje v eukaryotických buňkách s dalšími buněčnými komponentami. Mohou tak vznikat složitější struktury, které obsahují DNA s lineárně seřazenými geny; takové struktury se nazývají genofory. Genoforem RNA-virů je pouze vlastní RNA, genoforem DNA-virů nebo prokaryotické buňky je pouze vlastní DNA. V těchto případech se zpravidla jedná o jednu kružnicovou molekulu DNA, která je u virů obklopena kapsidem a u prokaryot lokalizovaná volně v prostředí cytoplazmy, neboť buněčné jádro v morfologickém slova smyslu se v buňkách těchto organizmů nevyskytuje; útvar jemu odpovídající se označuje jako nukleoid a sám genofor jako bakteriální (resp. prokaryotický) chromozom. Typickým genoforem eukaryotických buněk je chromozom, který představuje nukleohistonový komplex, lokalizovaný v morfologicky vyvinutém buněčném jádru. Každé jádro eukaryotické buňky obsahuje (za normálního stavu) konstantní počet morfologicky specificky individualizovaných chromozomů; to znamená, že celková genetická informace je v buněčném jádru rozdělena a to zcela striktně do několika (minimálně dvou) částí, reprezentovaných jednotlivými chromozomy (minimálně jedním párem chromozomů jako je tomu např. u škrkavky). V eukaryotických buňkách je genetická informace lokalizována nejen v buněčném jádru, ale též v dalších organelách: v mitochondriích buněk rostlin, hub i živočichů a v chloroplastech buněk rostlin. Ani u bakterií není jediným genoforem veškeré genetické informace bakteriální chromozom; kromě něho může být v jejich cytoplazmě přítomna jedna nebo více kružnicových molekul vytvářejících útvary, označované jako plazmidy. Společnou vlastností plazmidové, chloroplastové a mitochondriální DNA je relativní nezávislost (autonomie) na buněčném jádru (jaderném genomu), resp. nukleoidu. 38

40 Soubor veškeré genetické informace (všech genů) v buňce nebo ve virové částici se označuje jako genom. V eukaryotických buňkách je jeho převážná část umístěna v buněčném jádru a reprezentuje tzv. jaderný genom. Výrazně menší část genomu je umístěna jednak v mitochondriích a reprezentuje mitochondriální genom, jednak u rostlin ještě v chloroplastech, kde reprezentuje chloroplastový genom. Mitochondriální a chloroplastový genom bývají někdy označovány jako mimojaderný, extranukleární nebo cytoplazmatický genom. Analogicky u bakterií tvoří hlavní část genomu bakteriální chromozom (resp. nukleoid), kdežto menší část genomu tvoří plazmidová DNA. Mezi jednotlivými složkami genomu buňky existují vzájemné vztahy při současném zachování jejich relativní samostatnosti (autonomie). Genom buňky jako celek je tedy vnitřně strukturovaný, diferencovaný a organizovaný. Počet kopií jaderných genoforů v buňce vyjadřuje stupeň ploidie. Ve virových částicích a v prokaryotických (bakteriálních) buňkách funkci genoforu plní zpravidla pouze jedna molekula DNA (příp. RNA u RNA-virů); takové organizmy označujeme jako haploidní. Eukaryotické somatické buňky obsahují větší počet chromozomů v párovém uspořádání; takové buňky označujeme jako diploidní. Eukaryotické gametické buňky (gamety), vznikající jako produkt redukčního dělení (meiózy), obsahují poloviční počet chromozomů buněk somatických (diplodních), tj. po jednom členu od každého páru homologických chromozomů, a označujeme je jako haploidní. Každý jednotlivý genofor je charakterizován určitou uspořádanou množinou genů, která se označuje jako vazbová skupina. Chromozomy se shodnými vazbovými skupinami jsou nazývány homologické, chromozomy s odlišnými vazbovými skupinami se nazývají nehomologické. Homologické chromozomy v eukaryotických diplodních (somatických) buňkách vytvářejí homologické páry, tj. páry chromozomů se shodnou sadou genů uspořádaných ve shodném pořadí a shodně umístěných. U gonochoristů se vyskytují tzv. pohlavní chromozomy neboli gonozomy (též heterochromozomy či sex-chromozomy), přičemž pár homologických chromozomů primárně determinuje vznik jednoho pohlaví a pár nehomologických (resp. částečně homologických) chromozomů primárně determinuje vznik opačného pohlaví. Všechny ostatní chromozomy, kromě gonozomů, se vyskytují v diploidních buňkách důsledně jako páry homologických chromozomů. Počet vazbových skupin v diploidní eukaryotické buňce je obecně roven počtu párů homologických chromozomů. Místo, na kterém je daný gen na chromozomu lokalizován, se nazývá lokus. Každý gen se vyskytuje zpravidla alespoň ve dvou formách, které označujeme jako alely (Pozn.: Je třeba podotknout, že existují i geny, od kterých známe zatím pouze jednu variantu, tedy jednu alelu, avšak na druhé straně jsou známy celé alelové série u některých genů). Protože gen představuje určitý úsek molekuly DNA (resp. RNA u RNA-virů), je zřejmé, že jednotlivé alely se v tomto úseku liší sekvencí nukleotidů (tedy primární strukturou). Alely, které vedou k syntéze příslušného genového produktu jsou alely dominantní, alely, které jsou v tomto smyslu neaktivní, jsou alely recesivní. Alely dominantní označujeme podle dohody obvykle velkými písmeny (např. A, B), alely recesivní malými písmeny (např. a, b). Alely, které jsou v přírodních populacích zastoupeny nejvíce (obvykle alely dominantní), jsou považovány za alely standardní (též divoké) a podle konvence bývají nejčastěji označovány samostatnými 39

41 písmeny nebo skupinami písmen s křížkem (plus) v exponentu (např. a +, his + ). V řadě případů existuje více forem stejného genu, tedy více alel než jenom dvě. Takovéto jednotlivé molekulární varianty genu mohou vytvářet alelové série, avšak je třeba připomenout, že v diploidní buňce se vyskytují pouze dvě určité alely z příslušné alelové série. Obr.: Chromozom, lokus, alela Zdroj: Předpokládejme, že na určitém páru homologických chromozomů diploidní buňky je lokalizován gen tvořený dvěma alelami (dominantní A, recesívní a). V konkrétním případě se potom může vyskytnout jedna ze tří možných jejich kombinací, které určují tzv. genotyp: (1) jsou-li obě alely dominantní (po jedné na příslušném lokusu každého chromozomu uvažovaného páru homologických chromozomů), vznikne genotyp AA, jehož nositel je označován jako dominantní homozygot, (2) jsou-li obě alely recesivní (po jedné na příslušném lokusu každého chromozomu uvažovaného páru homologických chromozomů), vznikne genotyp aa, jehož nositel je označován jako recesivní homozygot, (3) je-li na příslušném lokusu jednoho chromozomu alela dominantní (A) a na příslušném lokusu druhého chromozomu uvažovaného páru homologických chromozomů alela recesivní (a), vznikne genotyp Aa, jehož nositel je označován jako heterozygot. Genotyp je tedy konkrétní formou genomu jedince, reprezentovanou určitou sestavou alel. Vnější vyjádření genotypu v podobě geneticky determinovaných, podmíněných nebo ovlivněných biologických znaků individua je označováno jako fenotyp. Některé znaky jsou jednoznačně (kompletně) geneticky determinovány a fenotypově se manifestují nezávisle na prostředí; to se týká především tzv. kvalitativních znaků, determinovaných jedním nebo 40

42 několika málo geny velkého účinku (neboli oligogeny, resp. majorgeny). Fenotypový projev jiných biologických znaků je konečným výsledkem interakce genotypu a prostředí; to se týká především tzv. kvantitativních znaků, determinovaných větším počtem genů malého účinku (neboli polygenů, resp. minorgenů). Zdroj: Podle fenotypového projevu jednotlivých genotypů můžeme vymezit několik základních typů dědičnosti: 1. Úplná dominance při tomto typu dědičnosti je fenotypový projev dominantního homozygota shodný s fenotypovým projevem heterozygota a je odlišný od fenotypového projevu recesivního homozygota (např. červená barva květu u jedinců genotypu AA + Aa, bílá barva květu u jedinců genotypu aa). V případech úplné dominance tedy může být týž fenotyp vyjádřením více genotypů; k jejich rozlišení a stanovení konkrétního genotypu konkrétního jedince je nutné provést genetickou analýzu (v zásadě se jedná o rozlišení mezi dominantním homozygotem a heterozygotem). 2. Nepřítomnost dominance při tomto typu dědičnosti leží fenotypový projev heterozygota právě uprostřed mezi fenotypovým projevem dominantního homozygota a recesivního homozygota (např. červená barva květů u jedinců AA, bílá barva květů u jedinců aa, růžová 41

43 barva květů u jedinců Aa). V případech nepřítomnosti dominance lze na základě fenotypu stanovit genotyp (neboť fenotypový projev AA Aa aa). 3. Neúplná dominance při tomto typu dědičnosti leží fenotypový projev heterozygota blíže k fenotypovému projevu některého z homozygotů, avšak nikoli právě uprostřed mezi nimi (např. tmavě červená barva květů u jedinců AA, bílá barva květů u jedinců aa, světle červená barva květů u jedinců Aa). V případech neúplné dominance lze na základě fenotypu stanovit genotyp (neboť, podobně jako v případě nepřítomnosti dominance, fenotypový projev AA Aa aa). 4. Kodominance při tomto typu dědičnosti má každý z genotypů vlastní specifický projev, přičemž fenotypovou hodnotu heterozygota nelze kvantitativně vyjádřit jako určitý podíl fenotypové hodnoty některého z homozygotů. Například genotyp I A I B determinuje v krevním systému AB0 člověka kodominantně děděnou krevní skupinovou vlastnost AB, která vykazuje imunohematologické znaky zcela odlišné od imunohematologických znaků erytrocytů s genotypy determinujícími krevní skupinové vlastnosti A, B a 0. Doplňme, že kromě dominantních alel I A a I B existuje v tomto systému ještě recesivní alela i, přičemž mezi ní a alelou I A, resp. mezi ní a alelou I B, existuje vztah úplné dominance. Proto jedinci s krevní skupinovou vlastností A mohou být genotypově dominantní homozygoti I A I A nebo heterozygoti I A i a obdobně jedinci s krevní skupinovou vlastností B mohou být genotypově dominantní homozygoti I B I B nebo heterozygoti I B i, kdežto jedinci s krevní skupinovou vlastností 0 mohou být pouze recesivní homozygoti ii. Alely, které determinují různé varianty fenotypového projevu téhož znaku v našem případě alely I A a I B se označují jako izoalely. 42

44 IV. REPLIKACE DNA Replikace DNA je proces zdvojení DNA obsažené v buněčném genomu (resp. v jeho jednotlivých součástech). Vzhledem k odlišnostem mezi různými typy genoforů i obecně mezi buňkami prokaryotickými a eukaryotickými existují jim odpovídající odlišnosti v procesu replikace DNA. Nicméně replikace jako jeden ze základních intracelulárních genetických procesů vykazuje jisté obecné znaky, základní principy, mechanismy a podmínky, za kterých se může realizovat: 1. začíná v replikonu vždy od počátku (místo ori) za vytvoření replikační vidlice. Jako replikon se označuje molekula DNA nebo její část, která obsahuje počátek (tj. nukleotidovou sekvenci, na kterou se váží specifické proteiny umožňující zahájit replikaci a řídit celý její průběh). 2. uskutečňuje se podle matričního řetězce (templátu) enzymaticky katalyzovanou polymerací deoxyribonukleotidů ve směru 5 3 na základě komplementarity bází. Mechanismus, vyžívající matrice (templátu), umožňuje biosyntézu identické kopie DNA a vytváří tak základní předpoklad pro následný přenos nezměněné DNA (genetické informace) do nově vznikajících buněk při buněčném dělení. 3. je semidiskontinuální v případě dsdna, neboť jeden řetězec (tzv. vedoucí) je syntetizován kontinuálně, kdežto druhý řetězec (tzv. opožďující se) je syntetizován diskontinuálně v úsecích označovaných jako Okazakiho fragmenty. 4. je semikonzervativní, to znamená, že každá zreplikovaná dsdna sestává z jednoho řetězce pocházejícího z původní molekuly dsdna (tj. před replikací) a z jednoho řetězce nově syntetizovaného (pro jehož syntézu byl matricí právě onen původní řetězec). 5. představuje vícestupňový proces (iniciace, elongace, terminace), enzymaticky katalyzovaný (polymerázy, nukleázy, ligázy). Iniciace replikace zahrnuje procesy, kterými se replikace zahajuje (rozpoznání místa ori replikačními proteiny, lokální denaturace v oblasti místa ori, rozvolnění a despiralizace řetězců DNA, vytvoření replikační vidlice). Elongace je fází následující po iniciaci, v níž se syntetizuje (polykondenzací) nový polynukleotidový řetězec komplementární k matričnímu řetězci a to postupným připojováním jednotlivých deoxyribonukleotid-5 -fosfátů svým 5 - koncem k 3 - konci nascentního řetězce za katalytické tvorby fosfodiesterové vazby. Terminace je závěrečnou fází replikace DNA a představuje soubor procesů, kterými se na specifickém místě ukončuje replikace. Při replikaci se jeden nový deoxyribonukleotidový řetězec syntetizuje kontinuálně (od počátku do konce); je to tzv. vedoucí řetězec. Naproti tomu druhý nový polydeoxyribonukleotidový řetězec se syntetizuje diskontinuálně v úsecích nazývaných Okazakiho fragmenty; je to tzv. opožďující se řetězec. Okazakiho fragment je útvar sestávající jednak z oligoribonukleotidu, syntetizovaného za katalýzy primázy a nazývaného primer, jednak z poměrně krátkého oligodeoxyribonukleotidu, syntetizovaného podle matričního řetězce a spojeného fosfodiesterovou vazbou s 3 - koncem RNA-primeru. 43

45 Obr.: Etapy replikace DNA Zdroj: Nový řetězec (resp. jeho úseky) DNA je při replikaci syntetizován za katalytického účinku DNA-polymeráz, avšak zahájena může být tato syntéza pouze v přítomnosti krátkého oligoribonukleotidu (RNA-primer) nebo oligodeoxyribonukleotidu (DNA-primer). U prokaryot jsou známy tři druhy DNA-polymeráz. Jednou z nich je DNA-polymeráza I, která vyžaduje DNA-primer k zahájení syntézy nového řetězce DNA; kromě polymerázové aktivity disponuje též exonukleázovou aktivitou ve směru 3 5 i 5 3 (tzn. že je schopna v obou uvedených směrech hydrolyzovat fosfodiesterové vazby na koncích polynukleotidových řetězců). DNA-polymeráza II rovněž disponuje exonukleázovou aktivitou ve směru 3 5 i 5 3. DNA-polymeráza III je heterooligomer složený z několika podjednotek, které plní významné a relativně samostatné funkce (např. monomer α polymerační, monomer ε exonukleázovou ve směru 5 3, γ váže ATP, χ váže proteiny SSB, ψ navzájem propojuje monomery γ a χ atp.). Tři podjednotky tvoří katalytické jádro; dvě katalytická jádra se mohou spojit za vzniku dimeru DNA-polymerázy III (který bývá též označován jako PolIII * ), charakteristického zvýšenou procesivitou (ve srovnání se základním uspořádáním katalytického jádra DNA-polymerázy III). Dalším nezbytným enzymem pro úspěšnou replikaci DNA je ligáza, která katalyzuje vytvoření fosfodiesterové vazby mezi 5 - a 3 - koncem polynukleotidových řetězců nebo jejich fragmentů (Okazakiho fragmenty). Do procesu replikace DNA zasahují i některé další enzymy (např. gyráza) a bílkovinné faktory, které zde nejsou blíže zmiňovány, nicméně plní své specifické funkce. Nelze též neuvést, že na průběhu replikace se podílí ještě některé dosud ne přesně identifikované látky, jejichž význam není zcela objasněn. 44

46 Obr.: Schéma replikace DNA Zdroj: IV.1 REPLIKACE PROKARYOTICKÉHO CHROMOZOMU Prokaryotický (bakteriální) chromozom je tvořen jednou kružnicovou molekulou dsdna s místem ori (počátek replikace); má tedy vlastnosti replikonu. Specifické replikační proteiny při iniciaci replikace rozpoznávají místo ori a v aktivovaném stavu se k němu váží; v důsledku této vazby (a dalších interakcí, zejm. mezi přítomnými proteiny) dochází k lokální denaturaci bakteriálního chromozomu, k rozrušení vodíkových vazeb mezi komplementárními bázemi a tím k rozvolnění polydeoxyribonukleotidových řetězců molekuly DNA v místě ori. Následně se do oblasti počátku replikace na takto uvolněné řetězce DNA naváží z obou stran molekuly helikázy, tj. enzymu, v jehož přítomnosti se začne řetězec DNA despiralizovat ve směru 5 3 za vzniku replikační vidlice; helikáza k despiralizaci utilizuje energii uvolněnou při hydrolýze NTP (s níž je aktivita tohoto enzymu spřažena). Vznikající jednořetězcové úseky v replikačních vidlicích jsou udržovány v linearizovaném stavu účinkem tzv. SSB-proteinů. Další děje spadají již do fáze elongace. Replikační vidlice se pohybuje obousměrně od místa ori opět za katalytického účinku helikázy a účinku SSB-proteinů. Úměrně s postupem replikační vidlice se za katalytického účinku primázy a v součinnosti s helikázou začíná v počátečním místě replikace syntetizovat primer pro vedoucí (leading) řetězec; protože se vedoucí řetězec syntetizuje kontinuálně, stačí pro jeho kompletní syntézu pouze jeden primer. Naproti tomu syntéza opožďujícího se řetězce DNA je možná jen za tvorby většího počtu primerů (v každém Okazakiho fragmentu jednoho), katalyzované komplexem sestávajícím minimálně z primázy a helikázy a označovaným jako primozom. Jakmile je ten který primer k dispozici, účinkem DNA-polymerázy III se k jeho 3 - konci napojí dntp komplementární 45

47 k matričnímu řetězci za vytvoření fosfodiesterové vazby a uvolnění pyrofosfátu. Postupně se takto nasyntetizuje vedoucí řetězec kontinuálně (počínaje primerem), kdežto opožďující se řetězec se syntetizuje diskontinuálně, vždy v rámci jednoho Okazakiho fragmentu. RNAprimery jsou poté odstraněny účinkem exonukleázové aktivity DNA-polymerázy I od 5 konce a zároveň polymerázovou aktivitou této DNA-polymerázy je katalyzována syntéza fragmentů deoxyribonukleotidových řetězců v místech uvolněných po primerech; takto dosyntetizované fragmenty deoxyribonukleotidových řetězců jsou se sousedními úseky DNA spojeny účinkem katalytické aktivity ligázy. Replikace celého chromozomu končí na specifických sekvencích označovaných jako terminátory, na které se váže specifický protein (tzv. Tus-protein), který inhibuje aktivitu helikázy a tím znemožňuje další tvorbu (resp. posun) replikační vidlice. Obr.: Schéma replikace prokaryotického chromozomu Zdroj: IV.2 REPLIKACE PLAZMIDOVÉ DNA Replikace plazmidové DNA je (jako u jiných) genoforů semikonzervativní a semidiskontinuální. Plazmidová DNA je tvořena malými kružnicovými molekulami, které představují jednotlivé replikony. Její replikace se obvykle uskutečňuje mechanismem otáčivé kružnice, při kterém se replikační vidlice pohybuje jedním směrem od počátku replikace ori. V dsdna plazmidu se rozlišuje řetězec pozitivní (+) a negativní (-). Na začátku replikace se nejprve na místo ori naváže specifický protein (Rep-protein), který tam hydrolýzou jedné fosfodiesterové vazby uvolní 5 - konec pozitivního řetězce; postupnou syntézou (polykondenzací) nového pozitivního řetězce DNA podle matričního negativního řetězce dochází k vytlačování původního pozitivního řetězce z kružnice. Hydrolýzou další fosfodiesterové vazby v terminačním úseku replikace v místě spojení obou pozitivních řetězců (tj. původního a nově syntetizovaného) dochází k jejich rozpojení, posléze k individuálnímu spojení volných konců každého z nich za katalytického působení ligázy a vzniku útvaru sestávajícího jednak z plazmidu, tvořeného původním negativním řetězcem a nově syntetizovaným pozitivním řetězcem, jednak z původního pozitivního řetězce 46

48 DNA plazmidu. Po této fázi, kdy je tedy dokončena replikace nového pozitivního řetězce podle matričního negativního řetězce původního plazmidu, začíná od místa ori diskontinuální syntéza nového negativního řetězce v podobě Okazakiho fragmentů za použití původního pozitivního řetězce jako řetězce matričního, jejímž produktem je další plazmid, tvořený původním pozitivním řetězcem a nově syntetizovaným negativním řetězcem. Některé plazmidy označujeme jako tzv. plazmidy konjugativní. Jejich charakteristickým znakem je, že mohou být při konjugaci transportovány z buňky donorové do buňky recipientní. S tímto transportem může být spojena též replikace konjugativního plazmidu. Po interakci mezi pilusem donorové buňky a povrchovými útvary recipientní buňky je v donorové buňce účinkem aktivované specifické endonukleázy hydrolyzována fosfodiesterová vazba v místě ori plazmidu, čímž se uvolní 5 - konec jednoho řetězce DNA. Tento naštěpený řetězec se přemisťuje via pilus 5 - koncem do recipientní buňky, v níž se za účasti DNA-polymerázy III uskutečňuje diskontinuální syntéza komplementárního řetězce. Podle řetězce, který zůstal v donorové buňce, se dosyntetizuje komplementární řetězec kontinuálně. Výsledkem celého popsaného procesu jsou tedy dva nově syntetizované plazmidy: jeden v buňce donorové a jeden v buňce recipientní. Obr.: Schéma replikace plazmidové DNA Zdroj: 47

49 Zdroj: IV.3 REPLIKACE CHROMOZOMOVÉ DNA EUKARYOT Replikace DNA eukaryot se vyznačuje stejnými obecnými znaky, jako replikace DNA prokaryot: je semikonzervativní, semidiskontinuální, uskutečňuje se ve směru 5 3 a celý proces replikace lze rozdělit do tří fází: iniciace, elongace a replikace. Významné odlišnosti replikace eukaryot nicméně existují. Především je třeba uvést, že replikace jaderné DNA se realizuje pouze v S-fázi interfáze buněčného cyklu (u prokaryot se replikace zahajuje zpravidla ihned po skončení buněčného dělení). Další odlišností je skutečnost, že zreplikovaná DNA v průběhu jaderného dělení (mitózy nebo meiózy) segreguje v podobě jednotlivých chromozomů do nově konstituovaných buněčných jader a po uskutečněné cytokinezi jejich prostřednictvím do nově vzniklých ( dceřinných ) buněk. Na rozdíl od prokaryotické buňky, kde jedna molekula DNA reprezentuje jeden replikon, DNA každého chromozomu je celým souborem lineárně uspořádaných replikonů, z nichž každý má 48

50 vlastní počátek (místo ori). V průběhu S-fáze se replikace DNA realizuje v každém dílčím časovém intervalu na několika replikonech současně a v určitém časovém sledu kompletně v rozsahu celého jaderného genomu, přičemž za normálních podmínek je každý replikon zreplikován pouze jedenkrát. Obecně platí, že euchromatinové oblasti chromozomů bývají replikovány v časnějších obdobích S-fáze, kdežto heterochromatinové úseky v obdobích pozdnějších. Na replikaci vedoucího a opožďujícího se řetězce eukaryotické jaderné (chromozomální) DNA participují odlišné typy DNA-polymeráz, kdežto u prokaryot syntézu obou typů řetězců katalyzuje pouze DNA-polymeráza III. DNA-polymeráza α katalyzuje syntézu oligodeoxyribonukleotidů opožďujícího se řetězce v Okazakiho fragmentech. DNA-polymeráza δ katalyzuje syntézu vedoucího řetězce a dokončuje syntézu opožďujícího se řetězce. V eukaryotických buňkách existuje možnost reparace chyb vzniklých při replikaci; v tomto procesu se uplatňuje DNA-polymeráza β katalytickou aktivitou při syntéze oligonukleotidů v reparovaných úsecích DNA. Iniciace replikace na příslušných replikonech chromozomové DNA eukaryot zahrnuje rozpoznání místa ori na replikonech specifickými proteiny, jejich navázání do této oblasti a lokální despiralizaci dsdna účinkem helikázové aktivity těchto proteinů; končí vytvořením replikační vidlice, která se v následujícím průběhu replikace pohybuje oběma směry. Ve fázi elongace jsou nejprve prostřednictvím stabilního komplexu DNA-polymerázy α a primázy (komplex polα/prim) nasyntetizovány RNA-primery pro tvorbu Okazakiho fragmentů a též části polydeoxyribonukleotidových řetězců těchto fragmentů. Následně je komplex polα/prim uvolněn specifickým proteinem (RFC protein), jenž zároveň umožňuje navázání DNA-polymerázy δ, která dosyntetizuje polydeoxyribonukleotidové řetězce v Okazakiho fragmentech včetně oblastí primerů, které byly již předtím účinkem ribonukleázy odstraněny. Vedoucí řetězec je syntetizován kontinuálně v celém replikonu za katalytického působení DNA-polymerázy α, přičemž pouze oblast na původním místě primeru je dodatečně dosyntetizována za katalýzy DNA-polymerázy δ. Na spojení nově syntetizovaných řetězců DNA (resp. jejich úseků) se podílí ligáza tím, že katalyzuje tvorbu fosfodiesterových vazeb. Zakončení (terminace) replikace lineárních molekul dsdna v chromozomech eukaryot se účastní telomeráza, která katalyzuje zvláštní syntézu telomerních konců chromozomů. Telomeráza je ribonukleoprotein, jehož RNA plní úlohu matrice, podle níž jsou za katalytického účinku proteinové části enzymu k primeru, představovanému několikanukleotidovou sekvencí na 3 - konci řetězce DNA, syntetizovány telomerní tandemové repetice. Poměrně složitým mechanismem je tak 3 - konec řetězce DNA účinkem telomerázy prodloužen, komplementárně k prodlouženému úseku jsou esyntetizovány další Okazakiho fragmenty, posléze jsou jejich primery odstraněny, uvolněná místa dosyntetizována za katalytické aktivity DNA-polymerázy δ a Okazakiho fragmenty spojeny pomocí DNA-ligázy. Tímto mechanizmem je umožněna replikace i původního (neprodlouženého) 3 - konce lineární dsdna matričního řetězce pro syntézu opožďujícího se řetězce. Nakonec je prodloužený úsek na 3 - konci odbourán. 49

51 Obr.: Děje při zahájení replikace chromozomové DNA Zdroj: Obr.: Celkové schéma replikace chromozomové DNA Zdroj: 50

52 IV.4 REPLIKACE MITOCHONDRIÁLNÍ DNA (mtdna) Mitochondrie jsou semiautonomní organely. Jejich dělení není spřaženo s buněčným dělením (karyokinezí, ani cytokinezí). Stejně tak replikace mitochondriální DNA neprobíhá souběžně s replikací jaderné (chromozomální) DNA. mtdna je některými svými znaky shodná s prokaryotickou DNA nebo se jí podobá, což je v souladu s endosymbiotickou teorií původu mitochondrií: je kružnicová, dvouřetězcová, nevytváří komplexy s proteiny. Podle výsledků centrifugace v hustotním gradientu chloridu cesného (CsCl) se rozlišuje lehký (L) a těžký (H) řetězec mtdna. mtdna, nacházejícící se zpravidla v mnoha kopiích v matrix mitochondrií, představuje mitochondriální genom, který je jedním z nositelů mimojaderné dědičnosti (vedle genomu chloroplastového) vyznačující se matroklinitou. Geny tohoto genomu kódují některé komponenty mitochondrií (např. mtdna člověka kóduje dva typy molekul rrna jako součásti mitochondriálních ribozomů, 22 typů molekul trna, tři jednotky cytochromoxidázy, 7 podjednotek NADH-CoQ-reduktázy, 2 podjednotky F1-ATPázy, cytochrom b), avšak mnoho proteinů, které plní příslušné funkce v mitochondriích (např. většina polypeptidů participujících na oxidativní fosforylaci), je kódována jadernou DNA, syntetizována na cytoplazmatických chromozomech a poté transportována do mitochondrií. Mezi jaderným a mitochondriálním genomem tedy existují četné interakce. Obr.: Schéma mtdna člověka. Zdroj: 51

53 Obvykle je replikace mtdna vysvětlována na základě modelu vytěsňování řetězce (tj. strand-displacement model). Podle tohoto modelu replikace mtdna, katalyzovaná DNApolymerázou γ, začíná v počátku replikace označovaném jako ori-h vytěsňováním původního řetězce H nově syntetizovaným řetězcem H (tzv. D-smyčka) podle matričního řetězce L. Když replikace postoupí asi do 2/3 celkové délky DNA, uvolní se místo označované jako ori-l, od kterého začíná replikace řetězce L v protisměru k replikaci řetězce H. Výsledkem dokončené replikace jsou dvě molekuly mtdna, z nichž každá obsahuje jeden původní a jeden nově syntetizovaný řetězec. Dvoušroubovicové molekuly mtdna mohou být gyrázovou aktivitou převedeny do struktury nadšroubovicové (superhelikální). Obr.: Schéma replikace mitochondriální DNA Zdroj: 52

54 Obr.: Schéma průběhu replikace mitochondriální DNA Zdroj: 53

55 Pro replikaci mtdna však existuje v současné době více modelů (viz obrázek níže). Mezi tři nejrozšířenější patří: model vytěsňování řetězce (strand-displacement model), model RITOLS (RNA incorporated throughout lagging strand model, tj. model inkorporace RNA v celém rozsahu opožďujícího se řetězce) a model spřažení vedoucího a opožďujícího se řetězce (strand-coupled model). Obr.: Modely replikace mitochondriální DNA. Zdroj: Na doplnění: - Mitochondria: from bioenergetics to the metabolic regulation of carcinogenesis. - Replicating animal mitochondrial DNA 54

56 IV.5 REPLIKACE CHLOROPLASTOVÉ DNA (ctdna) Chloroplastová DNA (ctdna, cpdna) je platidová DNA (pdna, plastom), která je obsažena ve stromatu chloroplastů. Plastidy jsou (podobně jako mitochondrie) semiautonomní organely. Jejich dělení není spřaženo s buněčným dělením (karyokinezí, ani cytokinezí). Stejně tak replikace chloroplastové DNA neprobíhá souběžně s replikací jaderné (chromozomální) DNA. ctdna je některými svými znaky shodná s prokaryotickou DNA nebo se jí podobá, což je v souladu s endosymbiotickou teorií původu chloroplastů (resp. obecně plastidů): je zpravidla kružnicová, dvouřetězcová, nevytváří komplexy s proteiny. ctdna, nacházejícící se v chloroplastech zpravidla v mnoha kopiích, představuje chloroplastový (plastidový) genom, který je jedním z nositelů mimojaderné dědičnosti (vedle genomu mitochondtíálního) vyznačující se matroklinitou. Geny tohoto genomu kódují některé komponenty chloroplastů, avšak řada proteinů (nebo jejich podjednotek), které plní příslušné funkce v chloroplastech (např. enzym RUBISCO), je kódována jadernou DNA, syntetizována na cytoplazmatických chromozomech a poté transportována do chloroplastů. Mezi jaderným a chloroplastovým genomem tedy existují četné interakce. Mechanizmus replikace ctdna je podobný mechanizmu replikace mtdna a jako v případě mitochondriální DNA i zde existuje více modelů. Na molekule ctdna existují dvě místa jako počátky replikace (oria, orib). Obr.: Schéma replikace chloroplastové DNA. Zdroj: Replication_of_Organelle_DNA.htm 55

57 V. TRANSKRIPCE Jak jsme již poznali, replikace je hlavním mechanismem, který ve vazbě na buněčné dělení zabezpečuje v přírodě téměř dokonale přesnou distribuci genetického materiálu (DNA) mezi buňkami jak z hlediska kvantitativního (druhově konstantní množství DNA v genomu), tak kvalitativního (kopie DNA podle matrice). Zakódovaná genetická informace se však v buňce musí adekvátními mechanismy dešifrovat a exprimovat. Realizace genetické informace v buňce je možná především prostřednictvím dalších dvou základních intracelulárních procesů: transkripce, tj. přepisu genetické informace, a translace, tj. překladu genetické informace. V této kapitole se budeme věnovat transkripci. Transkripcí rozumíme složitý, enzymaticky katalyzovaný a autoregulovaný proces, při kterém se genetická informace, obsažená ve formě lineárně uspořádané sekvence deoxyribonukleotidů v určitém úseku DNA, přepíše do komplementární lineárně uspořádané sekvence ribonukleotidů, označované jako mediátorová RNA (mrna), resp. primární transkript. Kromě tohoto nejobvyklejšího a nejčastějšího způsobu přepisu genetické informace, typického pro všechna eukaryota a většinu prokaryot, je třeba ještě doplnit, že transkribována může být též informace z RNA do RNA (u některých RNA-virů) a z RNA do DNA (u RNA-virů za přítomnosti reverzní transkriptázy čili revertázy, která je schopna na matričním řetězci RNA katalyzovat syntézu komplementárního polydeoxyribonukleotidového řetězce). V další části, nebude-li výslovně uvedeno jinak, se budeme zabývat transkripcí genetické informace z DNA do mrna. Genetická informace se nepřepisuje kontinuálně po celé délce molekuly DNA (od začátku do konce), ale po určitých úsecích. Uvažujme nejprve geny strukturní a geny pro funkční ribonukleové kyseliny. Tyto geny mají konečnou velikost a proto zaujímají jen omezenou část molekuly DNA, jinak řečeno, zaujímají určité místo (lokus) na chromozomu; takové úseky DNA (eukaryot, prokaryot), na kterých jsou lokalizovány strukturní geny nebo geny pro funkční RNA, jsou transkribovány a označují se jako transkripční jednotky. Každá transkripční jednotka se vyznačuje určitým obecně platným uspořádáním. Na jejím začátku se nachází tzv. startovací nukleotid, což je deoxyribonukleotid, jímž začíná přepisování celé transkripční jednotky; podle konvence je startovací nukleotid označován číslem +1. Schéma transkripce orientujeme (rovněž podle konvence) vždy tak, aby další přepisované deoxyribonukleotidy (+2, +3,..., +n) byly umístěny vpravo od startovacího nukleotidu, tzn. zleva doprava. Startovací nukleotid fakticky představuje počátek prvního přepisovaného genu dané transkripční jednotky. Podotkněme, že jedna transkripční jednotka může obsahovat (nést) pouze jeden přepisovaný (strukturní) gen, anebo více přepisovaných (strukturních) genů; obsahuje-li pouze jeden gen, hovoří se někdy o transkripční jednotce monogenní nebo monocistronní, obsahuje-li strukturních genů více, hovoří se o transkripční jednotce multigenní nebo polycistronní. Transkripční jednotka je zakončena regulační oblastí zvanou terminátor; tato oblast následuje za posledním genem uvažované transkripční jednotky, je ještě její součástí a tudíž se přepisuje. Při přepisu genetické informace strukturního genu se nejprve syntetizuje tzv. primární transkript (pre-mrna neboli hnrna), což reálně představuje jednu molekulu polyribonukleotidového řetězce komplementárního k přepisovanému matričnímu řetězci DNA v rozsahu jedné transkripční jednotky (tj. od nukleotidu startovacího až po poslední nukleotid terminátoru). Primární transkript může být 56

58 následně podroben různým posttranskripčním úpravám, jejichž výsledkem je finální molekula mrna. Před startovacím nukleotidem (tj. vlevo od +1) se nachází další regulační oblast, která se nepřepisuje. Touto oblastí je tzv. promotor, jenž tvoří úsek polydeoxyribonukleotidového řetězce DNA, který rozpoznávají a na který se váží proteiny nezbytné pro zahájení transkripce. /Pozn.: Nukleotidy umístěné vlevo od startovacího nukleotidu se označují záporným znaménkem. Číslice 0 se nepoužívá a proto první nukleotid vlevo před startovacím nukleotidem má označení 1/. Transkripční jednotka bez promotoru (resp. s promotorem strukturně nebo funkčně poškozeným) nemůže být transkribována; každý gen, který má být transkribován, musí přináležet k určitému promotoru (v rámci příslušné transkripční jednotky). Ačkoli nukleotidové složení jednotlivých promotorů není identické ani mezi jednotlivými transkripčními jednotkami v rámci individua, je si podobné, což odráží strukturní afinitu promotorů k molekulám RNA-polymerázy. Podle této afinity rozlišujeme promotory silné, které se vyznačují vysokou mírou iniciace transkripce v důsledku vysoké afinity mezi molekulou RNA-polymerázy a promotorem, a promotory slabé, které se vyznačují nízkou mírou iniciace transkripce v důsledku nízké afinity mezi molekulou RNA-polymerázy a promotorem. Transkripční jednotka sestávající z promotoru, startovacího nukleotidu, přepisovaných genů a terminátoru se označuje jako neoperonová transkripční jednotka. U prokaryot se kromě ní vyskytují ještě transkripční jednotky jiného typu, tzv. operony. Jsou to transkripční jednotky s další regulační oblastí, lokalizovanou mezi promotorem a startovacím nukleotidem a zvanou operátor. Funkční význam operátoru spočívá v regulaci transkripce: naváže-li se na operátor určitý protein, tzv. represor, následně se zastaví transkripce; naopak, je-li represor z operátoru uvolněn (například navázáním korepresoru na represor), může být transkripce zahájena nebo obnovena. Operon tedy sestává z promotoru, operátoru, starovacího nukleotidu, přepisovaných genů a terminátoru. Transkripční jednotky neoperonové jsou řízeny pouze promotorem, kdežto operony promotorem i operátorem. V buňkách eukaryot se některé transkripční jednotky navzájem přesahují. Následkem toho se potom mohou v genomu vyskytovat (kromě transkripčních jednotek nepřesahujících) transkripční jednotky se stejným začátkem a různými konci, nebo s různým začátkem a stejnými konci, nebo s různými začátky i různými konci. Vzhledem k tomu, že každá transkripční jednotka produkuje vlastní typ molekuly primárního transkriptu, specifický svou primární strukturou, lze detekcí celkového počtu typů molekul primárního transkriptu stanovit počet transkripčních jednotek umístěných v určité sledované oblasti genomu (molekuly DNA). Proces polymerace ribonukleotidů při vzniku primárního transkriptu v průběhu transkripce katalyzuje RNA-polymeráza. U prokaryot existuje pouze jeden druh RNApolymerázy, odpovídající jednomu typu promotoru pro všechny transkripčních jednotky. Naopak u eukaryot jsou známy tři druhy RNA-polymeráz, každý pro specifický typ promotoru: RNA-polymeráza I katalyzuje syntézu pre-rrna v buněčném jadérku (kde se exkluzivně vyskytuje), RNA-polymeráza II katalyzuje syntézu primárního transkriptu (hnrna neboli pre-mrna) a některých malých molekul rrna a RNA-polymeráza III 57

59 katalyzuje syntézu pre-trna, 5S-rRNA a některých dalších malých RNA. Malé molekuly RNA se vyskytují v jádru (snrna small nuclear RNA), jadérku (snorna small nucleolar RNA) nebo cytoplazmě (scrna small cytoplasmic RNA), kde plní různé specifické funkce (např. se podílejí na posttranskripčních úpravách nebo na translokaci proteinů). Na rozdíl od ssdna, kde se může transkribovat pouze jeden přítomný polydeoxyribonukleotidový řetězec, je v případech dsdna již možnost (alespoň hypoteticky) volby. V buňkách se zpravidla v určitém časovém okamžiku přepisuje pouze jeden z obu řetězců dsdna; ten, který při přepisu genetické informace plní matriční funkci, se označuje jako řetězec negativní (nekódující, antikódující), druhý, který při přepisu genetické informace neplní matriční funkci, se označuje jako řetězec pozitivní (kódující). Z uvedeného však nutně nevyplývá, že by vždy celý jeden řetězec dsdna musel být buď negativní nebo pozitivní; za běžné můžeme dnes považovat případy, kdy určité úseky jednoho řetězce dsdna jsou transkribovány a řetězec v tomto úseku funguje jako řetězec negativní, kdežto jiné úseky téhož řetězce dsdna nejsou transkribovány a řetězec v tomto úseku funguje jako řetězec pozitivní. Uspořádání (rozložení) takovéto mozaiky negativních a pozitivních úseků mezi řetězci dsdna nemusí být konstantní, ale u mnohobuněčných organizmů může vykazovat jistou variabilitu jednak mezi jednotlivými tkáněmi či orgány (případně i v jejich rámci), jednak v průběhu ontogenetického vývoje v souvislosti s procesy diferenciačními, při nichž dochází ke změnám ve složení spektra využívaných (exprimovaných) genů. Geny přepisované do funkčních ribonukleových kyselin se přepisují buď do primární struktury prekurzorů jednotlivých typů rrna, označovaných jako pre-rrna, nebo do primární struktury prekurzorů jednotlivých typů trna, označovaných jako pre-trna. Dodejme, že geny pro některé rrna (5,8S-rRNA, 18S-rRNA, 28S-rRNA) jsou lokalizovány v DNA jadérka, ve kterém jsou též přepisovány do pre-rrna; geny pro některé jiné rrna (např. 5S-rRNA) jsou lokalizovány v buněčném jádru a přepisují se přímo do primární struktury příslušné molekuly rrna. Posttranskripčními úpravami z pre-rrna a pre-trna vznikají finální produkty, tedy jednotlivé typy rrna a trna. Připomeňme znovu, že produkty transkripce genů pro funkční RNA se nepřekládají, ale přímo (jako produkty transkripce) plní své biologické funkce, zejm. při translaci. Proces transkripce se realizuje v buněčném jádru. Produkty transkripce tedy vznikají v buněčném jádru a z něho jsou transportovány do cytoplazmy, kde jsou buď dále upravovány, nebo přímo plní specifické příslušné funkce. Přes výrazná specifika transkripce u prokaryot a eukaryot (resp. transkripce virového genomu) lze uvést některé její obecné znaky. Transkripce in vivo se uskutečňuje na matrici, kterou je řetězec DNA (v případě dsdna negativní řetězec) v rozsahu transkripční jednotky řízené vlastním promotorem (případně též operátorem); v jejím průběhu je za účasti RNApolymerázy, prekurzorů ribonukleotidů a řady regulačních transkripčních faktorů syntetizován ve směru 5 3 polyribonukleotidový řetězec komplementární k matričnímu řetězci. V celém procesu transkripce lze vymezit tři fáze: iniciaci, elongaci, terminaci. 58

60 Obr.: Obecné schéma transkripce. Zdroj: V.1 TRANSKRIPCE V PROKARYOTICKÉ BUŇCE Na promotoru prokaryotických organizmů se nacházejí dvě sekvence: Pribnowův box s konvenční sestavou 5 TATAAT 3 v blízkosti nukleotidu -10 a sekvence s konvenční sestavou 5 TTGACAT 3. Prokaryotická RNA-polymeráza je heteromerní oligomer. Jedna z jejích podjednotek (σ, dříve též označovaná jako faktor sigma) umožňuje navázání celé molekuly výhradně na promotor. V nepřítomnosti podjednotky σ nerozpozná RNA-polymeráza začátek transkripce; může svou katalytickou funkci plnit, avšak nahodile z různých míst na molekule DNA. Ve fázi iniciace transkripce se RNA-polymeráza naváže prostřednictvím podjednotky σ na specifická místa promotoru za vzniku tzv. binárního komplexu (enzym RNA-polymeráza + oblast promotoru). V tomto komplexu RNA-polymeráza mění svou 59

61 konformaci a zaujímá takovou polohu, z níž může začít transkribovat transkripční jednotku právě od startovacího nukleotidu +1. Zároveň dochází na promotoru k fyzikálně-chemickým změnám, které rezultují v lokální rozvinutí DNA v obasti Pribnowova boxu. V závěru fáze iniciace translace se za katalýzy RNA-polymerázy nasyntetizuje na 5 - konci první diribonukleotid a vytvoří se tak ternární komplex (RNA-polymeráza + DNA + první diribonukleotid). Dále již transkripce pokračuje fází elongace RNA-řetězce. Po vytvoření prvního diribonukleotidu (obecně krátkého oligoribonukleotidu) se z molekuly RNA-polymerázy uvolní podjednotka σ a místo ní se na molekulu RNA- polymerázy naváže specifický protein (NusA - protein). RNA-polymeráza katalyzuje polymeraci ribonukleotidů do podoby polyribonukleotidového řetězce po celý elongační proces s tímto proteinem (a bez podjednotky σ). Při polymeraci se RNA-polymeráza posouvá po molekule DNA. Při tom v přední části molekuly RNA-polymerázy dochází k částečné despiralizaci, kdežto v její zadní části již k opětovné spiralizaci DNA; oblast s právě probíhající polymerizací je tudíž omezena pouze na dočasně despiralizovaný úsek dvoušroubovice mezi přední a zadní částí pohybující se RNA-polymerázy. Terminace transkripce nastává na terminátoru. Po přepisu terminátoru se pohyb RNA-polymerázy zastaví, z matričního řetězce se uvolní primární transkript, z molekuly DNA se uvolní molekula RNA-polymerázy, z molekuly RNA-polymerázy se uvolní specifický protein (NusA) a opět je nahrazen podjednotkou σ. Pravidelná vzájemná výměna podjednotky σ a proteinu NusA na počátku a na konci transkripce zřejmě souvisí s jejich specifickými funkcemi, uspořádanými v jistém časovém sledu a odrážejícími lokální strukturní rozdíly transkripční jednotky (promotoru a terminátoru). Do terminace transkripce může dále zasahovat specifický protein typu ATPázy, tzv. faktor ρ, který má vazebnou afinitu k proteinu NusA na molekule RNApolymerázy; po vytvoření spoje mezi těmito dvěma proteiny faktor ρ katalyzuje proces uvolňování RNA-polymerázy a primárního transkriptu z matričního řetězce DNA. Prokaryotická transkripční jednotka strukturních genů je charakteristická tím, že mezi startovacím nukleotidem a prvním strukturním genem (resp. bezprostředně za operátorem v případě operonové transkripční jednotky) obsahuje úsek označovaný jako vedoucí sekvence. Součástí vedoucí sekvence je tzv. Shineova-Dalgarnova sekvence, tvořená na negativním řetězci DNA skupinou nukleotidů 5 TCCT 3. Význam této tetradeoxyribonukleotidové sekvence spočívá v tom, že je přepisována do mrna na 5 - konci jako 5 AGGA 3 a mrna se tímto tetranukleotidem následně při translaci komplementárně 3 spojí se sekvencí UCCU 5 na 3 - konci molekuly 16S rrna, která je součástí menší podjednotky ribozomů (30S). Tímto způsobem se mrna svým 5 - koncem může na ribozomu ukotvit. Nelze vyloučit, že na přítomnosti či nepřítomnosti Shineovy - Dalgarnovy sekvence závisí, zda daný transkript bude či nebude translatován: molekuly mrna, které ji obsahují, translatovány jsou (mohou se vázat k ribozomu), kdežto primární transkripty genů pro funkční RNA (pre-rrna, pre-trna) ji neobsahují a translatovány nejsou (nemohou se vázat k ribozomu). Primární transkript jedné transkripční jednotky, zahrnující skupinu strukturních genů, sestává z transkribované vedoucí sekvence (která se nepřekládá), z transkriptů 60

62 jednotlivých strukturních genů (které se překládají) navzájem oddělených iniciačním a terminačním kodonem a z transkriptu terminátoru (který se nepřekládá). Prokaryotická mrna se posttranskripčně neupravuje. Životnost mrna je v prokaryotické buňce velmi omezená, protože je snadno a účinně atakována intracelulárními ribonukleázami a degradována ve směru 5 3. Proto je pochopitelné, že v prokaryotických buňkách je mrna ihned translatována; translace určité molekuly mrna leckdy bývá zahájena ještě před dokončením replikace, takže v době, kdy je 5 - konec transkriptu již vázán na ribozom a začíná se překládat, úsek na 3 - konci transkriptu je teprve dosyntetizováván. Transkripční jednotka pro rrna se nejprve transkribuje jako jeden celek za vzniku pre-rrna. Teprve následně se účinkem RNAázy z primárního transkriptu posttranskripčně vyštěpí finální molekuly 5S-rRNA, 16S-rRNA a 23S-rRNA. Analogická je situace v případě transkripce genů pro trna: primární transkript tvoří polycystronická pre-trna, která je následně enzymaticky štěpena na jednotlivé finální typy trna. Obr.: Schéma transkripce v prokaryotické buňce. Zdroj: 61

63 V.2 TRANSKRIPCE V EUKARYOTICKÉ BUŇCE Genetický materiál může být v eukaryotické buňce rozložen až do tří organel: buněčného jádra, mitochondrií a chloroplastů. Specifika každého z těchto typů organel se odrážejí též ve zvláštnostech exprese jejich genomů, tedy ve zvláštnostech transkripce a translace genetické informace. Nejprve pojednáme o transkripci jaderné části genomu eukaryotické buňky. Obecnou strukturu typického eukaryotického genu znázorňuje následující schéma: Zdroj: Při iniciaci transkripce eukaryot se uplatňují četné vysoce specifické regulační proteiny, označované souborně jako transkripční faktory. Některé z těchto faktorů jsou velmi frekventované a nezbytné pro zahájení transkripce; označují se proto jako transkripční faktory obecné a geny, na jejichž promotory se váží, jako tzv. geny provozní, exprimované ve většině buněk (ne-li ve všech), neboť jsou pro jejich život nepostradatelné. Jiné transkripční faktory jsou omezeně distribuovány, vyskytují se pouze v některých diferencovaných buňkách nebo přechodně třeba pouze v určitém vývojovém stadiu jedince; označují se proto jako transkripční faktory speciální a uplatňují se zejména v diferenciačních procesech. Ve fázi iniciace se nejdříve na regulační oblasti promotoru nebo zesilovače naváže určitá skupina (kombinace) transkripčních faktorů a teprve na ni rna-polymeráza, odpovídající příslušnému typu promotoru a způsobilá katalyzovat polymerační reakce při transkripci transkripční jednotky obsahující strukturní geny, nebo geny pro funkční RNA. Na rozdíl od celkové uniformity promotorů transkripčních jednotek prokaryot lze mezi eukaryoty vymezit tři základní typy promotorů. Pro promotor, na který se při iniciaci napojuje RNA-polymeráza II, je charakteristický (kromě několika dalších boxů) tzv. TATA-box (neboli Hognessův box) s konvenční sestavou TATAAAA v úseku přibližně 26 až 34. Na tento box se váže TBP-protein (= TATA-box binding protein) a v důsledku vzniklé vazby dochází v oblasti TATA-boxu k lokální denaturaci. Na TBP-protein se může vázat 62

64 RNA-polymeráza II a některé další látky, z nichž uvedeme alespoň tzv. TAF-faktory, které dohromady s TBP-proteinem tvoří transkripční faktor TFIID. Na promotoru, na který se při iniciaci napojuje RNA-polymeráza I, jenž katalyzuje polymeraci při přepisu transkripční jednotky obsahující geny pro 5,8S-rRNA, 18S-rRNA a 28S-rRNA, jsou dvě významnější oblasti: jedna těsně sousedí se startovacím nukleotidem a je pro uskutečnění transkripce nepostradatelná (tzv. základní oblast), druhá se nachází v úseku přibližně mezi nukleotidy 100 až 200 a pouze modifikuje účinnost transkripce (tzv. regulační oblast). Na promotoru pro RNA-polymerázu I se nenachází TATA-box (proto se TBP váže na tento promotor pouze jako součást komplexu s TAF-proteiny). RNA-polymeráza III katalyzuje na transkripční jednotce polymeraci ribonukleotidů při syntéze polyribonukleotidových řetězců tří relativně odlišných skupin makromolekul: jednak je to pre-trna, jednak 5S-rRNA a jednak více či méně početná skupina dalších malých RNA. S touto heterogenitou transkripčních produktů koresponduje existence dosud známých tří typů promotorů, na které se může navázat RNA-polymeráza III a katalyzovat příslušnou transkripci. Podrobnější strukturní rozdíly mezi jednotlivými těmito typy promotorů nebudeme rozebírat. Upozorníme však na jednu jejich zvláštnost, totiž na to, že jsou lokalizovány uvnitř transkripčních jednotek (na rozdíl od promotorů pro RNA-polymerázu I a II). Průběh transkripce, katalyzovaný jednotlivými RNA-polymerázami, vykazuje navzájem jisté odchylky od obecného schématu a zároveň svá specifika. Podrobnější informace jsou obsaženy v jiné literatuře, zde uvedeme pouze základní charakteristiku. Při transkripci katalyzované RNA-polymerázou II se ve fázi iniciace na TATA-boxu zprvu vytvoří iniciační komplex, sestávající z RNA-polymerázy II a souboru příslušných transkripčních faktorů. V důsledku probíhajících procesů, indukovaných tímto komplexem, dochází k lokální denaturaci DNA v blízkém okolí startovacího nukleotidu; RNA-polymeráza se v této fázi polohuje tak, že může zahájit katalýzu transkripce od místa +1 a aktivuje se fosforylací. Po aktivaci polymerázy začíná fáze elongace, při níž RNA-polymeráza II již bez transkripčních faktorů katalyzuje syntézu budoucího primárního transkriptu strukturních genů (hnrna) ve směru 5 3. Terminace transkripce nastává na signalizační sekvenci AATAAA, označované jako tzv. polyadenylační signál, který signalizuje, že v krátké vzdálenosti za touto sekvencí (asi 10 až 30 nukleotidů) se syntetizovaný řetězec primárního transkriptu (hnrna) rozštěpí a uvolní z molekuly DNA. 63

65 Obr.: Schéma iniciace transkripce u eukaryot. Legenda: Čtyři různé typy proteinů participují na vytvoření iniciačního komplexu: základní transkripční faktory, aktivátory, koaktivátory a represory. Zdroj: 64

66 Obr.: Přehledné schéma transkripce u eukaryot. Zdroj: 65

67 V.3 TRANSKRIPCE MITOCHONDRIÁLNÍ A CHLOROPLASTOVÉ DNA Poznatky o transkripci mitochondriální a chloroplastové části genomu jsou dosud značně neúplné a proto uvádíme pouze některé základní informace. Genofory v těchto buněčných organelách jsou tvořeny kružnicovými dvouřetězcovými molekulami DNA (podobně jako u bakterií), které nesou strukturní geny i geny pro funkční RNA. Geny mitochondrií i chloroplastů jsou rozmístěné ve více transkripčních jednotkách na obou řetězcích DNA. Mechanismus jejich transkripce je (zřejmě) obdobný jako u prokaryot; rovněž strukturou promotorů a některými vlastnostmi RNA-polymeráz jsou jim blízké. Podobnost organizace mitochondriálního a chloroplastového genomu v mnoha aspektech s organizací prokaryotického (bakteriálního) genomu byla ostatně východiskem pro formulování dnes poměrně široce akceptované endosymbiotické hypotézy. V.4 POSTTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVY Posttranskripční úpravy jsou charakteristickým znakem transkripce eukaryot. Primární transkripty, vzniklé jako bezprostřední produkt transkripce (jaderné, mitochondriální nebo chloroplastové), představují značně velké útvary, které jsou po ukončení transkripce podrobeny určitým procesům, při nichž jsou upravovány do finální podoby: molekuly hnrna na mrna, molekuly pre-rrna na rrna, molekuly pre-trna na trna. Obr.: Celkové schéma posttrakripčních úprav. Zdroj: 66

68 Mezi základní posttranskripční úpravy patří: 1. MODIFIKACE hnrna Již vlastně v průběhu transkripce se na hnrna specificky váží tzv. hnrnp-proteiny za vzniku hnrnp-komplexu. Obdobně se k malým jaderným RNA specificky váží tzv. snrnp-proteiny za vzniku komplexu označovaného jako snrnp-částice. snrnp-částice se mohou napojovat na molekule hnrna do oblasti intronů za vzniku komplexu označovaného jako spliceozom, ve kterém se účastní sestřihu. Další modifikací je tzv. čepička na 5 - konci (m 7 G) hnrna. Je to specifická struktura, která vzniká na 5 - konci transkriptu bezprostředně po jeho uvolnění z templátu a jež obsahuje metylované báze, z nichž dvě jsou spojené 5,5 - glykozidickou vazbou (pro nukleové kyseliny neobvykou). Obecné schéma čepičky je možné vyjádřit ve tvaru: m 7 G 5 ppp 5 N 1 mpn 2 mp... Čepička je místem, na které se váží tzv. CBP-proteiny, které participují v procesu iniciace translace. Na opačném konci, tedy na 3 - konci, je hnrna prodloužena o polyadenylovou sekvenci o délce přibližně nukleotidů, jejíž syntézu katalyzuje poly(a)-polymeráza bez matrice. Jednou z funkcí poly(a) - konce může být ochrana 3 - konce mrna před účinkem exonukleáz v průběhu jejího transportu do cytoplazmy. Obr.: Úpravy hnrna na 5 - a 3 - konci. Zdroj: 67

69 Obr.: Čepička (cap) na 5 -konci hnrna. Legenda: všimněte si atypické 5-5 trifosfátové vazby mezi m 7 G a prvním ribonukleotidem řetězce hnrna. Zdroj: Legenda: všimněte si atypické 5-5 trifosfátové vazby mezi m 7 G a prvním ribonukleotidem řetězce hnrna. Zdroj: 68

70 Obr.: Schéma polyadenylace na 3 -konci hnrna. Legenda: Na 3 - konci hnrna se nachází specifická sekvence (AAUAAA), která je rozpoznána polyadenylátpolymerázou. Ta svou endonukleázovou aktivitou rozštěpí primární transkript ve vzdálenosti asi nukleotidů od této sekvence a následně svou polymerázovou aktivitou katalyzuje připojení přibližně molekul adenozinmonofosfátů k takto vzniklému 3 - konci primárního transkriptu za vzniku úseku polyadenylátového úseku (A) n. Zdroj: 2. SESTŘIH (SPLICING) Kromě jednoduchých strukturních genů, jejichž primární transkripty nejsou posttranskripčně upraveny sestřihem, existují geny složené, jejichž primární transkripty naopak jsou posttranskripčně upraveny sestřihem. Složený gen sestává z úseků označovaných jako introny a exony. Introny se z molekuly hnrna vyštěpují; nestávají se tedy součástí definitivní mrna a ani se netranslatují. Exony se po odstranění intronů spojují a vytvářejí definitivní molekulu mrna, která může být translatována. Sestřih molekul primárního transkriptu určité transkripční jednotky obsahující složený gen může vést buď k molekule mrna vždy o stejné (shodné) primární struktuře (konstitutivní sestřih), anebo k více druhům molekul mrna vzájemně se lišících (alespoň v určitém rozsahu) primární strukturou (alternativní sestřih). 69

71 Obr.: Obecné schéma mechanizmu sestřihu. Zdroj: Obr.: Schéma sestřihu primárního transkriptu genu pro ovalbumin. 70

72 Zdroj: Jestliže existuje alternativní sestřih, je zřejmé, že některé úseky transkriptu složeného genu nemohou působit permanentně jako exony. Takové úseky složeného strukturního genu, které při určitém typu sestřihu fungují jako exony, ale při jiném typu sestřihu jako introny, se nazývají potenciální exony; úseky složeného strukturního genu, které vždy fungují při sestřihu jako exony, se nazývají konstitutivní exony. Z uvedeného vyplývá, že alternativní sestřih tam, kde se uplatňuje, je mechanismem umožňujícím rozšířit variabilitu primární struktury produktů příslušných složených strukturních genů. I když odlišnosti v primární struktuře mezi jednotlivými genovými produkty (polypeptidy, proteiny), vzniklými alternativním sestřihem například molekul primárních transkriptů stejné transkripční jednotky, se mohou jevit jako relativně malé, mohou být příčinou jejich významných strukturních a/nebo funkčních rozdílů. Základní typy alternativního sestřihu a jejich mechanizmy jsou znázorněny na následujícím schématu. Obr.: Schéma základních typů alternativního sestřihu. Zdroj: 71

73 Na primárním transkriptu bývá intron vymezen na úrovni primární struktury tzv. pravidlem GU AG, podle kterého se na 5 - konci transkriptu intronu nachází diribonukleotid GU a na 3 - konci transkriptu intronu diribonukleotid AG. Oblast intronu dále vymezují již zmíněné na ni navázané snrnp-částice. Spliceozom se podílí na vlastním sestřihu především tím, že katalyzuje transesterifikační reakci, jejímž prostřednictvím se může uskutečnit vlastní vyštěpení intronu a následné spojení exonů. Na sestřihu hnrna participuje celá škála proteinů; z nich relativně samostatnou a početnou skupinu tvoří tzv. proteiny pro úpravu prekurzorové RNA, tedy PRP-proteiny. V přirozených podmínkách se vyskytuje několik typů sestřihu. Za nejjednodušší by bylo zřejmě možné označit sestřih monomolekulární, který se uskutečňuje pouze na téže molekule hnrna; výsledná molekula mrna je pak produktem, který vznikne lineárním spojením exonů původní molekuly hnrna po odstranění intronů. Dalším typem sestřihu hnrna je sestřih bimolekulární, který se realizuje za účasti dvou odlišných molekul primárních transkriptů různých transkripčních jednotek tak, že výslednou mrna tvoří lineárně spojené exony pocházející z obou původních molekul hnrna. Sestřihy monomolekulární i bimolekulární se mohou vyskytovat buď v podobě sestřihů konstitutivních, nebo alternativních. Zvláštním případem alternativního sestřihu je sestřih kombinačních exonů. Při tomto sestřihu se v rámci složeného genu vytvářejí různé kombinace souborů potenciálních exonů v závislosti na stadiu ontogenetického vývoje. Tím se významně uplatňuje jako jeden z mechanismů při diferenci organismu. Posttranskripční úpravy pre-rrna a pre-trna se vyznačují některými zvláštnostmi. Z molekuly pre-rrna se v důsledku posttranskripčních úprav vydělí 5,8S-rRNA, 18S-rRNA a 28S-rRNA; při tom jsou degradovány mezerníky oddělující jednotlivé geny pro tyto rrna a rovněž určité úseky na 5 - a 3 - konci pre-rrna. Při sestřihu pre-rrna, kterého se účastní snrnp-částice, jsou odstraněny introny; exony zůstávají (na rozdíl od sestřihu hnrna) vzájemně nespojené jako samostatné molekuly RNA, z nichž většina se stává stavebními složkami ribozomů, ve kterých jsou udržovány ve specifickém prostorovém uspořádání působením ribozomálních proteinů, a menší část jich nadále zůstává v buňce mimo ribozomy, kde se uplatňují při některých jiných procesech (např. při transportu částic ribozomů). Z modifikací pre-rrna lze uvést metylaci určitých jejích nukleotidů. Některé geny pro trna obsahují introny a pre-trna, která vznikne jejich transkripcí, je posttranskripčně upravena sestřihem. Na rozdíl od sestřihu hnrna se v tomto případě uplatňují jiné enzymy: endonukleáza a RNA-ligáza. Primární transkripty mtdna (alespoň u savců) jsou posttranskripčně modifikovány na 3 -konci polyadenylací; na 5 - konci k modifikaci nedochází, tzn. že tam nevzniká čepička. Mitochondriální genom savců nese geny pro 12S-rRNA a 16S-rRNA, mitochondriální genom rostlin pro 5S-rRNA, 18S-rRNA a 26S-rRNA. 72

74 3. SAMOSESTŘIH Samosestřih je forma sestřihu primárního transkriptu, který se realizuje autokatalyticky, v nepřítomnosti proteinů spliceozomu a enzymů katalyzujících sestřih hnrna. Samosestřih je typický pro ribozym, což je molekula RNA, která katalyzuje štěpení a ligaci RNA-substrátů za nepřítomnosti proteinů. Za podmínek in vitro lze za ribozymy považovat některé introny, protože jsou schopny samosestřihu (in vivo se ovšem při sestřihu intronů uplatňují příslušné proteiny a významně účinnost sestřihu potencují). Obr.: Schéma mechanizmu sestřihu a samosetřihu primárního transkriptu Zdroj: 4. EDITACE MITOCHONDRIÁLNÍ RNA Specifickým rysem tohoto typu posttranskripční úpravy (na rozdíl od předchozích tří výše uvedených) je, že se při ní mění původní obsah genetické informace. V důsledku toho primární struktura editované RNA není zcela komplementární k primární struktuře matričního řetězce transkribovaného příslušného strukturního genu. Jinými slovy, v případě translace editované mrna je syntetizován polypeptidový řetězec o aminokyselinovém složení odlišném od aminokyselinového složení polypeptidového řetězce, který by byl syntetizován při translaci needitované mrna. 73

75 Jinými důsledky sekvenčních změn, způsobených editací RNA, mohou být například: alterace (vznik nebo zánik) cílových míst pro působení nukleáz, alterace míst pro splicing (sestřih) nebo změněná sekundární struktura RNA jako příčina změny vazebných míst pro proteiny. Editace není jevem nahodilým, ale přesně řízeným a regulovaným. Jsou známy menší molekuly RNA (řádově o několika desítkách ribonukleotidů), označované jako řídící RNA (grna). Molekula grna určitým svým úsekem hybridizuje s komplementárním úsekem mrna (označovaným jako kotva) a odtud editaci řídí. V současné době je známo, že se editace může uskutečnit mechanismem substituce, inzerce nebo delece bází v polyribonukleotidovém řetězci. Strukturní geny, jejichž genetická informace podléhá editaci, se označují jako kryptogeny. Editace je významný proces, jímž je modifikována genetická informace na úrovni mrna a který se netýká pouze mitochondriální mrna. Abnormální průběh editace RNA je v některých případech v kauzální souvislosti se závažnými patogenetickými procesy. Mechanizmus editace a projevy editace jsou zřejmé z následujících obrázků. Obr.: Schéma mechanizmu editace a jejích důsledků Zdroj: 74

76 Obr.: Patogenetické změny souvisejícími s abnormální editací. Zdroj: 75

77 VI. TRANSLACE Termínem translace se označuje proces překladu genetické informace z mrna do primární struktury proteinů (tj. pořadí aminokyselin v polypeptidových řetězcích). Translace je tedy po transkripci druhým hlavním mechanizmem exprese genetické informace. Můžeme shrnout: genetická informace strukturních genů DNA-organizmů, zakódovaná ve formě sekvence deoxyribonukleotidů DNA, je podle matričního řetězce DNA transkribována buď přímo do mrna, nebo do primárního transkriptu (pre-mrna, hnrna), jehož další posttranskripční úpravou vzniká mrna jako finální produkt. Při translaci na ribozomu pak mrna slouží jako matrice, k níž se na základě komplementarity bází přiřazují svými antikodony jednotlivé molekuly trna, nesoucí na akceptorovém rameni aktivované aminokyseliny, které se navzájem spojují peptidovými vazbami za vzniku polypeptidových řetězců. Translace je velmi složitý, komplexní proces, k jehož realizaci je zapotřebí několika základních složek: mrna, soubor trna, soubor standardních aminokyselin, ribozomy, zdroje energie, sada enzymů a (bílkovinných) faktorů participujících na iniciaci, elongaci a terminaci translace. O struktuře trna a některých jejich dalších vlastnostech bylo stručně pojednáno výše a proto jim již nebude věnována pozornost. Aminokyseliny, které se účastní proteosyntézy (translace), musejí být aktivované. Při aktivaci aminokyselin nejprve nastává reakce karboxylové skupiny určité aminokyseliny s fosfátovou skupinou ATP, katalyzovaná enzymem aminoacyl-trna- syntetáza, za vzniku aminoacyladenylátu (aa~amp) a uvolnění pyrofosfátu. Enzym (aa-trna-syntetáza) zůstává spojen s aa~amp až do setkání s trna, specifickou pro tuto aa-trna-syntetázu; aa-trnasyntetáza v momentě setkání katalyzuje přenos aminokyseliny z aa~amp na 3 - nebo 2 -konec adenozinfosfátu koncové skupiny ribonukleotidů CCA na 3 -konci akceptorového ramene trna za vzniku aminoacyl~trna (aa~trna) a AMP. Výsledkem aktivace aminokyselin je vznik makroergní vazby mezi aminokyselinou a trna, která se uplatňuje při následných translačních dějích. 76

78 Obr.: Schéma průběhu translace. Zdroj: 77

79 Obr.: Schéma aktivace aminokyselin. Legenda: Amino acid (aa) + adenosine triphosphate (ATP) + aminoacyl-trna synthetase (aars) aminoacyl-adenylate + PPi Legenda: aminoacyl-adenylate.aars + trna aminoacyl-trna + adenosine monophosphate (AMP) Zdroj: 78

80 Ribozomy jsou buněčné supramolekulární struktury, na nichž probíhá proteosyntéza při translaci genetické informace. Jejich základní stavební složku tvoří různé druhy rrna a řada specifických proteinů. Nacházejí se jednak v cytoplazmě buněk eukaryot i prokaryot, jednak v mitochondriích a chloroplastech eukaryot. Virové částice ribozomy neobsahují. Obr.: Složení prokaryotických a eukaryotických ribozomů. Zdroj: Prokaryotické (bakteriální) cytoplazmatické ribozomy jsou složeny ze dvou podjednotek se sedimentačními konstantami 30S a 50S; kompletní ribozom, vzniklý asociací obou těchto podjednotek, má sedimentační konstatntu 70S. Ribozomy prokaryotického typu se vyskytují též v mitochondriích a chloroplastech eukaryotických buněk. Tyto ribozomy kromě shodných nebo blízkých hodnot sedimentačních konstant vykazují ještě řadu dalších shodných nebo podobných znaků (zároveň však též i řadu znaků odlišných) s cytoplazmatickými ribozomy prokaryot, což pozitivně koreluje s endosymbiotickou hypotézou o původu mitochondrií a chloroplastů. Na povrchu ribozomů jsou rozložena různá specifická vazebná místa. Při translaci se významně uplatňuje vazebné místo pro mrna na podjednotce 30S (obsahuje několik specifických proteinů a 3 - konec 16S-rRNA), aminoacylové místo (A-místo) lokalizované z větší části na podjednotce 50S (obsahuje několik specifických proteinů a 16S-rRNA, je místem vstupu a navázání aa~trna), peptidylové místo (P-místo) lokalizované z větší části 79

81 na podjednotce 50S (obsahuje několik specifických proteinů, je místem navázání peptidyltrna), výstupní místo pro deacylovanou trna (E-místo) na podjednotce 50S, peptidyltransferázové místo na podjednotce 50S (katalytická aktivita peptidyltransferázy), vazebná místa pro iniciační faktory a vazebná místa pro elongační faktory. Eukaryotické cytoplazmatické ribozomy jsou složeny z podjednotek o sedimentačních konstantách 40S a 60S, jejichž asociací vzniká kompletní ribozom o sedimentační konstantě 80S. Mohou se v cytoplazmě vyskytovat buď volně, nebo vázané na endoplazmatické retikulum (tzv. drsné endoplazmatické retikulum). Proces translace lze rozdělit do tří fází: iniciace, elongace, terminace. Výsledkem iniciačních procesů (za účasti iniciačních faktorů) je vznik tzv. iniciačního komplexu sestávajícího z ribozomu (70S, resp. 80S), mrna a iniciační trna. Při elongaci se za účasti elongačních faktorů realizuje proteosyntéza téměř celého polypeptidového řetězce mechanizmem polykondenzace aminokyselin podle matrice, kterou je mrna. Terminace zahrnuje děje související s ukončením translace (tj. s dokončením biosyntézy polypeptidového řetězce) za účasti terminačních faktorů. VI.1 TRANSLACE V PROKARYOTICKÉ BUŇCE Při iniciaci nejprve disociuje ribozom 70S na své dvě podjednotky 30S a 50S. Následně se iniciační faktor IF3 naváže na jednotku 30S (čímž je stabilizován disociovaný stav ribozomu) a iniciační faktor IF2 se specificky váže s trna pro formylmetionin (fmet~trna fmet ) za vzniku binárního komplexu, ke kterému se účinkem IF2 (plní funkci G-proteinu) naváže ještě GTP za vzniku ternárního komplexu. Dále faktor IF3 (v komplexu s podjednotkou 30S) umožňuje navázání ternárního komplexu (neboť je rozpoznáván faktorem IF2) a mrna na ribozom (prostřednictvím Shineovy - Dalgarnovy sekvence na 3 -konec 16S-rRNA podjednotky 30S), přičemž prostorové vztahy mezi těmito jednotlivými složkami na podjednotce 30S jsou takové, že se iniciační kodon AUG na mrna dostává právě na peptidylové místo P; s navázáním ještě iniciačního faktoru IF1 dochází k zformování tzv. preiniciačního komplexu (mrna.30s.if3.fmet~trna fmet.if2.gtp.if1). Po vytvoření preiniciačního komplexu dochází k jeho dekompozici tím, že se uvolňuje iniciační faktor IF1 a IF3, inaktivuje se faktor IF2 (hydrolýzou GTP na GDP + P) a jednotka 30S může opět asociovat s podjednotkou 50S za vzniku kompletního ribozomu 70S. Po uvolnění všech iniciačních faktorů (tj. IF1, IF2, IF3) je s podjednotkou 30S spojena pouze mrna s kodonem AUG v místě P, ke kterému je komplementárně připojena svým antikodonem fmet~trna fmet ; tyto komponenty dohromady představují tzv. iniciační komplex (mrna.30s.fmet~trna fmet ), jehož vytvořením končí fáze iniciace translace a počíná fáze elongace translace. Inkorporace fmet~trna fmet Do preiniciačního komplexu je interakcí iniciačních faktorů IF2 a IF3 specificky inkorporována fmet~trna fmet. Primárně je tedy první aminokyselinou polypeptidového řetězce formylmetionin, který vzniká formylací metioninu formylázou po jeho připojení k trna pro formylmetionin (trna fmet ). Po začlenění formylmetioninu do polypeptidového řetězce je však deformylázou katalyzována deformylace formylmetioninu; často dokonce dochází k odštěpení iniciačního 80

82 metioninu účinkem aminopeptidázy, takže takový polypeptid pak začíná jinou aminokyselinou než metioninem. Elongace translace u prokaryot začíná vytvořením binárního komplexu sestávajícího z GTP a elongačního faktoru EF-Tu. Binární komplex se následně spojí s aa~trna (jinou než fmet~trna fmet ) za vzniku ternárního komplexu, který je důležitý pro navázání aa~trna do aminoacylového místa A na ribozomu 70S. Po komplementárním spárování bází kodonu mrna s antikodonem aa~trna v místě A nastává hydrolýza GTP na GDP + P, která rezultuje v uvolnění elongačního faktoru EF-Tu a GDP a účinkem peptidyltransferázy se vytvoří peptidová vazba mezi karboxylovou skupinou první aminokyseliny (obecně aminokyseliny, kterou přenáší aa~trna nacházející se v místě P) a aminoskupinou následující aminokyseliny (obecně aminokyseliny, kterou přenáší aa~trna nacházející se v místě A); za katalytického účinku elongačního faktoru EF-Ts se realizuje výměna GDP GTP a tím se obnovuje funkční schopnost binárního komplexu. Dále následuje translokace ribozomu o tři nukleotidy (tedy o jeden kodon) směrem k 3 - konci mrna. Tímto posunem aa~trna, která předtím byla na místě A, nyní zaujme místo P a na místo A se dostane další kodon mrna, k němuž bude již popsaným způsobem dotransportována a komplementárně připojena svým antikodonem příslušná aa~trna. Posun ribozomu podél mrna vždy o jeden kodon je realizován za účasti elongačního faktoru EF-G a spotřeby energie uvolněné hydrolýzou GTP. Sama translokace aa~trna z místa A do místa P je proces vícestupňový, při kterém se uplatňuje ještě tzv. místo E; po vytvoření peptidové vazby mezi aminokyselinou aa~trna v místě P a aminokyselinou aa~trna v místě A dochází k deacylaci trna a tím k uvolnění aminokyseliny, kterou transportovala do syntetizovaného polypeptidového řetězce. Místo E je výstupním místem pro deacylovanou trna, ve kterém se uvolňuje z ribozomu a může znovu plnit svou funkci. Popsaný proces elongace se cyklicky opakuje počínaje druhou a konče poslední aminokyselinou syntetizovaného polypeptidového řetězce. Každá aktivovaná aminokyselina (resp. každá aa~trna), zapojená do proteosyntézy na ribozomu, musí projít místem A; výjimkou je fmet~trna fmet pro formylmetionin (obecně iniciační aa~trna), která je transportována přímo na místo P. Terminace translace zahrnuje procesy související s ukončením syntézy polypeptidového řetězce na místě terminačního kodonu v přítomnosti terminačních faktorů RF1 (rozpoznává terminační kodony UAA, UAG), RF2 (rozpoznává terminační kodony UAA, UGA) a RF3 (plní zřejmě stimulační funkci vůči terminačním faktorů RF1 a RF2). Terminační faktory ve vazbě na GTP se podílejí na uvolňování trna z C-konce polypeptidového řetězce; tím jsou navozeny podmínky pro ukončení jeho další elongace. Součástí terminace je uvolnění nasyntetizovaného polypeptidového řetězce z ribozomu a následná disociace samotného ribozomu na své podjednotky 30S a 50S. Je-li k dispozici nově transkribovaná mrna, může být zahájen celý proces translace znovu počínaje iniciací. 81

83 Obr.: Celkové schéma průběhu translace u prokaryot. Zdroj: 82

84 Obr.: Obecné schéma translace u prokaryot Zdroj: 83

85 VI.2 TRANSLACE V EUKARYOTICKÉ BUŇCE Na počátku iniciace v důsledku navázání iniciačního faktoru eif-3 na podjednotku 40S a iniciačního faktoru eif-3a (dříve eif-6) na podjednotku 60S nastává disociace ribozomu 80S. Na vytvořený komplex eif-3.40s se poté naváže iniciační faktor eif-1a (dříve eif-4c) za vzniku komplexu 40S.eIF-3.eIF-1A. Iniciační faktor eif-2 se připojí ke GTP za účinku iniciačního faktoru eif-2b a vytvoří se komplex GTP.eIF-2, který se spojí s iniciační Met transferovou ribonukleovou kyselinou Met~tRNA i za vzniku ternárního komplexu GTP.eIF-2.Met~tRNA Met i. Ternární komplex se připojí ke komplexu 40S.eIF3.eIF-1A a vznikne komplex GTP.eIF-2.Met~tRNA Met i.40s.eif-3.eif-1a. Současně se iniciační faktor eif-4 (dříve eif-4f) naváže na čepičku m 7 G mrna; k tomuto komplexu se následně připojí iniciační faktor eif-4a, jehož helikázovou aktivitou a za účasti iniciačního faktoru eif-4b a využití energie uvolněné z ATP dochází k rozvolnění sekundární struktury mrna. (Iniciační faktory eif-4, eif-4a, eif-4b patří mezi CBP-proteiny a plní ochrannou funkci čepičky zejména proti účinku exonukleáz.) V dalším sledu dějů se eif-4b spojí s eif-3 na podjednotce 40S, k níž se poté připojí mrna. Za účasti iniciačních faktorů eif-4, eif-4a a eif-4b se na místo P proti iniciačnímu kodonu AUG mrna naváže svým antikodonem Met~tRNA Met i. Dále dochází za účasti iniciačního faktoru eif-5 k hydrolýze GTP, čímž jsou navozeny podmínky pro uvolnění komplexu GDP.eIF-2 (který posléze účinkem iniciačního faktoru eif- 2 přechází opět na komplex GTP.eIF-2) a iniciačních faktorů eif-3, eif-3a, eif-4, eif-4a, eif-4b, eif-5. Tím jsou vytvořeny podmínky pro spojení obou ribozomálních podjednotek za vzniku iniciačního komplexu. V další fázi je do místa A transportována aa~trna komplementární svým antikodonem s příslušným kodonem mrna. Mezi karboxylovou skupinou metioninu, neseného met-trna Met i v místě P a aminokyselinou, nesenou aa~trna v místě A, se vytvoří peptidová vazba za účasti iniciačního faktoru eif-5a (dříve eif-4d). Tím je zakončena fáze iniciace translace. Elongace se realizuje za účasti elongačních faktorů, které plní obdobné funkce jako elongační faktory u prokaryot. Elongační faktor EF-1 se vyskytuje ve dvou formách: EF-1α, který odpovídá prokaryotickému faktoru EF-Tu, a EF-1βγ, který odpovídá prokaryotickému faktoru EF-Ts. Elongační faktor EF-2 odpovídá prokaryotickému faktoru EF-G. Vlastní průběh elongace translace u eukaryot se zásadně neodlišuje od průběhu elongace u prokaryot. Terminace translace se uskutečňuje na terminačních kodonech (UAA, UAG, UGA) za účasti jediného terminačního faktoru RF (na rozdíl od tří terminačních faktorů u prokaryot), který rozpoznává terminační kodony; za využití energie, vznikající hydrolytickým štěpením GTP vázaného na terminační faktor RF, dochází k uvolnění polypeptidového řetězce z ribozomu (včetně vzniklého komplexu GTP.RF). 84

86 Obr.: celkové schéma translace u eukaryot. Zdroj: 85

87 Obr.: Průběh translace u eukaryot - iniciace. Zdroj: 86

88 Obr.: Průběh translace u eukaryot - iniciace. Zdroj: Obr.: Průběh translace u eukaryot - elongace. Zdroj: 87

89 Obr.: Průběh translace u eukaryot - elongace. Zdroj: Obr.: Průběh translace u eukaryot terminace. 88

90 Zdroj: Obr.: Průběh translace u eukaryot terminace. Zdroj: 89

91 Obr.: Porovnání exprese genetické informace u prokaryot a eukaryot. Legenda: Prokaryota transkripce a translace probíhají simultánně v cytoplazmě, regulace genové exprese se realizuje na úrovni transkripce. Eukaryota transkripce a translace probíhají odděleně časově i prostorově (transkripce v buněčném jádru, translace v cytoplazmě na ribozomech); regulace genové exprese se realizuje na úrovni transkripce (sestřih primárního transkriptu v buněčném jádru) i na úrovni translace (v cytoplazmě). Další úpravy mohou nastat jako posttranslační modifikace proteinů. Zdroj: 90

92 VI.3 TRANSLACE V MITOCHONDRIÍCH Templátem pro translaci v mitochondriích je mrna transkribovaná z mtdna. Ribozomy mitochondrií jsou považovány za ribozomy prokaryotického typu. Rovněž translace na mitochondriálních ribozomech probíhá obdobně jako u prokaryot, včetně řazení formylmetioninu jako iniciační aminokyseliny. Autonomie translace (jakožto i některých dalších molekulárně-biologických procesů) v mitochondriích není úplná, naopak, je v určitém rozsahu závislá na produktech cytoplazmatických dějů, především na některých proteinech, nepostradatelných pro realizaci translace (např. aa~trna-syntetázy, proteinové komponenty ribozomů, iniciační a elongační faktory). Charakteristickou zvláštností genetických procesů v mitochondriích je existence určitých odchylek od standardního genetického kódu a schopnost mitochondriálních trna tento pozměněný genetický kód číst. Obecné schéma translace v mitochondriích a schéma, znázorňující propojení exprese jaderných a mitochondriálních genů, jsou na následujících obrázcích. Obr.: Obecné schéma translace v mitochondriích. Zdroj: 91

93 Obr.: Schéma propojení exprese jaderných a mitochondriálních genů. (na příkladu aparátu pro oxidativní fosforylaci). Zdroj: Tab.: Odchylky mitochondriálního genetického kódu od standardního kódu. kodon Význam ve standardním genetickém kódu Význam v mitochondriálním kódu obratlovců Význam v mitochondriálním kódu kvasinek AUA Ile Met Met UGA stop Trp Trp AGA Arg stop Arg AGG Arg stop Arg CUU Leu Leu Thr CUC Leu Leu Thr CUA Leu Leu Thr CUG Leu Leu Thr 92

94 VI.4 TRANSLACE V CHLOROPLASTECH Rovněž v chloroplastech jsou zastoupeny ribozomy prokaryotického typu (přibližně 70S, podjednotky 30S a 50S) a průběh translace je v obecné rovině shodný s průběhem translace u prokaryot, včetně formylmetioninu jako iniciační aminokyseliny. Typické pro translaci v chloroplastech je uplatnění pravidla o kolísavém párování bází ve značném rozsahu. Autonomie translace i některých dalších molekulárně biologických procesů v chloroplastech je omezená podobně jako u mitochondrií, avšak genetický kód je standardní. VI.5 KOTRANSLAČNÍ A POSTTRANSLAČNÍ ÚPRAVY Kotranslační úpravy se uskutečňují v průběhu translace; jsou to tedy úpravy nascentního polypeptidového řetězce. Posttranslační úpravy se realizují až na dosyntetizovaném polypeptidovém řetězci, tedy až po dokončení jeho syntézy na ribozomu, a jejich výsledkem je vznik funkčního polypeptidového řetězce. Některé úpravy se mohou uplatňovat jak kotranslačně, tak posttranslačně. Kotranslační úpravou, charakteristickou pro prokaryota, mitochondrie a chloroplasty eukaryot, je deformylace formylmetioninu katalyzovaná deformylázou. Obecně se vyskytující kotranslační úpravou u prokaryot i eukaryot je odštěpení N- koncové aminokyseliny nebo skupiny aminokyselin u některých syntetizovaných polypeptidových řetězců. Mezi kotranslační úpravy lze zařadit rovněž různé chemické modifikace polypeptidu jako je hydroxylace některých aminokyselin (lyzin, prolin), glykozylace za vzniku glykoproteinů nebo tvorba disulfidických vazeb, která participuje (kromě jiných mechanismů) na utváření sekundární a terciární struktury. Tato skupina úprav se může realizovat též posttranslačně. Typicky posttranslačními úpravami je vyštěpení molekuly funkčního polypeptidu z některých primárních produktů translace, připojení prostetických skupin k polypeptidovým řetězcům, vytvoření kvartérní struktury molekul složených proteinů a formování supramolekulárních struktur. Exprese genetické informace je soubor složitých, časově a prostorově uspořádaných procesů. Je zřejmé, že se neomezuje pouze na transkripci a translaci v užším slova smyslu, tj. na vlastní přepis informace z matričního řetězce DNA do polyribonukleotidového řetězce primárního transkriptu na základě principu komplementarity a na vlastní proteosyntézu na ribozomech za vzniku primárního produktu translace (polypeptidového řetězce), ale zahrnuje též řadu dalších dějů, z nichž některé byly zmíněny, nezbytných pro biosyntézu biologicky aktivních, funkčních produktů strukturních genů. Na tomto místě považuji za vhodné připomenout roli tzv. slabých vazeb (nekovalentních interakcí), které na úrovni fyzikálněchemické vymezují základní rámec možných interakcí mezi (makro)molekulami při uskutečňování různých životních procesů v organizmu a jejich variability ( plastičnosti ) na molekulární úrovni; význam těchto vazeb pro specificky biologické procesy (např. 93

95 rozpoznávání na molekulární úrovni, princip komplementarity, přechody asociace disociace, autoregulace) bývá někdy opomíjen nebo není dostatečně zdůrazněn v širších souvislostech. Obr.: Příklady posttranslačních úprav proteinů. Zdroj: 94

96 VII. REGULACE GENOVÉ EXPRESE Jak již bylo uvedeno dříve, genetická informace se exprimuje prostřednictvím transkripce a translace. V buňkách prokaryot i eukaryot jsou tyto procesy, včetně posttranskripčních a posttranslačních úprav, regulovány. Regulace genové exprese je nezbytná pro normální fungování genomu. Uplatňuje se např. v diferenciačních procesech při zapínání a vypínání určitých genů nebo genových oblastí v průběhu ontogeneze; selhání těchto regulačních procesů může mít závažné negativní až fatální důsledky (vrozené vývojové vady, poruchy imunity, maligní transformace, letalita apod.). Mechanismy regulace genové exprese umožňují organizmu adekvátně reagovat na některé změny vnějšího prostředí a jejich biologické účinky v organizmu; spolupodílejí se tak na procesech morfogeneze a fyziologické adaptace. Při regulaci transkripce se významně uplatňují regulační proteiny. Molekula regulačního proteinu obvykle obsahuje specifické vazebné místo, kterým se naváže na určitou regulační oblast DNA (např. na promotor), kde plní funkci regulátoru, tzn. účastní se regulace příslušného děje (např. transkripce). Regulační protein může po vazbě na specifickou regulační oblast DNA příslušný regulovaný proces stimulovat (např. navodí podmínky pro činnost RNA-polymerázy) nebo inhibovat (např. navodí podmínky, za kterých činnost RNApolymerázy není možná); v prvním případě jsou regulační proteiny označovány jako pozitivní, ve druhém případě jako negativní. Mnohdy je regulační funkce regulačního proteinu podmíněna (nebo ovlivněna) navázáním efektoru na vazebné místo pro efektor nacházející se na molekule regulačního proteinu. Následkem navázání efektoru na regulační protein může být konformační změna, která teprve buď umožní vazbu regulačního proteinu na specifickou regulační oblast DNA (např. promotor) a realizaci jeho regulační funkce, anebo naopak znemožní vazbu regulačního proteinu na specifickou regulační oblast DNA (např. promotor) a realizaci jeho regulační funkce. V uvedených příkladech se jedná o alosterické efektory, které mohou být pozitivní, jestliže v důsledku konformačních změn po vazbě na regulační protein vedou k jeho navázání na příslušnou regulační oblast, anebo negativní, jestliže v důsledku konformačních změn po vazbě na regulační protein vedou k inhibici jeho vazby na příslušnou regulační oblast. Některé formy regulace genové exprese se realizují na úrovni operonu. V této souvislosti je významnou regulační oblastí operonu operátor. Za vhodných podmínek se na operátor váže represor, který je možno definovat jako negativní protein kódovaný regulačním genem. Následkem této vazby je změna prostorového uspořádání, která RNApolymeráze znemožní buď napojit se na promotor, anebo se z promotoru posunout dále ke strukturním genům operonu; v obou případech se nerealizuje transkripce v rozsahu celého operonu, tj. všech jemu příslušejících strukturních genů. S molekulami represorů mohou interagovat molekuly dalších dvou skupin látek s regulační funkcí: induktory a korepresory. Vazbou induktoru na represor se projeví alosterický efekt, jehož důsledkem je inaktivace represoru, tzn. neschopnost represoru navázat se na operátor; jestliže tedy vazba represoru na operátor rezultuje v zastavení transkripce 95

97 operonu, potom vazba induktoru na represor rezultuje v uvolnění represoru z operátoru a obnovu transkripce. Je zřejmé, že induktor plní funkci negativního alosterického efektoru. Vazbou korepresoru na represor se v důsledku alosterického efektu aktivuje represor; to znamená, že represor nabyde konformace, v níž se může vázat na operátor a inhibovat transkripci operonu. V takovýchto případech je tedy represor sám o sobě neaktivní, nemůže se bez spojení s korepresorem navázat na operátor a reprimovat transkripci příslušného operonu. Z uvedeného je zřejmé, že existují dva základní typy represorů: (1) represory, které jsou aktivní samy o sobě a stávají se inaktivními reakcí s induktorem (jsou inaktivovatelné induktorem), (2) represory, které jsou samy o sobě inaktivní a stávají se aktivními až reakcí s korepresorem (jsou aktivovatelné korepresorem). V souvislosti s tím rozlišujeme jednak regulaci operonu negativní, při níž dochází k zastavení transkripce v důsledku navázání aktivního represoru na operátor, jednak regulaci operonu pozitivní, při níž dochází k transkripci v důsledku uvolnění represoru z operátoru. Mezi rozšířené formy regulace genové exprese, založené na negativní regulaci operonu, patří enzymová indukce a enzymová represe. Enzymová indukce se týká pouze tzv. inducibilních enzymů, jejichž biosyntéza je závislá (na rozdíl od tzv. konstitutivních enzymů) na přítomnosti induktoru. Induktor je specifická látka (např. substrát), která vede k produkci určitého enzymu. Jako příklad inducibilního enzymu lze uvést β galaktozidázu Escherichia coli, jejímž induktorem je laktóza. Bakterie syntetizují tento enzym v hojném množství pouze v přítomnosti laktózy jako jediného zdroje uhlíku v živném médiu; naopak, není-li laktóza v médiu přítomna jako jediný zdroj uhlíku a je jím jiná látka, např. glukóza, je využívána ona a syntéza β galaktozidázy ustává (resp. je udržována na minimální bazální úrovni). Enzymová represe je založena na principu potlačení biosyntézy jednoho enzymu nebo více enzymů některým z metabolitů (zpravidla konečným produktem) biosyntetické dráhy, v níž se sám tento enzym (tyto enzymy) katalyticky uplatňuje (uplatňují). Represe v tomto případě odráží kvantitativní zastoupení příslušného metabolitu, který funguje jako korepresor. Zvýší-li se koncentrace korepresoru nad určitou hraniční mez, dochází k enzymové represi; sníží-li se koncentrace korepresoru v důsledku jeho intracelulární utilizace pod tuto hraniční mez, obnovuje se funkce příslušné biosyntetické dráhy. Formou regulace genové exprese, založenou na aktivní regulaci operonu, je katabolické represe. Při katabolické represi je určitým substrátem potlačena biosyntéza určitého enzymu i v přítomnosti induktoru. Tento typ regulace genové exprese můžeme demonstrovat na již zmiňovaném případu indukce β galaktozidázy v buňkách Escherichia coli v přítomnosti laktózy jako induktoru, je-li jediným zdrojem uhlíku; jestliže dalším zdrojem uhlíku v živném médiu bude v dostatečné koncentraci glukóza, která je metabolizována přednostně, resp. katabolity glukózy, bude syntéza β galaktozidázy reprimována. V mechanizmu katabolické represe se uplatňuje tzv. katabolický aktivační protein (CAP), který zvyšuje afinitu promotoru k RNA-polymeráze poté, co se jako součást komplexu s camp naváže v přítomnosti induktoru do oblasti promotoru. CAP v tomto procesu plní funkci pozitivního regulačního proteinu, camp pozitivního alosterického efektoru. V uvedeném příkladu katabolické represe syntézy β galaktozidázy v přítomnosti glukózy jako druhého substrátu (vedle laktózy) v živném médiu E. coli katabolity glukózy 96

98 inhibují syntézu camp, kterého se pak nedostává k vytvoření komplexu CAP camp; omezená dostupnost a tím i omezená možnost navázání komplexu CAP camp do oblasti promotoru vede k snížení až znemožnění vazby RNA-polymerázy na promotor a tomu odpovídající inhibici až zástavě transkripce. Enzymová indukce, enzymová represe a katabolická represe patří mezi formy regulace genové exprese rozšířené a dobře známé zejména u bakterií. Jiným způsobem regulace transkripce u prokaryot je atenuace. Uplatňuje se při ní tzv. atenuátor, což je specifická oblast vedoucí sekvence DNA, jejíž určitý úsek funguje jako předčasný terminátor transkripce některých operonů. Vyskytuje se např. v tryptofanovém operonu E. coli. Regulace exprese genů kódujících rrna a trna u prokaryot je závislá na dostupnosti aminokyselin z vnějšího prostředí. Za podmínek, kdy je syntéza trna a rrna pro nedostatek aminokyselin již zastavena, může syntéza mrna ještě pokračovat; tento jev se označuje jako striktní regulace. U prokaryot se jako účinný způsob regulace genové exprese uplatňuje protismyslová RNA (= antisense RNA). Je to transkript RNA komplementární k jiné molekule (nebo k části molekuly) RNA, s níž se spojuje a tím inhibuje její funkci. Například u Escherichia coli existuje protismyslová (antisense) RNA komplementární k mrna, která je přepisem genu pro transponázu; vznik hybridní molekuly RNA (mrna x komplementární antisense RNA) zabraňuje translaci této mrna a tím inhibuje syntézu transponázy. V buňkách eukaryot existuje celá řada dalších způsobů regulace genové exprese. Vzhledem k tomu, že molekulární mechanizmy jejich působení jsou tématy jiných předmětů (zejména molekulární a buněčné biologie), nebudeme se jimi zde podrobně zabývat. Pouze připomeneme některé z nich. Aktivátory iniciace transkripce umožňují zvýšit účinnost transkripce nad bazální hodnotu tím, že se váží se základními transkripčními faktory při formování preiniciačního komplexu a přispívají k jeho větší stabilitě. Některé aktivátory při interakci se základními transkripčními faktory nepůsobí přímo, ale prostřednictvím dalších proteinových molekul, tzv. koaktivátorů. Účinnost transkripce pozitivně ovlivňují specifické regulační oblasti na DNA tzv. zesilovače transkripce. Zesilovač transkripce interaguje prostřednictvím transkripčních faktorů s promotorem, přičemž výsledkem této interakce je uvedení RNA-polymerázy do aktivního stavu, v němž může zahájit transkripci. Naopak negativně ovlivňují účinnost transkripce tzv. tlumiče transkripce, které většinou rovněž působí prostřednictvím interakce s některými transkripčními faktory. V průběhu ontogenetického vývoje se uplatňuje specifická aktivace genů, která se v zásadě děje dvěma základními způsoby: buď je určitý gen v uvažované tkáni aktivován k transkripci biosyntézou specifického transkripčního faktoru v dané tkáni (a pro ni charakteristického), anebo je ve tkáni aktivován specifický transkripční faktor, který následně stimuluje transkripci v buňkách této tkáně. Alternativní sestřih probíhající v různých tkáních odlišně je mechanismem zajišťujícím variabilitu finálních produktů transkripce strukturních genů a konsekventně i produktů translace mezi jednotlivými tkáněmi v rámci diferencovaného mnohobuněčného 97

99 organizmu. Je zřejmé, že na alternativním sestřihu participují tkáňově specifické transkripční faktory. Homeotické geny zahrnují zvláštní a velice složitou skupinu regulačních mechanismů, které se uplatňují při morfogenetických procesech v přesně časově uspořádaných a lokalizovaných posloupnostech. Expresi genetické informace ovlivňují četné hormony (např. steroidní), pro které existují intracelulární (cytoplazmatické nebo jaderné) receptory, fungující jako transkripční faktory. Po vazbě hormonu na takový receptor dochází k navázání komplexu receptor hormon na hormonový responzivní element (HRE), lokalizovaný na promotoru, popř. zesilovači transkripce. Některé další hormony se váží na receptory umístěné v cytoplazmatické membráně (např. inzulin, glukagon, FSH, ACTH, LH); vznik takové vazby vede k aktivaci G-proteinů a následné sérii reakcí zprostředkujících přenos signálu z receptoru prostřednictvím druhého přenašeče (posla) až na cílové molekuly, které se uplatňují v reakci buňky na signál indukovaný hormonem. Na ještě mnohem komplexnější úrovni je genová exprese ovlivněna regulací buněčného cyklu. Podobně můžeme do regulace genové exprese zahrnout procesy spojené s funkcemi imunitního systému (ať už se jedná o tzv. imunitu zprostředkovanou buňkami nebo o tzv. protilátkovou imunitu), procesy související s maligní transformací, aktivitami protoonkogenů a onkogenů. Obr.: Regulace transkripce prostřednictvím zesilovače (enhanceru). Zdroj: 98

100 Obr.: Regulace transkripce prostřednictvím mirna. Zdroj: Obr.: Regulace genové exprese remodelací chromatinu. Zdroj: 99

101 Obr.: Regulace genové exprese epigenetickými vlivy metylace DNA. Legenda: Některé chemické modifikace (např. metylace některých komponent chromatinu) jako epigenetické vlivy mohou vést ke vzniku heterochromatinu (tedy transkripčně neaktivní formě chromatinu) v euchromatinových oblastech chromozomů. Zdroj: e/04_03.html Obr.: Schéma různých úrovní a způsobů regulace genové exprese ueukaryot. Zdroj: 100

102 VIII. ROZMNOŽOVÁNÍ A PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE Jak již bylo uvedeno dříve, genetická informace se přenáší při buněčném dělení jednak z generace rodičovské na generaci potomků (vertikálním směrem), jednak (v rámci mnohobuněčných organizmů) z jedné generace somatických buněk do generace následující (horizontálním směrem). U mnohobuněčných eukaryotických sexuálně se rozmnožujících organizmů je vertikální přenos zprostředkován především pohlavními buňkami, vznikajícími jako produkt meiotického dělení. U prokaryotických organizmů se typické pohlavní rozmnožování nevyskytuje, avšak za jeho obdobu můžeme považovat konjugaci (např. u bakterií). Nepohlavně se rozmnožující organizmy vznikají v zásadě jako produkty mitotického dělení, stejně jako somatické buňky mnohobuněčného organizmu. Pro správné pochopení a interpretaci genetických procesů u jednotlivých skupin organizmů je tedy třeba znát způsob jejich reprodukce. Z tohoto důvodu je dále uvedena stručná charakteristika základních typů rozmnožování a životních cyklů. VIII.1 BUNĚČNÉ DĚLENÍ Buněčné dělení je jako součást buněčného cyklu základním mechanizmem autoreprodukce buněk. Zpravidla se rozlišují čtyři základní typy buněčného dělení: binární, mitotické (neboli nepřímé), meiotické (neboli redukční) a amitotické (neboli přímé). VIII.1.1 BINÁRNÍ DĚLENÍ Jedná se pravděpodobně o nejjednodušší a v krátkém časovém intervalu uskutečňované buněčné dělení, které je typické pro bakteriální buňky. Souběžně s růstem buňky se replikuje bakteriální (prokaryotický) chromozom a exprimuje se genetická informace. Po zreplikování prokaryotického chromozomu dochází k syntéze buněčné stěny a cytoplazmatické membrány směřující mezi oba chromozomy, které posléze oddělí a původní buňka se rozdělí ve dvě geneticky identické buňky: mateřskou a dceřinnou. V některých pracích se uvádí, že bakteriální buňky se dělí mitoticky. Takový názor je značnou simplifikací, neboť u bakterií nelze uvažovat o buněčném cyklu v pravém slova smyslu (tak, jak je znám u eukaryot): neexistuje zřetelné rozhraní procesů odpovídajících interfázi a vlastní mitóze, ani jednotlivých fází interfáze a mitózy, absentují procesy spojené se změnami buněčného jádra a cytoplazmatických organel v průběhu buněčného dělení (bakteriální buňka tyto útvary neobsahuje) a další. Prokaryotická (bakteriální) buňka je obecně považována za haploidní. 101

103 Obr.: Binární dělení u prokaryot. Zdroj: VIII.1.2 MITÓZA Z genetického hlediska lze na mitózu nahlížet jako na mechanizmus zajišťující přesnou reprodukci (replikaci) genetické informace obsažené v jaderném genomu eukaryot a její přenos v nezměněné podobě z buňky mateřské do buňky dceřinné. Teoreticky tedy opakovaným mitotickým dělením vzniká populace buněk se stejným počtem chromozomů obsahujících identickou genetickou informaci; takovou populaci buněk označujeme jako klon. Mitóza je základním typem buněčného dělení uplatňujícím se při dělení somatických buněk a při nepohlavním rozmnožování. Reprodukce (replikace) genetické informace obsažené v buněčném jádru se realizuje v interfázi v průběhu S-fáze (syntetická fáze) jako zdvojení chromozomů. V somatické buňce za základní považujeme diplodní počet chromozomů (2n). V presyntetické fázi interfáze (tj. v G1-fázi) je každý chromozom tvořen dvojicí vláken sestávajících z despiralizovaného chromatinu a představujících jednu chromatidu. V průběhu S-fáze se chromatin (přesněji DNA) jednotlivých chromozomů zreplikuje a každý zreplikovaný chromozom tak sestává ze dvou identických chromatid spojených centromerou. Po replikaci diplodního počtu chromozomů (2n) v průběhu S-fáze buňka dočasně obsahuje fakticky dvojnásobný počet chromozomů. Po postsyntetické fázi interfáze, tj. po G2-fázi, pokračuje 102

104 buněčný cyklus mitózou, v jejímž průběhu se sesterské chromatidy, z nichž sestávají jednotlivé chromozomy, v metafázi od sebe oddělí v důsledku rozdělení centromer a v anafázi přesunou k opačným pólům dělicího vřeténka. Výsledkem karyokineze jsou dvě buněčná jádra, z nichž každé obsahuje diploidní počet chromozomů (2n). Mitotické dělení je završeno cytokinezí, jejímž produktem jsou dvě geneticky (chromozomálně) identické diploidní buňky, z nichž každá každá obsahuje polovinu ze zreplikovaných chromozomů původní, mitoticky se dělící mateřské buňky. Na tomto místě bych rád upozornil na obvyklé, avšak zavádějící označení produktů mitózy jako dvě buňky dceřinné. Nejedná se o dvě buňky dceřinné; takové pojetí implikuje nesmrtelnost buněk a časoprostorovou reverzibilitu životních dějů, což je v rozporu se skutečností: jsou známy projevy buněčného stárnutí a smrti; spontánně probíhající životní procesy v individuálních buňkách jsou ve svém souhrnu časoprostorově in finitum ireverzibilní. Obr.: Mitóza a buněčný cyklus. Zdroj: 103

105 Obr.: Mitóza přehledné schéma. 104

106 VIII.1.3 MEIÓZA Meióza je typem buněčného dělení, jehož produktem jsou pohlavní buňky obsahující poloviční počet chromozomů než měly buňky, z nichž vznikly (buňky somatické). Vzhledem k tomuto snížení počtu chromozomů v průběhu meiózy na polovinu bývá meióza označována též jako redukční dělení. Jestliže za výchozí stav somatických buněk, pokud jde o počet chromozomů, považujeme stav dipolodní (2n), pak pohlavní buňky (gamety) budou haploidní (1n). Meióza sestává ze dvou na sebe navazujících dělení: prvního heterotypického (neboli redukčního) a druhého homeotypického (neboli ekvačního) dělení. K replikaci DNA (chromozomů) dochází (stejně jako v případě mitózy) v S-fázi interfáze heterotypického dělení, tzn. že do profáze vstupuje buňka se zdvojeným počtem chromozomů. Profáze prvního redukčního dělení trvá zpravidla poměrně dlouho (v některých případech i několik let); dělí se na pět stadií (leptoten, zygoten, pachyten, diploten a diakineze), z nichž každé je charakterizováno specifickými procesy. Na počátku profáze, v leptotenním stadiu, jsou chromozomy patrné jako jemná vlákna. Ještě před rozpadem jaderné membrány se všechny homologické chromozomy spárují tak, že proti každému lokusu jednoho chromozomu určitého homologického páru leží odpovídající lokus druhého chromozomu téhož homologického páru; takovéto spojení homologických chromozomů se označuje jako synapse nebo též konjugace. Každý takový pár homologických chromozomů dále spiralizuje a vytvoří strukturu označovanou jako bivalent; bivalent tedy sestává ze čtyř chromatid spojených synaptonemálním komplexem. Spiralizace pokračuje i ve stadiu pachytenním. V tomto stadiu jsou mikroskopicky zjistitelné tzv. tetrády, což jsou ony čtyři chromatidy jednotlivých bivalentů. V některých místech tetrád jsou patrná překřížení chromatid, tzv. chiazmata. V místech chiazmat může dojít k přerušení chromatinových vláken a k výměně částí nesesterských chromatid. Takováto výměna genetické informace mezi nesesterskými chromatidami v rámci páru homologických chromozomů se označuje jako rekombinace a molekulární mechanismus, kterým se výměna realizuje, jako crossing-over. Můžeme tedy říci, že tetrády jsou vlastně cytologickou (resp. cytogenetickou) manifestací crossing-overu. V diplotenním stadiu se počínají v každém páru homologických chromozomů (bivalentu) od sebe oddělovat centromery jednotlivých členů tvořících ten který pár. Spojení chiazmaty ještě zůstává zachováno, avšak chiazmata se posouvají ke koncům každého páru homologických chromozomů; tento děj se označuje jako terminalizace. Po diplotenu následuje stadium diakineze, které je charakteristické přesunem bivalenů v buněčném jádru a rozpadem jaderné membrány. V metafázi heterotypického dělení dochází (podobně jako při mitóze) k řazení chromozomů do ekvatoriální roviny, avšak nenastává rozdělení centromer (na rozdíl od mitózy) a tudíž nenastává ani rozdělení sesterských chromatid. V důsledku toho se v anafázi rozcházejí k opačným pólům dělicího vřeténka celé dvouchromatidové chromozomy; tím se uskutečňuje vlastní redukce počtu chromozomů. Produktem heterotypického (tj. prvního redukčního) dělení jsou dvě buňky, které jsou navzájem geneticky (chromozomálně) odlišné (na rozdíl od buněk vznikajících mitoticky, které jsou geneticky chromozomálně identické). Příčiny této genetické rozrůzněnosti jsou dvě: první spočívá v tom, že v anafázi přechází k jednomu pólu dělicího vřeténka z každého páru homologických chromozomů vždy jeden dvouchromatidový chromozom, tj. buď chromozom 105

107 pocházející od matky, nebo od otce. Distribuce jednotlivých mateřských a otcovských chromozomů z každého homologického páru chromozomů do jedné ze dvou buněk vznikajících při heterotypickém dělení je náhodná. Jestliže počet chromozomů v haploidní sadě bude n, potom lze vypočítat celkový počet možných variant chromozomálních sestav v takových buňkách jako 2 n. Například obsahují-li haploidní buňky 23 chromozomů (n = 23), může vzniknout 2 23 = různých kombinací samičích a samčích chromozomů v gametách. Tuto vysokou variabilitu genotypů gamet, vyplývající z principu volné kombinovatelnosti, ještě významně zvyšují produkty rekombinace. Můžeme tedy konstatovat, že meióza je mechanizmem kombinace a rekombinace chromozomů (vloh) uplatňujícím se při vzniku gamet a zdrojem obrovské genetické variability pohlavně se rozmnožujících organizmů. Obr.: Meióza. Zdroj: Po dokončeném prvním, heterotypickém dělení každá ze vzniklých buněk po krátkém časovém intervalu (tzv. interkineze), který není totožný s interfází, vstupuje již bez replikace DNA (chromozomů) do druhého, homeotypického dělení. Teprve v metafázi tohoto dělení se rozdělí centromery jednotlivých dvouchromatidových chromozomů a v anafázi putují k opačným pólům dělicího vřeténka již chromozomy jednochromatidové. Po uskutečnění karyokineze a cytokineze jsou tak celkovým výsledkem meiózy (tj. heterotypického i homeotypického dělení) celkem čtyři buňky s redukovaným (haploidním) počtem chromozomů. Přitom míra genetické (genotypové) odlišnosti vždy dvou buněk, které jsou 106

108 produkty homeotického dělení jedné ze dvou buněk vzniklých jako produkty předcházejícího heterotypického dělení, je dána pouze podílem připadajícím na rekombinaci. Je třeba připomenout, že gametogeneze neprobíhá u samčího a samičího pohlaví stejně, což se projeví i v konečném produktu meiózy: v případě spermiogeneze jsou konečným výsledkem meiotického dělení jedné výchozí buňky čtyři spermie, kdežto v případě oogeneze je konečným výsledkem meiotického dělení výchozí buňky jedno vajíčko a dvě nebo tři malé pólové buňky, které zanikají. U cévnatých rostlin se haploidní (1n) vaječná buňka nachází uvnitř diploidního (2n) zárodečného vaku společně se dvěma haploidními (1n) synergidami a třemi haploidními (1n) antipodami. Celý tento útvar se formuje v důsledku tří po sobě následujících mitotických dělení jednoho z haploidních jader vzniklých meiotickým dělením, přičemž se vytvoří celkem osm haploidních jader, z nichž následně dvě splynou. Obr.: Porovnání mitózy a meiózy. Zdroj: 107

109 VIII.1.4 AMITÓZA Výskyt amitózy jako způsob buněčného dělení je poměrně vzácný (např. dělení makronukleu u některých prvoků), bývá omezen na vysoce specializované buňky (leukocyty, epiteliální buňky močového měchýře) a patologické stavy (některé karcinomy, leukemické buňky, buňky v tkáňových kulturách, buňky po aplikaci radioaktivního záření). Při amitóze se buněčné jádro zaškrtí a rozdělí na dvě části, aniž by došlo k vytvoření dělicího vřeténka a kondenzaci chromozomů. Amitotická karyokineze může, ale nemusí být následována cytokinezí. Pokud následuje cytokineze, mohou vznikat buňky s nestejnou genetickou výbavou. V posledních letech však určité výzkumy naznačují, že alespoň v některých případech i při amitóze se chromatin reprodukuje a distribuuje rovnoměrně (nebo téměř rovnoměrně) do amitoticky vznikajících buněk, čímž je garantována kontinuita přenosu genů i jejich rovnoměrné (nebo téměř rovnoměrné) rozdělení do amitoticky vzniklých buněk. Porovnáním uvedených čtyř typů buněčného dělení z genetického hlediska můžeme dospět k následujícím závěrům: (1) binární dělení a mitóza jsou mechanizmy, které konzervují genotyp dělících se buněk a umožňují jeho přenos v nezměněné podobě do produktů těchto dělení za vzniku geneticky identických individuí tvořících klon; nevedou k rozšíření genetické variability, ale napomáhají zachovat status quo; jsou typické pro nepohlavní rozmnožování a pro proliferaci (dělení) somatických buněk mnohobuněčných organizmů (2) meióza je mechanizmem, který prostřednicvím segregace, kombinace a rekombinace vede ke změnám genotypu výchozí (zárodečné) buňky a produkci geneticky heterogenní populace pohlavních buněk; tím se podílí na rozšiřování genetické variability; meióza je typická pro gametogenezi u pohlavně se rozmnožujících organizmů (gonochoristů) (3) amitóza může vést ke změně genotypu buněk, ve kterých se uskutečňuje, neboť genom výchozí buňky může být do produktů amitózy rozdělen nerovnoměrně (fragmentován), čímž může být ovlivněna jejich normální funkceschopnost a životaschopnost. Proto se amitóza zřejmě vyskytuje u vysoce specializovaných buněk nebo v souvislosti s některými cytopatologickými jevy. Při absenci cytokineze rezultuje ve vznik dvou nebo vícejaderných buněk. 108

110 VIII.2 ROZMNOŽOVÁNÍ Při studiu genetických procesů na organizmální a vyšší úrovni je nezbytné přihlížet ke způsobu rozmnožování příslušného druhu a proto uvádíme stručný přehled a charakteristiku základních způsobů rozmnožování. VIII.2.1 NEPOHLAVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ (AMIXE) Nepohlavní rozmnožování je typické pro organizmy nacházející se na nižším stupni fylogenetického vývoje. Mezi jeho charakteristické znaky patří absence gamet a produkce geneticky identických individuí (klonu) prostřednictvím mitotického (nebo jemu analogického) dělení. Nepohlavní rozmnožování tedy konzervuje existující genotypy (resp. genomy) a tudíž nepřispívá k rozšíření genetické variability (neuvažujeme-li vliv mutačního procesu). VIII BINÁRNÍ DĚLENÍ O tomto způsobu rozmnožování již bylo pojednáno výše. Kromě bakterií se vyskytuje též u některých jednobuněčných řas a prvoků. VIII FIZIPARIE Jedná se o způsob rozmnožování na základě dělení (fragmentace) těla mnohobuněčných organizmů, uplatňující se např. u nižších bezobratlých živočichů (láčkovci, ploštěnci, kroužkovci) a souvisí s jejich vysokou regenerační schopností. VIII GEMIPARIE Gemiparií rozumíme vytváření pupenů na výchozích (rodičovkých) organizmech a jejich následné oddělení za vzniku nových, samostatně existujících jedinců (potomků). Vyskytuje se například u láčkovců, mechovek nebo pláštěnců. VIII VEGETATIVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ Tento způsob nepohlavního rozmnožování je typický pro stélkaté rostliny i pro mnohé druhy cévnatých rostlin. U některých taxonů rostlin existují dokonce specifické orgány vegetativního rozmnožování (cibule, hlízy, oddenky, šlahouny apod.). Mezi významné pěstitelské a šlechtitelské metody patří očkování a roubování jako formy vegetativního rozmnožování, uplatňované zejména v ovocnářství. VIII.2.2 POHLAVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ (AMFIMIXE) Při pohlavním rozmnožování se uplatňuje princip segregace, kombinace a rekombinace genetické informace (chromozomů, vloh) zprostředkovaný meiotickým dělením a oplozovacím procesem. V důsledku toho je při gametogenezi segregována do jednotlivých gamet jiná sestava chromozomů (resp. genů) než jaká byla původně obsažena v buňkách, z nichž gamety pocházejí. Vytváří se tak geneticky (genotypově) vysoce heterogenní populace. Pohlavní rozmnožování tudíž vede k rozšíření genetické variability (na rozdíl od rozmnožování nepohlavního). Primární podmínkou zplození nového diploidního (2n) jedince je splynutí dvou haploidních (1n) rodičovských gamet (resp. buněčných jader) za vzniku oplozené samičí gamety (zygoty) s jedním diploidním (2n) buněčným jádrem obsahujícím rovným dílem (tj. 109

111 jednou polovinou) zastoupený genetický materiál pocházející z obou zúčastněných rodičovských gamet (spermie a vajíčka, pylového zrna a vaječné buňky). Další proliferací a diferenciací zygoty se vyvíjí nový jedinec. Kromě diploidních organizmů existují též organizmy polyploidní, tj. takové, které ve svém genomu obsahují celé násobky (vyšší než dvě) haploidních (základních) sad chromozomů. Je zřejmé že u polyploidního organizmu, např. tetraploidního, povede meióza k redukci chromozomů na polovinu a proto gamety tetraploida budou diploidní (2n) a po splynutí dvou diploidních gamet (pocházejících od tetraploidních jedinců) se u potomka obnoví tetraploidní (4n) stav. Obecně tedy platí, že při pohlavním způsobu rozmnožování se v průběhu gametogeneze redukuje počet chromozomů (obsah jaderné genetické informace) na polovinu a po oplození se obnovuje (v zygotě) původní počet chromozomů (obsah genetické informace) charakteristický pro somatické buňky příslušného druhu. Princip segregace spolu s principem kombinace (uplatňujícími se při vzniku gamet) ve svých důsledcích zaručují konstantní počet chromozomů (karyotypovou stabilitu) jednotlivých druhů organizmů. Je třeba upozornit na některé zvláštnosti pohlavního rozmnožování. Například zygota u některých druhů rostlin (řas) a hub bezprostředně po svém vzniku prochází meiotickým dělením za produkce haploidních pohlavních spor, z nichž se vyvinou haploidní jedinci. VIII.2.3 APOMIXE Jako apomiktické se označuje takové rozmnožování, při kterém se nový jedinec vyvíjí buď z pohlavní buňky (gamety), anebo z jiné buňky pohlavního aparátu, avšak bez vzniku zygoty (azygoticky). Apomixi tedy lze označit za zvláštní případ amfimixe. VIII PARTENOGENEZE Partenogenezí se rozumí vývoj nového jedince z neoplozeného vajíčka nebo vaječné buňky. U včel se z neoplozených vajíček partenogeneticky vyvíjejí samci a proto jsou haploidní, kdežto z oplozených vajíček se vyvíjejí samice, které jsou proto diploidní. Partenogeneze se významně uplatňuje též v reprodučním procesu mšic a některých dalších skupin bezobratlých živočichů. VIII GYNOGENEZE Při gynogenezi se nový jedinec vyvíjí ze samičí gamety, avšak po stimulaci (indukci dělení) samčí gametou. Gynogenezi lze navodit u některých druhů rostlin a bezobratlých živočichů stimulací samičí gamety samčí gametou, která byla před tím enukleována, anebo v níž bylo buněčné jádro inaktivováno (například vlivem radioaktivního ozáření). VIII ANDROGENEZE Při androgenezi se nový jedinec vyvíjí z neoplozené samčí gamety. Androgeneze, indukovaná při kultivaci pylových zrn nebo prašníků za specifických podmínek in vitro, je jednou z efektivních a účelně používaných šlechtitelských metod k produkci haploidních rostlin, neboť v relativně krátkém časovém intervalu lze diploidizací apomikticky vzniklých haploidů získat dokonale homozygotní (dihaploidní), dobře geneticky definované čisté linie. 110

112 VIII APOGAMETIE Tento způsob rozmnožování se může vyskytnout u cévnatých rostlin. Nový haploidní jedinec (resp. semeno) vzniká z některé synergidy nebo antipody, nikoli z (neoplozené) vaječné buňky. VIII ADVENTIVNÍ EMBRYONIE Vyskytuje se u cévnatých rostlin. V tomto případě se vyvíjí nový jedinec z některé buňky nucellu. 111

113 IX. PRINCIP SEGREGACE A KOMBINACE VLOH HYBRIDIZMUS Jak již víme, největší část genetické informace je v eukarytických buňkách lokalizována v buněčném jádru. V něm jsou jejími genofory chromozomy, jejichž počet a tvar (morfologie) je jedním z charakteristických znaků každého druhu organizmů. V buňkách somatických považujeme za základní počet chromozomů počet diploidní (2n), v buňkách pohlavních (v gametách) počet haploidní (1n). Chromozomy diplodních somatických buněk lze uspořádat do homologických párů. Dále víme, že základní diskrétní jednotkou genetické informace je gen, který je lokalizován na určitém místě (lokusu) určitého chromozomu a může se vyskytovat minimálně ve dvou variantách (alelách) mezi nimiž existuje specifický funkční vztah. Dosud jsme pojednali pouze o některých podstatných genetických jevech a procesech na molekulární nebo subcelulární úrovni (replikace DNA, transkripce a translace genetické informace, exprese genetické informace a její regulace). Jak je známo, genetické jevy a procesy lze studovat i na vyšších úrovních organizace živé hmoty, tj. na úrovni buněčné, orgánové, organizmální a populační. V následujících kapitolách se budeme zabývat popisem a výkladem (interpretací) základních genetických procesů na úrovni buněčné až organizmální. Tyto jevy a procesy budeme demonstrovat na jednoduchých příkladech nebo simplifikovaných modelech. U pohlavně se rozmnožujícího diploidního (2n) organizmu předpokládejme existenci jednoho jednoduchého strukturního genu vyskytujícího se ve dvou formách, představovaných alelou A a alelou a, přičemž alela A je úplně dominantní nad alelou a. Dále předpokládejme, že tento gen je lokalizován na jednom páru homologických autozomů a je zastoupen u jednoho z rodičů pouze alelami dominantními (A), kdežto u druhého z rodičů pouze alelami recesivními (a); rodič, který nese pouze dominantní alely, se označuje jako dominantní homozygot (AA), rodič, který nese pouze recesivní alely se označuje jako recesivní homozygot (aa). Konečně ještě budeme předpokládat, že všechny genotypy (na diploidní i haploidní úrovni) jsou stejně životaschopné a reprodukceschopné, tj. mají stejnou relativní vitalitu a relativní fertilitu. Všechny haploidní (1n) gamety, produkované dominantním homozygotem (AA), ponesou z uvažovaného alelového páru (A, a) pouze alelu dominantní (A), kdežto všechny haploidní (1n) gamety, produkované recesivním homozygotem (aa) ponesou pouze recesivní alelu (a). Provedeme-li reciproká křížení těchto rodičů (tj. samice AA x samec aa a reciproce, samice aa x samec AA) vzniknou v důsledku kombinace haploidních gamet rodičů, tj. gamety nesoucí alelou A od dominantního homozygota a gamety nesoucí alelu a od recesivního homozygota, diploidní potomci (resp. zygoty), kteří se označují jako heterozygoti neboli hybridi (Aa). Je zřejmé, že genotyp všech těchto potomků je ve sledovaném znaku shodný bez ohledu na to, zda dominantně (resp. recesivně) homozygotním rodičem byl jedinec samičího nebo samčího pohlaví, jinými slovy výsledky reciprokých křížení jsou identické. Generace sestávající z potomků uvedených homozygotních rodičů (parentální generace) se nazývá první filiální generace (F1); všichni její členové jsou uniformní a fenotypově shodní s fenotypem dominantně homozygotního rodiče. Popsané děje jsou schematicky uvedeny v následující tabulce: genotyp rodiče AA AA genotyp gamet rodiče A a genotyp potomků Aa 112

114 Tyto děje lze též popsat prostřednictvím počtu pravděpodobnosti. Protože dominantní homozygot (AA) obsahuje pouze dominantní alely uvažovaného genu, potom pravděpodobnost vzniku gamet s dominantní alelou Pd A = 1 a pravděpodobnost vzniku gamety s recesivní alelou Pd a = 0; u recesivního homozygota (aa), který nese pouze recesivní alely uvažovaného genu, tomu bude právě naopak: Pr A = 0, Pr a = 1. Kombinací gamet těchto rodičů tedy mohou vzniknout pouze heterozygoti, neboť pravděpodobnost vzniku heterozygota je za daných podmínek rovna jedné ( Ph Aa = Pd A x Pr a = 1), kdežto pravděpodobnost vzniku kteréhokoli homozygota je rovna nule (Pd A x Pr A = 1 x 0 = 0, Pd a x Pr a = 0 x 1 = 0). Každý heterozygot (Aa) bude tvořit dva typy gamet: polovinu s alelou dominantní (A), polovinu s alelou recesivní (a). Tato zákonitost vyplývá ze skutečnosti, že každá haploidní gameta jako produkt meiotického dělení zárodečné buňky heterozygota (Aa) může obsahovat buď chromozom s alelou dominantní (A), nebo chromozom s alelou recesivní (a), neboť v jaderném genomu diploidních buněk heterozygota Aa nese z uvažovaného páru homologických chromozomů jeden chromozom alelu dominantní (A), druhý alelu recesivní (a). Při vzniku gamet se uplatňuje princip segregace alel (vloh), který lze formulovat jako distribuci jednotlivých členů párových genoforů (resp. forem genů) do jednotlivých gamet v průběhu gametogeneze. Jestliže se uskuteční křížení mezi heterozygoty ( tj. v našem případě navzájem mezi potomky homozygotních rodičů), může se při vzniku zygoty spojit kterákoli gameta jednoho jedince s kteroukoli gametou jedince opačného pohlaví. Tedy samičí gameta nesoucí alelu dominantní se může spojit se samčí gametou nesoucí alelu dominantní nebo alelu recesivní, stejně jako se samičí gameta nesoucí alelu recesivní může spojit se samčí gametou nesoucí alelu dominantní nebo recesivní; obdobně samčí gameta nesoucí dominantní alelu se může spojit se samičí gametou nesoucí alelu dominantní nebo recesivní a samčí gameta nesoucí recesivní alelu se může spojit se samičí gametou nesoucí alelu dominantní nebo recesivní. Při vzniku zygoty se tedy uplatňuje náhodné spojování gamet. Tytéž genetické procesy se realizují v případech samooplození (samosprášení) heterozygotů. V našem případě se v generaci potomků, pocházejících ze vzájemného křížení heterozygotů nebo vzniklých jejich samooplozením, vyskytnou jedinci tří různých genotypů: dominantní homozygoti (AA), heterozygoti (Aa) a recesivní homozygoti (aa) v poměru 1AA : 2Aa : 1aa. Tato generace se nazývá druhá filiální generace (F2). Schematicky jsou tyto procesy znázorněny v následující tabulce: Genotyp gamet heterozygotů Aa A a genotyp potomků A AA Aa a Aa Aa Na popis uvedených dějů můžeme rovněž aplikovat počet pravděpodobnosti. Jestliže u diploidního heterozygota (Aa) určitý pár homologických autozomů sestává z jednoho chromozomu nesoucího alelu dominantnní (A) a z jednoho chromozomu nesoucího alelu recesivní (a) uvažovaného genu, potom relativní četnost alely dominantní je stejná jako relativní četnost alely recesivní, tj. 0,5. Odtud plyne, že u heterozygota je pravděpodobnost vzniku haploidní gamety nesoucí dominantní alelu rovna pravděpodobnosti vzniku haploidní gamety nesoucí recesivní alelu, tedy Ph A = Ph a = 0,5. Při náhodném spojení těchto dvou typů gamet platí: 113

115 (1) pravděpodobnost vzniku dominantního homozygota je rovna součinu pravděpodobností výskytu gamet s dominantní alelou, čili P AA = Ph A x Ph A = 0,5 x 0,5 = 0,25 (2) pravděpodobnost vzniku recesivního homozygota je rovna součinu pravděpodobností výskytu gamet s recesivní alelou, čili P aa = Ph a x Ph a = 0,5 x 0,5 = 0,25 (3) pravděpodobnost vzniku heterozygota je rovna součinu pravděpodobností výskytu gamet s dominantní alelou u jednoho pohlaví a gamet s recesivní alelou u druhého pohlaví a vice versa, čili P Aa = 2 x (Ph A x Ph a ) = 2 x 0,5 x 0,5 = 0,5 Pravděpodobnost vzniku kteréhokoli z těchto tří různých genotypů je P AA+Aa+aa = P AA + P Aa + P aa = 0,25 + 0,50 + 0,25 = 1,00. Je-li tedy tato pravděpodobnost rovna jedné, znamená to zároveň, že žádný jiný genotyp (než tři uvedené) při dodržení daných podmínek nemůže vzniknout, neboli pravděpodobnost vzniku jakéhokoli jiného genotypu je za těchto podmínek rovna nule. V genetické terminologii se v klasickém (mendelovském) pojetí rodičovská generace (tvořená homozygoty) nazývá parentální generace (P); generace sestávající z potomků parentální generace se nazývá první filiální generace (F1) a generace, vzniklá vzájemným křížením nebo samooplozením (samosprášením) jedinců první filiální generace, se nazývá druhá filiální generace (F2). Analogicky bychom odvodili třetí, čtvrtou a další filiální generaci. Za úplné dominance platí, že fenotyp dominantního homozygota je shodný s fenotypem heterozygota. Z tohoto důvodu bude fenotyp jedinců první filiální generace (heterozygotů) shodný s fenotypem dominantně homozygotního rodiče. V generaci F2 jsou zastoupeny tři genotypové třídy: dominantní homozygoti, heterozygoti a recesivní homozygoti v poměru 1AA : 2Aa : 1 aa; poměr jednotlivých genotypových tříd se nazývá genotypový štěpný poměr. Fenotypové třídy v generaci F2 se však vyskytnou v našem případě pouze dvě a to v poměru 3A- : 1aa, protože třídy dominantních homozygotů a heterozygotů (v poměru 1AA : 2Aa) není možné bez použití speciálních metod genetické analýzy od sebe odlišit na základě fenotypu; poměr jednotlivých fenotypových tříd se nazývá fenotypový štěpný poměr. Ke stanovení genotypu konkrétního jedince s dominantním fenotypem je nutné provést genetickou analýzu. Jednou z metod genetické analýzy je tzv. zpětné křížení (B1, back cross); při něm se testovaný jedinec (v našem případě dominantní homozygot nebo heterozygot) kříží s prokazatelně homozygotním jedincem. Použití dominantního homozygota ve zpětném křížení je irelevantní pro určení genotypu testovaného individua vykazujícího dominantní fenotyp, neboť všichni potomci takového křížení budou fenotypově uniformní. Za předpokladu, že testovaný jedinec je dominantní homozygot, potom tímto zpětným křížením získáme potomstvo složené pouze ze samých dominantních homozygotů: AA x AA AA. Za předpokladu, že testovaný jedinec je heterozygot, získáme potomstvo sestávající z jedné poloviny z dominantních homozygotů a z jedné poloviny z heterozygotů: Aa x AA AA + Aa v poměru 1 : 1. Rozhodnout o genotypu testovaného jedince s fenotypem dominantního homozygota může pouze tzv. analytické zpětné křížení, při kterém je testovaný jedinec křížen s recesivním homozygotem. Je-li testovaný jedinec dominantní homozygot, bude potomstvo tohoto křížení fenotypově uniformní, sestávající ze samých heterozygotů: AA x aa Aa. Jestliže však testovaný jedinec bude heterozygot, potom v potomstvu analytického zpětného křížení budou zastoupeni z jedné poloviny heterozygoti (s fenotypem dominantních homozygotů) a z jedné poloviny recesivní homozygoti se svým vlastním fenotypem (odlišným od fenotypu dominantních homozygotů a heterozygotů): Aa x aa Aa + aa v poměru 1:1. Předpokládejme nyní existenci dvou genů lokalizovaných na dvou různých párech homologických autozomů, přičemž jeden gen je tvořen alelovým párem A, a (kde alela A je 114

116 úplně dominantní nad alelou a), druhý gen alelovým párem B, b (kde alela B je úplně dominantní nad alelou b). Ostatní předpoklady zůstávají stejné jako v předchozím příkladu. Provedeme-li v parentální generaci reciproká křížení mezi dvojnásobně homozygotními rodiči ( AABB x aabb, aabb x AABB), bude potomstvo v generaci F1 uniformní a fenotypově shodné s dominantně homozygotním rodičem: AABB x aabb AaBb. Všichni jedinci v generaci F1 jsou heterozygotní v obou genech; takoví heterozygoti se též označují jako dihybridi. Při meiotickém dělení bude každý dihybrid tvořit čtyři typy gamet s genotypy AB, Ab, ab, a ab v poměru 1 : 1 : 1 : 1. Při křížení jedinců generace F1 mezi sebou navzájem (nebo při samooplození) se budou na základě volné kombinovatelnosti v generaci F2 vyskytovat 4 fenotypové třídy a 9 genotypových tříd. Výsledky křížení do generace F2 v případě dihybridizmu jsou schematicky uvedeny v následující tabulce: Genotypy gamet AB Ab ab ab dihybridů AaBb genotypy potomků (zygot) AB AABB AABb AaBB AaBb Ab AABb AAbb AaBb Aabb ab AaBB AaBb aabb aabb ab AaBb Aabb aabb aabb Pozn.: Stejný výsledek bychom získali i tehdy, jestliže by v parentální generaci byli reciproce kříženi jedinci dominantně homozygotní v jednom a recesívně homozygotních ve druhém alelovém páru ( AAbb x aabb, aabb x AAbb). Jednotlivé genotypy, vyskytující se v generaci F2 v případě dihybridizmu, jsou zastoupeny v poměru 1AABB : 2 AABb : 1aaBB : 2 AaBB : 4AaBb : 2 Aabb : : 1aaBB : 2 aabb : 1aabb, což vyjadřuje genotypový štěpný poměr. Při úplné dominanci se budou jedinci všech genotypů, v nichž je obsažena alespoň jedna dominantní alela od každého alelového páru (A-B-), fenotypově jevit jako dominantní homozygoti v obou alelových párech. Jedinci, v jejichž genotypu je obsažena alespoň jedna dominantní alela jednoho alelového páru a dvě recesivní alely druhého alelového páru (A-bb nebo aab-), se budou fenotypově projevovat jako dominantní homozygoti ve znaku, pro který obsahují dominantní alelu, a jako recesivní homozygoti ve znaku, pro který obsahují obě alely recesivní. Jedinci, jejichž genotyp je v obou genech tvořen pouze recesivními alelami, bude vykazovat fenotyp dvojnásobně recesivního homozygota. Tedy jedinci s genotypem AABB, AABb, AaBB, AaBb budou mít fenotyp shodný s fenotypem dvojnásobně dominantně homozygotního rodiče parentální generace, jedinci AAbb a Aabb budou mít dominantní fenotyp ve znaku A a recesivní fenotyp ve znaku B, jedinci genotypu aabb a aabb budou mít naopak recesivní fenotyp znaku A a dominantní fenotyp znaku B a konečně jedinci genotypu aabb budou mít fenotyp shodný s dvojnásobně recesivně homozygotním rodičem parentální generace. Sumujeme-li v potomstvu dihybrida relativní podíly jednotlivých genotypových tříd se stejným fenotypovým projevem, dostaneme fenotypový štěpný poměr 9A-B- : 3 A-bb : 3 aab- : 1 aabb, tzn. 9/16 jedinců s dominantním fenotypem v obou znacích, 3/16 jedinců s dominantním fenotypem ve znaku A a recesivním fenotypem ve znaku B, 3/16 jedinců s recesivním fenotypem ve znaku A a dominantním fenotypem ve znaku B a 1/16 jedinců s fenotypem recesivním v obou znacích. V generaci F2 se objevily dvě nové fenotypové třídy (A-bb, aab-), které se nevyskytovaly v žádné z předchozích generací (parentální a F1). Jedinci v těchto třídách, kteří mají genotyp AAbb a aabb, se označují jako šlechtitelské novinky. Jejich dalším 115

117 křížením intra se ( tj. AAbb x AAbb, resp. aabb x aabb) nebo jinou vhodnou metodou lze od šlechtitelských novinek odvodit čisté linie. Jako jedna z metod se ve šlechtění uplatňuje kombinační šlechtění. Při něm vznikají nové žádoucí kombinace znaků (vlastnosti) pouze na základě kombinace vloh obsažených ve výchozím šlechtitelském materiálu. Právě šlechtitelské novinky této definici vyhovují a proto je můžeme považovat za jeden z cílových produktů kombinačního šlechtění. Čisté linie jsou cílem šlechtitelského úsilí při tzv. liniovém šlechtění. Výhodou čistých linií je především to, že v důsledku homozygotnosti nedochází k vyštěpování (segregaci) nežádoucích genotypů; tím je zaručena konstantnost znaků charakteristických pro danou čistou linii. Čisté linie jsou také zpravidla dobře geneticky definované a snadno identifikovatelné. Někdy se šlechtitelsky významné znaky výrazněji fenotypově manifestují v heterozygotním (hybridním) stavu, což může souviset s projevem superdominance (tzn. jevu, při kterém je fenotypová hodnota heterozygota vyšší než fenotypová hodnota dominantního homozygota), nebo heterozního efektu. Proto vedle liniového šlechtění existuje též hybridní šlechtění. Je však třeba si uvědomit, že hybridní efekt (resp. heterozní efekt) je vázán pouze na jednu generaci; odpovídá situaci v generaci F1. V dalších generacích, odpovídajících generaci F2, F3 atd., už nemůže být zachován v důsledku segregace a volné kombinovatelnosti vloh do gamet. Hybridní šlechtění se tudíž neobejde bez liniového šlechtění, které mu v podobě čistých linií poskytuje vhodný šlechtitelský materiál. Podle počtu sledovaných alelových párů (resp. genů) rozlišujeme různé stupně hybridizmu: monohybridizmus vzniká za účasti jednoho alelového páru (monohybrid se značí např. Aa), dihybridizmus za účasti dvou alelových párů (dihybrid se značí např. AaBb), trihybridizmus za účasti tří alelových párů (trihybrid se značí např. AaBbCc) a tak dále až po polyhybridizmus, jehož se účastní obecně větší počet alelových párů. Je však třeba zdůraznit, že výše odvozené principy segregace a volné kombinovatelnosti vloh (alel) předpokládají lokalizaci každého alelového páru na jiném páru homologických chromozomů (autozomů). Výsledky, které jsme odvodili pro monohybridizmus a dihybridizmus, můžeme snadno rozšířit i na vyšší stupně hybridizmu (viz následující tabulka): Znak Počet druhů gamet hybrida Počet druhů zygot Obecný vzorec Počet šlechtitelských novinek 2 n 2 Genotypový štěpný poměr (1 : 2 : 1) n Fenotypový štěpný poměr při úplné dominanci (3 : 1) n Počet homozygotních zygot Počet heterozygotních zygot n = počet zúčastněných alelových párů 2 n 3 n 2 n 4 n - 2 n Základní principy dědičnosti při experimentální práci s hrachem setým (Pisum sativum) objevil a precizně formuloval J. G. Mendel ( ). Lze považovat za prokázané, že Mendel tyto experimenty prováděl na základě již předem vypracované hypotézy, kterou jimi chtěl empiricky ověřit a potvrdit. V souladu s tím je pozornost, kterou věnoval výběru pokusného objektu. Po dobu dvou let před zahájením vlastní experimentální 116

118 práce ověřoval konstantnost výskytu některých morfologických znaků u většího počtu odrůd hrachu a získal tak geneticky velmi homogenní materiál. Z těchto odrůd do pokusů zařadil pouze ty, které z dnešního hlediska můžeme považovat za čisté linie. Sledoval dědičnost projevu celkem sedmi alternativních znaků (tvar semen, zbarvení děloh, zbarvení testy, tvar zralých lusků, zbarvení nezralého lusku, postavení květů, délka stonku), z nichž každý byl determinován jedním genem s jednou dominantní a jednou recesivní alelou. Tím, že křížil vždy dvě a dvě variety lišící se v jednom páru znaků, mohl poznat a objasnit základní principy dědičnosti (princip segregace a kombinace vloh), popsat, analyzovat a objasnit procesy spojené se vznikem a vlastnostmi hybridů (mono- a dihybridizmus; identita výsledků reciprokých křížení, genotypový a fenotypový štěpný poměr; zpětné křížení). Ke zdaru Mendelovy výzkumné práce přispěly některé jím použité specifické, v té době však v biologii neobvyklé a nepochopené pracovní metody (matematicko-logická, statistická). Nástin společenského prostředí, ve kterém žil a působil Mendel, historie počátků genetiky a Mendelova práce jsou pro zájemce o tuto problematiku v příloze studijní opory. Mezi znaky, jejichž dědičnost Mendel u hrachu studoval, byly zjištěny následující vztahy: - kulatý tvar semene je dominantní nad hranatým tvarem semene, - žluté zbarvení děloh je dominantní nad zeleným, - tmavé zbarvení testy je dominantní nad světlým zbarvením, - jednoduše klenutý tvar zralých lusků je dominantní nad zaškrceným tvarem, - zelené zbarvení nezralého lusku je dominantní nad žlutým, - úžlabní postavení květů je dominantní nad vrcholovým postavením květů, - vysoký stonek je dominantní nad krátkým stonkem. Obr.: Znaky hrachu studované Mendelem. Zdroj: Výsledky Mendelových pokusů, publikovaných r v článku Pokusy s rostlinnými hybridy, a jejich zobecnění souvisí s právě probíraným tématem. Lze je proto využít jako konkrétních příkladů pro ilustraci teoretického výkladu. Níže jsou ve schematizované podobě z jeho práce uvedeny údaje týkající se tvaru semen (kulatý hranatý) a zbarvení děloh (žluté zelené): 117

119 Tvar semen - monohybridizmus P: AA x aa kulatý hranatý F1: Aa x Aa kulatý kulatý F2: AA + Aa : aa kulatý hranatý : : 1 Zbarvení děloh monohybridizmus: P: BB x bb žluté zelené F1: Bb x Bb žluté žluté F2: BB + Bb : bb žluté zelené : : 1 Tvar semen a zbarvení děloh dihybridizmus: P: AABB x aabb kulatý, žluté hranatý, zelené F1: AaBb x AaBb kulatý, žluté kulatý, žluté F2: A-B- : A-bb : aab- : aabb kulatý, kulatý, hranatý, hranatý, žluté zelené žluté zelené 315 : 108 : 101 : 32 9 : 3 : 3 : 1 118

120 X. GENOVÉ INTERAKCE V předchozí kapitole jsme se zabývali dědičností monogenně založených znaků. Genová exprese a fenotypová manifestace těchto znaků nebyla závislá na přítomnosti a expresi žádného jiného genu, ani na faktorech zevního prostředí. V některých případech však dochází k interakci mezi dvěma či více geny, jež se odráží též ve fenotypovém projevu. Většina genových interakcí vede ke změně fenotypových štěpných poměrů. X.1 RECIPROKÁ INTERAKCE Tato interakce je charakteristická tím, že při ní nenastává změna fenotypového štěpného poměru. Při křížení dvou rodičovských linií, které se liší v jednom párovém znaku, se v generaci F2 (a též v generaci B1) vyskytnou nové formy téhož znaku při zachování fenotypového štěpného poměru charakteristického pro dihybridizmus. Z toho vyplývá závěr, že stav v generaci F2 (a obdobně v generaci B1) je výsledkem interakce dvou alelových párů. Jako příklad reciproké interakce uvedeme dědičnost tvaru hřebínku u kura domácího, podmíněného dvěma alelovými páry, lokalizovanými na dvou párech homologických chromozomů. Genotyp RRPP vede k ořechovitému, genotyp rrpp k listovitému tvaru hřebínku. V generaci F1 má hybrid RrPp, vzniklý křížením rodičů s genotypem RRPP x rrpp, hřebínek ořechovitý. V generaci F2 se kromě těchto dvou tvarů hřebínku vyskytnou ještě jedinci s růžicovitým (R-pp) a hráškovitým (rrp-) tvarem hřebínku. Z uvedeného je zřejmé, že ořechovitý tvar hřebínku je výsledkem interakce mezi dominantními alelami R a P. Schéma reciproké interakce: P: RRPP x rrpp ořechovitý listovitý F1: RrPp x RrPp ořechovitý ořechovitý F2: R-P- : R-pp : rrp- : rrpp ořechovitý růžicovitý hráškovitý listovitý 9 : 3 : 3 : 1 Obr.: Tvar hřebínku u kura domácího. Hřebínek: ořechovitý, růžicovitý, hráškovitý, jednoduchý Zdroj: 119

121 Jiným příkladem reciproké interakce může být dědičnost zbarvení plodů papriky roční. Na expresi tohoto znaku se podílejí dva alelové páry R, r a Cl, cl: červené plody R-Cl-, zelené plody rrclcl, hnědé plody R-clcl, žluté plody rrcl-; červené plody jsou výsledkem interakce mezi dominantními alelami R a Cl. Tuto interakci můžeme interpretovat na biochemické úrovni následujícím způsobem: alela Cl podmiňuje rozklad chlorofylu, což má v nepřítomnosti alely R za následek žluté (plastidovými pigmenty způsobené) zbarvení plodů; alela cl je v tomto směru neúčinná, tzn. v nepřítomnosti alely Cl není chlorofyl rozkládán. Alela R podmiňuje syntézu antokyanů, které způsobují červené zbarvení plodů; alela r je v tomto směru neúčinná. Červené zbarvení se však může projevit pouze při interakci alely R s alelou Cl, která podmiňuje degradaci chlorofylu; v její nepřítomnosti (clcl) je zbarvení plodů hnědé jako výsledek kombinace červených antokyanů a zeleného chlorofylu. Obecné schéma biochemické interpretace reciproké interakce: A S > P 1 /a/ B } => INT S > P > P 3 /b/ Legenda: A, a; B, b = alely (alelové páry) S 1, S 2 = substráty (prekurzory) P 1, P 2, P 3 = produkty (fenotypy) INT = interakce dominantních alel s vlastním fenotypem Uvedení alely v závorce pod určitým symbolem znamená, že alela na označený substrát (prekurzor nebo meziprodukt) aktivně nepůsobí. Pozn.: Tytéž symboly, použité v dalších schématech biochemické interpretace genových interakcí, mají stejný nebo obdobný význam a proto již nejsou opakovaně vysvětlovány. X.2 DOMINANTNÍ EPISTÁZE Při této interakci je dominantní alela určitého alelového páru nadřazena (epistatická) dominantní alele jiného alelového páru. Alela, jejíž projev je potlačován alelou epistatickou, se označuje jako alela hypostatická. Příkladem dominantní epistáze může být zbarvení srsti u některých plemen psů. V alelovém páru B, b podmiňuje dominantní alela černé, recesivní alela hnědé zbarvení srsti; v alelovém páru W, w je dominantní alela W eustatická nad dominantní alelou B a vede k bílému zbarvení srsti, alela recesivní je v tomto směru neúčinná. Při křížení psa s bílou srstí (WWBB) se psem s hnědou srstí (wwbb) mají všichni potomci v generaci F1 srst bílou. Jejich křížením do generace F2 se v potomstvu objeví psi se srstí bílou (W-B-, W-bb), černou (wwb-) a hnědou (wwbb) v poměru 12 : 3 : 1. Z hlediska biochemického obě dominantní alely podmiňují utilizaci téhož substrátu (prekurzoru) ve stejné biosyntetické dráze, avšak vedou k odlišným konečným produktům. Jako epistatická se potom projeví alela, která je účinná v pokročilejším stupni příslušné metabolické dráhy. 120

122 Schéma dominantní epistáze: P: WWBB x wwbb bílý hnědý F1: WwBb x WwBb bílý bílý F2: W-B- : W-bb : wwb- : wwbb bílý bílý černý hnědý 9 : 3 : 3 : 1 12 : 3 : 1 Obecné schéma biochemické interpretace dominantní epistáze: A B S > P > P 2 /a/ /b/ B>A Obr.: Zbarvení srsti u některých plemen psů. Zdroj: Jako další příklad dominantní epistáze můžeme uvést zbarvení obilek u ovsa. Ve dvou zúčastněných alelových párech G, g a B, b je alela B eustatická nad alelou G. Genotypy B-G- + B-gg vedou k tmavému (černému) zbarvení obilek, bbg- k šedému a ggbb ke světlému (bílému) zbarvení obilek. 121

123 X.3 RECESIVNÍ EPISTÁZE Při epistázi recesivní se projevuje epistatický účinek určité recesivní alely v homozygotním stavu nad dominantní alelou jiného alelového páru. Budeme uvažovat dva alelové páry A, a a C, c, které se podílejí na zbarvení srsti u králíků. Alela C vede k syntéze chromogenu černé barvy, alela c je v tomto směru neúčinná (nesyntetizuje chromogen) a v homozygotním stavu je epistatická vůči alele A. Alela A podmiňuje zonální pigmentaci srsti, což vede k zbarvení aguti, typického pro divokého králíka, alela a je v tomto směru neúčinná. V důsledku recesivní epistáze se v generaci F2 vyskytnou králíci se zbarvením srsti aguti (C-A-), černým (C-aa) a bílým (cca- + ccaa). Schéma recesivní epistáze: P: CCAA x ccaa aguti bílý F1: CcAa x CcAa aguti aguti F2: C-A- : C-aa : cca- : ccaa aguti černý bílý bílý 9 : 3 : 3 : 1 9 : 3 : 4 Obr.: Zbarvení srsti u myší. Zbarvení srsti: agouti, hnědé, bílé. Zdroj: 122

124 Obecné schéma biochemické interpretace recesivní epistáze: A B S > P > P2 /b/ S 1 aa (P 1 ) B (P 2 ) Legenda: (P 1 ), (P 2 ) = produkty, které nemohou být syntetizovány z důvodu nevyužitelnosti substrátu (prekurzoru) u nositelů recesivně epistatické alely v homozygotním stavu (aa). Jiným příkladem recesivní epistáze může být dědičné založení zbarvení květů šalvěje zelené. Dominantní alela P podmiňuje růžové zbarvení květů, které je v přítomnosti dominantní alely A přeměňováno na fialové; recesivní alely (p, a) zbarvení květu neovlivňují (květy jsou bílé), avšak alela p je recesivně epistatická nad alelou A. X.4 INHIBICE Při inhibici dominantní alela jednoho alelového páru potlačuje projev dominantní alely jiného alelového páru, avšak inhibující alela vlastní fenotypový projev nemá. Příklad genové interakce typu inhibice uvedeme na zbarvení peří u slepic kura domácího. V alelovém páru C, c podmiňuje dominantní alela syntézu pigmentu a tudíž vznik zbarveného peří; alela recesivní je v tomto směru neaktivní, takže v homozygotním stavu determinuje bíle zbarvené peří. Dominantní alela I z alelového páru I, i inhibuje účinek alely C, což má za následek bíle zbarvené peří. Při křížení dvou plemen bílých slepic (např. leghornek a wyandotek) se v generaci F1 objeví pouze bílé slepice, avšak v generaci F2 se kromě bílých slepic (C-I- + cci- + ccii) vyskytnou též slepice se zbarveným peřím (C-ii). Zastoupení jednotlivých genotypů v generaci F2 pouze dvěma fenotypovými třídami je charakteristickým znakem inhibice. Schéma inhibice: P: CCII x ccii bílá bílá F1: CcIi x CcIi bílá bílá F2: C-I- : C-ii : cci- : ccii bílá barevná bílá bílá 9 : 3 : 3 : 1 13 : 3 123

125 Obecné schéma biochemické interpretace inhibice: A I A S > P 1 S 1 (P 1 ) /a/ /i/ /a/ /i/ Legenda: I A = inhibice alely A alelou I. Na schématu vlevo může alela A v nepřítomnosti inhibiční alely I utilizovat substrát (prekurzor) a syntetizovat produkt P 1. Na schématu vpravo alela A, inhibovaná alelou I, nemůže utilizovat substrát (prekurzor) S 1 a syntetizovat produkt P 1. X.5 KOMPLEMENTARITA Při komplementaritě se určitý znak manifestuje v důsledku spolupůsobení dvou (respektive více) genů, z nichž žádný sám o sobě daný znak nemůže vyvolat. V souladu s tím se v generaci F2 objeví vždy pouze dvě fenotypové třídy. Tuto genovou interakci můžeme konkretizovat na zbarvení květu hrachoru, na kterém participují dva alelové páry (C, c; R, r) dvou genů lokalizovaných na různých párech homologických chromozomů. Červené zbarvení květů se projeví pouze u rostlin s genotypy C-R-, u rostlin všech ostatních genotypů jsou květy bílé. Schéma komplementarity: P: CCRR x ccrr červený bílý F1: CcRr x CcRr červený červený F2: C-R- : C-rr : ccr- : ccrr červený bílý bílý bílý 9 : 3 : 3 : 1 9 : 7 124

126 Obecné schéma biochemické interpretace komplementarity: A S > P 1 /a/ A + B } > P 3 B S > P 2 /b/ X.6 DUPLICITA (MULTIPLICITA) NEKUMULATIVNÍ Při duplicitě (obecně multiplicitě) nekumulativní postačuje k úplnému fenotypovému projevu příslušného znaku pouze jedna dominantní alela kteréhokoli ze zúčastněných genů. Z tohoto důvodu se v generaci F2 vyskytují vždy pouze dvě fenotypové třídy. Jako příklad duplicity nekumulativní uvedeme dědičnost tvaru šešule u kokošky pastuší tobolky. Tento znak je determinován dvěma alelovými páry (T 1, t 1 ; T 2, t 2 ) dvou genů lokalizovaných na různých párech homologických chromozomů. V přítomnosti alespoň jedné dominantní alely (lhostejno, zda T 1 nebo T 2 ) vzniká šešule srdcovitého tvaru, u dvojnásobně recesivního homozygota vzniká šešule válcovitého tvaru. Schéma duplicity nekumulativní: P: T 1 T 1 T 2 T 2 x t 1 t 1 t 2 t 2 srdcovitá válcovitá F1: T 1 t 1 T 2 t 2 x T 1 t 1 T 2 t 2 srdcovitá srdcovitá F2: T 1 -T 2 - : T 1 -t 2 t 2 : t 1 t 1 T 2 - : t 1 t 1 t 2 t 2 15 : 1 srdcovitá srdcovitá srdcovitá válcovitá 9 : 3 : 3 : 1 125

127 Obecné schéma biochemické interpretace duplicity nekumulativní: A 1, A 2 S > P 1 a 1, a 2 S > P 2 X.7 DUPLICITA (MULTIPLICITA) KUMULATIVNÍ S DOMINANCÍ Duplicita kumulativní s dominancí je typem genové interakce, při kterém spolupůsobí dominantní alely dvou alelových párů takovým způsobem, že intenzita projevu příslušného znaku je vyšší v přítomnosti alespoň jedné dominantní alely od každého alelového páru, než v přítomnosti jedné nebo dvou dominantních alel, avšak pouze od jednoho ze zúčastněných alelových párů. Analogické vztahy platí v případě multiplicity kumulativní s dominancí. Pro tuto genovou interakci obecně platí, že při vyjádření fenotypu se kumuluje efekt aktivních alel různých alelových párů (genů) nezávisle na tom, zda je konstituce jednotlivých lokusů homozygotní nebo heterozygotní. Jako příklad duplicity kumulativní s dominancí uvedeme dědičnost zbarvení obilek u ječmene, podmíněného dvěma alelovými páry (P 1, p 1 ; P 2, p 2 ) dvou genů lokalizovaných na dvou párech homologických chromozomů. Přítomnost alespoň jedné dominantní alely P 1 a jedné alely P 2 v genotypu vede k tmavě hnědému zbarvení obilek, přítomnost alespoň jedné dominantní alely P 1 nebo P 2 v genotypu vede k hnědočervenému zbarvení obilek a absence jakékoli dominantní alely v uvažovaných alelových párech vede ke světlému zbarvení obilek. V generaci F2 tak vzniknou tři fenotypové třídy. Schéma duplicity kumulativní s dominancí: P: P 1 P 1 P 2 P 2 x p 1 p 1 p 2 p 2 tm. hnědá světlá F1: P 1 p 1 P 2 p 2 x P 1 p 1 P 2 p 2 tm. hnědá tm. hnědá F2: P 1 -P 2 - : P 1 -p 2 p 2 : p 1 p 1 P 2 : p 1 p 1 p 2 p 2 tm. hnědá hnědočervená světlá 9 : 3 : 3 : 1 9 : 6 : 1 126

128 Obecné schéma biochemické interpretace duplicity kumulativní s dominancí: A 1 nebo A 2 A 1 + A 2 S > nižší hladina P > vyšší hladina P 1 /a 1, a 2 / X.8 DUPLICITA (MULTIPLICITA) KUMULATIVNÍ BEZ DOMINANCE Při duplicitě (obecně multiplicitě) kumulativní bez dominance je intenzita fenotypového projevu znaku závislá na počtu aktivních alel bez ohledu na jejich příslušnost k jednomu nebo druhému (v případě multiplicity ke kterémukoli dalšímu) alelovému páru genů spolupodílejících se na determinaci daného znaku. Pro tuto genovou interakci tedy platí: čím více aktivních alel je obsaženo v genotypu určitého jedince, tím intenzívněji se znak fenotypově vyjádří. Znamená to, že účinek jednotlivých aktivních alel je aditivní. V případě duplicity kumulativní bez dominance se objeví v generaci F2 pět fenotypových tříd v poměru shodném s koeficienty druhé sudé řady Pascalova trojúhelníku. Pro různé stupně multiplicity tohoto typu obecně platí, že počet fenotypových tříd v generaci F2 je 2n + 1, přičemž fenotypový štěpný poměr v generaci F2 odpovídá koeficientům n-té sudé řady Pascalova trojúhelníku (n = počet alelových párů). Duplicita kumulativní bez dominance se uplatňuje například při dědičnosti zbarvení obilek u pšenice. Podílejí se na ní dva alelové páry (R 1, r 1 ; R 2, r 2 ) dvou genů lokalizovaných na různých párech homologických chromozomů. V přítomnosti pouze recesivních alel v genotypu vzniknou obilky bílé (velmi světle zbarvené), v přítomnosti jedné aktivní alely (R 1 nebo R 2 ) vzniknou obilky zbarvené světle červeně, v přítomnosti kterýchkoli dvou aktivních alel těchto dvou genů vzniknou obilky zbarvené středně červeně, v přítomnosti kterýchkoli tří aktivních alel těchto dvou genů vzniknou obilky zbarvené červeně a konečně v přítomnosti všech čtyř aktivních alel těchto dvou genů vzniknou obilky zbarvené tmavě červeně. Schéma duplicity kumulativní bez dominance: P: R 1 R 1 R 2 R 2 x r 1 r 1 r 2 r 2 tm. červená bílá F1: R 1 -R 2 - x R 1 -R 2 - stř. červená stř. červená F2: R 1 R 1 R 1 : R 1 R 1 R 2 r 2 : R 1 R 1 r 2 r : R 1 r 1 r 2 r 2 : r 1 r 1 r 2 r 2 127

129 R 1 r 2 R 2 R 2 R 1 r 1 R 2 r 2 r 1 r 1 R 2 r 2 r 1 r 1 R 2 R 2 tmavě středně slabě červená červená červená červená bílá 1 : 4 : 6 : 4 : 1 Pascalův trojúhelník první sudá řada druhá sudá řada Obecné schéma biochemické interpretace duplicity kumulativní bez dominance: 1ak. al. S > 1P /neak. al./ 3 ak. al. S >3P 2 ak. al. 4 ak. al. S > 2P S > 4P Legenda: neak. al. = neaktivní alela ak. al. = aktivní alela 1, 2, 3, 4 = počet (aktivních alel) 1P, 2P, 3P, 4P = množství produktu 128

130 Pro jednotlivé typy genových interakcí je možné vypočítat počet fenotypových tříd v generaci F2 a určit fenotypové štěpné poměry podle vzorců uvedených v následující tabulce. Genová interakce Fenotypový štěpný poměr Počet fenotypových tříd Reciproká (3 : 1) n 2 n Dominantní epistáze (4 n 4 n-1 ) : (4 n-1 4 n-2 ) :... : 1 n + 1 Recesivní epistáze 3 n : (3 n-1 x 4 0 ) : (3 n-2 x 4 1 ) :...: (3 0 x 4 n-1 ) n + 1 Inhibice (4 n 3) : 3 2 Komplementarita 3 n : (4 n 3 n ) 2 Multiplicita nekumulativní s dominancí Multiplicita kumulativní s dominancí Multiplicita kumulativní bez dominance (4 n 1) : 1 2 (9 : 6 : 1) x (3 : 1) n-2 n + 1 (1 + 1) 2n koeficienty sudých řad Pascalova trojúhelníku 2n

131 XI. VAZBA GENŮ V předchozí kapitole jsme se zabývali dědičností znaků, jejichž geny byly lokalizovány na různých párech homologických chromozomů. Ukázali jsme si, že se v takových případech při přenosu genetické informace u eukaryot uplatňuje princip segregace a kombinace vloh. Každý chromozom však nenese pouze jeden gen, ale větší počet genů. To platí o chromozomech prokaryotických i eukaryotických organizmů. Geny lokalizované na jednom a tomtéž páru homologických chromozomů se označují jako geny vázané. Soubor těchto genů tvoří tzv. vazbovou skupinu. Přibližně platí, že počet vazbových skupin v buňce je roven počtu párů homologických chromozomů (tj. haploidnímu počtu chromozomů v případě diploidních organizmů). Odchylku od tohoto pravidla je třeba uvažovat v případě jedinců heterogametického pohlaví, jejichž gonozomy netvoří homologický pár (např. muži). Jestliže jsou jednotlivé chromozomy distribuovány při buněčném dělení do nově vznikajících buněk jako určité diskrétní jednotky představující soubory lineárně uspořádaných genů, potom by bylo možné předpokládat, že se pořadí a formy genů uvnitř konkrétních chromozomů z generace na generaci nebudou měnit; jinými slovy - genová sestava každého chromozomu zůstane z generace na generaci konstantní a genetická variabilita bude výsledkem pouze principu segregace a kombinace chromozomů, resp. genů, umístěných na nehomologických chromozomech (neuvažujeme-li vliv mutačního procesu). Tento předpoklad je však v rozporu se skutečností. Jak již bylo uvedeno výše, v průběhu profáze prvního (heterotypického) meiotického dělení dochází k rekombinaci, tedy k výměně kratších či delších úseků nesesterských chromatid mechanizmem nazývaným crossing-over. Při crossing-overu nejprve vzniknou zlomy na jednom nebo více místech každé ze zúčastněných nesesterských chromatid a následkem toho se tyto chromatidy přeruší. V další fázi se nesesterské chromatidy v místech zlomů překříží a nakonec se (v tomto překříženém stavu) znovu spojí. Molekulární mechanizmy rekombinace jsou doposud jen částečně objasněny (zejména u eukaryot). Z tohoto důvodu se omezíme na velice stručný popis Hollidayova modelu obecné rekombinace (Robin Holliday, 1964), který je ve shodě s dílčími experimentálně získanými údaji a vyhovuje lépe současným poznatkům, než některé modely starší, zejm. mechanistické. Tento model je znám pod označeními double strand break repair (DSBR) nebo double Holliday junction model (viz schéma níže). Jiný model rekombinace, založený na předpokladu dvojitého zlomu DNA, předložil v r Jack Szostak (tzv. double break model of recombination). Existují i další modely rekombinace (např. SDSA model synthesisdependent strand annealing). V některých částech se překrývají (shodují), v jiných (zejm. v předpokládaném molekulárním mechanizmu rekombinace) se vzájemně různí. V každém ze jmenovaných modelů se vychází ze skutečnosti, že obě molekuly dsdna (jako hlavní složky chromatid chromozomů) nebo jejich části, které rekombinují, jsou zcela homologické nebo kvazihomologické a nacházejí se v těsném vzájemném kontaktu; obě tyto podmínky jsou splněny vytvořením bivalentů v profázi prvního meiotického dělení. Vlastní rekombinace se pak podle Hollidayova modelu - realizuje mezi stejně (tj. paralelně) orientovanými řetězci dsdna homologických chromozomů, v nichž se působením endonukleáz vytvoří zlomy. Po vytvoření zlomů se uvolněné paralelní řetězce dsdna vzájemně provlečou, překříží, v překříženém stavu se volnými konci kovalentně spojí s homologickým řetězcem a komplementárně spárují s řetězcem téže molekuly dsdna, s níž rekombinovaly. Schémata některých modelů rekombinace jsou uvedena na následujících obrázcích. 130

132 Obr.: Schéma meiotické rekombinace. A Zdroj: 131

133 Obr.: Bivalenty a crossing-over v redukčním meiotickém dělení. Zdroj: 132

134 Obr.: Schéma modelů rekombinace: DSBR a SDSA. Zdroj: 133

135 Obr.: Model rekombinace předpokládající dvojitý zlom DNA (double break model) Zdroj: Za běžný jev je považována tzv. obecná rekombinace, uskutečňovaná mezi členy téhož páru homologických chromozomů, tedy v rámci jedné vazbové skupiny. V tomto případě mohou být rekombinovány kterékoli geny, které se v dané vazbové skupině nacházejí. Výměna částí nesesterských chromatid se nejčastěji uskutečňuje na úrovni celých genů (rekombinace intergenová), zřídka na úrovni nižší než gen (rekombinace intragenová). Kromě obecné rekombinace se v omezené míře vyskytuje tzv. specifická rekombinace, která se realizuje mezi různými nehomologickými vazbovými skupinami. Je zřejmé, že rozsah této formy rekombinace je omezen pouze na homologické (nebo kvazihomologické) oblasti nehomologických vazbových skupin. Uplatňuje se např. při integraci virového genoforu do DNA hostitelské buňky (vznik proviru), nebo při přechodu epizomu ze stavu autonomního do stavu integrovaného. Chromozomy, jejichž genetická informace byla pozměněna rekombinací, se označují jako rekombinované chromozomy. Podobně gamety, které obsahují rekombinované chromozomy, se označují jako rekombinované gamety a jedinec, který je nositelem rekombinovaných chromozomů, resp. vznikl z gamet, z nichž alespoň jedna byla rekombinovaná, se označuje jako rekombinant. O rekombinantech hovoříme též v těch případech, kdy se rekombinace neuskutečnila sexuálním procesem, ale procesem jemu obdobným (např. konjugací u bakterií), případně je výsledkem technologií genových manipulací využívajících rekombinantní molekuly DNA. 134

136 První zásadní práce a výzkum v oblasti genové vazby se pojí se jmény W. Bateson a R. C. Morgan. Na základě výsledků rozsáhlých experimentů (především s modelovým organizmem Drosophila melanogaster) Morgan objasnil projevy vazby genů na základě chromozomové teorie dědičnosti. Od r jsou známy jeho dva všeobecně platné zákony: (1) pořadí genů na chromozomu je lineární (2) počet vazbových skupin je roven počtu párů homologických chromozomů Problematiku vazby genů budeme demonstrovat na příkladu dvou genů, které jsou lokalizovány na tomtéž páru homologických chromozomů (jinými slovy jsou součástí jedné a téže vazbové skupiny), přičemž každý z nich je tvořen alelovým párem (A, a; B, b) a mezi alelami uvnitř každého alelového páru existuje vztah úplné dominance. Pro zdůraznění, že lokusy genů leží na stejném páru homologických chromozomů, provádíme symbolický zápis genotypů v podobě zlomku, v němž jsou v čitateli uvedeny alely lokalizované na jednom a ve jmenovateli na druhém chromozomu příslušného páru homologických chromozomů. V rodičovské generaci budeme křížit dominantního homozygota v obou znacích s recesivním homozygotem v obou znacích (AB/AB x ab/ab). V generaci F1 získáme dihybrida AB/ab, u něhož jeden chromozom příslušného páru homologických chromozomů nese obě dominantní alely (AB) a druhý chromozom téhož páru homologických chromozomů nese obě recesivní alely (ab). Za předpokladu, že by neexistovala žádná možnost výměny genetického materiálu mezi nesesterskými chromatidami, tvořil by takový dihybrid pouze dvě třídy gamet: AB a ab. V generaci F2 by se za této situace objevili jedinci pouze dvou fenotypových tříd: jedni s fenotypem v obou znacích dominantním a druzí s fenotypem v obou znacích recesivním; fenotypový štěpný poměr (3 : 1) a genotypový štěpný poměr (1 : 2 : 1) by byl shodný s fenotypovým a genotypovým štěpným poměrem typickým pro monohybridizmus. Ve skutečnosti však i dihybrid s vázanými geny (AB/ab) tvoří obvykle čtyři typy gamet (AB, Ab, ab, ab), avšak v jiném poměru než 1 : 1 : 1 : 1 (na rozdíl od dihybrida, jehož geny leží na různých párech homologických chromozomů a tudíž se mohou volně kombinovat). Jejich vznik při gametogenezi je právě výsledkem rekombinace, uskutečněné prostřednictvím crossing-overu v průběhu profáze prvního meiotického dělení. Jestliže gamety genotypů AB, Ab, ab, ab vznikají v jiném poměru než 1 : 1 : 1 : 1, znamená to, že rekombinace (crossing-over) je jevem, vyskytujícím se náhodně s určitou pravděpodobností menší než jedna (0 < P < 1). Pravděpodobnost vzniku crossing-overu je tím vyšší, čím větší je vzdálenost mezi lokusy dvou různých genů lokalizovaných na tomtéž páru homologických chromozomů. Touto pravděpodobností je vyjádřena síla vazby. Z toho vyplývá, že vazba genů je tím silnější, čím menší je vzdálenost mezi geny na chromozomu. Proto pravděpodobnost vzniku rekombinovaných gamet je tím nižší, čím silnější je vazba genů a tudíž i četnost rekombinantů odráží funkční závislost rekombinace na síle vazby (rekombinace je nepřímo úměrná síle vazby). Dihybrid v generaci F1 (AB/ab), který je potomkem rodičů s genotypy AB/AB a ab/ab, bude produkovat nerekombinované gamety s genotypem AB a ab v poměru 1 : 1 a gamety rekombinované Ab a ab rovněž v poměru 1 : 1, avšak četnost všech nerekombinovaných gamet bude vyšší než četnost všech rekombinovaných gamet, tj. Σ(AB + ab) > Σ(Ab + ab), přičemž tento rozdíl v četnostech nerekombinovaných a rekombinovaných gamet odráží sílu vazby. V generaci F2 budou zastoupeny všechny genotypové i fenotypové kategorie jako v případě dihybridizmu s volně kombinovatelnými alelami (chromozomy), avšak v pozměněných poměrech. Při analytickém zpětném křížení získáme jedince čtyř fenotypových kategorií odpovídající čtyřem genotypovým kategoriím (AB/ab, Ab/ab, ab/ab, ab/ab) v poměru teoreticky shodném s poměrem produkovaných rekombinovaných a nerekombinovaných gamet. 135

137 Dihybrida s dominantním fenotypem v obou znacích lze v generaci F1 získat též jako potomka rodičů, z nichž jeden je dominantní homozygot ve znaku A a recesivní homozygot ve znaku B (Ab/Ab), druhý je recesivní homozygot ve znaku A a dominantní homozygot ve znaku B (ab/ab). Rozložení alel A, a, B, b na jednotlivých chromozomech příslušného páru homologických chromozomů se však u něho bude lišit od rozložení těchto alel u dihybrida (AB/ab) pocházejícího od rodičů, z nichž jeden byl v obou zkoumaných znacích dominantní homozygot (AB/AB) a druhý recesivní homozygot (ab/ab): jeden chromozom ponese dominantní alelu A a recesivní alelu b, druhý chromozom ponese naopak recesivní alelu a a dominantní alelu B (Ab/aB). Toto uspořádání alel na jednotlivých chromozomech příslušného páru homologických chromozomů se projeví při produkci gamet dihybrida Ab/aB: genotyp nerekombinovaných gamet bude Ab a ab, kdežto genotyp rekombinovaných gamet bude AB a ab, tedy právě opačně, než tomu bylo u dihybrida AB/ab. Četnost jednotlivých kategorií nerekombinovaných gamet bude 1 : 1, právě tak jako četnost jednotlivých kategorií rekombinovaných gamet, avšak stejně jako v předchozím případě celková četnost gamet nerekombinovaných bude vyšší než celková četnost gamet rekombinovaných, tedy: Σ(Ab + ab) > Σ(AB + ab). Podle uspořádání alel v rámci jedné vazbové skupiny (tj. jednoho páru homologických chromozomů) se rozlišují dvě vazbové fáze: cis (dříve coupling) a trans (dříve repulsion). Jestliže u jednoho z rodičů jsou na obou chromozomech zastoupeny pouze dominantní alely (AB/AB) a u druhého pouze recesivní alely (ab/ab) dvou genů ve vazbě, jedná se o vazbovou fázi cis (genotyp jedinců generace F1 se zapisuje AB/ab). Jestliže u jednoho z rodičů jsou na jednom chromozomu zastoupeny dominantní alely jednoho a recesivní alely druhého ze dvou genů ve vazbě (Ab/Ab) a u druhého je tomu naopak (ab/ab), jedná se o vazbovou fázi trans (genotyp jedinců generace F1 se zapisuje Ab/aB). Sílu vazby je možné stanovit na základě výsledků (tj. četností jednotlivých fenotypových tříd) dosažených v generaci B1 a vyjádřit ji tzv. Batesonovým nebo Morganovým číslem. Batesonovo číslo ( c ) se vypočítá jako poměr mezi četností gamet (resp. zygot) s nerekombinovaným uspořádáním alel a gamet (resp. zygot) s rekombinovaným uspořádáním alel. suma nerekombinovaných gamet c = suma rekombinovaných gamet Morganovo číslo ( p ) se vypočítá jako poměr rekombinovaných gamet (resp. zygot) ku všem (tj. rekombinovaným i nerekombinovaným) vyprodukovaným gametám (resp. zygotám). Rekombinační jednotka je 1 centimorgam (1 cm) a znamená, že dihybrid tvoří 1% (resp. 0,01) gamet s rekombinovanou sestavou alel neboli pravděpodobnost vzniku crossing-overu je rovna 1% (resp. 0,01). suma rekombinovaných gamet p = suma všech gamet 136

138 Batesonovo a Morganovo číslo jsou čísla navzájem převoditelná: 1 p 1 c = p = p c + 1 Sílu vazby je možné stanovit též na základě výsledků segregace v generaci F2, neboť jsou-li dva geny ve vazbě, potom četnost jedinců v jednotlivých genotypových třídách bude v generaci F2 vyjádřením četností gamet jednotlivých genotypů. V tomto případě se k výpočtu síly vazby používá tzv. součinových vzorců pro vazbovou fázi cis a trans: a 2 x a 3 a 1 x a 4 p cis = p trans = a 1 x a 4 a 2 x a 3 Výsledek, získaný výpočtem podle součinových vzorců, neudává sílu vazby přímo v centimorganech, a proto je třeba vyhledat ji v příslušných tabulkách (např. pro p cis = 0,076 a pro p trans = 0,088 je tabelovaná hodnota síly vazby p = 20 cm). Je patrné, že stanovení síly vazby touto metodou je méně přesné a někdy může být i zavádějící. Příčinou určitých nepřesností může být rozdílná pravděpodobnost vzniku crossingoveru u samic a samců (např. u samic myší je vyšší než u samců, u samců holubů je vyšší než u samic, u samců drozofily a u samic bource morušového ke crossing-overu vůbec nedochází). Jiným zdrojem nepřesností může být málo početná generace F2, v níž se rekombinanti nemusí vůbec vyskytnout (zejména při velmi silné vazbě genů a tudíž velmi nízké pravděpodobnosti vzniku crossing-overu). Varianty křížení dvou genů ve vazbě ve fázi cis a trans jsou uvedeny na následujícím schématech. Genotypy rekombinovaných gamet a genotypy rekombinantů jsou psány tučně. Schéma: P: AB/AB x ab/ab (vazbová fáze cis) F1: AB/ab gamety AB Ab ab ab dihybrida B1: AB/ab : Ab/ab : ab/ab : ab/ab četnosti zygot B1: a 1 a 2 a 3 a 4 a 1 = a 4, a 2 = a 3 a 1 + a 4 > a 2 + a 3 Batesonovo číslo: c = (a 1 + a 4 ) / (a 2 + a 3 ) Morganovo číslo: p = (a 2 + a 3 ) / a 1 + a 2 + a 3 + a 4 ) 137

139 P: Ab/Ab x ab/ab (vazbová fáze trans) F1: Ab/aB gamety AB Ab ab ab dihybrida B1: AB/ab : Ab/ab : ab/ab : ab/ab četnosti zygot B1: a 1 a 2 a 3 a 4 a 1 = a 4, a 2 = a 3 a 1 + a 4 < a 2 + a 3 Batesonovo číslo: c = (a 2 + a 3 ) / (a 1 + a 4 ) Morganovo číslo: p = (a 1 + a 4 ) / a 1 + a 2 + a 3 + a 4 ) 138

140 Obr.: Schéma rekombinace ve fázi trans. Obr.: Schéma rekombinace ve fázi trans. Zdroj: 139

141 Varianty křížení dvou genů ve vazbě ve fázi cis a trans jsou uvedeny na následujícím schématech. Genotypy rekombinovaných gamet a genotypy rekombinantů jsou psány tučně. Schéma: P: AB/AB x ab/ab (vazbová fáze cis) F1: AB/ab gamety AB Ab ab ab dihybrida B1: AB/ab : Ab/ab : ab/ab : ab/ab četnosti zygot B1: a 1 a 2 a 3 a 4 a 1 = a 4, a 2 = a 3 a 1 + a 4 > a 2 + a 3 Batesonovo číslo: c = (a 1 + a 4 ) / (a 2 + a 3 ) Morganovo číslo: p = (a 2 + a 3 ) / a 1 + a 2 + a 3 + a 4 ) P: Ab/Ab x ab/ab (vazbová fáze trans) F1: Ab/aB gamety AB Ab ab ab dihybrida B1: AB/ab : Ab/ab : ab/ab : ab/ab četnosti zygot B1: a 1 a 2 a 3 a 4 a 1 = a 4, a 2 = a 3 a 1 + a 4 < a 2 + a 3 Batesonovo číslo: c = (a 2 + a 3 ) / (a 1 + a 4 ) Morganovo číslo: p = (a 1 + a 4 ) / a 1 + a 2 + a 3 + a 4 ) V současné době je možné detailně studovat vazbu genů a s ní související rekombinaci na molekulární (genové a subgenové) úrovni za použití řady molekulárněgenetických metod (např. sekvenování, hybridizace nukleových kyselin). Významných výsledků však lze dosáhnout i za použití metod, které umožňují detegovat a analyzovat projevy vazby genů na úrovni cytologické a organizmální. Výsledky studia genové vazby na všech těchto úrovních (tj. organizmální, buněčná, molekulární) jsou využity převážně 140

142 k účelům genetického mapování a konstrukci genetických map. Pod pojmem genetické mapování rozumíme takovou činnost, jejímž výsledkem je zjištění lokalizace zkoumaných genů v karyotypu daného druhu (jinými slovy, na kterém chromozomu se nachází lokus určitého genu, ve které jeho části a v jaké vzdálenosti od sousedních nebo dalších genů ležících na tomtéž chromozomu) a jejich struktury. Na základě takovýchto poznatků jsou konstruovány genetické mapy. Podle úrovně, na které bylo genetické mapování prováděno a podle použitých metod jsou genetické mapy klasifikovány do několika skupin: 1. cytologické (chromozomové) jedná se o mapy, ve kterých je možné lokalizovat na jednotlivých chromozomech lokusy genů za použití vhodných cytologických (resp. cytogenetických metod). Lokusy jednotlivých genů nebo skupin genů jsou pozorovatelné v rozsahu rozlišovací schopnosti světelného mikroskopu a měřitelné v hodnotách absolutních (obvykle µm) nebo relativních (v podobě různých indexů). Z uvedeného je patrné, že cytologické mapy mohou být konstruovány pouze za předpokladu, že chromozomy karyotypu příslušného druhu jsou dostatečně veliké na to, aby jejich vnitřní struktura byla patrná i při limitech cytogenetických metod. Za velmi vhodné pro konstrukci cytologických map můžeme považovat polytenní chromozomy slinných žláz hmyzu (lze vizualizovat jednotlivé chromomery). Pro svou velikost se někdy označují jako obří chromozomy (např. Bridges uvádí délku všech čtyř chromozomů Drosophila melanogaster přibližně 1 180µm). Při použití moderních cytogenetických metod (proužkovacích, fluorescenčních) lze s dostatečnou přesností analyzovat i chromozomy značně menší, např. chromozomy člověka. Cytologické mapy musejí být v souladu s mapami zkonstruovanými na základě výsledků studia rekombinace 2. genetické (vazbové, rekombinační) jedná se o mapy, ve kterých jsou jednotlivé geny (resp. lokusy genů) na chromozomech zobrazeny ve vhodném měřítku jako lineárně uspořádané hmotné body, přičemž vzdálenost mezi nimi je úměrná síle vazby udané v rekombinačních jednotkách (centimorgany). 3. fyzikální (genová, restrikční, sekvenční, molekulární) jedná se o mapy, ve kterých je uvedena primární struktura DNA (resp. RNA u RNA-organizmů) jednotlivých genů. Gen je v těchto mapách prezentován ve formě sekvence deoxyribonukleotidů (resp. ribonukleotidů) stanovené při jeho sekvenování. Mezi všemi třemi druhy genetických map musí existovat soulad, tedy vzájemná převoditelnost, i když ne naprostá shoda. V rámci tématu vazby genů se budeme blíže zabývat konstrukcí vazbových neboli rekombinačních map. Z hlediska terminologického je třeba dodat, že termín genetická mapa vznikl historicky v době, kdy byly známy pouze cytologické (resp. cytogenetické) a rekombinační (vazbové) metody konstrukce genetických map. Pro odlišení těchto dvou skupin metod a specifických přístupů (na jedné straně cytologických a na straně druhé genetických) byly zavedeny termíny cytologické mapování (cytologická mapa) a genetické mapování (genetická mapa). S rozvojem molekulárněgenetických metod však genetické mapování proniklo až na subgenovou úroveň. Pro odlišení molekulárně genetických metod a přístupů ke genetickému mapování se začalo používat označení fyzikální, genové, sekvenční či molekulární mapování (mapy). Termín genetické mapování se tedy dnes používá ve dvou významech: v užším, zahrnujícím metody mapování založené na využití poznatků o vazbě genů, a v širším, zahrnujícím kromě toho ještě metody molekulárně genetické, případně cytogenetické. Každý chromozom představuje množinu lineárně uspořádaných genů. Teoreticky mezi jakýmikoli dvěma sousedními geny (resp. lokusy) může při meiotickém dělení vzniknout crossing-over a uskutečnit se výměna příslušných úseků nesesterských chromatid. Podle počtu takovýchto výměn v rámci jednoho páru homologických chromozomů rozlišujeme několik typů crossing-overů: jednoduchý, dvojitý, trojitý atd., obecně vícenásobný. 141

143 Obr.: Částečná genetická (vazbová) mapa Drosophila melanogaster. Zdroj: Jednoduchý crossing-over se uskutečňuje mezi dvěma lokusy téhož genu s následnou výměnou úseků nesesterských chromatid, vymezených místem zlomu na chromatidách a konci chromatid. Jestliže na jednom chromozomu bude pořadí genů A B C D E F G, na druhém chromozomu téhož páru bude pořadí genů a b c d e f g a vznikne-li s určitou pravděpodobnosí P A-B jednoduchý crossing-over mezi lokusy genů A a B, potom pořadí genů na rekombinovaných chromozomech bude: A b c d e f g, resp. a B C D E F G. Podobně vznikne-li s určitou pravděpodobností P B-C jednoduchý crossing-over mezi lokusy genů B a C, bude pořadí genů na rekombinovaných chromozpmech: A B c d e f g, resp. a b C D E F G. Připusťme ještě, že s určitou pravděpodobností P C-D vznikne jednoduchý crossing-over mezi lokusy genů C a D ; potom pořadí genů na rekombinovaných chromozomech bude A B C d e f g, resp. a b c D E F G. Analogicky můžeme postupovat u lokusů pro všechny ostatní geny daného chromozomového páru. Na některých chromozomech však může dojít ke vzniku dvojitého crossing overu. Připusťme, že se v našem případě uskuteční dvojitý crossing-over mezi geny A B a 142

144 B C. Pravděpodobnost výskytu takového dvojitého crossing-overu je teoreticky rovna součinu pravděpodobností vzniku jednoduchého crossing-overu mezi geny A a B a jednoduchého crossing-overu mezi geny B a C, tedy P A-B-C = P A-B x P B-C. Pořadí genů na rekombinovaných chromozomech v důsledku dvojitého crossing-overu mezi uvedenými geny bude: A b C D E F G, resp. a B c d e f g. Podobně pravděpodobnost vzniku dvojitého crossing-overu mezi geny B C a C D bude teoreticky rovna součinu pravděpodobností vzniku jednoduchého crossing-overu mezi geny B a C a jednoduchého crossing-overu mezi geny C a D, tedy P B-C-D = P B-C x P C-D. Pořadí genů na rekombinovaných chromozomech v tomto případě bude: A B c D E F G, resp. a b C d e f g. Kdybychom oblast možné lokalizace dvojitého crosingoveru vymezili pouze genem A a genem D, potom pravděpodobnost vzniku takového dvojitého crossing-overu (P A-D ) by byla vyšší než pravděpodobnost vzniku kteréhokoli z výše uvedených dvojitých crossing-overů a to úměrně vzdálenosti mezi geny A a D, protože pravděpodobnost vzniku crossing-overu je funkcí vzdálenosti mezi geny nacházejícími se na daném páru homologických chromozomů. V našem případě bude platit, že P AD > P A-B-C, P AD > P B-C-D. Tomuto vymezení vyhovuje vznik dvojitého crossing-overu mezi geny A B a C D ; pořadí genů na rekombinovaných chromozomech potom bude: A b c D E F - G, resp. a B C d e f g. Kromě uvedených jednoduchých a dvojitých crossing-overů může mezi geny A B C D vzniknout také jeden trojitý crossing over s teoretickou pravděpodobností rovnou součinu pravděpodobností vzniku jednotlivých jednoduchých crossing-overů mezi geny A a B, B a C, C a D, tedy P A-B-C-D = P A-B x P B-C x P C-D. Pořadí genů na takto vzniklých rekombinovaných chromozómech bude: A b C d - e f g, resp. a B c D E F G. Uvedené pravděpodobnostní vztahy mezi jednotlivými typy crossing-overů a vzdálenostmi mezi geny (lokusy) na chromozomu se využívají v základní metodě genetického mapování založeného na vazbě genů, kterou je tzv. tříbodový test. Při provedení tříbodového testu se sledují současně vazbové vztahy mezi třemi různými geny. Provedení tříbodového testu budeme demonstrovat na modelovém příkladu. Samice F1 genotypu Abc/aBC (tedy trihybrid s dominantním fenotypem ve všech třech znacích) bude zpětně křížena se samcem s genotypem abc/abc (tj. se samcem s recesivním fenotypem ve všech třech znacích). Jestliže při gametogenezi této trihybridní samice nedojde k rekombinaci, bude fenotyp poloviny potomků dominantní ve znaku A a recesivní ve znacích B i C (genotyp Abc/abc) a poloviny recesivní ve znaku A a dominantní ve znacích B i C (genotyp abc/abc). Uskuteční-li se jednoduchý crossing-over mezi geny A a B, objeví se potomci s fenotypem dominantním ve všech třech znacích (genotyp ABC/abc) a potomci s fenotypem recesivním ve všech třech znacích (genotyp abc/abc). Po realizaci jednoduchého crossing-overu mezi geny B a C vzniknou potomci dominantní ve znacích A a C a současně recesivní ve znaku B (genotyp AbC/abc), a potomci recesivní ve znacích A, a C a dominantní ve znaku B (genotyp abc/abc). Konečně po vzniku dvojitého crosing-overu mezi geny A B C se vyskytnou jednak potomci s fenotypem dominantním ve znacích A a B a současně recesivním ve znaku C (genotyp ABc/abc), jednak potomci s fenotypem recesivním ve znacích A a B a současně dominantním ve znaku C (genotyp abc/abc). Na základě četností jednotlivých fenotypových tříd v generaci B1 (ty, které vznikají v důsledku dvojitého crossing-overu jsou nejméně četné) je možné stanovit vzdálenost mezi jednotlivými geny (lokusy), neboli sílu vazby, a pořadí genů na chromozomu; fenotypové třídy vznikající v důsledku dvojitého crossing-overu jsou nejméně četné). Postup je zřejmý z následujícího schématu modelového příkladu tříbodového testu. 143

145 Tab.: Schéma tříbodového testu B1: Abc/aBC x abc/abc Typ a poloha crossingoveru žádný jednoduchý mezi A a B jednoduchý mezi B a C dvojitý mezi A a B a mezi B a C Gamety v F1 Fenotyp v B1 Počet jedinců v B1 [%] Abc abc ABC abc AbC abc ABc abc ac a standard abc b ac c ab ,2 0,8 Hodnoty relativních četnosti rekombinantů produkovaných v důsledku vzniku jednoduchých crossing-overů (14% a 5,2%) je třeba upravit ještě o hodnotu relativních četností rekombinantů produkovaných v důsledku vzniku dvojitého crossing-overu (0,8%). Korigované hodnoty potom budou 14% + 0,8% = 14,8% pro sílu vazby mezi geny A B a 5,2% + 0,8% = 6% pro sílu vazby mezi geny B C. Z uvedeného příkladu tříbodového testu vyplývají následující závěry: (1) gen B leží mezi geny A a C (nejméně četné fenotypové třídy ABc a abc vznikly dvojitým crossing-overem a proto v našem případě budou krajními geny gen A a gen C ) (2) síla vazby mezi geny A B je 14,8 cm, síla vazby mezi geny B - C je 6 cm (3) vzdálenost mezi geny A B je přibližně 2,5-krát větší než vzdálenost mezi geny B C Přesnost genetického mapování prováděného na základě vazby genů, může být ovlivněna interferencí. Interferencí rozumíme jev, při kterém vznik jednoho crossing-overu snižuje nebo naopak zvyšuje pravděpodobnost vzniku druhého (resp. dalšího) crossing-overu. V případě pozitivní interference je nalezená četost dvojitých (resp. dalších vícenásobných) crossing-overů nižší než teoreticky očekávaná. V případě negativní interference je naopak nalezená četnost dvojitých (resp. dalších vícenásobných) crossing-overů vyšší než teoreticky očekávaná. Poměr mezi nalezenou četností dvojitých (vícenásobných) crossing-overů a jejich teoreticky očekávanou četností se označuje jako koeficient koincidence. V příkladu, uvedeném ve schématu tříbodového testu, byla relativní četnost rekombinantů vzniklých v důsledku dvojitého crossing-overu 0,8% (0,008). Upravené četnosti rekombinantů vzniklých v důsledku jednoduchých crossing-overů byly 14,8% (0,148) a 6% (0,060). Teoreticky očekávaná četnost dvojitých rekombinantů by měla být rovna 0,148 x 0,060 = 0,00888 (0,888 %). Koeficient koincidence bude roven 0,008 / 0,00888 = 0,9009. To tedy znamená, že z teoreticky očekávaného počtu dvojitých rekombinantů jich skutečně vzniklo (bylo nalezeno) jenom asi 90% a proto lze v daném případě uvažovat o vlivu pozitivní interference. Vzhledem ke skutečnosti, že k rekombinaci dochází v profázi prvního meiotického dělení, kdy každý chromozom sestává z jedné dvojice chromatid, může dvojitý (obecně vícenásobný) crossing over zasahovat tyto chromatidy v různých kombinacích. Z tohoto 144

146 hlediska rozlišujeme tři typy dvojitých crossing overů: reciproký, který zasahuje pouze dvě ze čtyř nesesterských chromatid, komplementární, při kterém jeden crossing over zasahuje jednu a druhý crossing-over druhou dvojici nesesterských chromatid, a diagonální, při kterém crossing-over zasahuje pouze tři chromatidy a to tak, že na jedné chromatidě se vymění dva chromatidové úseky, kdežto na dvou dalších chromatidách se vymění pouze po jednom chromatidovém úseku. Dosud jsme předpokládali, že v důsledku párování homologických chromozomů dojde ke crossing overu přesně na rozhraní dvou sousedních genů a tudíž následně k reciprokým výměnám alel. V přírodě se však vyskytují určité odchylky od zcela přesného párování homologických chromozomů, které rezultují ve vznik inekválního crossing-overu, při kterém dochází k nereciproké výměně alel. Důsledkem inekválního crossing-overu je duplikace určité oblasti na jedné a delece téže oblasti na druhé z rekombinovaných chromatid, což vede k produkci gamet s nestejným obsahem genetické informace. Duplikace genetického materiálu se významně uplatnily v biologické evoluci (zejména jako prostředky navození a fixace strukturně-funkčních změn v genomu). Při analýze genomů mnoha druhů organizmů se často vyskytují geny s velmi podobnou sekvencí deoxyribonukleotidů; předpokládá se, že tyto geny, někdy označované jako paralogní geny, vznikly opakovanými duplikacemi ancestrálního genu. Takové duplikace mohou být výhodné jak z hlediska jedince, který je jejich nositelem, tak z hlediska evolučního. Například při poškození jednoho z duplikovaných genů může být jeho funkce zajišťována druhým (duplikovaným) genem. V delším časovém intervalu od vzniku duplikace je možné, aby druhý gen nabyl nové funkce, která se může uplatnit při adaptivní evoluci. Konečně odlišné změny, vznikající v duplikovaných (obecně multiplikovaných) genech a přenášené z generace na generaci v různých skupinách potomků, mohou vést prostřednictvím postzygotického izolačního mechanizmu k vytvoření reprodukční bariéry mezi těmito skupinami potomků; jejich další izolovaný vývoj ve smyslu nemožnosti vzájemného křížení mezi příslušníky obou (příp. více) skupin, poskytujícího fertilní potomky, může dospět až k evolvování dvou (případně více) samostatných druhů. Inekválním crossing-overem mohou být produkovány též geny složené ze dvou částí různých genů, jestliže konce vyměňovaných chromatid zasahují do vnitřní části genů:...aaaaaaaa...bbbbbbbb... gen A c.-over..aaaaaaaa...bbbbbbbb... gen B...AAAAAAAA...BBAAAAAA...BBBBBBBB... složený gen...aaaaaaaa...aabbbbbb...bbbbbbbb... Některé z takto vzniklých složených genů mohou vést k novém genovému produktu se specifickým fenotypovým projevem, nebo alterovat fenotypový projev původních genů. Například způsobem, znázorněným na uvedeném schématu, vznikl složený gen sestávající na 5 - konci z oblasti promotoru genu pro 11-β-hydroxylázu a na 3 - konci z genu pro aldosteron syntázu, postrádajícího oblast promotoru; v tomto složeném genu se gen pro aldosteron syntázu vlivem nového promotoru silněji exprimoval než vlivem vlastního promotoru. Fenotypově se tato změna projevovala u nositelů složeného genu (alespoň na jednom chromozomu) hypertenzí a s ní asociovaným infarktem myokardu v relativně mladém věku. 145

147 Kromě popsaného statistického přístupu, běžně aplikovaného u eukaryot při stanovení síly vazby na základě štěpných poměrů v generaci B1 nebo F2, je v některých případech možné detegovat rekombinanty přímo metodou, která se označuje jako tetrádová analýza. Tuto metodu lze použít například při analýze tetrád haploidních jader spor u askomycet nebo bazidiomycet. Meiotickým dělením diploidních heterokaryontních buněk (tj. buněk, vzniklých fúzí dvou genotypově odlišných haploidních buněk rozdílného párovacího typu /mt +, mt - /) vzniknou čtyři haploidní jádra a následně čtyři haploidní spory uložené v asku nebo nesené bazidií, tvořící samostatný celek tetrádu askospor nebo bazidiospor (případně oktet spor, jestliže se buněčná jádra po vzniku tetrády ještě mitoticky rozdělí). Zvláště vhodné pro genetickou analýzu jsou uspořádané tetrády, které se vytvářejí např. u heterotalické askomycety Neurospora crassa a která se stala již klasickým modelovým mikroorganizmem. Analýzou jednotlivých tetrád můžeme přímo stanovit, zda při redukčním dělení určitého diploidního jádra došlo či nedošlo k rekombinaci a v kladném případě určit genovou oblast, která byla rekombinována. Předpokládejme, že před prvním redukčním dělením ponese z alelového páru A, a jeden zreplikovaný chromozom heterokaryontu dvě dominantní alely A (na každé chromatidě jednu) a druhý zreplikovaný chromozom dvě recesivní alely a (rovněž na každé chromatidě jednu). Jestliže se crossing-over neuskuteční ve zkoumané oblasti (např. mezi centromerou a lokusem genu A ), potom uspořádání spor v tetrádách bude 1A : 1A : 1a : 1a nebo 1a : 1a : 1A : 1A, obecně 2 : 2; říkáme, že sledované alely segregovaly při prvním meiotickém dělení. Jestliže se ve zkoumané oblasti (např. mezi centromerou a lokusem genu A ) uskuteční jednoduchý crossing-over, potom zjistíme některé z těchto uspořádání spor v tetrádách: 1A : 1a : 1A : 1a (resp. 1a : 1A : 1a : 1A) nebo 1A : 1a : 1a : 1A (resp. 1a : 1A : 1A : 1a); říkáme, že sledované alely segregovaly ve druhém meiotickém dělení. Nyní uvažujme dva alelové páry (A, a; B, b), z nichž se před meiotickým dělením heterokaryontu na každé chromatidě jednoho zreplikovaného chromozomu nachází dvojice dominatních alel A, B a na každé chromatidě zreplikovaného homologického chromozomu se nachází dvojice recesivních alel a, b. V tetrádě se objeví některé z následujících uspořádání spor: a) 1AB : 1AB : 1ab : 1ab, neboli 2AB : 2ab. Takovýto typ tetrád se označuje jako dikrátní parentální. Představuje nerekombinovanou sestavu alel. b) 1Ab : 1Ab : 1aB : 1aB, neboli 2Ab : 2aB. Takovýto typ tetrád se označuje jako dikrátní neparentální. Představuje rekombinovanou sestavu alel. c) 1AB : 1Ab : 1aB : 1ab. Takovýto typ tetrád se označuje jako tetrakrátní. Představuje rekombinovanou sestavu alel. Analogicky bychom postupovali při zkoumání výskytu crossing-overů mezi třemi či více geny. Z uvedených příkladů je zřejmé, že při takto prováděné tetrádové analýze je možno určit podíl asků, ve kterých došlo k segregaci alel při druhém meiotickém dělení a na základě toho přímo vyjádřit sílu vazby [centimorgany]. Mapování bakteriálních chromozomů je možné provádět na základě konjugace, transdukce a transformace. Podrobněji je o těchto procesech pojednáno na jiném místě. Konjugace je proces (obdobný sexuálnímu), při kterém se prostřednictvím pilusu realizuje výměna genetického materiálu mezi dvěma bakteriálními buňkami po jejich předchozím kontaktu. Konjugace je možná u některých druhů baktérií a to mezi kmeny, které obsahují tzv. fertilitní faktor typu epizomu a kmeny, které tento faktor neobsahují; první se 146

148 označují jako kmeny F +, druhé jako kmeny F. Pro účely genetického mapování musí být fertilitní faktor před konjugací v integrovaném stavu, tzn. musí být včleněn do bakteriálního chromozomu jako jeho součást; takové kmeny se označují jako Hfr a vyznačují se vysokou frekvencí rekombinace. Při konjugaci se přesouvá chromozom z buňky kmene Hfr (donor) do buňky kmene F (recipient). Zpravidla se nepřenese celý chromozom donorové buňky, ale pouze část, neboť dojde dříve či později k jeho zlomu. Z recipientní buňky tak vzniká merozygota, která obsahuje celý vlastní chromozom a přenesenou část chromozomu donorové buňky. Přenesená část chromozomu donorové buňky může rekombinovat s homologickou oblastí chromozomu recipientní buňky za vzniku transkonjugantů, které lze za použití vhodného selekčního systému snadno detegovat. Četnost transkonjugantů je mírou síly vazby. Protože je přenos chromozomu z donorové buňky do buňky recipientní polarizován (linearizovaný chromozom donora vstupuje do recipientní buňky 5 - koncem vždy od místa ori) a uskutečňuje se konstantní rychlostí, je četnost přenosu jednotlivých genů lokalizovaných na chromozomu donorové buňky funkcí jejich vzdálenosti od počátku chromozomu (tj. od místa ori). Jestliže se umožní konjugaci bez vnějšího zásahu spontánně proběhnout (tzv. nepřerušovaná konjugace), vzniknou merozygoty vzájemně se lišící délkou přenesených segmentů chromozomu donora, přičemž četnost merozygot s kratšími segmenty (nesoucími geny umístěné blíže místa ori) bude vyšší než četnost merozygot s delšími segmenty (nesoucími i geny umístěné ve větší vzdálenosti od místa ori). Jestliže se v jednotlivých časových intervalech konjuganti od sebe oddělí (tzv. přerušovaná konjugace), vznikne množina merozygot obsahujících různě dlouhé segmenty přenášeného chromozomu donora, přičemž délka těchto segmentů, a tedy i počet genů a vzdálenost mezi nimi, je funkcí času. Proto též série transkonjugantů, selektovaných po přerušení konjugace v jednotlivých časových intervalech, odráží pořadí genů a vzdálenost mezi nimi na chromozomu v závislosti na délce trvání konjugace. Při mapování bakteriálního chromozomu na základě konjugace se z těchto důvodů udává síla vazby v minutách, nikoli v centimorganech. Transdukce je proces přenosu genetického materiálu z donorové buňky do buňky recipientní zprostředkovaný transdukujícím fágem (obecně virem). Transdukující fágové částice obsahují fragment bakteriálního chromozomu (případně plazmid) donorové buňky, který může být při transdukci včleněn mechanizmem crossing-overu do chromozomu recipientní bakteriální buňky; recipientní buňka, která rekombinací s transdukujícím fágem přijala do svého chromozomu fragment chromozomu donorové bakteriální buňky, se označuje jako rekombinantní transdukant. Pro genetické mapování bakteriálního chromozomu je použitelná pouze transdukce produkující rekombinantní transdukanty. Transdukce abortivní, při níž přenášený fragment chromozomu donora nerekombinuje s chromozomem recipienta a transdukce plazmidová, při které je přenášen plazmid z donorové buňky, jsou k tomuto účelu nepoužitelné. Některé transdukující fágy mohou přenášet z chromozomu donorové buňky do recipientní buňky jen určité geny (transdukce specifická), jiné transdukující fágy mohou z chromozomu donorové buňky přenášet do recipientní buňky v zásadě kterýkoli gen (nespecifická transdukce). 147

149 Při nespecifické transdukci se vazba mezi dvěma geny stanovuje na základě tzv. kotransdukce, čímž se rozumí začlenění dvou těsně vázaných genů, přenesených týmž transdukujícím fágem, do chromozomu recipientní buňky. Přenášejí-li se tedy s vysokou četností jedním transdukujícím fágem do stejné recipientní buňky dva geny, lze je považovat za geny, mezi nimiž je silná vazba. Při mapování bakteriálního chromozomu na základě nespecifické transdukce se používá: (1) tzv. dvoubodové křížení. Předpokládejme existenci tří genů A, B, C. Jestliže gen A bude kontransdukovat s genem B, gen B bude kontransdukovat s genem C a gen C bude kontransdukovat s genem A, lze stanovit pořadí genů na chromozomu A B C. Vzdálenost mezi těmito geny je dána relativní četností příslušných kontransdukcí. Nespecifická transdukce může rezultovat v intragenovou rekombinaci, tj. rekombinaci, při které se crossing-over uskutečňuje nikoli mezi jednotlivými geny (lokusy), ale uvnitř jednoho a téhož genu (lokusu). Dvoubodové křížení je v tomto případě prostředkem ke zjištění, zda dva mutanti se stejným fenotypovým projevem vznikli mutací dvou různých genů, anebo dvěma mutacemi v různých částech téhož genu. Například, jestliže dva auxotrofní mutanti (např. pro histidin) produkují v určitém podílu prototrofní rekombinantní transdukanty, můžeme konstatovat, že mutace každého z obou mutantů je lokalizována na jiném místě téhož genu (lokusu); relativní četnost těchto transdukantů vyjadřuje vzdálenost mezi mutačními místy obou mutací. (2) tzv. tříbodové křížení, jehož princip je shodný s výše uvedeným tříbodovým testem. Uvažujme tři geny ( A, B, C ); jestliže donorová buňka má genotyp A + B + C + a recipientní buňka A B C, potom na základě četností jednotlivých kategorií rekombinantních transdukantů můžeme určit pořadí genů na chromozomu stejným způsobem, jak bylo uvedeno u tříbodového testu. Sílu vazby mezi geny A, B, C pak vyjadřuje relativní četnost kotransdukce jednotlivých dvojic alel (A + - B +, A + - C +, B + - C + ). Specifickou transdukci lze k mapování bakteriálního chromozomu rovněž použít, avšak vzhledem k přenosu pouze určitých genů, jen v omezeném rozsahu. Uplatňuje se zejména při intragenové analýze těchto genů. Transformace je přenos izolované (samotné) DNA z donorové buňky do buňky recipientní. Přenesená DNA může rekombinovat s chromozomem recipientní buňky za vzniku rekombinantního transformanta. Dva geny, které se přenesou jednou transformující molekulou DNA do recipientní buňky zároveň, se považují za geny ve vazbě. Četnost transformantů je lineární funkcí koncentrace DNA použité k transformaci. Z tohoto důvodu se při použití transformace genová vazba blíže charakterizuje na základě výsledků (relativních četností transformantů) zjištěných po inkubaci kompetentních recipientních bakteriálních buněk s transformující DNA aplikovanou v různých koncentracích tvořících koncentrační řadu. Geny (lokusy) rekombinantních transformantů, kteří se vyskytnou ve vyšších četnostech a i při použití transformující DNA v nižších koncentracích, jsou vzdálenější než geny transformantů, kteří se vyskytnou v nižších četnostech a při použití transformující DNA ve vyšších koncentracích. 148

150 Transdukci lze navodit v eukaryotických buňkách vhodným virem. Rovněž transformace eukaryotických buněk cizorodou DNA je možná. Pro studium vazby genů v těchto případech obecně platí totéž, co bylo uvedeno k problematice transdukce a transformace bakteriálních buněk. Rekombinace je možná i u bakteriofágů (virů). Dokazují to pokusy s mutantními fágy (viry). Například při směsné infekci bakteriální kultury dvěma typy mutantních fágů, z nichž genotyp jednoho typu je např. a + b a druhého a b +, se vyskytnou též fágové částice s nemutantním (standardním) fenotypem (genotyp a + b + ) a dvojnásobně mutantním fenotypem (genotyp a b ). Tuto skutečnost můžeme interpretovat jako důsledek rekombinace mezi oběma mutantními fágy (viry). Poznatky z oblasti studia vazby genů a rekombinace se uplatňují v poslední době při genových manipulacích, založených na technologiích využívajících rekombinantní DNA. Lze očekávat, že progresivní vývoj s tím souvisejících metod genového inženýrství (sekvenování genomů, klonování, transgenní organizmy) a jejich aplikace v praxi bude mít zásadní (revoluční) význam pro další rozvoj civilizace. 149

151 XII. DĚDIČNOST A POHLAVÍ V průběhu biologické evoluce se vyvinuly dva základní způsoby rozmnožování organizmů: nepohlavní a pohlavní. Asexuální organizmy, tj. nepohlavně se rozmnožující organizmy, netvoří gamety, jejich buňky neprocházejí meiotickým dělením, v jejich ontogenetickém vývoji nedochází ke střídání haploidní a diploidní fáze, v karyotypu nejsou obsaženy diferencované pohlavní chromozomy, potomci určitého nepohlavně se rozmnožujícího jedince jsou geneticky identičtí (tvoří klon). Za zdroj genetické variability můžeme u těchto organizmů považovat pouze mutace, protože segregace a kombinace vloh, ani rekombinace se v tomto smyslu nemohou uplatnit. Nepohlavní rozmnožování se majoritně vyskytuje u evolučně starších a ve fylogenetických systémech níže postavených taxonů. Sexuální organizmy, tj. pohlavně se rozmnožující organizmy, ve svém ontogenetickém vývoji procházejí střídáním haploidní a diploidní fáze. Tento znak je určující, ostatní lze považovat za doprovodné, protože ne všechny skupiny sexuálních organizmů produkují specializované pohlavní buňky (gamety), ne všechny vytvářejí morfologicky rozlišitelné gamety a pohlavní orgány, ne u všech se vyvinuly pohlavní chromozomy. Některé druhy sexuálních organizmů se mohou reprodukovat i některým ze způsobů nepohlavního rozmnožování. Genetická variabilita uvnitř pohlavně se rozmnožujících taxonů je obecně mnohem větší než uvnitř nepohlavně se rozmnožujících taxonů, protože jejím zdrojem nejsou pouze mutace, ale též produkty segregace, kombinace a rekombinace vloh. Pohlavní rozmnožování se majoritně vyskytuje u evolučně mladších a ve fylogenetických systémech výše postavených taxonů. XII.1 CHROMOZOMOVÉ A GENOTYPOVÉ URČENÍ POHLAVÍ V populacích dvoudomých rostlin a gonochoristických živočichů je za normálních podmínek vždy přibližně jedna polovina jedinců samičího pohlaví a jedna polovina jedinců samčího pohlaví. Tento stav primárně vyplývá z chromozomového určení pohlaví. Pohlaví, které je determinováno dvojicí homologických pohlavních chromozomů (= heterochromozomů = gonozomů = sex - chromozomů) v diploidních (somatických) buňkách, se označuje jako homogametické. Pohlaví, které je determinováno dvojicí heterochromozomů, mezi nimiž existuje homologie pouze v omezeném rozsahu, anebo pouze jedním heterochromozomem v diploidních (somatických) buňkách, se označuje jako heterogametické. V souladu s označením heterochromozomů symboly X a Y, zavedeným v r Wilsonem, se konstituce chromozomového určení homogametického pohlaví označuje XX, heterogametického pohlaví XY nebo X0 (jestliže je pohlaví určeno pouze jedním heterochromozomem). Kromě těchto symbolů se k označení chromozomového určení pohlaví používají ještě (zejména u ptáků) symboly Z a W ; zápisem ZZ se označuje homogametické pohlaví, zápisem ZW heterogametické pohlaví. V poslední době se však od tohoto značení upouští a jednotně se používá symbolů X a Y, neboť rozdílná symbolika neodráží rozdílné principy chromozomové determinace pohlaví. Chromozom Y, resp. W, jako částečně homologický ( či nepárový) chromozom s chromozomem X, resp. Z se u heterogametického pohlaví označuje jako alozom. Pokud se týká přítomnosti heterochromozomů v gametách, potom jedinci homogametického pohlaví produkují gamety pouze jednoho typu, kdežto jedinci heterogametického pohlaví produkují gamety dvou typů v poměru 1 : 1. Tím jsou vytvořeny základní předpoklady pro zastoupení jedinců obou pohlaví (samičího i samčího) v populaci 150

152 v poměru 1 : 1. Nicméně, od tohoto teoreticky očekávaného poměru jsou ve všech stadiích ontogenetického vývoje zjišťovány určité (i signifikantní) odchylky, na jejichž vzniku mohou participovat faktory jak vnitřní (včetně genetických), tak vnější. Kvantitativní změny v četnostech jedinců obou pohlaví můžeme posuzovat na základě stanovení primárního poměru pohlaví (= poměr pohlaví v okamžiku oplození), sekundárního poměru pohlaví (= poměr pohlaví při narození) a terciárního poměru pohlaví (= poměr pohlaví v různých obdobích postnatálního vývoje). Jsou známy dva základní typy chromozomového určení pohlaví: (1) typ Drosophila (též savčí), kde homogametické pohlaví představují samice (XX) a heterogametické pohlaví představují samci (XY). Označení pochází z vědeckého názvu octomilky Drosophila melanogaster. Samice tedy produkují pouze jeden typ gamet obsahujících chromozom X, kdežto samci produkují dva typy gamet v poměru 1 : 1: jeden s chromozomem X a druhý s chromozomem Y. Tento typ chromozomového určení pohlaví se vyskytuje u savců, většiny druhů dvoudomých rostlin a hmyzu, u některých druhů ryb a plazů. (2) typ Abraxas (též ptačí), kde homogametické pohlaví představují samci (XX, resp. ZZ) a heterogametické pohlaví představují samice (XY, resp. ZW). Označení pochází z vědeckého názvu píďalky angreštové (Abraxas grossulariata). Tento typ se vyskytuje u ptáků, motýlů, u některých druhů ryb, obojživelníků a plazů, výjimečně též u některých druhů rostlin (např. Fragaria orientalis). Obr.: Abraxas grossulariata Zdroj: Za odvozené od základního typu Drosophila lze považovat tyto typy chromozómového určení pohlaví: (1) typ Protenor, kde homogametické pohlaví představují samice (XX) a heterogametické pohlaví samci (X0), v jejichž diploidním karyotypu je obsažen pouze jeden heterochromozom X. Tito samci produkují dva typy gamet v poměru 1 : 1, přičemž jedna polovina obsahuje heterochromozom X a druhá neobsahuje žádný heterochromozom. Označení pochází z vědeckého názvu ploštice Protenor belfragii. Tento typ chromozomového určení pohlaví se vyskytuje u některých druhů hmyzu, zejm. z řádů Orthoptera a Hemiptera. 151

153 Obr.: Protenor belfragei. Zdroj: (2) typ Habrobracon (lumčík), je charakteristický pro diplo-haploidní organizmy, kde samice jsou diploidní a samci haploidní. Například u včel se samice vyvíjejí z oplozených vajíček a představují homogametické pohlaví, kdežto samci se vyvíjejí partenogeneticky a představují haploidní jedince, v jejichž karyotypu je obsažen jeden chromozom X. Obr.: Habrobracon hebetor. Zdroj: 152

154 Pojednáváme-li o chromozomovém určení pohlaví a v souvislosti s tím o heterochromozomech, je třeba ještě podotknout, že existují druhy pohlavně se rozmnožujících (tedy sexuálních) organizmů, u nichž morfologické rozlišení heterochromozomů není patrné. Pro genetickou determinaci pohlaví jsou pohlavní chromozomy podstatným, avšak nikoli jediným faktorem. Na vzniku určitého pohlaví se spolupodílejí též tzv. genové komplexy faktorů femininních (F) a maskulinních (M), které mohou být lokalizovány na autozomech i na heterochromozomech. V souvislosti s těmito komplexy faktorů hovoříme o genotypovém určení pohlaví, které u gonochoristů vytváří tři základní typy: (1) typ Drosophila - maskulinní komplexy (M) jsou umístěny na autozomech (A), femininní komplexy (F) na heterochromozomech (X). Dvojnásobná dávka femininních faktorů u samic převažuje nad dvojnásobnou dávkou maskulinních faktorů, kdežto u samců dvojnásobná dávka maskulinních faktorů převažuje nad jednoduchou dávkou femininních faktorů. Tento stav můžeme vyjádřit zápisem: - AA(MM)XX(FF), FF > MM, - AA(MM)XY(F), MM > F. (2) typ Lymantria (bekyně) femininní faktory (F) jsou lokalizovány na chromozomu Y, maskulinní faktory na chromozomu X. Jednoduchá dávka femininních faktorů u samic převládá nad jednoduchou dávkou maskulinních faktorů; u samců femininní faktory nejsou přítomny a proto se může uplatnit účinek dvojité dávky pouze maskulinních faktorů. Tento stav můžeme vyjádřit zápisem: - AAX(M)Y(F), F > M, - AAXX(MM). Obr.: Lymantria dispar. samice samec Zdroj: (3) typ Habrobracon maskulinní (M) i femininní (F) faktory jsou umístěny na chromozomu X. Dvojnásobná dávka femininních faktorů u samic převažuje nad dvojnásobnou dávkou maskulinních faktorů, kdežto u samců jednoduchá dávka maskulinních faktorů převažuje nad jednoduchou dávkou femininních faktorů. Tento stav můžeme vyjádřit zápisem: - AAXX(FFMM), FF > MM, - AX(FM), M > F. 153

155 Na mnoha příkladech lze dokumentovat vyváženost vztahu mezi autozomy a heterochromozomy pokud se jedná o genetické (tj. chromozomové a genotypové) určení normálního samičího nebo samčího pohlaví. Je-li tato rovnováho narušena, vznikají obvykle jedinci s patrnými morfologickými odchylkami od normy, se sníženou vitalitou a fertilitou. V experimentech s Drosophila melanogaster bylo prokázáno, že určujícím faktorem vývoje normálních samic a samců je poměr mezi počtem chromozomů X a počtem sad autozomů (A) v diploidní buňce, označovaný jako pohlavní index (PI): počet chromozómů X X PI = = počet sad autozómů A Pohlavní index samic jako homogametického pohlaví je roven 1,00 a samců jako heterogametického pohlaví 0,50. Jakékoli jiné hodnoty pohlavních indexů nejsou slučitelné s vývojem normálních samic a samců, ale určitých odchylek. Pro nadsamice nabývá pohlavní index hodnoty vyšší než 1,00 v důsledku nadbytečného jednoho nebo více chromozomů X (např. trizomie AAXXX). Pro nadsamce jsou hodnoty pohlavního indexu nižší než 0,5 (např. AAAX tři sady autozomů a jeden chromozom X). Hodnoty pohlavního indexu jedinců, označovaných jako intersex, jsou větší než 0,50 a menší než 1,00 (např. AAAXX tři sady autozomů a dva chromozomy X). Z definice pohlavního indexu lze vyvodit značný význam chromozomu X při determinaci pohlaví i pro životaschopnost jedince. Absence chromozomu Y v zásadě je slučitelná se životem (např. u člověka konstituce X0), avšak nikoli absence chromozomu X (konstituce 0Y, YY apod. jsou letální). Lze připustit (alespoň u savců), že chromozom X může zcela plnit své funkce, je-li v karyotypu diploidní buňky obsažen jedenkrát. Tento názor podporuje tzv. lyonizace; tím se rozumí skutečnost, že ve většině (ne-li ve všech) diploidních somatických buněk samic (XX) zůstává i v interfázi jeden chromozom X spiralizován a tím inaktivován, přičemž inaktivace jednoho nebo druhého chromozomu X je náhodná. Tato náhodná inaktivace chromozomu X se může u heterozygota projevit jako mozaika dědičného znaku, jehož gen je lokalizován na chromozomu X. Za příklad takového jevu lze uvést anhydrotickou ektodermální dysplazii, která se u heterozygotních žen projevuje v podobě střídajících se okrsků potící se (vylučující pot) a nepotící se (nevylučující pot) kůže. Inaktivovaný (tedy v průběhu buněčného cyklu trvale spiralizovaný) chromozom X je barvitelný v interfázním buněčném jádru a po obarvení se jeví jako tzv. Barrovo tělísko. Počet Barrových tělísek je obecně roven n 1, kde n = počet chromozomů X v buňce. V této souvislosti je třeba ještě zmínit, že existují též metody vizualizace (např. fluorescenční) chromozomu Y v interfázním buněčném jádru (tzv. F-tělísko). Protože inaktivace chromozomu X nastává v diploidních buňkách pouze u samic (nikoli u samců), lze kombinací cytogenetických metod detekce Barrova tělíska (tedy inaktivního chromozomu X) a F-tělíska (tedy chromozomu Y) spolehlivě určit pohlaví jedince, respektive různé numerické odchylky heterochromozomů v karyotypu vyšetřovaného biologického materiálu (monozomie X0, trizómie XXX, XXY, XYY apod.). Takové vyšetření se významně uplatňuje například v prenatální diagnostice. Lyonizace byla prokázána pouze v rámci chromozomálního určení pohlaví typu Drosophila, nikoli v rámci typu Abraxas. To podle některých autorů může souviset s předpokládaným navzájem nezávislým evolvováním každého z těchto typů chromozomálního určení pohlaví. 154

156 Od lyonizace je nutné odlišovat gynandromorfizmus. Tělo gynandromorfů je v důsledku vzniku chromozomální mozaiky postihující heterochromozomy (např. XX/X0) z části tvořeno tkáněmi samičího a z části samčího typu. Nejedná se tedy o inaktivaci jednoho z heterochromozomů, ale o jeho eliminaci v důsledku poruchy buněčného dělení po oplození. Například jestliže u Drosophila melanogater se při mitotickém dělení zygoty s konstitucí heterochromozomů odpovídající samičímu pohlaví (XX) neoddělí chromatidy jednoho chromozomu X, bude v karyotypu jedné z buněk, vzniklé tímto dělením, přítomen pouze jeden chromozom X. Genetická konstituce heterochromozomů X0 u octomilky však (v souladu s pohlavním indexem PI = 0,5) vede k vývoji samčího pohlaví. Proto mozaika XX/X0 podmiňuje vývoj gynandromorfního jedince, jehož část těla bude tvořena buňkami s normálním samičím karyotypem a část těla buňkami s aberantním karyotypem (monozomie X). Je zřejmé, že čím dříve v embryogenezi uvedená porucha mitózy nastane, tím rozsáhlejší a fenotypově (morfologicky i funkčně) patrnější budou oblasti tvořené normálními diploidními samičími (XX) a aberantními monozomickými samčími (X0) buňkami. Obr.: Příklady gynandromorfizmu. Zdroj: V některých případech mohou mít gynandromorfové vyvinuty samčí i samičí pohlavní orgány. Je nutné si uvědomit, jaké jsou příčiny tohoto jevu u gynandromorfů a odlišit gynandromorfizmus od hermafroditizmu. Hermafrodité nemají morfologicky diferencované heterochromozomy. Předpokládá se, že femininní a maskulinní komplexy jsou u nich v rovnováze. Z těchto důvodů je u hermafroditů vývoj pohlavních žláz produkujících samičí i samčí pohlavní buňky biologicky normálním jevem (na rozdíl od gynandromorfů, kteří se vyvíjejí na patogenetickém základu). Rovněž nelze zaměňovat gynandromorfizmus za intersex. 155

157 Mezi chromozomem X a Y existuje určitá homologie. Chromozom Y sestává z některých úseků homologických s chromozomem X a z některých úseků nehomologických s chromozomem X. Takovéto strukturní odlišení chromozomu X od chromozomu Y omezuje možnosti vzniku crossing-overu a rekombinace pouze na homologické úseky obou heterochromozomů. Rekombinace mezi nehomologickými úseky X a Y chromozomu není možná. V souvislosti s tím se rozlišuje tzv. úplná a neúplná vazba na pohlaví. Termín úplná vazba na pohlaví se vztahuje k těm genům (resp. jimi determinovaným znakům), které jsou lokalizovány v nehomologických úsecích heterochromozomů, tedy v úsecích, které nemohou rekombinovat. Naopak termín neúplná vazba na pohlaví se vztahuje k těm genům (resp. jimi determinovaným znakům), které jsou lokalizovány v homologických úsecích heterochromozomů a mezi nimiž rekombinace v zásadě je možná (nebrání-li tomu jiné skutečnosti, např. k rekombinaci vůbec nedochází u samců D. melanogaster). Obecně je přijímána hypotéza, že heterochromozomy u gonochoristů vznikly pravděpodobně z určitého páru autozomů, přičemž chromozom Y se považuje za odvozenější. V souladu s touto hypotézou je již uvedená nepostradatelnost chromozomu X z hlediska životaschopnosti jedince a různý význam chromozomu Y při determinaci pohlaví u jednotlivých taxonů. Například konstituce heterochromozomů X0 v karyotypu člověka vede k celkově ženskému fenotypu (Turnerův syndrom), kdežto u řady bezobratlých k samčímu fenotypu; z toho lze usuzovat na významnější roli chromozomu Y u člověka než třeba u ploštice. Komplexnost spolupůsobení vnitřních faktorů (heterochromozomy, genové komplexy femininních a maskulinních faktorů) při determinaci pohlaví dokládá výskyt intersexů. Za intersexy jsou označováni ti jedinci, jejichž konstituce heterochromozomů sice odpovídá konstituci charakteristické pro určité pohlaví v rámci příslušného typu chromozomální determinace pohlaví, ale u nichž se v průběhu ontogenetického vývoje mohou objevovat znaky opačného pohlaví, případně může dojít až k pohlavnímu zvratu (pohlavní reverzi). Tyto jevy nepřímo podporují hypotézu o potenciálně bisexuálním založení všech pohlavně se reprodukujících organizmů; podle této hypotézy je výsledný fenotypový projev určitého pohlaví výsledkem nejen přítomnosti jemu odpovídajících heterochromozomů, ale též převládajícím vztahem mezi femininními a maskulinními faktory. Za intersex můžeme označit tzv. freemartinizmus. Jedná se o jev známý u skotu, kdy se v případě různopohlavných dvojčat vyvíjí tzv. býčice. Býčice představuje jedince s chromozomovým určením pohlaví samičího typu (XX), avšak celkově spíše samčího exteriéru, zpravidla sterilního a s narušeným (patologickým) vývojem reprodukčních orgánů v důsledku intrauterinního ovlivnění plodu androgenními hormony dvojčete samčího pohlaví, cirkulujícími ve společném placentárním krevním oběhu. 156

158 Obr.: Freemartinizmus dizygotická dvojčata. Zdroj: Ve vztahu k pohlaví rozlišujeme tři typy dědičnosti znaků: znaky pohlavně vázané, znaky pohlavně ovládané a znaky pohlavně ovlivněné. XII.2 ZNAKY POHLAVNĚ VÁZANÉ Geny znaků pohlavně vázaných jsou lokalizovány na pohlavních chromozomech. Dědičnost těchto znaků se vyznačuje některými odlišnostmi od dědičnosti znaků, jejichž geny jsou lokalizovány na autozomech: a) výsledky reciprokých křížení v případě genů lokalizovaných na chromozómu X (resp. Z) nejsou identické b) recesivní alela, jejíž lokus se nachází na chromozomu X (resp. Z), se v hemizygotním stavu fenotypově projeví u jedince heterogametického pohlaví c) pro znak, jehož gen je umístěn v nehomologické části chromozomu X (resp. Z), je charakteristická tzv. dědičnost křížem. Při tomto způsobu dědičnosti gen (znak) přechází z homogametického rodiče na heterogametického potomka a z heterogametického rodiče na homogametického potomka; jedinci generace F1 tedy nejsou uniformní. Jedinci, u nichž se zděděná vloha fenotypově neprojeví, ale mohou ji přenést do další generace, se označují jako přenašeči. d) pro znak, jehož gen je lokalizován na nehomologickém úseku chromozomu Y (resp. W), je charakteristická dědičnost přímá. Při tomto způsobu dědičnosti gen (znak) přechází z heterogametického rodiče pouze na heterogametického potomka a e) vždy se fenotypově manifestuje. Je-li heterogametickým pohlavím pohlaví samčí, jsou takto děděné geny nazývány geny holandrické. f) dědičnost znaků, jejichž geny leží v homologických oblastech heterochromozomů se řídí stejnými pravidly jako dědičnost znaků, jejichž geny jsou umístěny na autozomech. 157

159 Uvedené zvláštnosti dědičnosti znaků pohlavně vázaných jsou zřejmé z níže uvedených schémat dědičnosti hypertrichosis auriculae (znak vázaný na pohlavní chromozom Y holandrický gen) a hemofilie (znak vázaný na pohlavní chromozom X). Schéma přímé dědičnosti (tučně chromozom Y s genem pro hypertrichosis auriculae). Hypertrichosis auriculae se fenotypově manifestuje jako nadměrné ochlupení horní a zadní části ušního boltce u mužů. rodiče: XX x XY potomci v 1. generaci: X X x XY potomci ve 2. generaci: XX XY Schéma dědičnosti hemofilie (tučně chromozom s alelou pro hemofilii). Hemofilie je dědičná choroba, která se projevuje u recesivních homozygotů. Gen pro hemofilii leží v nehomologickém úseku chromozomu X. rodiče: X a X a x X A Y X A X A x X a Y nemocná zdravý zdravá nemocný potomci v 1. generaci: X A X a : X a Y X A X a : X A Y zdravé nemocní zdravé zdraví přenašečky přenašečky 1 : 1 1 : 1 potomci ve 2. eneraci: X A X a X A Y X A X A X A Y zdravé zdraví zdravé zdraví přenašečky X a X a X a Y X A X a X a Y nemocné nemocní zdravé nemocní přenašečky 1 : 1 : 1 : 1 1 : 1 : 1 : 1 158

160 XII.3 ZNAKY POHLAVNĚ OVLÁDANÉ Geny pro znaky pohlavně ovládané jsou lokalizovány na autozomech, avšak jejich fenotypový projev je v závislosti na pohlaví rozdílný. Typickými představiteli znaků pohlavně ovládaných jsou sekundární pohlavní znaky; geneticky jsou založeny u obou pohlaví shodně, avšak účinkem pohlavních hormonů se manifestují specificky pouze u jednoho pohlaví. Expresivita znaku je závislá na funkčním stavu příslušných endokrinních žláz a proto vývoj sekundárních pohlavních znaků vykazuje v populaci zpravidla poměrně širokou variabilitu. Znaky pohlavně ovládané tedy souvisejí s projevy pohlavního dimorfizmu. Znaky pohlavně ovládané se mohou projevovat též v rámci jednoho pohlaví rozdílně v závislosti na genotypu. Příkladem může být velikost ploutví u bojovnice pestré (Betta splendens). Dlouhé ploutve se vyvinou pouze u dominantně homozygotních (PP) a heterozygotních (Pp) samců v přítomnosti samčích pohlavních hormonů, kdežto u recesivně homozygotních samců (pp) a u samic všech genotypů (PP, Pp, pp) se vyvinou pouze krátké ploutve. Dominantní alela P se tedy může projevit pouze v přítomnosti samčích pohlavních hormonů. Obr.: Znak pohlavně ovládaný pohlavní dimorfismus: slepice vs kohout. Zdroj: Obr.: Znak pohlavně ovládaný pohlavní dimorfismus: Betta splendens. 159

161 Legenda: vlevo samec, vpravo samice. Zdroj: XII.4 ZNAKY POHLAVNĚ OVLIVNĚNÉ Geny pro znaky pohlavně ovlivněné (sex-influenced) jsou lokalizovány rovněž na autozomech a jejich fenotypový projev u heterozygotů je závislý na přítomnosti pohlavních hormonů jednoho pohlaví. S ohledem na to se určitý pohlavně ovlivněný znak jeví jako dominantní u jednoho pohlaví a naopak jako recesivní u druhého pohlaví. Například rohatost je geneticky založena alelovým párem H, h. Dominantně homozygotní samice (HH) jsou rohaté, heterozygotní (Hh) a recesivně homozygotní (hh) jsou bezrohé; rohatost se tedy u samic jeví jako znak recesivní. Pokud jde o samce, dominantní homozygoti (HH) a heterozygoti (Hh) jsou rohatí, recesivní homozygoti (hh) jsou bezrozí; rohatost se u samců jeví jako znak dominantní. Alternativnost projevu znaku u heterozygotů (Hh) závisí na přítomnosti hormonů samčích (rohatost) nebo samičích (bezrohost). Podobně vliv testosteronu u heterozygotů (Aa) genu pro předčasnou plešatost je příčinou častějšího výskytu tohoto znaku u mužů než u žen. 160

162 Obr.: Schéma křížení v případě znaku pohlavně ovlivněného. Zdroj: 20Limited%20inheritance.htm 161

163 XIII. MUTAČNÍ GENETIKA Dosud jsme se zabývali dědičnou rozmanitostí vznikající na podkladě segregace, kombinace a rekombinace genů, při níž se samy geny nemění. Vedle ní existuje rovněž dědičná proměnlivost, při které se geny kvalitativně (strukturně) mění, označovaná jako mutační proměnlivost. Mutabilita jako schopnost genetické informace podléhat relativně trvalým dědičným změnám, je jedním ze základních atributů genetické informace a podmiňuje samu existenci alternativních forem (alel) jednotlivých genů. Základním prvkem mutačního procesu je mutace. Tento termín byl poprvé navržen Hugo de Vriesem v jeho práci Mutační teorie ( ) pro změny dědičnosti skokem. Hlavní teze de Vriesovy mutační teorie, které dosud neztratily na významu, lze shrnout do následujících bodů: (1) mutace vzniká náhle bez jakýchkoli přechodů (2) nové (mutantní) formy jsou konstantní (stabilní) (3) mutace netvoří nepřetržité řady (na rozdíl od nedědičných změn) a neseskupují se kolem středního (modálního) typu (4) mutace jsou kvalitativní změny (5) mutace se realizují v různých směrech (6) mutace mohou být ve svých důsledcích prospěšné i škodlivé (7) tytéž mutace mohou vznikat opakovaně (rekurentní mutace) (8) detekce mutací je závislá na velikosti analyzovaného souboru. Bohužel, de Vries svou teorii chápal jako protikladnou teorii přírodního výběru. Domníval se, že mutace jsou bezprostřední příčinou vzniku nových druhů již přizpůsobených zevnímu prostředí a tím vyloučil přírodní výběr jako jeden z podstatných faktorů speciace. Dnes můžeme termínem mutace definovat relativně stálé změny genotypu nebo karyotypu, které nejsou podmíněny segregací nebo rekombinací. Mutace představují mechanizmus rozrůznění jednoho genotypu ve dva nebo více genotypů a poskytují primární hmotný substrát pro biologickou evoluci. Řada mutací vede ke vzniku nových znaků, které jsou žádoucí z hlediska šlechtitelských cílů nebo z hlediska některých průmyslových odvětví (potravinářský a farmaceutický průmysl); proto se výsledky výzkumu mutageneze významně uplatňují například v mutačním šlechtění a v mnoha biotechnologiích (včetně genového inženýrství). Naproti tomu velký počet mutací vykazuje negativní (škodlivý) účinek například v podobě dědičných chorob a proto co nejhlubší poznání zákonitostí mutačního procesu je v této souvislosti předpokladem nejen k objasnění příčin těchto chorob, jejich diagnostiky, prevence a případně léčby (i když dosud téměř výhradně symptomatické, nikoli kauzální), ale též k posouzení mutagenity jednotlivých faktorů zevního prostředí (resp. zevního prostředí pracovního, životního - jako celku) a odhadu jejich rizika pro tzv. genetické zdraví. Mutační genetika zásadně přispívá ke studiu stavu a vývojových tendencí ekosystémů, zejména pokud se jedná o vlivy genotoxické a zaujímá nezastupitelné místo při výzkumu biosféry, v ochraně přírody, tvorbě životního prostředí či environmentalistice. V této souvislosti je na místě připomenout si slova z citované práce de Vriese z r. 1901: Mutace, sama mutabilita, se musí stát objektem bádání. A podaří-li se nám... vyjasnit zákony mutability, nejen se stane značně hlubší náš názor na vzájemnou příbuznost...organizmů, nýbrž můžeme mít naději, že se musí objevit možnost ovládnout mutabilitu... Mnohé, co se nyní zdá nedostižné, bude v naší moci, podaří-li se nám poznat zákony, na nichž je založena mutabilita druhů. Pochopitelně, že k tomu dojdeme postupně, zvládající jednotlivé mutace, a to také přinese mnoho prospěšného zemědělské a sadařské praxi. Zřejmě nás zde čeká... pole tvrdé, vysoce významné práce jak pro vědu, tak pro praxi. Je to mnohoslibná oblast vlády nad mutacemi. 162

164 XIII.1 KLASIFIKACE MUTACÍ Mutace můžeme klasifikovat podle různých hledisek: (1) podle způsobu vzniku: a) spontánní: vznikají působením nekontrolovatelných faktorů b) indukované: vznikají záměrným (kontrolovaným) působením mutagenů. Mechanizmus vzniku spontánních a indukovaných mutací je stejný. Rozdíl spočívá pouze v tom, že v případě spontánních mutací není znám faktor (mutagen), který mutaci vyvolal, kdežto v případě indukovaných mutací je znám, protože se záměrně k indukci mutace použije určitý mutagen, nebo se ověřuje, zda určitý faktor či látka vykazuje mutagenní aktivitu. (2) podle změny smyslu: a) beze změny smyslu: nevede k záměně aminokyselin nebo jiné změně genového produktu (např. zkrácení nebo prodloužení polypeptidového řetězce), ani ke změně funkce určité regulační oblasti genomu. Př. DNA:...ACC AAT ACA... >...ACC AAC ACA... mrna:...ugg UUA UGU......UGG UUG UGU... peptid - Trp - Leu- Cys - - Trp - Leu- Cys - b) se změněným smyslem (missense): vede ke změně primární struktury genového produktu nebo ke změně funkce určité regulační oblasti genomu Př.: DNA:...ACC AAT ACA... >...ACC AAG ACA... mrna:...ugg UUA UGU......UGG UUC UGU... peptid: - Trp - Leu - Cys - - Trp - Phe - Cys... c) beze smyslu (nonsens): vede ke vzniku terminačního kodonu a tím ke zkrácení příslušného polypeptidového řetězce. Př.: DNA:...ACC AAT ACA... >...ACC ATT ACA... mrna:...ugg UUA UGU......UGG UAA UGU... peptid: - Trp - Leu Cys - - Trp. (Cys-) (3) podle posunu čtení genetického kódu: a) posunové (s posunem čtecího rámce, frameshift): od místa adice nebo delece baze dochází k posunu čtení genetického kódu. Jestliže v určitém místě polynukleotidového řetězce došlo k adici (deleci) jedné báze, může se správné čtení genetického kódu obnovit od místa, ve kterém dojde k deleci (adici) jedné báze. Správné čtení genetického kódu se může rovněž obnovit od tripletu následujícího za třetí adicí nebo třetí delecí, resp. od tripletu následujícího za poslední adicí nebo delecí, která je násobkem tří (tj. za šestou, devátou atd.). Zároveň každá adice (resp. delece), pokud postihuje molekulu DNA v místě, které se stane v mrna součástí exonu, rezultuje v prodloužení (resp. zkrácení) polypeptidového řetězce; délka polypeptidového řetězce se nezmění pouze tehdy, jestliže počet adicí je roven počtu delecí. 163

165 -T Př: DNA:..ACC AAT ACA CGC.. >..ACC AAA CA C GC.. mrna:..ugg UUAUGU GCG....UGGUUUGUG CG.. peptid: - Trp Leu Cys Ala- - Trp - Phe- Val +G >..ACC AAT AGC ACG C....UGG UUA UCG UGC G.. - Trp - Leu Ser Cys - -T >..ACC AAA GCA CGC.. +G..UGG UUUCGU GCG - Trp Phe Arg - Ala -C, -T, -A >..ACA AAC CGC....UGU UUG GCG.. - Arg Leu Ala - +C, +T, +A >..ACC CAA TTA CAA CGC....UGG GUU AAU GUU GCG.. -Trp Val - Asn - Val - Ala - b) bez posunu čtecího rámce: jedná se o mutace typu substitucí, tj. mutací, při kterých je zaměněna jedna báze DNA (resp. RNA) jinou bází. V případě substituce pyrimidinové báze pyrimidinovou bází nebo purinové báze purinovou bází hovoříme o mutaci (substituci) typu tranzice, v případě substituce pyrimidinové báze purinovou nebo purinové báze pyrimidinovou hovoříme o mutaci (substituci) typu transverze. 164

166 Obr.: Schéma vzniku některých typů genových mutací. Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm (4) podle vzniku v ontogenezi: a) gametické: vznikají při gametogenezi a pokud nejsou letální, mohou být při pohlavním rozmnožování přeneseny z generace na generaci (vertikální přenos). b) somatické: vznikají v somatických buňkách a při pohlavním rozmnožování nejsou přenášeny z generace na generaci, pokud nejsou lokalizovány ve tkáni, která produkuje gamety. K somatickým mutacím můžeme přiřadit mutace zygotické a postzygotické. Somatická mutace má v mnohobuněčném organizmu vesměs charakter mozaiky, to znamená, že tělo jejího nositele ve vztahu k dané somatické mutaci sestává z mutantních a nemutantních buněk. Přitom platí, že čím dříve somatická mutace v ontogenezi vznikne, tím větší bude podíl mutantních buněk v organizmu zastoupen (za předpokladu, že mutace není letální); vznikne-li mutace při prvním dělení zygoty, bude mozaika 50% (tzn. že polovina buněk bude normálních a polovina buněk bude mutantních), vznikne-li mutace při druhém dělení zygoty, bude mozaika 25% (tzn. že budou tři čtvrtiny buněk normálních a jedna čtvrtina buněk mutantních) a tak dále se bude podíl mutantních buněk teoreticky snižovat geometrickou řadou. Při vegetativním (nepohlavním) rozmnožování lze z klonu mutantních somatických buněk získat kompletně mutantního jedince, který v důsledku vlastního asexuálního rozmnožování dá vzniknout klonu identických mutantních jedinců. (5) podle projevu: a) makromutace: fenotypově se projevují na makroskopické úrovni b) mikromutace: fenotypově nejsou makroskopicky patrné (6) podle směru vzniku vůči standardu: a) přímé: vedou k přeměně standardní alely (obvykle dominantní) na mutantní alelu (obvykle recesivní), jinými slovy od standardního (dříve divokého) genotypu (resp. fenotypu) k mutantnímu genotypu (resp. fenotypu). V některých případech může vzniknout ze standardní alely nikoli jedna, ale více forem mutantních alel. Řada mutací jednoho a téhož genu může vést ke vzniku alelové série; takový jev se označuje jako mnohotný alelizmus. Nová mutantní alela v dané alelové sérii může 165

167 vzniknout též mutací některé z již existujících mutantních alel dané alelové série. Mezi jednotlivými alelami alelové série existují různé stupně dominance a recesivity. b) zpětné: vedou k přeměně mutantní alely na standardní alelu, jinými slovy od mutantního genotypu (resp. fenotypu) k standardnímu genotypu (resp. fenotypu). Totéž obdobně platí pro jednotlivé alely alelové série: každá z nich může zpětně mutovat za vzniku standardní alely, anebo té mutantní alely, z níž vznikla. Mutační rychlost zpětných mutací je výrazně nižší (obvykle o více řádů) než mutační rychlost přímých mutací. Je to pochopitelné, neboť pravděpodobnost vzniku pravé reverze, tj. zpětné mutace ve stejném místě téhož genu a přesně opačně (oproti přímé mutaci), je menší než pravděpodobnost vzniku jakékoli mutace v kterémkoli místě uvažovaného genu. Z hlediska molekulárně genetického však nemusí zpětná mutace zasahovat přesně totéž místo daného genu v přesně opačném smyslu jako mutace přímá, ale může postihnout jiné místo téhož genu a i jinak než mutace přímá, avšak musí vést ke standardnímu fenotypovému projevu; v tomto případě se jedná o operační reverzi, tj. o zpětnou mutaci vedoucí k synonymnímu kodonu s původním kodonem pro danou aminokyselinu před vznikem přímé mutace. Možnost vzniku takové zpětné mutace vyplývá z degenerace genetického kódu a je jí v zásadě limitována. Jinou možnost představuje pseudoreverze, tj. taková zpětná mutace, která nevede ani k původnímu, ani synonymnímu kodonu, ale ke kodonu pro aminokyselinu, jejíž zařazení do primární struktury příslušného genového produktu nenarušuje, nýbrž zachovává jeho původní biologickou funkci. Genotyp (resp. fenotyp), který je produktem operační reverze nebo pseudoreverze, bývá označován jako pseudostandardní (dříve též pseudodivoký). -G Př.: DNA:..AAA GCT CTA TAA....AAA CTC TAT AA.. +G mrna:..uuu CGA GAU AUU....UUU GAG AUA UU.. peptid: - Phe Arg Asp Ile - - Phe Glu Ile (standardní fenotyp) (mutantní fenotyp) +T ٧..AAA TCT CTA TAA....UUUAGA GAU AUU.. - Phe Arg Asp Ile - (pseudostandardní fenotyp) G C Př.: DNA:..TTT AGA CCC....TTT ACA CCC.. A G mrna:..aaa UCU GGG....AAA UGU GGG.. peptid: - Lys Ser Gly - - Lys - Cys Gly (standardní fenotyp) (mutantní fenotyp) A T ٧..TTT TCA CCC....AAA AGU AAG.. - Lys Ser Gly - (pseudostandardní fenotyp) 166

168 V řadě případů není po původní přímé mutaci v určitém genu navozen standardní (resp. pseudostandardní) stav zpětnou mutací v tomtéž genu, ale jinou přímou mutací, kterou je suprimován projev první přímé mutace. Mutace, která potlačuje účinek jiné mutace, se označuje jako supresorová, mutace, jejíž účinek je potlačován, se označuje jako mutace supresorsenzitivní. Supresorová mutace může vzniknout ve stejném alelovém páru jako mutace přímá, anebo v jiném alelovém páru než mutace přímá; v prvním případě hovoříme o supresorové mutaci intragenové, ve druhém případě o supresorové mutaci intergenové. Mutantní alela genu, která suprimuje účinek supresorsenzitivní mutace při intergenové supresi, se označuje jako supresor. Supresorové mutace lze klasifikovat do dvou základních typů: (a) typ supresorových mutací, který vede ke vzniku supresoru suprimujícího projev nesmyslného kodonu, vzniklého supresorsenzitivní mutací, (b) typ supresorových mutací, který vede ke vzniku supresoru suprimujícího projev kodonu se změněným smyslem, vzniklého supresorsenzitivní mutací. (7) podle fenotypového projevu: a) dominantní: fenotypově se projevují u dominantních homozygotů a heterozygotů b) recesivní: fenotypově se projevují u recesivních homozygotů (8) podle účinku na vitalitu: a) letální: neslučitelné se životem, relativní vitalita je rovna nule b) subletální: relativní vitalita je menší než 50% a vyšší než nula c) semiletální: relativní vitalita se pohybuje kolem 50% d) subvitální: relativní vitalita je vyšší než 50% a menší než 100% e) neutrální: relativní vitalita se významně neliší od standardu, tzn. že se pohybuje kolem 100% f) supravitální: relativní vitalita je vyšší než u standardu, tzn. že je vyšší než 100% (9) podle doby od vzniku do projevu mutace: a) bez zpoždění: mutace se projeví bezprostředně po jejím vzniku b) se zpožděním: mutace se neprojeví bezprostředně po jejím vzniku, ale se zpožděním (delayed effect, storage effect) (10) podle lokalizace v genomu: a) jaderné: mutace postihují eukaryotickou DNA (chromozomy) v buněčném jádru, resp. prokaryotický chromozom (nukleoid) b) mimojaderné (cytoplazmatické): mutace postihují DNA lokalizovánou mimo buněčné jádro, tj. v cytoplazmatických organelách eukaryot s vlastní DNA (mitochondrie, chloroplasty), resp. v plazmidech prokaryot. Mezi mimojaderné mutace tedy náleží mutace mitochondriální, chloroplastové a plasmidové DNA. Obecně jsou důsledky jaderné mutace pro mnohobuněčný organizmus výraznější (dalekosáhlejší) než důsledky mutací cytoplazmatických. Vyplývá to zejména z relativní autonomie mitochondrií a chloroplastů, jejich většího počtu v buňce a malého obsahu genetické informace, omezeného na několik genů. Případné negativní účinky mutace, vzniklé např. v jedné mitochondrii, mohou být překryty mnohonásobně větším počtem ostatních mitochondrií, které nejsou nositeli dané mutace. 167

169 (12) podle typu nukleové kyseliny: a) mutace DNA: vznikají v molekule DNA zpravidla v interfázi buněčného cyklu, některé z nich jako neopravené chyby při replikaci DNA. Tyto mutace, pokud nejsou pro buňku letální, mohou být přenášeny horizontálně i vertikálně a tak perzistovat nebo se rozšiřovat v populaci. Představují též základní zdroj genetické variability. b) mutace RNA: zásadní význam mají pro RNA-organizmy, kde jsou zdrojem jejich genetické variability. U ostatních organizmů mají omezený až zanedbatelný význam pro jejich omezený účinek. Mutace v primární struktuře rrna, způsobená mutací genu pro rrna, může vést k anomální stavbě ribozomů a tím k narušení případně až selhání proteosyntézy. Podobně mutace v primární struktuře trna, způsobená mutací genu pro trna, může vést k anomální funkci či ztrátě funkce příslušné trna a tím k narušení translace. Mutace mrna (resp. hnrna) vznikají na úrovni transkripce a proto je jejich účinek v buňce velmi omezený, vázaný pouze na jednu molekulu mrna (resp. hnrna). Podobně mutace vznikající na úrovni translace jsou teoreticky omezeny pouze na jednu molekulu syntetizovaného polypeptidového řetězce. (13) podle úrovně organizace genomu, na které vznikají: a) genové (bodové): základní jednotkou pro posuzování těchto mutací je gen chromozomální (chromozomální aberace): základní jednotkou pro posuzování těchto mutací je chromozom b) genomové (polyploidie, aneuploidie): základní jednotkou pro posuzování těchto mutací je genom. XIII.1.1 GENOVÉ MUTACE Základní tři mechanizmy vzniku genových mutací představují adice, delece a substituce nukleotidů nukleových kyselin. Adicí se rozumí včlenění další (nové) báze do polynukleotidového řetězce a delecí naopak eliminace (uvolnění) báze z polunukleotidového řetězce. Oba tyto mechanizmy vedou ke změně původního počtu nukleotidů v polynukleotidovém řetězci a tedy k posunovým (frameshift) mutacím; od místa adice nebo delece báze dochází k posunu čtení genetického kódu. Substitucí se rozumí záměna určité báze v polynukleotidovém řetězci jinou bází. Mutace, která vznikne mechanizmem substituce, je omezena pouze na jeden triplet a může být typu mutace se změněným smyslem (missens), mutace beze smyslu (nonsens) nebo mutace beze změny smyslu. Z uvedeného je zřejmé, že mutace vzniklé mechanizmem adice nebo delece nukleotidu obecně postihují rozsáhlejší oblast genového produktu než mutace vzniklé mechanizmem substituce nukleotidů. Dřívější označení genových mutací jako mutace bodové (point mutations) odráželo skutečnost, že jednotkou, ve které se mutace uskutečňuje, je jedna báze (resp. nukleotid). Toto bodové vymezení místa lokalizace genové mutace je dobře využitelné např. při studiu vnitřní struktury genů, konstrukci komplementačních map či molekulárně genetické diagnostice. Místo výskytu genové mutace je přesně detegovatelné molekulárně genetickými metodami (sekvenování, hybridizace vyšetřované nukleové kyseliny se sondou, analýza aminokyselinového složení vyšetřovaného genového produktu apod.). Na doplnění: - animace genových mutací - animace genových mutací 168

170 XIII.1.2 CHROMOZOMÁLNÍ ABERACE Jako chromozomální aberace se označují strukturní změny jednotlivých chromozomů, které jsou detegovatelné cytologickými a cytogenetickými metodami. Chromozomální aberace vznikají zpravidla v interfázi buněčného cyklu: ty, které vznikají v presyntetické fázi interfáze, tj. v G1-fázi, se označují jako aberace chromozomové, ty, které vznikají v syntetické a postsyntetické fázi interfáze, tj. v S- a G2- fázi, se označují jako aberace chromatidové. Základní událostí při vzniku každé chromozomální aberace je přerušení (zlom) chromozomu. Místa přerušení (zlomů) se mohou opět spojit do původního stavu a v takovém případě hovoříme o restituci, anebo do jiného než původního stavu a pak hovoříme o reparaci zlomů. Jestliže se zlomy nerestituují, konstituují se chromozomální aberace, které lze cytogenetickými metodami detegovat v metafázi nebo anafázi. Zlomem chromozomu ve fázi G1 vznikne zkrácený (deletovaný) chromozom a acentrický fragment (o který je deletovaný chromozom kratší). V S-fázi oba vzniklé útvary (tj. deletovaný chromozom i acentrický fragment) mohou být replikovány, takže v metafázi můžeme zjistit chromozom s deletovanými oběma chromatidami a párovým acentrickým fragmentem. Obě po cytokinezi vzniklé buňky budou ve svém karyotypu obsahovat deletovaný chromozom a jejich genom bude zmenšen o deletovanou část příslušného chromozomu. Fragmenty chromozomů, které neobsahují centromeru, jsou v průběhu buněčného cyklu eliminovány, protože se při jaderném dělení nemohou v ekvatoriální rovině orientovat, a proto se zpravidla již v další buněčné generaci (v dalším buněčném cyklu) neobjevují. Popsaná chromozomální aberace se označuje jako párová acentrická terminální deficience (syn. izochromatidový zlom). Jestliže zlom chromozomu nastane v S- nebo G2-fázi interfáze, potom v metafázi můžeme detegovat chromozom s jednou zkácenou (deletovanou) chromatidou a jedním acentrickým fragmentem. Proto po cytokinezi této buňky bude aberantní (deletovaný) chromozom obsažen v karyotypu pouze jedné buňky, kdežto karyotyp druhé buňky bude normální. Ztráta genetického materiálu tedy postihne pouze jednu z obou buněk. Acentrický fragment se již v dalším buněčném cyklu (zřejmě) neobjeví v důsledku jeho degradace. Popsaná chromozomální aberace se označuje jako nepárová acentrická terminální deficience (syn. chromatidový zlom). Uvažujme chromozom s pořadím genů A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K a centromerou mezi geny C-D. Předpokládejme, že na tomto chromozomu vzniknou dva zlomy: jeden mezi geny E-F, druhý mezi geny H-I. V důsledku těchto zlomů se původní chromozom rozdělí na tři části: centromerickou s geny A až E, acentrickou s geny F až H a acentrickou s geny I až K. Pokud zlomy nebudou restituovány, může následně nastat některý z těchto případů: (1) oba acentrické fragmenty jsou degradovány, zůstane deletovaný chromozom s pořadím genů A-B-C - centromera D-E, který přejde mitoticky do další buněčné generace (a jak je zřejmé z výše uvedeného příkladu odlišné geneze chromozomálních aberací indukovaných v různých fázích interfáze buď do obou buněk nebo pouze do jedné). V metafázi zjistíme deletovaný chromozóm a příslušené acentrické fragmenty. (2) acentrický fragment s geny I K se připojí k místu zlomu za genem E za vzniku deletovaného chromozomu s pořadím genů A-B-C centromera D-E-I-J-K, acentrický fragment s geny F-G-H se nereparuje. V metafázi zjistíme deletovaný chromozom a příslušný acentrický fragment. Do další buněčné generace přejde deletovaný chromozom, acentrický fragment bude degradován. Tento deletovaný chromozom je zkrácen o určitou vnitřní část (F-G-H) původního nepoškozeného chromozomu. Chromozomální aberace, představující popsanou ztrátu vnitřního úseku chromozomu, se označuje jako intersticiální delece. 169

171 Obr.: Schéma vzniku terminální (vlevo) a intersticiální delece (vpravo). Zdroj: (vlevo); (vpravo) Obdobná situace by nastala v případě, že by se restituoval acentrický fragment s geny F-G-H (tzn. že by došlo ke znovuspojení chromozomu v místě zlomu mezi genem E a F do původního stavu) a acentrický fragment s geny I-J-K by se nereparoval, ani nerestituoval. (3) acentrický fragment s geny F-G-H se otočí o 180 (invertuje) a všechny části se v místech zlomů znovu spojí. Vznikne tak chromozom bez ztráty jakéhokoli genetického materiálu, avšak se změněným pořadím genů: A-B-C centromera D-E-H-G-F-I-J-K. Chromozomální aberace tohoto typu se označuje jako paracentrická inverze. Za předpokladu, že by chromozomální zlomy nastaly na obou stranách centromery, např. mezi geny A-B a E-F, a invertovala by část chromozomu obsahující centromeru, pak by vznikl aberantní chromozom s uspořádáním genů A-E-D centromera C-B-F-G-H-I-J-K. Chromozomální aberace typu inverze zahrnující centromerickou oblast, se označuje jako pericentrická inverze. Oba typy inverze je možné detegovat v metafázi cytogenetickými metodami. Inverze, i když není spojena s žádnou ztrátou genetického materiálu, může vést k určitým změnám fenotypového projevu aberantního genomu vzhledem ke změněnému pořadí genů na chromozomu. Je známo mnoho případů tzv. polohového efektu (position effect), kdy se gen přenesený do jiné oblasti chromozomu, než ve které se původně nacházel, fenotypově odlišně manifestuje (např. u Drosophila melanogaster mutantní alela white lokalizovaná na chromozomu X vede v homozygotně recesivním, resp. hemizygotním stavu k bíle zbarveným očím, avšak přenesená do určité jiné genové oblasti na chromozomu X se projeví vznikem oranžově zbarvených očí). Polohovým efektem objasnil A. H. Sturtevant v r jím objevenou mutaci Bar (redukovaný počet očních facet) u Drosophila melanogaster a on také navrhl termín polohový efekt, jímž se označuje skutečnost, že gen mění své působení v závislosti na jeho postavení v systému celého chromozomu. V některých případech inverze vedou k vážným poruchám, případně mají letální účinek (zpravidla v homozygotním stavu). 170

172 Obr.: Schéma vzniku inverze. Zdroj: (4) acentrický fragment s geny F-G-H se spojí zlomenými konci za vytvoření kružnicové struktury, která se označuje jako acentrický prstencový chromozom (syn. acentrický ring chromozom), acentrický fragment s geny I-J-K zůstane nezreparován. V metafázi můžeme detegovat deletovaný chromozom, acentrický prstencový chromozom a příslušný acentrický fragment (acentrickou terminální deficienci). Do další buněčné generace přejde obvykle pouze deletovaný chromozom, acentrický prstencový chromozom i acentrická terminální deficience jsou degradovány. Je též možné připustit variantu, při které se terminální acentrický fragment s geny I-J- K připojí ke genu E deletovaného chromozomu. V tom případě bude v metafázi detegován pouze deletovaný chromozom a prstencový chromozom, který bude posléze degradován. Uvažujme nyní, že zlomy vzniknou mezi geny A-B a E-F (jako v příkladu s pericentrickou inverzí); jestliže dojde k znovuspojení mezi geny A-E, vytvoří se kružnicová struktura označovaná jako centrický prstencový chromozom (syn. centrický ringchromozom) a dva acentrické fragmenty (jeden s genem A, druhý s geny F-G-H-I-J-K), které se případně mohou znovu spojit za vytvoření acentrického fragmentu s geny A-F-G-H-I- J-K. V metafázi můžeme detegovat centrický prstencový chromozom a příslušné acentrické fragmenty (resp. acentrický fragment). Prstencový chromozom (zejména větších rozměrů) z mechanických důvodů (podobně jako multicentrický chromozom) zpravidla nepřechází do dalších buněčných generací, acentrické fragmenty jsou degradovány a proto tento typ chromozomální aberace je často spojen s úplnou ztrátou aberantního chromozomu. 171

173 Obr.: Schéma vzniku inverze, delece a prstencového chromozomu. Zdroj: Vzniknou-li zlomy na obou chromatidách dvou chromozomů, mohou se oba deletované chromozomy v místech zlomů znovu spojit za vzniku jednoho aberantního dicentrického chromozomu a acentrických fragmentů. Obdobně za účasti tří chromozomů se zlomy na obou chromatidách může vzniknout tricentrický chromozom (přičemž na prostředním chromozomu musí vzniknout celkem čtyři zlomy na každé chromatidě dva, po jednom na každém raménku); obecně za účasti více chromozomů mohou vzniknout multicentrické chromozomy. Schéma vzniku džentrického chromozomu. Zdroj: 172

174 Dicentrické (multicentrické) chromozomy zpravidla nepřecházejí do dalších buněčných generací, resp. přenášejí se pouze do jedné z obou buněk vznikajících při mitóze. Důvody jsou především mechanické. Dicentrický (tím spíše multicentrický) chromozom představuje v mitóze (zejména na přechodu metafáze - anafáze) abnormálně velký útvar pro normální pohyb zabezpečovaný příslušným mitotickým aparátem, navíc znesnadněný opačně (různosměrně) orientovanými tahy vláken dělicího vřeténka, napojených na jednotlivé centromery, při přesunu chromozomů z ekvatoriální roviny k pólům dělícího vřeténka. V některých případech proto může dojít k roztržení chromozomů a jejich nerovnoměrnému přechodu do jednotlivých produktů mitotického dělení. Je patrné, že dicentrické (multicentrické) chromozomy jsou obvykle spojeny s výraznými ztrátami genetického materiálu v buňce a proto mívají často letální efekt. Uvažujme nyní dva různé nehomologní chromozomy: jeden s geny A-B-C-D-E-F-G- H a druhý s geny M-N-O-P-Q-R-S-T. Na obou vzniknou dva zlomy: na prvním mezi geny B- C a F-G, na druhém mezi geny N-O a R-S. Následně se úseky s geny C-D-E-F a O-P-Q-R navzájem vymění za vzniku chromozomů se změněným uspořádáním genů: A-B-O-P-Q-R-G- H a M-N-C-D-E-F-S-T. Takovéto přemístění genů mezi chromozomy se označuje jako reciproká translokace. Translokace vedou k přestavbám chromozomů různého rozsahu, které většinou bývají slučitelné se životem buňky, resp. organizmu, který je jejich nositelem, i když v některých případech mohou vést k závažnému genetickému postižení. Vzhledem k tomu, že při reciproké translokaci tohoto typu nedochází k žádným ztrátám genetického materiálu, mohou být tyto chromozomální aberace přenášeny do dalších buněčných generací. Jestliže by v námi uvažovaném příkladu došlo k jinému typu výměny úseků chromozomů mezi oběma chromozomy, např. za vzniku aberantních chromozomů s pořadím genů A-B-O-P-Q-R a M-N-G-H, jednalo by se o nereciprokou translokaci. Nevyváženost genomů produktů mitotického dělení v případě nereciproké translokace může mít závažné důsledky. Přenos chromozomálních aberací typu nereciprokých translokací do dalších buněčných generací je obvykle možný. Obr.: Schéma vzniku reciproké a nereciproké translokace. Zdroj: 173

175 Při vzniku více zlomů na více chromozomech může docházet k vzájemnému pospojování chromozomů v místech zlomů za vytvoření trojúhelníkovitých, křížových a jiných (někdy i dosti bizarních) tvarů. Takové chromozomální aberace se označují jako multiradiály (syn. chromatidové translokace) a zpravidla nepřecházejí do další buněčné generace. Významným typem translokací je tzv. Robertsonova (či robertsonovská) translokace. Uskutečňuje se fúzí dvou chromozomů v místech příčně rozštěpených centromer. Je jedním z mechanizmů evolvování metacentrických a submetacentrických chromozomů z původních telocentrických chromozomů. Obr.: Schéma vzniku Robertsonovy translokace. Zdroj: Obr.: Schéma vzniku izochromozomu. Zdroj: 174

176 Výměnou úseků chromatid (translokace) v rámci páru homologických chromozomů může vzniknout duplikace (obecně multiplikace) genu. Předpokládejme jeden pár homologických chromozomů s genovou sestavou A-B-c-D-E-f-g-H na jednom a A-b-C-D-E- F-g-H na druhém členu tohoto páru. Na prvním vzniknou zlomy mezi geny c-d a f-g, na druhém mezi geny D-E a g-h. Po translokaci ponese jeden chromozom geny A-B-c-E-F-g-g- H, druhý chromozom ponese geny A-b-C-D-D-E-f-H, přičemž na každém z nich je jeden gen duplikován a jeden deletován. Duplikované úseky mohou být uspořádány jednak tandemově bezprostředně za sebou (jako v uvedeném příkladu), anebo mohou být rozloženy v různých částech chromozomu, pokud se uplatní tzv. přemístěná duplikace. Obr.: Schéma vzniku duplikace. Zdroj: Někdy bývají mezi chromozomální aberace zařazovány tzv. gapy. Jsou to nebarvitelné úseky chromozomů. Nejedná se o chromozomální aberace v pravém slova smyslu, protože se při jejich vzniku neuplatňuje zlom chromozomu (chromatidy), avšak k určitým změnám vnitrochromozomové struktury dochází. Četnost gapů se zvyšuje v přítomnosti řady mutagenů. Obr.: Schéma vzniku gapu. Zdroj: 175

177 V souvislosti s chromozomálními aberacemi je třeba zmínit sesterské chromatidové výměny (SCE, sister chromatid exchange), které vznikají v důsledku somatického crossingoveru mezi chromatidami téhož chromozomu. Po aplikaci některých mutagenů jsou zjišťovány ve zvýšené četnosti ve srovnání s kontrolou a proto mohou být považovány za jedno z kritérií při hodnocení mutagenity. Uvedený výčet chromozomálních abrací není vyčerpávající, pouze zahrnuje jejich základní typy a nastiňuje mechanizmus jejich vzniku. Různé typy chromozomálních aberací vedou k různým důsledkům. U diploidních organizmů se rozsahem malé deficience a delece v homozygotním stavu většinou uchovávají a mohou vést ke změně fenotypového projevu. Tím imitují genové mutace, avšak na rozdíl od nich nejsou schopny zpětné mutace (reverze). Změna fenotypu v důsledku delece nebo deficience spočívá v poruše posloupnosti rozložení genů na aberovaném chromozomu a s ní související změně jejich vzájemného vztahu. Pokud chromozomy s malou delecí nebo deficiencí mají centromeru, mohou se reprodukovat a při buněčném dělení rovnoměrně distribuovat do vznikajících buněk. V takovém případě je genetická změna, způsobená těmito aberacemi, dědičná. Jestliže u heterozygota postihuje delece nebo deficience pouze lokus s dominantní alelou na jednom chromozomu příslušného páru homologických chromozomů, pak se při úplné dominanci fenotypově projeví alela recesivní; takovýto jev se označuje jako pseudodominance (syn. nepravá dominance). Rozsáhlejší delece a deficience vedou k rozsáhlejším ztrátám genetického materiálu a proto jsou zpravidla letální; u heterozygotů pro kompenzatorní efekt takových ztrát druhým (neaberantním) chromozomem daného páru homologických chromozomů nemusí být spojeny se ztrátou životaschopnosti. Duplikace úseků chromozomů jsou významným faktorem a často se vyskytujícím jevem v evoluci chromozomů. Rozšířením (amplifikací) obsahu genetické informace se uplatňují jako zdroj genetické variability a mohou tak přispívat k rozrůznění (divergenci) genomů jednotlivých taxonomických skupin organizmů. Inverze v heterozygotním stavu, pokud nejsou pro své nositele letální, mají za následek potlačení crossing-overu, neboť je jimi narušena homologie mezi oběma chromozomy příslušného páru. V případech homozygotních inverzích není homologie chromozomů narušena, protože oba chromozomy nesou identicky invertované úseky; proto mohou v meiotické profázi konjugovat a rekombinovat. Inverze mohou též fenotypově napodobovat genové mutace, především v důsledku polohového efektu. Inverze mají značný význam v evoluci, zejména jako jeden ze zdrojů divergence druhů. Charakteristickým rysem translokací je změna vazbových skupin genů lokalizovaných v úsecích chromozomů dotčených konkrétními translokacemi. Translokované geny jsou vřazeny do jiných vazbových skupin, čímž dochází k vytvoření nové, translokací pozměněné sekvence genů v genomu. Toho lze využít při detekci translokací genetickými metodami, založenými na průkazu změn vazbových skupin a narušení genové rovnováhy v zygotě. Reciproké translokace se obvykle konstituují v heterozygotním stavu, kdežto homozygoti bývají zjišťováni až mezi potomky těchto heterozygotů. Reciproká translokace v heterozygotním stavu, pokud není letální, se specificky projevuje v meióze vznikem křížové figury mezi nehomologickými translokovanými chromozomy, která při terminalizaci v diakinezi přechází v útvary kružnicovité, vedoucí k produkci nesbalancovaných gamet, nebo v útvary podoby čísla osm, vedoucí k produkci sbalancovaných gamet. Nesbalancované gamety v důsledku nevyrovnanosti jejich genomů jsou obvykle spojeny s letalitou nebo poruchami fertility. Z evolučního hlediska se translokace uplatňují především jako významný mechanizmus uskutečňování změn vazbových skupin. 176

178 Závěrem můžeme konstatovat, že: (1) chromozomální aberace lze využít při genetickém mapování, při studiu působení genů v souvislosti se změnami jejich lokalizace na chromozomu, při objasňování intrachromozomálních genových interakcí či interchromozomálních vztahů v rámci genotypu jedince a též ve šlechtitelském procesu (2) chromozomální aberace mohou vést ke vzniku nových vazbových skupin, jsou mechanizmem přestaveb genotypu a karyotypu (3) chromozomální aberace se uplatňují při intraspecifické i interspecifické diferenciaci (např. jako forma genetické izolace při vzniku nekřižitelnosti nebo snížené reprodukční zdatnosti v populaci, anebo naopak u životaschopných homozygotů v příslušné chromozomální aberaci jako základ pro jejich adaptaci k odlišnému či změněnému životnímu prostředí) (4) studium chromozomálních aberací potvrzuje lineární diskrétnost chromozomů a vede k nutnosti systémového pojetí genomu. Na doplnění: - animace chromozomálních aberací - animace translokace u Downova sy. - animace abnormalit na bázi inverze - animace abnormalit na bázi translok. 177

179 Obr.: Příklad uplatnění chromozomálních aberací v evoluci chromozomů šelem. Zdroj: 178

180 Obr.: Chromozomální aberace v lymfocytu z periferním krve člověka.. Zdroj: Obr.: Aberantní karyotyp člověka (fluorescenční barvení). Zdroj: 179

181 Obr.: Chromozomální aberace v dělících se buňkách endospermu pšenice. Zdroj: XIII.1.3 GENOMOVÉ MUTACE Mezi genomové mutace se řadí polyploidie a aneuploidie. Polyploidie (sy. euploidie, pravá polyploidie) je změna počtu celých haploidních (základních) sad chromozomů. Jeli polyploidní počet chromozomů lichým násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů (3n, 5n,...), hovoříme o anortoploidii, je-li sudým násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů (4n, 6n, 8n...), hovoříme o ortoploidii. Polyploid s trojnásobným haploidním počtem chromozomů (3n) se nazývá triploid, se čtyřnásobným haploidním počtem (4n) chromozomů se nazývá tetraploid atd. Anortoploidie vede k tvorbě nesbalancovaných gamet (protože lichý počet chromozomů nelze rozdělit na dvě poloviny beze zbytku), a proto bývá většinou příčinou sterility nebo snížené fertility anortoploidů, případně jejich potomků. Naproti tomu ortoploidie skýtá možnost tvorby sbalancovaných gamet a proto ortoploidi bývají fertilní, resp. míra sterility nebo snížené fertility ortoploiddů je menší než u anortoploidů, případně je důsledkem jiných příčin, než tvorby nesbalancovaných gamet. Aneuploidie (syn. heteroploidie, nepravá polyploidie) je změna počtu chromozomů, která není násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů. Obsahuje-li karyotyp určitého jedince jeden chromozom navíc (2n + 1), nazývá se trizomik, obsahuje-li dva chromozomy navíc (2n + 2), nazývá se tetrazomik atd. Obsahuje-li naopak o jeden chromozom méně (2n 1), nazývá se monozomik, obsahuje-li o dva méně (2n - 2), nazývá se nulizomik. Genomové mutace vznikají jako následek poruch karyokineze při meiotickém nebo mitotickém dělení. Z tohoto hlediska lze potom hovořit o genomových mutacích meiotických a mitotických, respektive gametických, zygotických či postzygotických (somatických). Obecným mechanizmem jejich vzniku je nepravidelné rozestoupení chromozomů k pólům dělicího vřeténka v anafázi, karyokineze nenásledovaná cytokinezí, endomitóza a fúze jader (např. při somatické hybridizaci). S tím souvisí skutečnost, že i když se meiotická a mitotická polyploidie liší místem a mechanizmem vzniku, jejich genetické následky mohou být shodné. Důsledky polyploidie však jsou u různých taxonomických skupin organizmů rozdílné. Obecně lze konstatovat, že ortoploidie je vcelku běžným jevem u rostlin a hub a obvykle negativně neovlivňuje reprodukční zdatnost polyploidů; leckdy lze jejím prostřednictvím dosáhnout lepších užitkových vlastností a proto bývá polyploidie často využívána ve šlechtitelských 180

182 programech. U prvoků zřejmě sehrála důležitou roli při evoluci makronukleu a mikronukleu; např. makronukleus nálevníků je vysoce autopolyploidní, což bývá dáváno do souvislosti s možností amitotického dělení tohoto jádra (při velkém počtu kopií sad chromozomů je vysoká pravděpodobnost, že amitoticky vzniklá buňka bude obsahovat alepoň jeden kompletní genom). U živočichů však polyploidie obvykle nebývá tolerována a vede většinou k letálnímu efektu, nebo k vážným genetickým poškozením, spojeným se sníženou životaschopností. Relativně často se objevuje ve formě autopolyploidie u bezobratlých živočichů (u hermafroditů, v případech partenogeneze), výjimečně u obratlovců (např. axolotl, bourec morušový), avšak existence polyploidních jedinců ze třídy savci není známa. U člověka (a dalších druhů savců) dochází v raných stadiích prenatálního vývoje ke spontánním potratům polyploidních zárodků; polyploidii u těchto organizmů lze označit za neslučitelnou se životem, aneuploidii buď za neslučitelnou se životem, anebo vedoucí k vážnému postižení jejího nositele (např. Downův syndrom jako trizomie chromozomu č. 21). Nerozestoupení všech chromozomů v meióze vede ke vzniku gamet s neredukovaným počtem chromozomů (meiotická polyploidie). Dojde-li při oplození ke splynutí takové gamety (2n) s normální haploidní gametou (1n), vznikne triploidní zygota. Obdobně splynutím dvou gamet s neredukovaným počtem chromozomů (2n) vznikne tetraploidní zygota. V některých případech je přítomnost polyploidních buněk v diploidním organizmu normálním jevem (např. buňky endospermu semen rostlin jsou triploidní). Dojde-li k polyploidizaci při prvním dělení zygoty, budou všechny další produkované buňky polyploidní (zygotická polyploidie). Dojde-li k polyploidizaci až v některém z dalších dělení zygoty (postzygotická polyploidie), vznikne buněčná mozaika, v níž část buněk bude diploidních a část polyploidních. U mnoha druhů roslin se vyskytují polyploidní řady, v nichž se jednotlivé druhy (případně nižší taxonomické jednotky) liší počtem chromozomů, který je násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů. Například rod Triticum obsahuje několik druhů, které se dělí do tří skupin: jednozrnné pšenice (T. monococcum, 2n = 14), tvrdé pšenice (T. durum, T. turgidum, T. polonicum, 2n = 28) a měkké pšenice (T. aestivum, T. compactum, T. spelta, 2n = 42). Je-li základní počet chromozomů x = 7, potom jednozrnné pšenice jsou diploidní, tvrdé pšenice tetraploidní a měkké pšenice hexaploidní. Existují též rody rostlin, jejichž druhy tvoří dvě polyploidní řady, případně více polyploidních řad (např. Vicia, x = 6 a x = 7). Tyto příklady ilustrují význam polyploidie jako důležitého zdroje genetické variability využitelné nejen v praxi, ale uplatňující se též v evoluci. Polyploidi, vznikající zmnožením chromozomálních sad téhož druhu, se označují jako autopolyploidi. Autopolyploidie se u rostlin vyskytuje nezávisle na způsobu jejich rozmnožování, avšak autopolyploidi se snáze udržují v populaci rostlin s nepohlavním (vegetativním) rozmnožováním a u druhů autogamních než u druhů alogamních. Autopolyploidie se obvykle manifestuje změnou habitu rostliny (zvětšení celé rostliny nebo jejích jednotlivých orgánů). Fertilita polyploidů výrazně kolísá. Příčinu tohoto jevu lze spatřovat ve zvláštnostech meiózy u polyploidů. V profázi meiózy se za normálních podmínek u diploida vytvářejí pouze bivalenty, jejichž rovnoměrným rozdělením je v konečném výsledku zajištěn vznik sbalancovaných gamet; heterozygot v určitém genu (Aa) bude tedy tvořit dva druhy gamet v poměru 1A : 1a. U polyploida se v profázi meiózy vytvářejí nejen bivalenty, ale i univalenty, trivalenty, tetravalenty, obecně polyvalenty, protože mohou náhodně mezi sebou konjugovat všechny homologické chromozomy. Jestliže budeme uvažovat tetraploida heterozygotního v určitém genu (AAaa), vzniklého polyploidizací heterozygotního diploida (Aa), je možná realizace některé z těchto variant rozestoupení homologických chromozomů k pólům dělicího vřeténka: Aa : Aa (bivalenty), AA : aa (bivalenty), AAa : a (trivalent + univalent), Aaa : A (trivalent + univalent), AAaa : 0 181

183 (tetravalent). Je zřejmé, že kromě tvorby bivalentů a rovnoměrného rozestupování chromozomů v meiózi tetraploida a následně vzniku sbalancovaných gamet, objevují se též gamety nesbalancované (AAa, a, Aaa, A, AAaa, 0), které jsou příčinou snížené fertility autopolyploidů. Avšak je třeba si uvědomit, že i v případě tvorby bivalentů a sbalancovaných gamet nastane u tetraploida změna štěpných poměrů: gamety budou produkovány v poměru 1AA : 4Aa : 1aa, fenotypový štěpný poměr při úplné dominanci bude v generaci F2 35 : 1, neboť při volné kombinovatelnosti platí (AA : 4Aa : aa) 2 = 1AAAA : 8AAAa : 18AAaa : 8Aaaa : 1aaaa. Na základě uvedených zvláštností je možné ozřejmit značný rozsah fenotypové proměnlivosti autopolyploidů a zdůvodnit jejich využití při šlechtění rostlin. Z evolučního hlediska popsané zvláštnosti meiózy autopolyploidů společně s tvorbou anortoploidů při spojení diploidní gamety s gametou ortoploida naznačují úlohu polyploidie jako jednoho z faktorů genetické izolace. Autopolyploidie se významně uplatňovala hlavně v evoluci autogamních rostlin a nepohlavně se rozmnožujících rostlin i živočichů. Na autopolyploidii u autogamních rostlin a nepohlavně se rozmnožujících organizmů lze nahlížet jako na specifický mechanizmus, který působí na jedné straně jako protektor před konstituováním homozygotního stavu nepříznivých recesivních mutací tím, že v důsledku zmnožení chromozomových sad snižuje pravděpodobnost jejich vzniku, na straně druhé jako zdroj genetické variability tím, že v důsledku zmnožení chromozomových sad se zvyšuje mutační potenciál polyploidů (pravděpodobnost vzniku mutace na buňku). Polyploidi, vznikající zmnožením chromozomových sad pocházejících od jedinců různých druhů, se označují jako alopolyploidi; lze je považovat za výsledný produkt polyploidizace interspecifických hybridů. Je známo, že mezidruhoví (vzdálení) hybridi jsou vesměs sterilní. Cytologická příčina této sterility spočívá v nemožnosti vytvářet bivalenty v meiotické profázi. Jedním z mechanizmů, kterým lze tuto sterilitu překonat, je polyploidizace mezidruhových hybridů za vzniku amfidiploidů. Příkladem takto produkovaných aloploidů je Raphanobrassica (amfidiploid mezidruhového hybrida Raphanus sativus a Brassica oleracea) nebo Triticosecale (polyploid mezidruhového hybrida pšenice a žita - tritikále). Aloploidy je možné získat též křížením více než dvou druhů a následnou diploidizací (polyploidizací) hybridů. Křížením dvou druhů (A, B) vznikne sterilní mezidruhový hybrid, který se polyploidizuje za vzniku fertilního amfidiploida; tento amfidiploid křížením s druhem C poskytne sterilního trojitého hybrida, jehož diploidizací vznikne fertilní alopolyploid. Lze připustit, že se alopolyploidie významně uplatnila především v evoluci alogamních druhů rostlin. Na základě alopolyploidie se podařilo resyntetizovat některé druhy. Například polyploidizací hybridů, vzniklých křížením Prunus spinosa (2n = 32) x Prunus divaricata (2n = 16) byl resyntetizován druh Prunus domestica (2n = 48). Podobně polyploidizací hybridů, vznikých křížením Triticum dicoccoides (2n = 28) x Aegilops speltoides (2n = 14), se podařilo resyntetizovat Triticum spelta (2n = 42). Druh konopice Galeopsis tetrahit (2n = 32) byl resyntetizován křížením alotriploida (2n = 24), nalezeného v generaci F2 mezidruhového hybrida, vzniklého křížením G. speciosa x G. pubescens, zpětně s G. pubescens). Přestože se resyntetizovaní alopolyploidi křížili s příslušnými druhy vyskytujícími se v přírodě (tj. Prunus domestica, Triticum spelta, Galeopsis tetrahit) a poskytovali fertilní potomstvo, sensu stricto je nelze považovat za totožné, neboť neodrážejí komplexní proces evolučního vývoje těchto druhů. Nicméně úspěšná resyntéza druhů na základě využití polyploidie může nalézt uplatnění při záchraně některých kriticky ohrožených druhů rostlin nebo dokonce při obnově (rekonstrukci) druhů již vyhynulých. Vznik aneuploidie je podmíněn poruchou distribuce jednotlivých párů homologických chromozomů při meióze nebo mitóze; rozeznáváme tedy aneuploidii meiotickou a mitotickou. Nejčastěji vzniká tzv. nondisjunkcí, tj. nerozestoupením určitého páru chromozomů (v důsledku neuskutečněného podélného rozdělení centromery) a jejich nerovnoměrnou 182

184 distribucí do buněk, produkovaných buněčným dělením. Dojde-li k nondisjunkci při meióze, přesouvá se celý bivalent pouze do jedné buňky a tudíž ve druhé buňce příslušný chromozom chybí; v důsledku toho při oplození vznikne buď trizomická zygota (2n + 1), jestliže se spojí gameta nesoucí nadbytečný chromozom s haploidní gametou, anebo monozomická zygota (2n 1), jestliže se spojí gameta postrádající příslušný chromozom s gametou haploidní. Analogicky můžeme odvodit vznik nulizomických, tetrazomických, pentazomických, obecně polyzomických zygot. Dojde-li k nondisjunkci postihující jeden chromozomový pár při mitóze, bude jedna nově vzniklá buňka obsahovat tři chromozomy od daného chromozomového páru (bude trizomická, 2n + 1) a druhá pouze jeden (bude monozomická, 2n 1). Jestliže nadbytečné chromozomy v buňce pocházejí ze dvou či více párů chromozomů, zapisuje se takový stav ve formě 2n , 2n atd. Pokud ztráta či nadbytek jednoho chromozomu (nebo více chromozomů) nemá letální efekt, může vést (a zpravidla vede) ke změně fenotypu (např. u heterozygotů se v důsledku monozomie taková změna může projevit jako pseudodominance). Aneuploidie lze výhodně použít k lokalizaci genů do jednotlivých vazbových skupin a ke genetickému mapování. Životaschopnost aneuploidů je zpravidla silně redukována z důvodu dysbalance genomu (porušení genové rovnováhy). Aneuploidie, realizovaná naznačeným způsobem, rezultuje ve změnu počtu jednotlivých homologických chromozomů, nikoli ve změnu počtu (nebo vnitřní struktury) vazbových skupin. Z evolučního hlediska se mohou uplatnit významně ty případy aneuploidie, které jsou podmíněny příčným rozdělením centromery a které ve spojení s dalšími přestavbami karyotypu vedou ke změně počtu a struktury vazbových skupin. Obr.: Schéma nondisjunkce a jejích důsledků. Zdroj: 183

185 Obr.: Polyploidie na příkladu pšenice. Zdroj: 184

186 Obr.: Využití sterilních triploidů ve šlechtění užitkových rostlin. Musa acuminata (vlevo) a Musa balbisiana (vpravo) plody diploidních rostlin se semeny. Zdroj: (vlevo); (vpravo) Musa x paradisiaca plod triploidní rostliny Zdroj: Schéma původu kulturního banánovníku (Musa X paradisiaca). Musa acuminata x Musa balbisiana Musa X paradisiaca Genom: AA BB AAB nebo ABB Ploidie: 2n 2n 3n Fertilita: fertilní fertilní sterilní hybrid 185

187 Schéma vzniku mezidruhového hybrida Triticale (Triticosecale). Triticum aktivum x Secale cereale Triticale 6n = 42 (AABBCC) 2n = 14 (DD) sterilní hybrid (ABCD) Triticum aestivum (A), Secale cereale (B), Triticosecale (C). Zdroj: Obr.: Příklady polyploidie u živočichů. Xenopus laevis (allotetraploid) Salmo trutta 4n a 3n se přirozeně vyskytují Zdroj: Na doplnění:

188 XIII.2 KLASIFIKACE MUTAGENŮ Látky, které indukují mutace, se označují jako mutageny. Obvykle jsou klasifikovány do tří skupin: na mutageny fyzikální, chemické a biologické. Vznik mutace je výsledkem řady procesů, zahrnutých pod název mutageneze. Účinek mutagenu na exponovaný organizmus může být buď přímý nebo nepřímý. Pod označením přímý účinek mutagenu se rozumí bezprostřední vznik mutace v průběhu buněčného cyklu, ve kterém byl zasažen genetický materiál příslušné buňky (DNA, RNA) mutagenem; mutace tedy vznikne bez zpoždění. Při nepřímém účinku mutagenu dochází nejdříve ke vzniku premutačních změn, které mohou být dále restituovány, reparovány (jak již bylo uvedeno), nebo přejít v mutaci; mutace vznikne se zpožděním (tzv. delayed effect, storage effect). Premutační změny představují kratší či delší dobu perzistující potenciální stavy, které mohou přejít v mutaci až po jednom či více buněčných cyklech. Premutační změny jsou následkem primární interakce mezi mutagenem a nukleovou kyselinou, resp. chromozomem (např. excitace atomů a molekul, ionizace, uvolnění radikálů, přesuny atomů) a na ni navazujících sekundárních reakcí (např. dimerizace nukleotidů, alkylace, defosforylace), které mohou vést (nejsou-li reparovány) k fixaci nastalých změn a vzniku mutace. Některé látky (tzv. premutageny) samy o sobě jako chemická individua v organizmu (buňce) nevykazují mutagenní aktivitu, avšak při jejich metabolizování mohou být přeměněny na mutageny (metabolická konverze). V takových případech rovněž dochází ke vzniku a projevu mutací se zpožděním. Při studiu mutageneze je nutno zohlednit úlohu různých buněčných reparačních mechanizmů, které mohou mutagenitu určité látky nebo faktoru významně modifikovat. Kromě toho mutagenní účinky určitého mutagenu závisejí rovněž na přítomnosti či nepřítomnosti látek (faktorů), které je mohou snižovat (tzv. antimutageny), nebo jinak ovlivňovat (synergidní či amplifikační efekt). Je patrné, že mutační proces ovlivňuje kromě mutagenu a nukleových kyselin řada vnitřních a vnějších faktorů (typ tkáně, stupeň diferenciace, stadium ontogenetického vývoje, životní podmínky, aktuální fyziologický stav, složky environmentu, genetické pozadí apod.). XIII.2.1 FYZIKÁLNÍ MUTAGENY Mezi nejvýznamnější fyzikální mutageny patří ionizující a ultrafialové záření. Ultrafialové záření v rozsahu vlnových délek = nm účinně reaguje s nukleovými kyselinami (zejména při vlnových délkách v blízkosti jejich absorpčního maxima) za vzniku dimerů tyminu nebo cytosinu jako produktů příslušných fotochemických reakcí. V místech výskytu diméru v nukleové kyselině polymeráza nemůže katalyzovat polymerační reakci; polymerace se zastaví před dimerem a pokračovat případně může až za dimerem. V důsledku tohoto zastavení nebo přerušení polymerace při transkripci může vzniknout změněný genový produkt (mutace na úrovni replikace). Při obdobném mechanizmu poruchy replikace DNA v místě diméru může dojít ke vzniku mutace typu delece nebo substituce (při chybné opravě poškozeného místa). Odstraňování pyrimidinových dimerů cyklobutanového typu, indukovaných UV-zářením, zajišťuje v buňkách tzv. fotoreaktivační reparační systém. Fotoreaktivační enzymy tohoto systému se napojují na dimery, po osvitu fotoreaktivačním světlem vhodné vlnové délky jsou aktivovány a konvertují dimery v monomery. Fotoreaktivace byla zjištěna za podmínek in vivo i in vitro. Hladina fotoreaktivačních enzymů kolísá mezi tkáněmi jedince a je též funkcí věku (ve stáří se snižuje). Existuje rovněž značná interindividuální variabilita v aktivitě fotoreaktivačních enzymů; je významně snížena u některých chorob (např. xeroderma pigmentosum) a u jedinců jimi postižených pozitivně koreluje s častějším výskytem maligních projevů (rakovina kůže). 187

189 Vzhledem ke skutečnosti, že UV-záření nevede k ionizaci molekul, je možnost jeho mutagenního účinku v důsledku následných sekundárních a terciárních reakcí znemožněna, resp. silně redukována. V tom spočívá jedna z hlavních příčin poměrně nízké mutagenity UV-záření ve srovnání s ionizujícím zářením nebo některými chemomutageny. Nicméně riziko negativního vlivu (včetně mutagenního) UV-záření na lidské zdraví nelze podceňovat, protože jsme mu pravidelně a dlouhodobě (někdy záměrně) exponováni v podobě slunečního světla. Obr.: Pyrimidinové dimery. Zdroj: Obr.: Schéma vzniku a reparace tyminových dimerů. Zdroj: Ober.: Schéma úseku DNA s pyrimidinovým dimerem. Zdroj: 188

190 Obr.: Schéma reparace pyrimidinových dimerů. Zdroj: Obr.: Schéma fotoreaktivace. Zdroj: Ionizující záření indukuje především chromozomální zlomy (jednořetězové i dvouřetězcové) a různé další typy strukturních a numerických změn chromozomů, ale též genové mutace. Radiosenzitivita se zvyšuje v pořadí: nukleová kyselina nukleotid 189

191 nukleozid dusíkatá báze. Biologické účinky ionizujícího záření na živou hmotu jsou výsledkem celého řetězce procesů, které lze shrnout do následujících skupin reakcí: (1) reakce radiofyzikální jsou provázeny přenosem energie do reakčního prostředí. Tyto reakce samy i jejich výsledek závisejí na konkrétní interakci záření s hmotou a na množství předané energie. V mechanizmu radiofyzikálních reakcí se uplatňuje rozptyl (pružný, při kterém částice při interakci s hmotným prostředím pouze mění směr dráhy, nikoli energii, nebo nepružný, při kterém částice nejen mění směr své dráhy, ale též předá část své kinetické energie absorpčnímu prostředí), absorpce (částice je pohlcena prostředím a předá mu všechnu svou energii) a výměnné reakce (částice je pohlcena absorpčním prostředím, přičemž část své energie předá tomuto prostředí a část předá jiné částici, jejíž uvolnění a emisi z prostředí vyvolala). Radiofyzikální reakce, vedoucí ke vzniku ionizovaných a excitovaných atomů a molekul, jsou též (z biologického hlediska) označovány jako primární reakce; jejich produkty se stávají substráty pro reakce následující. (2) reakce radiochemické představují z biologického hlediska reakce sekundární a terciární. Mezi sekundární se řadí reakce excitovaných molekul, při kterých ve větších molekulách (makromolekulách) může docházet k delokalizaci excitační energie bez rozštěpení molekuly (což souvisí se zvýšením vibrační, rotační a kinetické energie a tím tepelného obsahu soustavy). Excitovaná molekula může též část energie vyzářit v podobě fotonu a přejít do základního stavu, nebo tuto část energie předat při srážce jiné molekule, kterou excituje a sama přechází do základního stavu, anebo konečně excitovaná molekula se může štěpit za vzniku iontů či radikálů. Obsahuje-li excitovaná molekula systém konjugovaných vazeb, může se energie přenášet v průběhu celého řetězce těchto vazeb a rezultovat ve zvýšení celkového energetického obsahu molekuly, resp. štěpení molekuly na místě vzdáleném od místa primární reakce. Reakce ionizovaných molekul vedou ke štěpení těchto molekul na ionty a radikály. Biologický účinek primárních (radiofyzikálních) a sekundárních (radiochemických) reakcí je jednak přímý (tzn. že tyto reakce probíhají přímo v molekulárně-genetických strukturách), jednak nepřímý (tzn. že radiofyzikálními a radiochemickými reakcemi dochází k ovlivnění ostatních složek biologického prostředí, např. molekul vody, vodíku, které teprve podmiňují vznik dalších změn). Jako terciární reakce se v zásadě označují reakce vzniklých radikálů a iontů. Jejich průběh významně ovlivňuje přítomnost kyslíku, který se uplatňuje při produkci řady nestálých toxických peroxidů, schopných disociace na velmi reaktivní radikály; tento tzv. kyslíkový efekt potencuje mutagenní (a jiné biologické) účinky ionizujícího záření. (3) reakce biochemické v prostředí, změněném radiofyzikálními a radiochemickými reakcemi, mohou vést k molekulárním změnám biologických struktur (např. depolymerace a denaturace nukleových kyselin, rozevření kruhů dusíkatých bází a jejich delece mohou vést k poruchám transkripce a translace, ke změnám struktury proteinů a z nich vyplývajících poruch různých buněčných funkcí). (4) reakce radiobiologické navazují na reakce předchozí. Vyvíjejí se v čase jako reakce destrukční, které se nejčastěji projevují ztrátou, inhibicí, nebo alterací některých biologických funkcí, což mívá za následek rozvoj patologických procesů s rozličnými důsledky, včetně letality. Na různých organizačních úrovních jedince (od molekulární po organizmální) může být rozvoj negativních důsledků ozáření zmírněn (v krajním případě zcela znemožněn) při účinném zapojení reparačních a obranných (imunitních) mechanizmů. Průběh a konkrétní projev radiobiologických reakcí závisí na mnoha biologických faktorech; poznatky z této oblasti zobecňuje zákon Bergoniér Tribondeauův: čím vyšší je metabolická aktivita, mitotická aktivita a diferenciace individua, tím vyšší je jeho senzitivita vůči záření. 190

192 Z naznačeného mechanizmu působení ionizujícího záření na živý systém je zřejmé, že určité reakce se mohou uskutečnit v časné fázi, tedy již v průběhu ozáření nebo bezprostředně po něm, jiné až po jistém časovém intervalu a pokud se týká důsledků genetického poškození (např. indukce gametických mutací), mohou se manifestovat až v některé z následujících generací. V hrubých rysech lze k vyjádření mutačních účinků záření v závislosti na jeho dávce aplikovat zásahovou teorii (hits theory). V souladu s touto teorií je četnost genových mutací a jednozlomových chromozomálních aberací lineární funkcí dávky: M = N D kde M = počet mutací, N = počet chromozomů, D = dávka ozáření, = konstanta vyjadřující pravděpodobnost vzniku mutace při ozáření jednotkovou dávkou. Za předpokladu nezávislého vzniku dvou- a vícezlomových chromozomálních aberací bude jejich četnost exponenciální funkcí dávky ozáření. Na základě uvedeného vztahu můžeme odvodit význačný, experimentálně ověřený a pro radiomutagenezi charakteristický závěr: jakákoli dávka záření může indukovat mutaci; neexistuje tedy žádná absolutně spolehlivá (bezriziková) dávka ozáření, žádná dolní hranice dávky, pod níž by záření nepůsobilo jako mutagen nebo karcinogen (na rozdíl od chemomutagenů). Obr.: Biologické účinky ionizujícího záření. Zdroj: 191

193 Obr.: Radiobiologické účinky na subcelulární úrovni. Zdroj: XIII.2.2 CHEMICKÉ MUTAGENY Chemické mutageny (chemomutageny) představují velmi heterogenní skupinu chemických látek. Mechanizmus chemomutageneze je do jisté míry determinován složením a strukturou toho kterého mutagenu, respektive jeho příslušností k určité skupině látek s podobnými chemickými vlastnostmi. Pro analogy bazí nukleových kyselin je typická indukce substitucí bází typu tranzice nebo transverze, přičemž první typ se obecně vyskytuje častěji. Například 5 - bromuracyl (5-BU) v oxo-formě se páruje dvěma vodíkovými vazbami s adeninem, tedy stejně jako uracyl, a proto v této formě nemusí vést ke vzniku mutace. V enol-formě se však může párovat třemi vodíkovými vazbami s guaninem a vést tak k substituci původního páru A U (případně A - T) párem G C. Obdobně se chovají i jiné halogenderiváty pyrimidinových bází (jóduracyl, chlóruracyl atd.). Inkorporace halogenderivátů pyrimidinových bází do řetězce DNA (resp. RNA), i když nevede k indukci mutace, obvykle zvyšuje radiosenzitivitu buněk a tím nepřímo jejich mutabilitu, jsou-li exponovány ionizujícímu nebo UV záření. 2-aminopurin (2-AP) se jako analog adeninu může párovat dvěma vodíkovými vazbami s molekulou tyminu nebo pouze jednou vodíkovou vazbou s molekulou cytozinu; ve druhém 192

194 případě tak může vést k záměně původního páru bází A T párem G C. Hypoxantin (HX), vznikající deaminací adeninu, se může párovat dvěma vodíkovými vazbami s cytozinem a vést k substituci bází v řetězci DNA (RNA) typu tranzice; původní pár A T tak může být zaměněn za pár G C (A T HX C G C). Obr.: Tautomerní formy bází nukleových kyselin a mutageneze. Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm 193

195 Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm Obr.: Příklady analogů bází nukleových kyselin. Zdroj: 194

196 Velmi rozsáhlá a významná skupina mutagenů se nachází mezi alkylačními látkami. Alkylační látky preferenčně působí v nukleofilních oblastech molekul nukleotidů; proto alkylace postihuje především atomy dusíku (alkylsulfáty) a kyslíku (N-nitrózosloučeniny). Alkylace těchto atomů má za následek nejčastěji substituci bází v řetězci nukleové kyseliny. Alkylační látky obsahují ve své molekule jednu nebo dvě funkční skupiny; monofunkční alkylační látky reagují s jedním nukleofilním centrem nukleotidu, bifunkční alkylační látky mohou reagovat se dvěma nukleofilními centry dvou nukleotidů za vzniku vnitrořetězcových a meziřetězcových křížových vazeb (cross-linking), které mohou narušovat procesy replikace a transkripce (N-yperit, cytostatikum cis-platina). Důsledky alkylace nukleových kyselin jsou ovlivňovány též řadou fyzikálně-chemických faktorů. Například při metylaci atomu N 7 guaninu v kyselém prostředí (ph < 7) se N-glykozidická vazba stává labilní, hydrolyzuje a dochází k uvolnění cukerného zbytku, v zásaditém prostředí (ph > 7) se rozevírá purinový kruh mezi atomy C 8 a N 9. V nukleových kyselinách může docházet též k alkylaci fosfátových skupin, jejich následné hydrolýze a případnému přenesení alkylradikálu na bázi nukleové kyseliny. Mezi významné mutageny ze skupiny alkylačních látek lze zařadit dimetylsulfát (DMS), mono- a dialkylsulfáty, epoxidy, β-propiolakton, yperit a jeho analogy, etylénimin, diazosloučeniny či N-alkyl-N-nitrózaminy (samy o sobě jsou pouze premutageny, které musejí být v buňce nejprve metabolicky aktivovány na mutageny, indukující mutace mechanizmem alkylace bází nukleových kyselin). Akridinová barviva se vyznačují schopností včlenit se do řetězce DNA (RNA). Vzhledem k tomu, že mohou vytvářet páry s bázemi nukleových kyselin, mohou indukovat mutace typu adice. Mohou též interkalovat (tzn. vmezeřit se) mezi dva sousední nukleotidy molekuly dsdna. Jako zástupce této skupiny látek lze kromě akridinu uvést některé jeho deriváty, například 5-aminoakridin, proflavin (= 2,8-diaminoakridin), akridinovou oranž (=2,8-bis-dimetylaminoakridin), akridinovou žluť (= 2,8-diamino-3,7-dimetylakridin). Mezi interkalační chemomutageny patří, podobně jako akridinová barviva, též psoraleny. Jednou z charakteristických vlastností interkalovaných psoralenů je tvorba aduktů s molekulou dsdna po fotoreakci UV světlem o delších vlnových délkách; tím mohou být negativně ovlivněny procesy replikace a transkripce. Kyselina dusitá způsobuje oxidativní deaminaci bází, takže z adeninu vznikne hypoxantin (HX), z guaninu xantin (X) a z cytozinu uracyl. Z těchto změn je zřejmé, že deaminované báze mohou v některých případech vést k substitucím bází (např. A T HX C G C; C G U A). Hydrogensiřičitany deaminují cytozin na uracyl. V důsledku toho může být indukována mutace typu tranzice, spočívající v substituci páru G C párem A T. Hydroxylamin (HA) reaguje s uracylem, cytozinem a adeninem. Jednotlivé reakce závisejí na hodnotě ph reakčního prostředí. Při ph > 7 (nejlépe v rozmezí ph 9 10) probíhá reakce s uracylem, při které dochází k rozštěpení vazby mezi atomy N 3 a C 4 s následující destrukcí molekuly báze až na močovinu a ribózylhydroxylamin jako konečné produkty. Při ph < 7 (nejlépe v rozmezí ph 5 6) reaguje hydroxylamin s cytozinem a adeninem, přičemž je aminoskupina báze ( NH 2 ) hydroxylována za vzniku hydroxyaminoskupiny ( NHOH). Za fyziologických podmínek probíhají nejčastěji reakce HA s cytozinem a adeninem, které mohou rezultovat v substituční mutace (G - C A - T nebo A - T G - C). 195

197 Obr.: Deaminace bazí nukleových kyselin. Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm Metoxyamin reaguje v nukleových kyselinách s adeninem a cytozinem tak, že aminoskupina těchto bází ( NH 2 ) je nahrazena metoxyaminoskupinou ( NHOCH 3 ). V důsledku toho může docházet k odchylnému párování bází za vzniku substitučních mutací typu tranzice ( G C A T nebo A T G C). Hydrazin reaguje s pyrimidinovými bázemi. Při reakci dochází k rozevření pyrimidinového kruhu; následující reakční procesy vedou k tvorbě močoviny a pyrazolu (resp. 3-aminopyrazolu) jako konečných produktů reakce hydrazinu s uracylem (resp. cytozinem). Polycyklické uhlovodíky lze chápat jako premutageny, jejichž metabolická aktivace se realizuje působením enzymů cytochromového systému P-450. Tento enzymový systém se v buňkách uplatňuje jako jedna z forem detoxikace nepolárních xenobiotik na polární metabolity, které mohou být z buňky vylučovány. Arylhydroxylázy tohoto enzymového systému katalyzují reakce metabolické konverze polycyklických aromatických uhlovodíků na fenoly a dihydrodioly, odstranitelné z buňky. Některé z těchto metabolitů ovšem mohou reagovat s nukleofilními centry nukleových kyselin a působit tak jako mutageny nebo karcinogeny. Do této skupiny mutagenů spadají též tzv. polychlorované bifenyly (PCB). Jako premutageny označujeme látky, které mohou být konvertovány na mutageny až po metabolické aktivaci. Obdobně některé látky, označované jako prekarcinogeny, vyžadují ke konverzi na karcinogeny metabolickou aktivaci. Na této aktivaci se podílejí především enzymy mikrozomální frakce (enzymy cytochromového systému P-450, glutathion-stransferázy, acetyltransferázy, metylázy a jiné), případně některé další cytoplazmatické enzymy. 196

198 Mezi nejznámnější premutageny a/nebo prekarcinogeny patří: benzo[a]pyren, polycyklický aromatický uhlovodík (jeho molekula je tvořena pěti benzenovými jádry) obsažený např. ve výfukových plynech a cigaretovém kouři. Mutagenní a karcinogenní aktivitu vykazují epoxidy, vznikající při jeho metabolické aktivaci. AAF (= N-acetyl-2-aminofluoren) patří do skupiny aromatických aminů. Na jeho metabolické aktivaci se účastní nejprve cytochromový enzymový systém za vzniku relativně slabě mutagenního a karcinogenního intermediárního produktu N-hydroxy AAF, který je dále konvertován za katalytického působení specifických cytoplazmatických enzymů až na AAAF (= N-acetoxy-N-acetyl-2-aminofluoren), který je velmi účinným mutagenem (alkylace bází DNA) a karcinogenem. Některé insekticidy obsahují aromatické aminy jako účinnou složku a v tomto ohledu mohou představovat kontaminanty životního prostředí s potenciálně mutagenními a karcinogenními účinky. Obr.: Schéma tvorby adduktů s DNA. Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm Aflatoxiny představují skupinu mykotoxinů produkovaných v relativně velkém množství některými druhy rodu Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus). Tyto houby mohou běžně růst na nesprávně uskladněných nebo špatně pražených burských oříšcích, případně další potravinách. Metabolity všech aflatoxinů (zejména však aflatoxinu B1), produkované za účasti mikrozomálních enzymů při metabolické aktivaci, jsou velmi silnými karcinogeny (aflatoxin B1-8,9-oxid), účinnými zejména při maligních transformacích jaterních buněk (hepatokarcinomy). Dusičnany jsou v organizmu konvertovány na dusitany, nitrózaminy a N-metyl-N-nitrózomočovinu. Tyto metabolity vykazují mutagenní a karcinogenní účinky. Z tohoto důvodu je třeba sledovat obsah dusičnanů a dusitanů ve vodě a potravinách (zejména v zelenině v souvislosti s možným zvýšením jejich obsahu v důsledku nadměrného hnojení ledky). N-metyl-N -nitro-n-nitrózoguanidin, N-metyl-N-nitrózomočovina a některé další chemicky příbuzné látky jsou v buňkách konvertovány na produkty, které alkylují báze nukleových kyselin a tak mohou vést k mutagennímu nebo karcinogennímu efektu. Sloučeniny, které obsahují v molekule dvě reakční skupiny (nebo i více reakčních skupin), 197

199 které mohou atakovat nukleové kyseliny a indukovat mutace, se označují jako supermutageny. Obě jmenované látky k nim náleží. Mutagenní účinky některých látek nejsou výsledkem ani jejich přímého působení na genetický materiál buňky, ani jejich metabolické aktivace, ale vyplývají z jejich ovlivnění jiných buněčných složek, souvisejících s normálním fungováním genetického aparátu. Například azaserin inhibuje enzymy účastnící se replikace DNA, nebo kofein a jeho deriváty inhibují buněčné reparační systémy, čímž se zvyšuje pravděpodobnost vzniku mutace v důsledku nereparované mutační chyby (premutačního stavu). Řada mutagenů může vést k indukci chromozomálních aberací (např. ty, jejichž účinek je spojen s depurinací nebo depyrimidinací řetězců nukleových kyselin, s dimerizací bází nebo tvorbou meziřetězcových křížových vazeb a aduktů); pro takové mutageny se používá název klastogeny a jejich účinek, tj. indukce chromozomálních aberací, se označuje jako klastogenní účinek. Z uvedeného stručného přehledu mechanizmu působení chemomutagenů lze snadno pochopit, proč se mutagenní účinek (mutace) projeví nejen bezprostředně po aplikaci mutagenu, ale též se zpožděním. Například je zřejmé, že substituce párů bází se mohou projevit nejdříve v buněčném cyklu následujícím po začlenění analogů bází do řetězce DNA či RNA, nebo po uskutečněných reakcích na molekulách bází příslušných nukleotidů. Zpožděný účinek mutagenu (tzv. delayed effect, resp. storage effect) je charakteristický pro řadu chemomutagenů a může přetrvávat po více buněčných cyklů. Pro chemomutageny lze stanovit spodní hranici mutagenity, tj. koncentraci chemické látky, od které se za daných podmínek projevuje jako mutagen (resp. karcinogen). Teoreticky bychom mohli předpokládat, že četnost indukovaných jednozásahových (genových) mutací bude lineární funkcí koncentrace mutagenu. Ve skutečnosti se tato závislost četnosti mutací na koncentraci mutagenu jeví jako exponenciální. Odchylka od linearity je patrná především v oblasti nízkých koncentrací mutagenu; tento jev je označován jako efekt nízkých koncentrací (low doses effect). Podílí se na něm nižší pravděpodobnost vzniku mutace při aplikaci mutagenu v koncentracích blízkých spodní hraniční koncentraci než v koncentracích vyšších. Zároveň je třeba podotknout, že koncentraci mutagenu nelze zvyšovat neomezeně; po dosažení určité hladiny její další zvyšování již není, pokud jde o zvýšení četnosti mutací, efektivní. Kromě toho je třeba vzít v úvahu skutečnost, že vedle mutagenního účinku chemomutageny vykazují též účinky toxické, které od určité koncentrace mohou převážit a vést k inhibici buněčné proliferace nebo k letalitě. Rovněž indukce více genových mutací nebo chromozomálních aberací v jedné buňce může vést (a zpravidla vede) k inhibici buněčného dělení nebo k letalitě z genetických příčin. Proto při aplikaci chemomutagenu nad určitou horní hranici dochází k postupnému zpomalování nárůstu četností mutací, případně k jeho zastavení nebo dokonce poklesu. XIII.2.3 BIOLOGICKÉ MUTAGENY Mezi biologické mutageny jsou řazeny retroviry a transdukující bakteriofágy. Jako retroviry jsou označovány RNA-viry s reverzní transkriptázou. Tyto viry po infekci hostitelské buňky reverzní transkripcí produkují DNA, která se za katalytické aktivity integrázy může integrovat do genomu (chromozomální DNA) hostitelské buňky a ve formě proviru se replikovat současně s replikující se hostitelskou DNA. Některé proviry (tzv. pomalu transformující) neobsahují onkogeny, ale navozují transformaci hostitelské buňky prostřednictvím aktivace promotoru protoonkogenu, do jehož sousedství se integrovaly. Jiné retroviry (tzv. akutně transformující) obsahují onkogeny, které při infekci přenášejí a s nimiž se integrují do genomu hostitelské buňky. Do této skupiny retrovirů patří např. virus Rousova sarkomu (RSV), virus opičího sarkomu, virus kočičího sarkomu, virus krysího sarkomu, virus 198

200 ptačího sarkomu, virus ptačí erytroblastózy, virus ptačí myeloblastózy, virus ptačí myelocytomatózy, Abelsonův leukemický virus a další. Retroviry tedy mohou transformovat hostitelskou buňku a vést ke vzniku některých typů nádorových (maligních) onemocnění. S některými neopláziemi u lidí bývají asociovány též některé retroviry, případně DNA-viry s reverzní transkriptázou: retroviry HTLV-1 a HTLV-2 jsou asociovány s leukemickým T lymfomem, HIV s non-hodgkinovým lymfomem a Kaposiho sarkomem, virus Epstein- Barové (EBV), původce mononukleózy, je asociován s Burkittovým lymfomem, virus hepatitidy B (HBV), původce sérové žloutenky, je asociován s karcinomem jater. Lidské papiloma viry (HPV), pro které je typické navození benigní proliferace infikovaných epiteliálních buněk a tvorba bradavic, mohou vést v některých případech ke vzniku nádorů. Pro řadu retrovirů nejsou onkogeny přirozenou součástí jejich genomu, ale staly se jí pravděpodobně v důsledku nepřesné excize provirů z chromozomu hostitelské buňky. Nepřesnou excizí lze rovněž vysvětlit možnost vzniku delecí genetického materiálu z chromozomu hostitelské buňky a přenos deletovaného úseku prostřednicvím viru do další hostitelské buňky, kterou infikuje a do jejíhož genomu se integruje. Obdobným způsobem se uskutečňuje přenos fragmentů bakteriálního chromozomu zprostředkovaný při transdukci transdukujícím fágem. V tomto ohledu se retroviry a transdukující bakteriofágy jako biologické mutageny liší od mechanizmu působení fyzikálních a chemických mutagenů: vnášejí do genomu hostitelské buňky cizorodý genetický materiál (DNA); proto se někdy uvádí, že biologické mutageny působí podle zásady zasáhni a zůstaň (hit-and-stay), kdežto ostatní mutageny podle zásady zasáhni a uteč (hit-and-run). Problematika biologických mutagenů je blíže probírána v předmětu Biologie prokaryot a virů. XIII.3 DETEKCE MUTACÍ Mutagenní účinky chemických látek závisejí nejen na jejich chemickém složení, struktuře, fyzikálně-chemických vlastnostech a koncentraci, ve které jsou aplikovány, ale též na organizmu, který je jimi ovlivněn, na konkrétním typu buněk nebo tkání, na stadiu ontogenetického vývoje, na fylogenetickém postavení konkrétního biologického druhu, na momentálním fyziologickém stavu, na charakteru intermediárního metabolizmu, na schopnosti metabolizovat danou látku, na přítomnosti a funkceschopnosti reparačních mechanizmů buněk, na genotypu, na způsobu rozmnožování, na způsobu, formě a podmínkách aplikace mutagenu a řadě dalších faktorů. Objektivní posouzení mutagenity určité chemické látky (nebo fyzikálního faktoru) a objasnění mutageneze je tedy záležitostí značně obšírnou a komplikovanou. K problematice studia mutageneze lze přistupovat z mnoha hledisek. Pro samotnou detekci mutací existuje v současné době celá řada systémů, z nichž některé stručně popíšeme. Je třeba zdůraznit, že k dostatečně spolehlivým závěrům, týkajících se mutagenity (resp. karcinogenity) testovaných látek (faktorů) a odhadu jejich genetického rizika, je nezbytné zpracovat údaje získané z celé baterie testovacích systémů. V každé takové baterii testů mutagenity by měly být zastoupeny testy prováděné na organizmech prokaryotických, nižších a vyšších rostlinách, nižších a vyšších živočiších za podmínek in vivo i in vitro a testy, prováděné in vitro na biologickém materiálu lidského původu. Amesův test používá jako testovací organizmus mutantní kmen Salmonella typhimurium. Bakterie tohoto kmene jsou auxotrofními mutanty v syntéze histidinu (his ), tj. mutanty neschopnými syntetizovat histidin a vyžadující jeho přidání do kultivačního média (na médiu bez histidinu nerostou). Hodnocení mutagenity je v tomto testu založeno na 199

201 detekci revertantů (tj. zpětných mutantů), zjištěných po aplikaci testované látky a porovnání jejich četnosti s četností spontánně vzniklých revertantů v kontrole. Základní postup testu je následující: suspenze auxotrofních mutantů se vyseje na agarové plotny neobsahující histidin a překryje disky filtračního papíru saturovanými testovanou látkou (v kontrole vodou nebo roztokem, ve kterém byla testovaná látka rozpuštěna). Na použitém médiu mohou růst pouze revertanti (his + ) a proto v těch místech, kde se na plotně nacházejí, posléze vyrostou jejich kolonie. Jestliže je četnost kolonií (tudíž revertantů) na plotnách s testovanou látkou signifikantně vyšší než v kontrole, lze označit testovanou látku za mutagen. Jak je známo, bakterie nedisponují žádnými cytoplazmatickými organelami a tudíž ani na ně vázanými enzymatickými systémy, schopnými katalyzovat metabolickou konverzi premutagenů na mutageny. Z tohoto hlediska by varianta Amesova testu, provedená výše uvedeným postupem, poskytla falešně negativní výsledky při testování těch látek, jejichž mutagenita (resp. karcinogenita) se projeví až u meziproduktů vzniklých metabolickou aktivací. Tento nedostatek Amesova testu, vyplývající z biologických specifik bakteriální buňky, lze eliminovat jeho modifikací. Ta spočívá v tom, že k vysévané suspenzi auxotrofů S. typhimurium se přidá mikrozomální frakce (izolovaná např. z krysích jater), obsahující enzymy zapojené do procesů metabolické aktivace, resp. se testovaná látka před vlastní aplikací do bakteriální kultury preinkubuje ve směsi obsahující mikrozomální frakci. Tím je zajištěna možnost uskutečnit in vitro metabolickou konverzi premutagenu na mutagenní produkt, který může následně indukovat reverze u bakterií obsažených v médiu. Amesův test se tedy provádí ve dvou variantách: bez metabolické aktivace (kdy lze prokázat mutagenní účinky mutagenů nevyžadujících metabolickou aktivaci) a s metabolickou aktivací (kdy lze odhalit premutageny na základě mutagenity jejich metabolitů, vzniklých metabolickou aktivací). Vhodným objektem k detekci gametických mutací u rostlin je huseníček rolní (Arabidopsis thaliana). Müllerův embryonální test umožňuje snadnou a spolehlivou detekci chlorofylových mutací ve zrajících šešulích. Mutantní embrya defektní v syntéze chlorofylu jsou oproti normálním světlejší (žlutavá až bílá). Tímto testem lze detegovat i celou škálu dalších embryonálních mutací. Takzvaný stamen hairs test se používá u vybraných kultivarů Tradescantia k detekci somatických mutací. Zbarvení chloupků na tyčinkách je modré u dominantních homozygotů a heterozygotů, červené u recesivních homozygotů. Nález červeně zbarvených chloupů (resp. jejich sektorů) na heterozygotní rostlině exponované testované látce (či fyzikálnímu faktoru) je dokladem indukce somatické recesivní mutace. Analýzou jednotlivých buněk těchto chloupků lze velmi přesně kvantitativně vyhodnotit mutagenitu testované látky (faktoru). Podobně je možné analyzovat i výskyt červeně zbarvených sektorů na korunních lístcích modře zbarvených květů heterozygotních rostlin. 200

202 Obr.: Schéma Amesova testu. Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm Celá řada systémů detekce mutací je rozpracována u octomilky Drosophila melanogaster. K detekci recesivních letálních mutací lokalizovaných na chromozomu X je vhodná metoda Basc. Dominantní mutace Bar (B) se fenotypově projevuje výrazně zmenšeným okem v důsledku redukce počtu očních facet, recesivní mutace apricot (a) v homozygotním stavu meruňkově zbarveným okem; alela scute (sc) se nachází v oblasti inverze, která znemožňuje rekombinaci chromozomu X. Jestliže v parentální generaci jsou kříženy homozygotní samice Basc/Basc s normálními samci B + a + sc + /Y, objeví se v generaci F2 dvě fenotypově rozlišitelné kategorie samic: homozygotních Basc/Basc a heterozygotních Basc/B + a + sc +, a dvě fenotypově rozlišitelné kategorie samců: Basc/Y (s fenotypem Basc) a B + a + sc + /Y (se standardním fenotypem). Jestliže byla v parentální generaci indukována recesivní letální mutace u samice, pak po individuálním křížení jedinců generace F1 bude v generaci F2 absentovat kategorie samců s fenotypem Basc (Basc/Y); jestliže byla v parentální generaci indukována recesivní letální mutace u samce, pak po individuálním křížení jedinců generace F1 bude v generaci F2 absentovat kategorie samců standardního fenotypu (B + a + sc + /Y). Pokud budou jedinci rodičovské generace vystaveni účinku testované látky (faktoru) a v generaci F2 bude četnost uvedených kategorie samců významně nižší než v kontrole, lze označit testovanou látku (faktor) za mutagen. K detekci somatických mutací u D. melanogaster lze dobře použít tzv. wing spot test. Využívá mutace mwh (multiple wing hair), lokalizované na chromozomu č. 3, fenotypově se projevující na křídlech vícečetností chloupků vyrůstajících z jednoho místa (u standardních jedinců vyrůstá z jednoho místa pravidelně jeden chloupek). Jestliže se na křídlech 201

203 heterozygotních jedinců (mwh + mwh) po expozici testované látce (faktoru) vyskytnou oblasti s fenotypem mwh (tj. recesivně homozygotní mwh mwh) ve významně vyšší četnosti než v kontrole, můžeme testovanou látku označit za mutagen. Obdobně lze postupovat za použití mutace flare (flr), lokalizované na chromozomu č. 3, která se projevuje v recesivně homozygotním stavu specifickou deformací chloupků na křídlech. K testování mutagenity lze rovněž použít jedince nesoucí obě zmíněné mutace v heterozygotním stavu (mwh + mwh flr + flr); výskyt sektorů na křídlech s vícečetnými a zároveň deformovanými chloupky (genotyp mwh mwh flr flr), může být výsledkem vzniku dvou nezávislých mutací. Nesporným pozitivem tohoto testu je možnost detegovat indukované somatické mutace v téže generaci, ve které byl aplikován mutagen. Stanovení dominantních letálních mutací u myší je jedním z vhodných testů mutagenity, uskutečňovaných na savčí úrovni. Testovaná látka se aplikuje samcům, kteří jsou každý týden připařováni ke skupině neovlivněných samic. Test se provádí po dobu osmi týdnů, aby bylo možné posoudit poškození v jednotlivých stadiích gametogeneze. Samice se v období mezi dnem po zabřeznutí usmrtí a pitvají; při pitvě se hodnotí počet žlutých tělísek v ovariích (CL), počet implantací (I), počet resorbovaných zárodků (R) a počet živých zárodků v uteru (V = I - R). Na základě získaných údajů se vypočítá celková dominantní letalita L TOT = (CL V) / CL, preimplantační letalita L PRE = (CL I) / CL a postimplantační letalita L POST = R / I. Tento test umožňuje detegovat dominantní letály indukované testovanou látkou v pohlavních buňkách a projevující se po oplodnění samic zastavením raných stadií embryogeneze. Dominantní letalita je ve značné míře důsledkem indukce chromozomálních aberací. Test umožňuje analyzovat senzitivitu jednotlivých stadií spermatogeneze vůči testované látce a další důležité projevy interakce mezi organizmem a mutagenem. Nepřímou metodou detekce mutagenity u savců je tzv. host-mediated assay. V tomto případě se pokusnému zvířeti aplikuje intraperitoneálně mikroorganizmus a perorálně (příp. subkutánně) testovaná látka. U paralelní skupiny mikroorganizmů, vystavených účinku testované látky v mikrobiální kultuře, se stanoví četnost indukovaných mutací. Po určité době se mikroorganizmy z pokusného zvířete izolují zpět a vhodnou metodou se detegují indukované mutace. Porovnáním výsledků v obou skupinách lze rozhodnout, zda hostitel metabolizuje testovanou látku v mutagenně aktivní anebo v mutagenně inertní produkt. K detekci mutací v buněčných kulturách rostlinných, živočišných i lidských je rozpracováno mnoho systémů, z nichž velká část spočívá na průkazu absence nebo změny aktivity nějakého enzymu. Například enzym HGPRT u savců (hypoxantinguaninfosforibózyltransferáza) s využitím fosforibózapyrofosfátu katalyzuje syntézu 5 - (d)mnp z hypoxantinu, guaninu a některých analogů guaninu (8-azaguanin, 6-thioguanin, 6-merkaptopurin), které jsou však pro buňku toxické. Buňky rezistentní k těmto analogům bází jsou deficientní v HGPRT (HGPRT ). Buňky s normální katalytickou aktivitou HGPRT (HGPRT + ) mohou růst v selekčním médiu HAT (obsahuje hypoxantin, aminopterin a tymidin). Protože aminopterin nedovoluje syntetizovat puriny de novo, buňky musejí nutně využívat hypoxantin jako zdroj purinů. Systém využívající HGPRT je tedy schopen potenciálně dvousměrné selekce přímých mutací a zpětných mutací. Pokud testovaná látka v linii HGPRT + (roste v HAT médiu, nikoli v selekčním médiu s 8-azaguaninem) indukovala mutaci vedoucí ke ztrátě aktivity enzymu (HGPRT ), mutantní buňky porostou v médiu s obsahem 8-azaguaninu, nikoli v médiu HAT; naopak, pokud byla v linii HGPRT indukována zpětná mutace, projeví se revertanti schopností růst v médiu HAT, nikoli však v selekčním médiu s azaguaninem. Gen pro HGPRT je lokalizován u člověka na chromozomu X. Deficience tohoto enzymu vede k poruchám metabolizmu purinů, k nadměrné produkci kyseliny močové a může se manifestovat jako Lesh-Nyhanův syndrom. 202

204 K detekci strukturních a numerických změn chromozomů (chromozomální aberace, aneuploidie, polyploidie) se využívá různých klasických i moderních cytogenetických metod, které se vyznačují poměrně vysokou rozlišovací schopností (proužkovací metody, průtoková cytofotometrie, denzitometrie, fluorescenční cytogenetické metody). S rozvojem molekulárně genetických metod je možné přesně určit mutační místo sekvenováním testované DNA, resp. některého jejího fragmentu. Významnou metodou detekce specifických mutací v určité genové oblasti je hybridizace in situ se sondou (tzv. FISH fluorescent in situ hybridization). Zachycení většího počtu genových mutací na bázi hybridizace nukleových kyselin u velmi rozsáhlého testovacího souboru skýtá využití čipů. Při posuzování mutagenity určité látky nebo komplexu látek mají nezastupitelné místo též populačně-genetické studie, při nichž mohou být mutace nejen detegovány, ale mohou být vypracovány i obecnější závěry týkající se např. relativní vitality a fertility mutantů, genetické smrti či genetické zátěže polulace. XIII.4 VZTAHY: MUTAGENEZE KARCINOGENEZE - TERATOGENEZE V mutační genetice je důležité rozlišovat mezi mutagenem, karcinogenem a teratogenem, resp. mezi mutagenezí, karcinogenezí a teratogenezí. O mutagenech (fyzikálních, chemických a biologických) a mutagenezi bylo již dostatečně pojednáno. Pokud se týká vztahu mutagenů a karcinogenů, je třeba si uvědomit, že ne každý mutagen je karcinogenem, avšak není znám karcinogen, který by nebyl mutagenem. Proto u látek s prokázanou karcinogenitou se předpokládá jejich mutagenita a pokud ještě nebyly provedeny příslušné testy, nahlíží se na ně jako na mutageny. Karcinogeneze jako značně složitý vícestupňový proces, za jehož primární základ je považována mutace, vede k maligní transformaci buněk a nakonec obvykle k manifestaci určitého nádorového onemocnění. Z hlediska genetického je podstatné, že změny v genetickém aparátu somatické buňky, indukované působením fyzikálního nebo chemického karcinogenu a vedoucí k rozvoji nádorového onemocnění, nejsou přenosné na potomky postiženého jedince a tudíž jimi není ohrožen gametový fond populace. Za určitých podmínek zevního prostředí se mohou v karcinogenezi uplatnit zřejmě pouze některé gametické mutace ve smyslu predispozice jedince k nádorovému onemocnění. Teratogeny jsou látky, které zasahují do embryogenetických (morfogenetických) procesů a mohou vést ke vzniku vrozených vývojových vad (VVV). Jejich účinek lze označit za epigenetický a proto je třeba přesně odlišit vrozené vývojové vady jako nedědičné poruchy embryogeneze (morfogeneze) od dědičných chorob. Podkladem každé dědičné choroby je nějaká konkrétní mutace, kdežto VVV se konstituují na negenetickém základu, tudíž nemají mutační podklad. Výše uvedené nevylučuje, aby určitá látka, která vykazuje znaky teratogenu, nemohla být zároveň mutagenem nebo karcinogenem, anebo teratogenem, mutagenem i karcinogenem; mechanizmus i důsledky jejího působení jako teratogenu, mutagenu nebo karcinogenu budou avšak rozdílné. Rovněž je třeba si uvědomit, že fenotypový projev určité mutace může být shodný s fenotypovým projevem některé VVV, kterou lze v takovém případě označit za fenokopii. Rozlišení mezi mutací a fenokopií má zásadní význam např. v genetickém poradenství při vypracování genetické prognózy. 203

205 Obr.: Příklady karcinogenů. Zdroj: Types_of_Damages_and_Effects.htm 204

206 Obr.: Metylace bází DNA jako příklad vztahu mutace a karcinogeneze. Zdroj: 205

207 XIII.5 REPARACE MUTAČNÍCH ZMĚN Různé mutageny mohou indukovat velmi rozmanité mutace genové, chromozomové či genomové. Základem všech je však buď chybné párování bází (jako následek substituce, adice nebo delece bází), nebo vznik mezery v rozsahu jednoho či více nukleotidů (např. jako následek přerušení replikace v oblasti výskytu pyrimidinového dimeru), anebo vznik zlomu jednoho řetězce DNA (single strand break) či obou řetězců dsdna (double strand break). Prokaryotické i eukaryotické buňky disponují opravnými, enzymaticky katalyzovanými systémy reparace těchto poškození (chyb). Mezi základní reparační mechanizmy patří: fotoreaktivace, excizní reparace a tolerantní reparace. Obr.: Schéma hlavních buněčných reakcí na počkození DNA. Zdroj: Fotoreaktivace již byla částečně zmíněna v souvislosti s reparací poškození indukovaných UV zářením. Na tomto místě informace již uvedené pouze doplníme. Vzhledem k tomu, že účinná fotoreaktivace vede k obnovení původního stavu molekuly DNA (resp. RNA), bylo by přesnější hovořit o restituci, než o reparaci. Z hlediska reakčního mechanizmu se rozlišují tři typy fotoreaktivace: (1) fotoreaktivace přímá, při které fotolyáza, aktivovaná světlem o vlnové délce λ = nm, katalyzuje štěpení tyminových dimerů. Reakce probíhá přes tvorbu 5,10-metylentetrahydrofolátu, který přenáší elektrony na FAD za vzniku FADH 2. FADH 2 se 206

208 pak stává donorem elektronů využitých ke štěpení cyklobutanových kruhů tyminových dimerů; po uvolnění elektronů přechází zpět na FAD. (2) fotoreaktivace senzitizovaná, která není závislá na fotolyáze (3) fotoreaktivace nepřímá, která byla popsána u mutantů E. coli s inaktivní fotolyázou. Po ozáření těchto buněk UV světlem o vlnové délce kolem 330 nm dochází k inaktivaci molekul trna a z ní vyplývajícího dočasného zastavení růstu a dělení bakteriálních buněk. V tomto mezičase mohou být pyrimidinové dimery odstraněny excizní reparací ještě před zahájením nové replikace. Excizní reparace se může uskutečňovat také několika různými mechanizmy: (1) bázová excizní reparace (BER) probíhá za účasti DNA-glykozyláz, které rozpoznávají specifické poškození molekuly DNA a katalyzují hydrolytické štěpení N-glykozidové vazby (nikoli však fosfodiesterové vazby), které vede k excizi poškozeného místa (báze). Tím vznikne tzv. AP místo (apurinové či apyrimidinové místo), v němž specifická 5 -APendonukleáza indukuje zlom řetězce DNA, z něhož je DNA-deoxyribofosfodiesterázovou aktivitou (drpáza) odstraněna fosfátová skupina nukleotidu na 5 -konci a v mezeře, vzniklé po uvolněném nukleotidu (či uvolněných) nukleotidech), se za účasti DNA-polymerázy a ligázy uskuteční opravná syntéza komplementárně k druhému řetězci DNA. (2) nukleotidová excizní reparace (NER) je specifická pro pyrimidinové dimery. Poškozená oblast DNA je rozpoznána proteiny s helikázovou aktivitou a za jejich účasti odstraněna. Uvolněné místo je následně za katalýzy DNA-polymerázy zaplněno při opravné syntéze komplementárně k druhému řetězci molekuly DNA. (3) korektorská excizní reparace se realizuje v průběhu replikace DNA na základě kontrolní (korektorské) funkce DNA-polymerázy III. Tato polymeráza je schopna rozpoznat chybný pár bází, odstranit ho svou 3 5 exonukleázovou aktivitou a svou polymerázovou aktivitou katalyzovat nahrazení odstraněného chybného nukleotidu správným. Obdobou korektorské excizní reparace je reparace jednořetězcového zlomu DNA katalyzovaná DNA-polymerázou I. Obecně můžeme procesy excizní reparace rozčlenit do čtyř fází. První, incize, představuje rozpoznání poškozeného místa na DNA N-glykozidázou nebo enzymem s nukleázovou aktivitou. Následuje excize, při které dochází k degradaci polynukleotidového řetězce vlivem exonukleáz, přičemž počet uvolněných nukleotidů závisí na typu indukovaného poškození. Třetí fází je polymerace (opravná syntéza) katalyzovaná polymerázami, jejímiž produkty se zaplní mezera po nukleotidech uvolněných při excizi. Poslední fází je ligace, která představuje včlenění nově syntetizovaného úseku DNA do reparovaného řetězce DNA, katalyzované ligázou. Tolerantní reparace je typem reparace zlomů v DNA. Vlastní poškození řetězce DNA (zlomy) se neodstraňují formou opravné syntézy, ale při replikaci se opravují (zacelují) mezery v nově syntetizovaném řetězci, odpovídající místům poškození replikovaného řetězce. Za specifickou formu reparace (přesněji restituce, neboť vede k obnově původního stavu), popsanou u E. coli, můžeme považovat demetylaci metylovaných bází a metylfosfotriesterů. Je znám enzym O 6 -metylguanin-dna-metyltransferáza (= Ada protein), který katalyzuje přenos metylových skupin z O 6 - metylguaninu, O 4 - tyminu a metylfosfotriesterů na proteinovou část vlastní molekuly. Tato transferáza patří mezi inducibilní enzymy, přičemž aktivátorem transkripce strukturního genu ada pro tento enzym je sama metylovaná transferáza. Proto produkce molekul O 6 -metylguanin-dnametyltransferázy v buňce je úměrná stupni metylace molekuly DNA. Důsledkem tohoto systému reparace může být tzv. adaptivní odpověď na alkylaci DNA, projevující se zvýšenou tolerancí buněk vůči některým alkylačním látkám. 207

209 Buňky jednotlivých typů tkání se vyznačují rozdílnou reparační kapacitou jak pro odlišné, tak pro podobné typy mutačního poškození. Tato kapacita se mění též v průběhu ontogenetického vývoje a proto ji lze považovat za jednu z hlavních příčin rozdílné senzitivity buněk v různých vývojových stadiích jedince a nacházejících se na různých úrovních diferenciace a specializace. Obr.: Schéma reparace dvojitých zlomů DNA (DSBR) Zdroj: Obr.: Schéma bázové excizní reparace (BER). Zdroj: 208

210 Obr.: Schéma nukleotidové excizní reparace (NER). Zdroj: uml on de_excision_repair.html 209

211 Obr.: Schéma mis match repair (MMR). Zdroj: 210

212 Obr.: Přehled hlavních typů poškození DNA a jejich reparace. Zdroj: 211

213 XIII.6 TRANSPOZICE Jako transpozice se označuje přemístění úseku DNA z donorového místa do recipientního v mezích genomu jedné buňky, které není způsobeno mutací, ani meiotickou nebo mitotickou rekombinací. Transponovatelný úsek DNA se označuje jako transpozon. Transpozon může být postupně včleňován (transponován) na různá místa buněčného genomu. V důsledku toho mohou vznikat mutace, může docházet k alteracím normálního projevu genů ovlivněných transpozicí a ke změnám celkového obsahu DNA v genomu. Transpozony lze označit za vlastní mutageny, to znamená, že transpozony v každém genomu, ve kterém se nacházejí, se mohou chovat jako mutageny. Například včlenění transpozonu do exonu může vést k syntéze změněného genového produktu; včlenění transpozonu do intronu může mít za následek chybné (odlišné) posttranskripční úpravy, které též mohou vést k syntéze změněného genového produktu; mezera, vzniklá po excizi transpozonu, může být chybně reparována; transpozon v místě inzerce může vést ke vzniku inekválního crossing-overu při meióze a tak by bylo možné pokračovat dále. Současně lze připustit, že některé ze změn v genomech, vyvolaných transpozony, se mohly významně uplatnit v evolučním procesu. Obr.: Transpozon. Zdroj:

214 Transpozony se obvykle rozdělují do tří tříd: TRANSPOZONY TŘÍDY I Do této skupiny patří retrotranspozony. Tyto retroelementy obsahují reverzní transkriptázu, integrázu a na koncích jsou opatřeny dlouhou koncovou repeticí LTR (long terminal repeats). Retrotranspozony jsou úseky DNA, které se na donorovém místě přepisují do RNA. Tato RNA se prostřednictvím zpětné transkriptázy přepíše do sekvence DNA, která se pak za účasti integrázy integruje na cílové místo v genomu. Tento typ transpozice se označuje jako retropozice. Mechanizmus replikace a integrace retrotranspozonů je tedy velmi podobný mechanizmu replikace a integrace u retrovirů; mezi oběma skupinami se proto předpokládají těsné evoluční vztahy. Rozdíl mezi retroviry a retrotranspozony spočívá především v tom, že retrotranspozony jsou vázány pouze na jednu buňku, intercelulární přenos se u nich nevyskytuje a proto je nelze považovat za infekční částice. Retrotranspozony se vyskytují v genomu ve vysoké četnosti; např. se odhaduje, že tvoří až 40% genomu člověka. Mezi transpozony třídy I se řadí rovněž retrosekvence (označované též jako cdnageny). Nemají zpětnou transkriptázu, integrázu, ani LTR. Retrosekvence vznikají včleněním reverzního transkriptu mrna (tj. již posttranskripčně upravené hnrna) do cílového místa genomu. Představují vlastně repliku určitého transkribovaného genu (donorového místa) bez intronů, zakončeného na 3 - konci poly(a) a lokalizovaného na jiném místě. Jestliže produkt exprese retrosekvence je identický nebo téměř identický s produktem původního genu, označuje se taková retrosekvence jako retrogen (též upravený gen). V případě, že tomu tak není, označuje se taková retrosekvence jako retropseudogen (též upravený pseudogen). Velmi rozšířeným retropseudogenem je Alu-sekvence o délce kolem 300 bp. V genomu člověka je přítomna přibližně v kopií (tj. přibližně 11% celého genomu); v jiném ohledu lze tyto sekvence považovat za krátké rozptýlené elementy SINE (short interspersed elements). Další skupinu retroelementů představují retropozony; mají zpětnou transkriptázu i integrázu, nikoli LTR. Mezi retropozony se řadí tzv. LINE (long interspersed elements), které jsou v lidském genomu asi v kopií (cca 20% celého genomu). Většina LINE patří do rodiny LINE-1 (L1). L1 jsou sekvence DNA o délce od několika set do několika tisíc bp. Většina z nich se v buňce netranskribuje, ani netranslatuje, pouze některé kódují reverzní transkriptázu (která zpětně přepisuje mrna) a endonukleázu; reverzní transkriptáza přepíše transkript L1 (mrna) do sekvence DNA, endonukleáza naštěpí DNA v cílovém místě a sekvence DNA, vytvořená reverzní transkripcí, se integruje do naštěpené genomové DNA v cílovém místě. Transkript L1 slouží nejen jako matrice pro syntézu DNA při reverzní transkripci, ale též se translatuje na ribozomech. Při transkripci L1 dochází relativně často k přesahu do další oblasti, takže zpětnou transkripcí je produkován úsek DNA delší než úsek DNA odpovídající původní L1. Naopak reverzní transkripce bývá předčasně ukončena, takže je produkován úsek DNA kratší než úsek DNA odpovídající původní L1. Přestože LINE se většinou neexprimují, mohou ovlivnit funkci genů, do nichž nebo do jejichž sousedství se integrují. LINE se též podílejí na vzniku pseudogenů tím, že někdy zpětně transkribují posttranskripčně upravenou hnrna jiných genů a integrují ji do genomu (vzniká tím jakási přirozená cdna ); tyto zpětně transkribované geny neobsahují introny, ani promotory a proto se neexprimují. Vzhledem k vysoké interindividuální variabilitě LINE jsou tyto retropozony vhodné jako markery při fingerprintingu a podobných molekulárně-genetických identifikačních metodách. 213

215 Jinou skupinu retropozonů představují SINE (short interspersed elements), sekvence DNA o délce přibližně bp. Jsou to reverzně transkribované molekuly RNA (trna, 7S rrna a některé další malé molekuly RNA), které původně vznikly jako produkt transkripce genů pro funkční RNA. Většina SINE nekóduje žádné funkční molekuly a proto jsou, pokud jde o jejich transpozici, závislé na aparátu aktivních L1. K nejrozšířenějším SINE v lidském genomu patří Alu-sekvence, o kterých se předpokládá, že vznikly reverzní transkripcí 7S rrna; Alu-sekvence obsahují specifické místo pro restriktázu AluI. U myxobakterií se vyskytují sekvence DNA označované jako retrony (msdna). Vzhledem k tomu, že sice obsahují reverzní transkriptázu, nikoli však LTR a integrázu, nejsou schopny transpozice a proto jejich zařazení mezi transpozony může být diskutabilní. TRANSPOZONY TŘÍDY II Do této třídy se řadí transpozony, které se přemísťují tzv. konzervativní transpozicí. Při ní se enzym transponáza připojuje k oběma koncům transpozonu, tvořených obrácenými repeticemi, i k sekvencím DNA cílového místa, které štěpí; uvolněný transpozon se integruje do cílového místa, v němž byla DNA naštěpena transponázou (případně některou restrikční endonukleázou); po ligaci transpozonu v cílovém místě se na základě komplementarity dosyntetizují chybějící úseky DNA za vzniku přímých repeticí. Mezi transpozony této třídy patří tzv. P - elementy u Drosophila melanogaster. Jestliže se kříží samci, v jejichž genomu jsou obsaženy P elementy, se samicemi, v jejichž genomu obsaženy nejsou (tzv. cytotyp M), dochází v zárodečné linii buněk k indukci četných mutací. P - elementy se při uvedeném křížení uplatní jako determinanty dysgeneze potomků. P - elementy jsou vhodným nástrojem přenosu genů. Do P - elementu je možné vpravit určitý gen, takto upravený P - element (vektor) injikovat do embrya v raném stadiu vývoje a po jeho včlenění do genomu embrya získat transgenního jedince. Do této skupiny transpozonů lze zařadit rovněž prokaryotické Tn - elementy. Kromě genu pro transponázu obsahují ještě strukturní geny, které kódují enzymy inaktivující antibiotika. Bakterie s Tn elementy, umístěnými v bakteriálním chromozomu nebo v plazmidech, jsou na příslušná antibiotika rezistentní. Na vysoké rychlosti šíření rezistence bakterií na antibiotika se významně podílí přenos takovýchto plazmidů mezi bakteriálními buňkami. TRANSPOZONY TŘÍDY III K transpozonům této třídy se řadí MITE (miniature inverted-repeat transposable elements). Jsou to velmi krátké repetitivní sekvence DNA v rozsahu sta až několika málo set bp, v nichž se na jednom konci řetězce DNA nachází obrácená repetice; např. u rýže má MITE následující uspořádání: 5 GGCCAGTCACAATGG nukleotidů...ccattgtgactggcc 3 3 CCGGTCAGTGTTACC nukleotidů...ggtaacactgaccgg 5 U rýže je známo několik případů, kdy inzerce MITE do určitého genu vedla ke stabilní změně jeho fenotypového projevu ve smyslu mutace. MITE jsou příliš malé útvary, než aby mohly kódovat nějaký protein. Není zatím jasné, jakým způsobem se tyto částice replikují a transponují. Nelze vyloučit replikativní formu transpozice, při které dochází k replikaci transpozonu v donorovém místě a přenosu produktu replikace do cílového místa. Nelze vyloučit ani účast jiných transpozonů na transpozici MITE. 214

216 První transpozony objevila Barbara McClintocková v r u kukuřice. Zjistila, že jsou odpovědné za jisté mutace typu adice, delece nebo translokace. Některé mutace byly nestabilní; to lze vysvětlit tak, že inzercí transpozonu do určitého genu vznikla přímá mutace a jeho pozdější excizí se obnovil původní fenotyp (zpětná mutace). Příkladem může být mutantní alela bz-m1, vzniklá vlivem transpozonu z dominantní alely Bz, která se fenotypově projevuje odlišně (hnědě) zbarvenou aleuronovou vrstvou obilky. V buňkách, ve kterých došlo k excizi transpozonu, se fenotypově projeví dominantní alela Bz. Uskutečněné excize a transpozice transpozonů v buňkách různých částí obilky se v tomto případě projeví jako odlišně zbarvené sektory obilky. Vysoká frekvence excize a transpozice některých transpozonů (autonomních) má za následek genetickou nestabilitu příslušného znaku, naopak velmi nízká frekvence excize a transpozice jiných transpozonů (neautonomních) má za následek relativně vysokou genetickou stabilitu příslušného znaku. 215

217 XIV. BIOCHEMICKÁ GENETIKA Biochemická genetika se zabývá studiem dědičnosti na úrovni různých biochemických procesů. Velmi těsně tak souvisí s molekulární genetikou; kdysi dokonce označení molekulární genetika a biochemická genetika byla některými genetiky používána jako synonyma. Biochemická genetika se tedy věnuje hlavně biochemickým aspektům genové exprese. Za otce biochemické genetiky lze považovat G. W. Beadla a E. L. Tatuma. Na základě jejich experimentů s Neurospora crassa byly formulovány tyto principy biochemické genetiky: (a) všechny biochemické pochody jsou ve všech buňkách a všech organizmech řízeny genotypem (b) veškeré metabolické procesy lze rozdělit do sérií jednoduchých spřažených (vzájemně navazujících) reakcí (c) mutace jednoho genu má za následek pouze poruchu jednoho stupně reakce, avšak podle jeho umístění v sérii spřažených reakcí může vést k rozdílným fenotypovým projevům (d) každá biochemická reakce je primárně řízena jedním genem; na základě toho byla vypracována hypotéza jeden gen jeden enzym, později upravená na hypotézu jeden gen jeden polypeptidový řetězec. Z uvedených principů je možné vyvodit závěr, že genetická variabilita, podmíněná kvalitativními i kvantitativními odlišnostmi jednotlivých genotypů, se manifestuje prostřednictvím rozdílných nebo modifikovaných biochemických reakcí reflektujících odlišnosti genotypové. Každá buňka, každý organizmus tedy disponuje unikátním souborem bílkovin syntetizovaných na základě příslušného genotypu. Biochemickou variabilitu je možné klasifikovat z různých hledisek. Jedním z nejčastěji používaných je hledisko fenotypového projevu, podle něhož se obvykle vymezují tři základní typy biochemické variability: (1) absence některých komponent: příčinou mohou být různé typy mutací nebo poruch regulace genové exprese, důsledkem může být produkce strukturně odlišného proteinu s alterovanou biologickou funkcí, produkce biologicky dysfunkčního nebo nefunkčního proteinu, produkce proteinu s novou funkcí oproti standardnímu proteinu (2) variabilita v kvantitě nebo aktivitě některých komponent: příčinou bývají obvykle poruchy regulace genové exprese (např. neschopnost operátoru spojit se s represorem, neschopnost regulátoru produkovat příslušný represor atp.), důsledkem může být kvantitativní změna v produkci standardního proteinu nebo změny v katalytické aktivitě určitých enzymů (3) molekulární polymorfizmus proteinů: z mutačních nebo regulačních změn genotypu může rezultovat jistá molekulární heterogenita projevující se konfigurační variabilitou, polymerizmem nebo alomerizmem. Genetický polymorfizmus definoval Ford (1945) jako společný výskyt dvou nebo více variant (forem) v téže době, v téže populaci a v takovém měřítku, že přítomnost nejméně zastoupené alely nemůže být udržena pouze rekurentní mutací. Příčinou polymorfizmu jsou genové mutace, které vedou k záměně jedné či více aminokyselin v polypeptidovém řetězci, chromozomální aberace a případně genomové mutace (aneuploidie, polyploidie). Polymorfizmus genetický je možno detegovat na fenotypové úrovni jako polymorfizmus proteinů projevující se např. spektrem izoenzymů určitého základního enzymu. Polymorfizmus proteinů lze poměrně snadno a s dostatečně vysokou mírou spolehlivosti detegovat elektroforeticky. 216

218 Biochemická genetika, zvláště za využití vhodných mutantů, přispívá též k objasnění některých biochemických drah, resp. jejich mutačně podmíněných změn při rozvoji patobiochemických a patofyziologických procesů. Uveďme si příklad (viz schéma na konci této kapitoly): předpokládejme, že od substrátu S k určitému produktu P, který je dále utilizován v intermediárním metabolizmu, vede biochemická dráha přes tři meziprodukty (M1, M2, M3) a je katalyzovaná enzymy E1, E2, E3, E4. Jestliže mutace postihne enzym E4 tak, že bude zcela inaktivní (resp. nebude se vůbec tvořit), bude nutné mutantnímu organizmu dodat v potřebném množství produkt P. Jestliže mutace postihne takto enzym E3, stačí dodat meziprodukt M3, z něhož mutací nepostižený enzym E4 může katalyzovat syntézu konečného produktu P. Analogicky budeme postupovat, jestliže mutací bude postižen enzym E2, nebo E1; pak bude stačit doplnit pouze meziprodukt M2, resp. M1, aby mohl být syntetizován konečný produkt P (za předpokladu, že enzymy, katalyzující dílčí biochemické reakce, jsou ve všech následujících stupních dané biochemické dráhy normálně funkční). Biochemická genetika se tak, mimo jiné, uplatňuje při objasňování příčin dědičných metabolických poruch; i z výše uvedeného jednoduchého příkladu lze pochopit, že týž fenotyp může být výsledným projevem různých příčin (konečný produkt P se nebude tvořit, jestliže nebude normálně fungovat kterýkoli z enzymů E1 až E4) a že alespoň některé formy pleiotropie mohou být projevem téže geneticky determinované příčiny. Biochemická variabilita ve struktuře a funkcích proteinů se též podílí na různé expresivitě a penetranci genů (znaků). Schéma katalýzy čtyřstupňové biochemické dráhy: a) standardní stav E1 E2 E3 E4 S M1 M2 M3 P b) absence E4 E1 E2 E3 S M1 M2 M3 P c) absence E3 E1 E2 E4 S M1 M2 M P d) absence E2 E1 E3 E4 S M1 M M P e) absence E1 S E2 E3 E4 M M M P Pozn.: Přerušovaná čára (------) značí úseky biochemické dráhy, které se mohou realizovat pouze tehdy, bude-li organizmus suplementován meziproduktem, jehož syntéza je v důsledku mutace blokována Na doplnění: - Vrozené poruchy metabolizmu. 217

219 XV. DĚDIČNOST KVANTITATIVNÍCH ZNAKŮ Termín kvantitativní znaky se v genetice používá k označení dědičných znaků, které jsou nějakým objektivním způsobem měřitelné, které jsou determinovány více geny s aditivním účinkem (tzv. geny malého účinku neboli polygeny neboli minorgeny), jejichž proměnlivost je zpravidla kontinuitní od minimální hodnoty po maximální (tj. v rozsahu celého variačního rozpětí) a na jejichž výsledném fenotypovém projevu se kromě genotypu podílí modifikujícím způsobem též zevní prostředí. Při studiu dědičnosti kvantitativních znaků se tedy vychází z polyfaktoriální hypotézy a účinku polygenů, založeném na aditivním principu. Geny malého účinku (polygeny, minor geny) jsou charakteristické tím, že účinek každého jednoho z nich na fenotypovém projevu je malý. Účinky jednotlivých genů, determinujících určitý kvantitativní znak, se však kumulují, jsou tedy aditivní. Jestliže při volné kombinovatelnosti vloh vznikne v dostatečně velkém souboru obecně 3 n různých genotypů (n = celkový počet alel), pak se vzrůstajícím počtem genů (alel) se zvyšuje počet různých genotypových kategorií a jim odpovídajících genotypových hodnot sledovaného znaku. Za předpokladu, že každý gen, podmiňující určitý kvantitativní znak, je tvořen dvěma alelami, z nichž jedna, tzv. alela neutrální (a), vede k určité základní genotypové hodnotě X tohoto znaku a jedna, tzv. alela aktivní (A), tuto základní genotypovou hodnotu zvýší o určitý přírůstek Y, bude každému genotypu příslušet právě jedna genotypová hodnota Z, kterou lze vypočítat podle vzorce Z = i X + j (X + Y), kde i = počet všech neutrálních alel v genotypu, j = počet všech aktivních alel v genotypu. Jestliže celkový počet neutrálních alel (i) a celkový počet aktivních alel (j) je n = i + j, potom můžeme řešením výrazu (A + a) n určit počet genotypových tříd v generaci F2, četnosti těchto jednotlivých tříd udané koeficienty jednotlivých členů polynomu a počet neutrálních i aktivních alel udaný exponenty u jednotlivých členů polynomu. Je zřejmé, že čím více genů (alel) se bude na determinaci daného kvantitativního znaku podílet, tím více genotypových kategorií s rozdílnou genotypovou hodnotou se bude vyskytovat v generaci F2 (obecně v populaci) a tím více se rozložení četností genotypových kategorií bude blížit normálnímu rozložení. Jestliže v rodičovské generaci bude genotyp jednoho rodiče obsahovat pouze neutrální alely a druhý rodič pouze aktivní alely, potom genotypová hodnota prvního rodiče bude minimální, druhého rodiče maximální; každý z rodičů tedy bude představitelem extrémních genotypových hodnot. Vzhledem k tomu, že jedinci generace F1 jsou uniformní hybridi, bude jejich genotypová hodnota za předpokladu aditivního působení polygenů rovna aritmetickému průměru genotypových hodnot obou rodičů. V generaci F2, vzniklé vzájemným křížením jedinců generace F1, budou zastoupeny genotypové hodnoty v rozsahu celého variačního rozpětí, tj. od minimální hodnoty (shodné s minimální hodnotou rodiče parentální generace, jehož genotyp obsahoval pouze neutrální alely), po maximální (shodnou s maximální genotypovou hodnotou rodiče parentální generace, jehož genotyp obsahoval pouze aktivní alely). Četnosti genotypů s extrémními genotypovými hodnotami (minimální a maximální) přitom budou nejnižší a obecně rovny podílu (1/2) 2m, kde m = počet genů. Četnosti genotypů s genotypovými hodnotami rovnajícími se aritmetickému průměru budou nejvyšší a současně shodné s genotypovou hodnotou jedinců generace F1. Jednotlivé generace F3 se budou svou variabilitou značně lišit v závislosti na tom, z jaké třídy (oblasti) rozložení generace F2 pocházeli jejich rodiče. Přitom příslušné průměry těchto generací F3 budou odpovídat průměrným hodnotám rodičů z generace F2 a variační rozpětí všech generací F3 nepřesáhne variační rozpětí generace F2. 218

220 Pro ilustraci uvedeme příklad. Uvažujme kvantitativní znak determinovaný třemi dialelními geny s neutrálními alelami a, b, c a aktivními alelami A, B, C, přičemž každá neutrální alela povede k základní fenotypové hodnotě X = 2 (jednotky) a každá aktivní alela tuto základní genotypovou hodnotu zvýší o jednu (jednotku), Y = 1. Potom genotypová hodnota rodiče genotypu aabbcc, obsahujícího pouze neutrální alely, bude Z P1 = 6 x 2 = 12, genotypová hodnota rodiče s genotypu AABBCC, obsahujícího pouze aktivní alely, bude Z P2 = 6 x (2 + 1) = 6 x 3 = 18. Genotyp potomků těchto rodičů (tj. jedinců generace F1) AaBbCc bude mít genotypovou hodnotu Z F1 = i X + j (X + Y) = (2 + 1) = 15, což je rovno aritmetickému průměru genotypových hodnot rodičů (Z P1 + Z P2 ) / 2 = ( ) / 2 = 15. Jednotlivé genotypové třídy a jejich četnosti v generaci F2 vypočítáme podle obecného vzorce (A + a) n ; dosazením za n = 6 dostaneme: (A + a) 6 = A 6 + 6A 5 a + 15A 4 a A 3 a A 2 a 4 + 6Aa 5 + a 6. V generaci F2 se tedy objeví celkem 7 genotypových tříd, jejichž charakteristika je uvedena v následující tabulce, v poměru 1 : 6 : 15 : 20 : 15 : 6 : 1. Po jednom dílu z celkového počtu jedinců v generaci F2, tj. (1/2) 6 = 1/64, budou představovat genotypy neobsahující žádnou aktivní alelu a genotypy obsahující pouze aktivní alely, po šesti dílech, tj. 6/64 = 3/32, genotypy s jednou aktivní alelou a s pěti aktivními alelami, po patnácti dílech, tj. 15/64, genotypy se dvěma a se čtyřmi aktivními alelami a po dvaceti dílech, tj. 20/64 = 5/8, genotypy se třemi aktivními alelami. počet neutrálních alel (i) v generaci P: F1: F2: počet aktivních alel (j) v generaci P: F1: F2: genotypová hodnota (Z) v P: F1: 15 F2: poměr genotypů v P: 1 1 F1: 1 F2: Výše uvedené výsledky (viz též předchozí tabulka) bychom získali za předpokladu, že by byl sledovaný znak determinován pouze genotypem bez jakéhokoli vlivu prostředí. Pro kvantitativní znaky je však právě vliv prostředí, tj. životních podmínek, ve kterých organizmy žijí a ve kterých se jednotlivé kvantitativní znaky realizují, nezanedbatelný a proto je nutné ho 219

221 při analýze zohlednit. Některé faktory prostředí působí na fenotypový projev stimulačně, jiné inhibičně (např. půdní podmínky rostlin, mikroklima, výživa, způsob ustájení, způsob výchovy atd.). Následkem toho není fenotypový projev (fenotypová hodnota) daného kvantitativního znaku jedinců téhož genotypu zcela uniformní, ale vykazuje určitou variabilitu (a to i u jednovaječných dvojčat). Přestože se při experimentální práci snažíme vytvořit a zachovat konstantní podmínky, určitý podíl variability fenotypového projevu znaku bude zachován. Fenotyp jakéhokoli kvantitativního znaku je výslednicí spolupůsobení genotypu a prostředí, ve kterém se nositel konkrétního genotypu vyvíjí. V průběhu celého života jedince se genotyp nemění (pomineme-li mutační proces), kdežto prostředí, respektive jeho jednotlivé složky, se mění prakticky permanentně. Z hlediska genetiky a vývojové biologie sehrává prostředí dvojjedinou roli. Žádný hmotný objekt neexistuje mimo prostor a čas. V kontextu s naší problematikou to znamená, že faktory prostředí napomáhají (stimulují) nebo naopak brání (inhibují) realizaci určitého dědičného základu; hovoříme o tzv. realizačních činitelích. Genotyp může na změny prostředí reagovat v mezích tzv. reakční normy; ta je pro každý genotyp specifická a její hranice jsou nepřesažitelné. Modifikační vliv prostředí se může uplatnit pozitivně nebo negativně pouze v rámci této normy a tak participovat na velikosti fenotypové hodnoty genotypu. Fenotypovou hodnotu znaku (P) lze tedy rozdělit na dvě složky: dědičnou a nedědičnou; dědičnou složku představuje genotypová hodnota (G), nedědičnou složku představuje účinnost environmentu (E). V důsledku spolupůsobení genotypu a prostředí při utváření fenotypu nelze odlišit nějaké ostře vymezené fenotypové kategorie. Proto při studiu dědičnosti kvantitativních znaků nemohou být využity štěpné poměry a na nich založené metody genetické analýzy, vhodné při studiu dědičnosti kvalitativních znaků, ale musejí být použity speciální metody matematické statistiky. Při sledování dědičnosti kvantitativních znaků je třeba především postihnout šíři variability v jednotlivých generacích. Při analýze kvantitativních znaků a při rozhodování o tom, zda konkrétní znak patří mezi znaky kvantitativní či nikoli, je třeba mít k dispozici údaje alespoň ze tří generací (F1, F2, F3, resp. B1, B2). Počet genů, podmiňujících projev určitého kvantitativního znaku, lze odhadnout pouze přibližně, zpravidla na základě simplifikovaného předpokladu rovnoměrného aditivního účinku jednotlivých genů, protože účinek jednotlivého genu není při tomto způsobu dědičnosti měřitelný. Představu o účinku jednotlivého polygenu je možné vyvodit nepřímo na základě jeho průměrného účinku v populaci v řadě následujících generací. Základní statistickou metodou, využitelnou při studiu dědičnosti kvantitativních znaků, je analýza rozptylu. Měřítkem variability je zde variance (neboli rozptyl), která je definovaná jako suma čtverců odchylek (jednotlivých měření, pozorování apod.) od průměru dělená počtem stupňů volnosti: σ 2 = Σ( x i x ) / N x i = i-tá hodnota znaku, x = průměrná hodnota znaku, N = počet stupňů volnosti Mezi další základní parametry a veličiny analýzy rozptylu patří: a) variační rozpětí: je to rozmezí všech hodnot znaku od hodnoty minimální (x min ) po hodnotu maximální (x max ): R = x max - x min b) aritmetický průměr (x ): je to podíl součtu všech hodnot znaku a součtu všech prvků (n), u kterých byla hodnota znaku stanovena x = Σx /n c) směrodatná odchylka: je to druhá odmocnina z variance (rozptylu): σ = σ 2 d) střední chyba průměru: je to vlastně směrodatná odchylka průměru : σ x = σ / n 220

222 Pozn.: Při statistickém zpracování expertimentálních dat, získaných na reálných souborech (výběrech), se provádí pouze odhad jednotlivých statistických veličin. K označení odhadnuté hodnoty směrodatné odchylky se proto většinou místo symbolu σ používá symbol s a k označení odhadnuté variance symbol s 2 nebo V. Významnou vlastností rozptylu (variance) je aditivita. Celkovou varianci lze rozložit na jednotlivé složky a sumací těchto dílčích variancí získat znovu varianci celkovou. Tento rozklad celkové variance (rozptylu) je podstatou metody označované jako analýza rozptylu. Aditivitu variance aplikujeme na rozložení pozorované fenotypové variability (V P ) na tzv. příčinné složky variability kvantitativního znaku, tj. na variabilitu podmíněnou dědičnou komponentou (V G ) a na variabilitu podmíněnou environmentem (V E ): V P = V G + V E Na dědičné variabilitě se podílí složka aditivní (V A ), vyplývající z aditivního vztahu mezi polygeny, složka dominantní (V D ), vznikající na základě vztahu dominance a recesivity mezi alelami v rámci jednotlivých genů, a složka nealelických interakcí (V I ), vznikající v důsledku interakcí mezi jednotlivými polygeny. Lze tedy psát: V G = V A + V D + V I Aditivita se chápe jako suma účinků jednotlivých neutrálních a aktivních alel. K ověření její přítomnosti u polygenně založeného znaku můžeme použít následující vztahy: F1 = (P1 + P2 ) / 2 F2 = (P1 + P2 + 2 F1 ) / 4 B1 = (P1 + F1 ) / 2 B2 = (P2 + F1 ) / 2 P1, P2 = průměrné genotypové hodnoty rodičů; F1, F2 = průměrné genotypové hodnoty generace F1, resp. F2; B1, B2 = průměrné genotypové hodnoty zpětného kříření B1, resp. B2. Po úpravě těchto výrazů dostaneme vztah: 4 F2-2 F1 - P1 - P2 = 2 B1 - P1 - F1 = 2 B2 - P2 - F1 = 0, který platí v případě aditivního účinku polygenů. Dominance se při analýze kvantitativních znaků nestanovuje v jednodnotlivých genech polygenního systému jako projev určité alely, protože v těchto případech účinky jednotlivých genů nelze měřit. Hodnotí se tedy průměrná dominance celého systému. Postup stanovení této dominance si ozřejmíme na jednoduchém modelu. Předpokládejme, že se dva homozygotní genotypy (AA, aa) liší genotypovými hodnotami. Nižší hodnotě recesivního homozygota aa přiřadíme číslo 1, vyšší hodnotě dominantního homozygota přiřadíme číslo +1. Aritmetickému průměru genotypových hodnot mezi oběma homozygoty přiřadíme číslo 0. Genotypové hodnotě heterozygota, který je potomkem těchto dvou homozygotních rodičů pak budou přiřazena čísla: +1 v případě úplné dominance, 0 v případě nepřítomnosti dominance, >1 v případě superdominance, nebo některé z čísel z otevřeného intervalu (-1; 1) kromě čísla 0 v případě neúplné dominance. Tento model lze aplikovat i na nalší generace 221

223 (F2, F3,...) a rozšířit na polygenní systém s více než dvěma geny. Protože se při autogamii v každé následující generaci četnost heterozygotů sníží na polovinu, sníží se stejně i jejich průměrná genotypová hodnota (h). Z toho vyplývá, že h F2 = h F1 /2, h F3 = h F1 /4 atd. Genové interakce jsou v případě kvantitativních znaků interakcemi určitých skupin polygenů (dvojic, trojic,...). Uvažujeme-li pouze dvojici takových interagujících genů, potom se mohou vyskytnou tři typy interakcí. Typ označovaný A x A je formou epistáze mezi dvěma homozygotními lokusy s aditivními účinky. Typ označovaný D x D představuje interakci dvou heterozygotních lokusů s dominantními účinky. Třetí typ, označovaný A x D, lze též chápat jako formu epistáze mezi dvěma lokusy, z nichž jeden je homozygotní a druhý heterozygotní, přičemž v interakci jsou účinky dominantní i aditivní. Variabilitu způsobenou interakcemi dvojice genů můžeme rozložit na tyto složky: V I = V AA + V DD + V AD Je zřejmé, že při interakcích větších skupin genů než dvojic bude spektrum všech možných typů interakcí bohatší a složitější. Přesně zjistit a vyhodnotit genetickou složku variability podmíněnou interakcemi nealelních genů v polygenním systému je značně obtížné a vyžaduje použití speciálních postupů. Obecně však platí, že genotypovou i fenotypovou variabilitu kvantitativních znaků nejvíce ovlivňují především interakce dvougenové (tj. interakce dvojice genů). Účinek tří-, čtyř- a vícegenových interakcí je již výrazně menší a proto bývá při genetické analýze kvantitativních znaků zanedbáván. Ke genetické složce, participující na fenotypové variabilitě kvantitativních znaků, je třeba ještě dodat, že v některých případech je místo aditivního účinku polygenů zjišťován účinek multiplikativní. To znamená, že účinky jednotlivých genů se mezi sebou nesčítají, ale násobí. Genotypová hodnota jedinců generace F1 potom není rovna aritmetickému průměru genotypových hodnot rodičů, ale průměru geometrickému: F1 = P1 P2. Dostatečně spolehlivou informaci o podílu prostředí na fenotypové variabilitě lze získat komparací rozsahu proměnlivosti, projevující se v souboru geneticky homogenním (P1, P2, F1) a geneticky nehomogenním. Teoreticky se ve zcela homogenních souborech geneticky podmíněná složka variability neuplatňuje a proto je možné veškerou variabilitu považovat za variabilitu nedědičnou, podmíněnou prostředím. Z tohoto důvodu se považuje variabilita zjištěná v geneticky homogenním souboru za míru variability, jíž se poměřuje variabilita v geneticky nehomogenním souboru. Komparací variability v obou souborech se tak dosáhne odlišení dědičné složky variability (V G ) od variability podmíněné prostředím (V E ). Nedědičnou složku variability (V E ) lze dále rozdělit na variabilitu podmíněnou trvale působícími vlivy prostředí (V Ep nebo V Eg ) a na variabilitu podmíněnou dočasně působícími vlivy prostředí (V Et nebo V Es ). Můžeme tedy psát: V E = V Ep + V Et Variabilita, podmíněná trvale působícími vlivy prostředí, je společná všem členům souboru (populace) a projevuje se především jako variabilita mezi členy souboru. Jako příklad trvale působících vlivů můžeme uvést způsob ustájení skotu, koncentraci hospodářských zvířat ve velkochovech, fyzikálně-chemické vlastnosti půdy, výživové schéma apod. Variabilita podmíněná dočasně působícími vlivy prostředí se týká pouze určité části souboru (populace) a projevuje se zejména jako variabilita uvnitř jedince nebo jako variabilita uvnitř dílčí skupiny daného souboru. Příkladem dočasně působících vlivů prostředí mohou být podmínky intrauterinního vývoje u multiparních druhů zvířat. Kromě základních složek fenotypové variability, tj. variability podmíněné dědičností (V G ) a variability podmíněné prostředím (V E ), je třeba zohlednit ještě interakci genotypu a 222

224 prostředí (V EG ). V této interakci se odráží vzájemné působení dědičného založení a životních podmínek jedince, což se projevuje tím, že různé genotypy v různých prostředích nebo při změnách prostředí reagují různě. Tím se v časovém sledu mohou měnit vztahy mezi jednotlivými genotypy. Krajní hodnoty znaku tak mohou být vázány jen na určitou kombinaci genotypu a faktorů prostředí. Jako příklad lze uvést geneticky determinované projevy zvýšené agresivity a kanibalizmu hospodářsky významných zvířat ve vysoce koncentrovaných chovech. Interakce genotypu a prostředí znamená, že diference mezi průměrnými hodnotami určitého znaku ve dvou či více rozdílných prostředích není pro všechny genotypy táž. Ze statistických metod je možné k průkazu interakce aplikovat analýzu rozptylu nebo korelační analýzu. Při použití druhé metody se týž kvantitativní znak ve dvou prostředích chápe jako dva samostatné znaky, mezi nimiž se stanovuje korelace. Na základě hodnoty této korelace a hodnoty koeficientu dědivosti daného znaku v obou prostředích lze posoudit, zda existuje interakce mezi genotypem a prostředím. Interakci genotypu a prostředí nelze zaměňovat za korelaci genotypů a prostředí (cov GE ), při níž různé genotypy reagují na změnu prostředí podobně. Při korelacích se nemění vztahy mezi genotypy, mění se pouze hodnoty (absolutní) příslušného kvantitativního znaku. Poté, co jsme rozčlenili fenotypovou variabilitu na jednotlivé dílčí složky, můžeme psát: V P = V G + V E = V A + V D + V I + V Ep + V Et + V EG + 2cov GE Analogicky lze rozdělit varianci fenotypovou (σ P 2 ) na varianci genotypovou (σ G 2 ) a na varianci prostředí (σ E 2 ): σ P 2 = σ G 2 + σ E 2 Každou z těchto složek variance můžeme rozložit na další dílčí složky: genotypovou varianci na varianci podmíněnou aditivním působením genů (σ A 2 ), dominancí (σ D 2 ) a interakcí (σ I 2 ), varianci prostředí na varianci trvale působících faktorů (σ Ep 2 ) a dočasně působících faktorů (σ Et 2 ). Nečlení se dále variance interakce genotypu a prostředí (σ GE 2 ). Platí tedy: σ P 2 = σ A 2 + σ D 2 + σ I 2 + σ Ep 2 + σ Et 2 + σ GE cov GE Veličinou zásadního významu charakterizující kvantitativní znaky je dědivost (heritabilita), vyjádřená koeficientem dědivosti (heritability) h 2. Dědivost je definována v širším smyslu jako podíl dědičně podmíněné složky variability na celkové fenotypové variabilitě znaku. Koeficient dědivosti se pak stanoví jako podíl variance genotypové a variance fenotypové: h 2 = σ G 2 / σ P 2 V užším slova smyslu se dědivost chápe jako podíl aditivní složky dědičně podmíněné variability na celkové fenotypové variabilitě. Vzorec pro výpočet koeficientu dědivosti má pak tvar: h 2 = σ A 2 /σ P 2 h 2 0;1 223

225 Podle hodnoty koeficientu dědivosti se kvantitativní znaky obvykle rozdělují na znaky s nízkou dědivostí (h 2 0,3), střední dědivostí (h 2 0,3 0,5) a vysokou dědivostí (h 2 0,5). Mezi znaky s nízkou dědivostí patří např. opakování říje, počet narozených selat, produkce mléka u dojnic. Mezi znaky se střední dědivostí lze uvést např. průměrný denní přírůstek u prasat, spotřebu krmiva na jednotku hmotnosti přírůstku. Ke znakům s vysokou dědivostí patří řada tělesných měr zvířat i člověka. Znaky s vyšším koeficientem dědivosti jsou výhodnější z hlediska šlechtitelského, protože umožňují dosahovat snáze stanoveného šlechtitelského cíle. Naopak znaky s nízkým koeficientem dědivosti jsou relativně snadno ovlivnitelné úpravou podmínek prostředí (např. změnou výživy, ustájení, agrotechnikých postupů apod.). Jestliže je koeficient dědivosti h 2 = 1, znamená to, že znak je zcela determinován genetickou složkou a vliv prostředí se vůbec neuplatňuje. Taková situace je charakteristická pro znaky kvalitativní, nikoli kvantitativní. Jeli h 2 = 0, jedná se o nedědičný znak, který je podmíněn pouze vlivy prostředí a realizovaný v organizmu jinými než geneticky determinovanými procesy. Protože se koeficient dědivosti stanovuje na základě příslušné genetické analýzy populace a za využití statistických (biometrických) metod vyhodnocení získaných údajů, je veličinou vztahující se k dané konkrétní populaci a proto jeho hodnota pro určitý kvantitativní znak může kolísat v závislosti na původu, složení a životních podmínkách populace, reprezentativnosti a rozsahu hodnoceného souboru, použité pracovní metodě a případně dalších faktorech. Metody výpočtu koeficientu dědivosti jsou založeny na předpokladu, že vzájemná podobnost kvantitativních znaků mezi příbuznými jedinci je v průměru vyšší než mezi jedinci nepříbuznými. Při výpočtu se nejčastěji používají údaje, získané regresní a korelační analýzou vztahů mezi blízkými příbuznými (rodiče a jejich potomci, vlastní sourozenci, polosourozenci) nebo analýzou rozptylu. Při regresní a korelační analýze se zjišťuje, jaký existuje vztah mezi dvěma proměnnými (znaky) a jaká je těsnost (síla) tohoto vztahu. Vztah závisle proměnné y (znaku y) na nezávisle proměnné x (znaku x) vyjadřují regresní (b) a korelační (r) koeficienty. Regresní koeficient udává, oč se v průměru změní závisle proměnná y, jestliže se nezávisle proměnná x změní o jednu jednotku a naopak. Regresní koeficient b yx pak značí regresi znaku y na znak x, regresní koeficient b xy regresi znaku x na znak y. Regresní koeficient může nabývat kladných i záporných hodnot. Např. je-li b yx = 3, znamená to, že změnou (vzrůstem) znaku x o jednu jednotku se znak y změní (vzroste) o 3 jednotky; je-li b xy = - 4, znamená to, že změnou (vzrůstem) znaku y o jednu jednotku se změní (poklesne) znak x o 4 jednotky. Korelační koeficient nabývá hodnot od 1 do +1. Jestliže se hodnota korelačního koeficientu blíží -1, znamená to, že s rostoucí hodnotou jednoho znaku se výrazně snižuje hodnota druhého znaku (nepřímá úměra); jestliže se naopak blíží +1, znamená to, že s rostoucí hodnotou jednoho znaku velmi silně roste i hodnota druhého znaku (přímá úměra). Protože korelační koeficient postihuje pouze lineární průběh závislosti dvou znaků, potom jeho hodnota blízká 0 nevylučuje existenci nelineární závislosti mezi posuzovanými znaky, ale pouze neprokazuje závislost lineární. Z hlediska genetického rozlišujeme korelace fenotypové a genotypové. Fenotypové korelace samy o sobě mají nízkou vypovídací hodnotu, protože v nich nejsou rozlišeny příčiny korelace (genetické, environmentální). Genotypová korelace je často projevem vazby genů nebo pleiotropního účinku. Její znalost je proto užitečná zejména pro predikci změn, které při selekci jednoho znaku nastanou v dalších znacích. Korelační a regresní koeficienty jsou tím přesnější, z čím většího počtu měření byly odvozeny. Proto je třeba k jejich stanovení provádět měření na reprezentativním a dostatečně velkém souboru. Níže je uvedeno několik základních vzorců pro výpočet regresních a korelačních koeficientů a tabulka, v níž 224

226 jsou uvedeny převodní vztahy mezi těmito koeficienty a koeficientem dědivosti pro různé typy příbuznosti. Regresní a korelační koeficienty b yx = σ(x,y) / σ 2 (x) b yx = r σ(x) / σ(y) r = σ (x,y) / σ(x) σ(y) r 2 = b yx b xy r = b yx b xy b xy = σ(x,y) /σ 2 (y) b xy = r σ (y) / σ(x) σ(x,y) = (1/n-1)(Σxy Σx Σy/n) σ(x) = (1/n-1) (Σx 2 - x Σx) σ(y) = (1/n-1) (Σy 2 - y Σy) x, y = jednotlivé hodnoty sledovaných znaků; x, y = průměrné hodnoty sledovaných znaků; n = počet jedinců (velikost souboru) Koeficienty dědivosti: příbuzenský vztah regr. a korel. koeficient vztah koef. k h 2 dědivosti potomek rodič b OP = 1/2 h 2 2 b OP potomek průměr rodičů b OP = h 2 b OP polosourozenci r HS = 1/4 h 2 4 r HS vlastní sourozenci r FS > 1/2 h 2 z r FS 225

227 XVI. GENETIKA POPULACÍ Předmětem genetiky populací je studium statiky a dynamiky populací z hlediska jejich genetické struktury. Genetika populací se tedy zabývá zákonitostmi dědičnosti a proměnlivosti na úrovni populací. Termín populace bývá různě definován v jednotlivých vědách i v jednotlivých biologických disciplínách. Pro účely genetiky můžeme vymezit pojem populace jako společenství jedinců určitého biologického druhu, kteří se podílejí na společném genovém fondu. Genový fond (genofond) je soubor genů příslušný dané populaci a odlišující ji od jiné populace s vlastním jiným genovým fondem. V tzv. mendelovské populaci, která je složena ze vzájemně příbuzných jedinců, je produkováno v každé generaci určité množství gamet, z nichž se však v následující generaci uplatní při tvorbě zygot jen část. Protože pouze tato část gamet se podílí na genetické struktuře takové populace, je přesnější definovat genový fond populace jako soubor všech genů v gametách, které splynou v zygoty další generace. Populace je možné klasifikovat na základě různých kritérií. Podle způsobu oplození rozlišujeme populace autogamní (samosprášení u rostlin) a alogamní (cizosprášení, volné páření). Mezním případem alogamní populace je populace panmiktická. V rámci gametového fondu panmiktické populace platí stejná pravděpodobnost spojení kterékoli gamety jednoho pohlaví s kteroukoli gametou druhého pohlaví. V přírodních populacích se úplně autogamní a panmiktické populace vyskytují omezeně. Mezi oběma těmito krajními typy existuje celá řada přechodů. Mimo jiné k nim patří populace druhů s asortativním pářením (např. druhy živočichů žijících v hierarchicky uspořádaných skupinách), s pravidelnými systémy inbrídinku (např. některé parazitické druhy hmyzu kladou vajíčka do hostitele a vylíhlí potomci se pak páří mezi sebou systémem bratr x sestra) a se střídáním pohlavní a nepohlavní generace (např. mšice). Podle velikosti se populace klasifikují na velké, středně velké a malé. Protože genofond populace zůstává za stabilních životních podmínek z generace na generaci víceméně konstantní, znamená to, že každá generace vzniká pouze ze vzorku gamet generace předchozí, nikoli z celého jejího genového fondu. Genový fond tvoří jen vzorek genů dospělých jedinců; proto se velikost populace neměří počtem jejích členů, ale reprezentativností vzorku jejich genů, který se stává genovým fondem populace. Vzorek je reprezentativní tehdy, když variabilita volby, tj. variabilita způsobená výběrem vzorku z populace, je rovna nule nebo limituje k nule a lze ji zanedbat; teoreticky nabývá nulové hodnoty při počtu členů populace n =. Předpoklady pro zanedbatelnou hodnotu variability volby je možné očekávat pouze ve velké populaci, tvořené větším počtem členů. V příliš velkých populacích, zejména osidlujících rozsáhlý areál, však dochází k rozdělování původně jednotné populace na menší subpopulace (démy); genový fond v těchto jednotlivých subpopulacích nelze považovat za reprezentativní vzorek, protože při vytváření genového fondu se v malých populacích zvyšuje variabilita volby nad přijatelnou mez. Většina přírodních populací je středně velkých, v nichž se může, ale nemusí, variabilita volby významně uplatňovat. Je třeba rovněž počítat se situacemi, kdy velikost populace není z generace na generaci stejně velká (kalamity, výskyt škůdců, střídání ročních období, ekologické fluktuace a oscilace, osidlování ekologické niky, sukcese apod.). Velikost je tedy důležitým kritériem populace. Tzv. efektivní velikost populace je dána počtem jedinců schopných rozmnožování a přispívajících do společného genového fondu. Členové populace, kteří byli z populace eliminováni (uhynuli) před dosažením věku, ve kterém jsou schopni se reprodukovat, anebo jsou sterilní, nemohou ovlivnit velikost 226

228 populace v další generaci. V tomto ohledu má nejen teoretický, ale i praktický význam znalost podílu genetické smrti a genetické zátěže populace a exaktní vyjádření reprodukční zdatnosti (fitness). Základním časovým měřítkem v genetice populací je generační doba (generační interval), tj. časové období měřené od narození předků (rodičů) do narození potomků. Průměrná generačí doba činí např. u člověka asi 25 let, u skotu 5 let, u drůbeže 1 rok, u octomilky 2 týdny. XVI.1 POPULACE PANMIKTICKÁ Každý genotyp je souborem určitých genů, každá populace je souborem určitého počtu genotypů; proto existuje možnost číselně vyjádřit genové a genotypové složení populace ve formě genových a genotypových četností (frekvencí). Genové a genotypové četnosti jsou základními veličinami v genetice populací, jejichž prostřednictvím je možné studovat genový fond populace a popisovat změny její genetické struktury. Genová četnost je definována jako podíl určité alely příslušného genu v populaci. Obdobně je definována genotypová četnost jako podíl určitého genotypu v populaci. Genová i genotypová četnost jsou veličiny relativní a mohou nabývat hodnot v rozmezí 0;1. XVI.1.1 HARDY WEINBERGOVA ROVNOVÁHA V genetice populací jsou objektem zájmu četnosti alel, resp. genotypů, a proto se nerozlišuje dominance nebo recesivita alel označením velkými nebo malými písmeny; jednotlivé alely se označují exponentem. Uvažujme jeden dvoualelový gen s dominantní alelou A 1 a recesivní alelou A 2. Četnost alely A 1 označíme symbolem p, četnost alely A 2 symbolem q. Kombinací těchto dvou alel mohou vzniknout tři genotypy: A 1 A 1, A 1 A 2, A 2 A 2. Četnost genotypu A 1 A 1 označíme symbolem P, genotypu A 1 A 2 symbolem H a genotypu A 2 A 2 symbolem Q. Jestliže daný gen sestává pouze ze dvou alel, potom součet jejich četností bude roven jedné, tedy p + q = 1. Obdobně musí být součet genotypových četností uvedených genotypů (tj. dominantních homozygotů, heterozygotů a recesivních homozygotů) roven jedné, tedy: P + H + Q = 1. Vztah mezi genovými a genotypovými četnostmi budeme sledovat v následující tabulce na dvoualelovém genu lokalizovaném na autozomu: gameta s alelou četnost alely A 1 p genotypová četnost A 2 q genotypová četnost A 1 p A 1 A 1 p 2 P A 1 A 2 pq ½H A 2 q A 1 A 2 pq ½H A 2 A 2 q 2 Q Z této tabulky vyplývá, že genotypové četnosti můžeme zapsat ve tvaru p 2 + 2pq + q 2 = 1 nebo ve tvaru P + H + Q = 1. Z těchto výrazů lze odvodit četnost p alely A 1 a četnost q alely A 2 : p = p 2 + pq = P + 1/2H a q = q 2 + pq = Q + 1/2H. Jestliže platí: p = q = 0,5, potom p 2 = q 2 = 0,25 a 2pq = 0,5. Poměr p 2 : 2pq : q 2 = P : H : Q = 1 : 2 : 1. Panmiktická populace, ve které platí uvedené vztahy, odvozené Hardy a Weinbergem, se nachází v Hardy-Weinbergově rovnováze. 227

229 Sledujme genové a genotypové četnosti v další generaci, která vznikne vzájemným křížením jedinců předchozí generace: p 2 q 2 křížení četnost genotypová četnost potomků A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 A 1 A 1 x A 1 A 1 A 1 A 1 x 2 A 1 A 2 A 1 A 1 x A 2 A 2 2 A 1 A 2 x 2 A 1 A 2 p 4 4p 3 q 2p 2 q 2 4p 2 q 2 p 4 2p 3 q p 2 q 2 2p 3 q 2p 2 q 2 2p 2 q 2 2 A 1 A 2 x A 2 A 2 A 2 A 2 x A 2 A 2 4pq 3 q 4 2pq 3 2pq 3 q 4 Celkem p 4 +2p 3 q+p 2 q 2 +2p 3 q+4p 2 q 2 +p 2 q 2 +2pq 3 +q 4 Četnosti jednotlivých genotypových tříd v této generaci budou: A 1 A 1 : p 4 + 2p 3 q + p 2 q 2 = p 2 (p 2 + 2pq + q 2 ) = p 2 (p + q) 2 = p 2 A 1 A 2 :2p 3 q + 4p 2 q 2 +2pq 3 = 2pq(p 2 + 2pq + q 2 ) = 2pq(p + q) 2 = 2pq A 2 A 2 : p 2 q 2 + 2pq 3 + q 4 = q 2 (p 2 + 2pq + q 2 ) = q 2 (p + q) 2 = q 2 p 2 + 2pq + q 2 Genotypové, ani genové četnosti se nezměnily. Kdybychom provedli obdobné analýzy potomstva v dalších generacích, zjistili bychom, že genotypové i genové četnosti budou stále stejné. Můžeme tedy konstatovat, že za rovnovážného stavu ve velké panmiktické populaci se genové ani genotypové četnosti z generace na generaci nemění. Jinými slovy: složení genového fondu velké panmiktické populace nepodlehne z generace na generaci žádné změně. Pokud bychom studovali genové a genotypové četnosti autozomového lokusu s více alelami, pak bychom vždy uvažovali jednu alelu samostatně a zbývající jako celek. Situace v případě autozomového lokusu se třemi alelami je uvedena v následující tabulce: A 2 A 2 A 1 A 2 Genotyp A 1 A 1 A 3 A 3 A 1 A 3 A 2 A 3 Fenotyp I II III IV Genotypové četnosti p 2 + 2pr q 2 + 2qr 2pq r 2 p + q + r = 1 p 2 + 2pr + q 2 + 2qr + 2pq + r 2 = 1 Pro více autozomálních lokusů platí: existuje-li rovnováha pro jeden lokus, existuje pro kterýkoli jiný, uvažuje-li se každý lokus zvlášť. Mějme dva dvoualelové autozomální geny s alelami A 1, A 2, B 1, B 2 ; četnost gamet genotypu A 1 B 1 označme r, četnost gamet genotypu A 1 B 2 označme s, četnost gamet genotypu A 2 B 1 označmě t a četnost gamet genotypu A 2 B 2 označme u. Populace je pro dva lokusy v rovnováze, jestliže je součin r u = s t. Měřítkem nerovnováhy v populaci je rozdíl d = s t r u. Rychlost, jakou se bude populace přibližovat rovnováze, závisí pouze na velikosti diference gametových četností ve fázi cis a trans. Ve sledu generací se rozdíl bude zmenšovat o 0,5d 0,75d 0,875d 0,9375d atd. Populace pro dva volně kombinovatelné geny dospěje do rovnovážného stavu prakticky za 4-5 generací (viz tabulka, sloupec p = 50%). 228

230 V případě vazby genů je situace v zásadě stejná, jako u dvou autozomálních volně kombinovatelných genů, pouze s tím rozdílem, že spění do rovnovážného stavu bude pomalejší, neboť změna genotypových četností je závislá i na síle vazby. Čím je vazba silnější, tím pomalejší je spění k rovnováze; z generace na generaci to je podíl odpovídající procentu rekombinace (p). Při stanovení podílu d v každé následující generaci je třeba z doplňku podílu d v předcházející generaci vypočítat část odpovídající rekombinaci a přičíst ji k podílu d v předcházející generaci (viz tabulka): Generace připočtený (odečtený) podíl d při p (%): ,5d 0,3d 0,2d 0,1d 2 0,75d 0,51d 0,36d 0,19d 3 0,875d 0,657d 0,488d 0,271d 4 0,9375d 0,7599d 0,5900d 0,3431d 5 0,96875d 0,8322d 0,71231d 0,40951d n (rovnováha) d d d d Pozn.: Připomeňme si, že při p = 50% (0,5) se jedná o volnou kombinovatelnost genů. V případě, že se jedná o lokus s úplnou vazbou na pohlaví, je třeba si uvědomit, že genotypové četnosti p 2, 2pq a q 2 se vyskytují pouze u homogametického pohlaví. U pohlaví heterogametického se z důvodu hemizygotního stavu může vyskytovat pouze jedna z obou alel, tedy alela A 1 s četností p, nebo alela A 2 s četností q. V rovnovážném stavu musí být četnost alely A 1 u samic (p f ) rovna četnosti alely A 1 u samců (p m ) a stejně tak četnost alely A 2 u samic (q f ) musí být rovna četnosti alely A 2 u samců (q m ): p f = p m, q f = q m. Rovnovážné hodnoty genových četností jsou váženým průměrem u obou pohlaví. Protože jedinci homogametického pohlaví nesou 2/3 alel (mají dva chromozomy X), kdežto jedinci heterogametického pohlaví nesou 1/3 alel (mají pouze jeden chromozom X), potom za rovnovážného stavu v populacích s chromozomovým určením pohlaví typu Drosophila platí: p = 2/3p f + 1/3p m q = 2/3q f + 1/3q m U typu Drosophila dědí alely genu vázaného na chromozom X matky potomci samčího pohlaví a proto platí: q matek = q synů. Samice dědí tyto alely od obou rodičů stejným dílem a proto platí: q dcer = 1/2(q matek + q otců ). Populace, která není v rovnováze pro lokus s úplnou vazbou na pohlaví, pospěje do rovnovážného stavu po několik generací, přičemž se rozdíl genových četností mezi oběma pohlavími v každé generaci sníží na polovinu: q dcer q synů = 1/2 (q matek q otců ) = - 1/2(q matek q otců ) Četnost jednotlivých genotypů v panmiktické populaci závisí na četnosti příslušných alel. Lze tedy konstatovat, že genotypové četnosti jsou funkcí a genových četností. Tyto vztahy, odvozené z Hardy-Weinbergovy rovnováhy, jsou znázorněny na následujícím obrázku pro jeden dvoualelový lokus: 229

231 Obr.: Genotypové četnosti jako funkce genových četností. Zdroj: 230

232 XVI.1.2 SYSTEMATICKÉ PROCESY RUŠÍCÍ HARDY WEINBERGOVU ROVNOVÁHU Každá reálná populace je vystavena vlivům, které mohou narušit rovnovážný stav a přivodit změnu její genetické struktury. Procesy, které vedou k predikovatelným změnám v rozsahu i směru genového složení populace se označují jako procesy systematické a lze je pojímat jako procesy deterministické. Patří k nim migrace, mutace a selekce. Druhou skupinu představují procesy disperzivní, které směřují k rozdělení velké populace na populace menší. V malých populacích se významně uplatňuje variabilita volby. Při působení disperzivních procesů, které jsou procesy stochastickými, tedy můžeme predikovat pouze rozsah změn v genovém složení populace, nikoli směr. Prostřednictvím změn v genových a genotypových četnostech umožňují systematické i disperzivní procesy časoprostorový vývoj populací. XVI MIGRACE Migrace je proces, při kterém dochází k výměně alel mezi dvěma populacemi. Je to proces obousměrný, sestávající z emigrace a imigrace. Populace, z níž emigruje určitý podíl alel, se označuje jako populace donorová, populace, do níž tento podíl alel imigruje, se označuje jako populace recipientní. Předpokládejme, že do recipientní populace imigruje určitý podíl m alel A 2. Tím se původní četnost této alely q 0 v recipientní populaci zvýší. V donorové populaci se původní četnost q m uvažované alely o tento podíl sníží a proto bude rovna 1 m. Celková četnost q 1 alely A 2 po uskutečněné imigraci bude rovna: q 1 = m q m + (1 m) q 0 = m (q m q 0 ) + q 0 Změna četnosti alely A 2 po jedné generaci imigrace do recipientní populace bude: q = q 1 q 0 = m (q m q 0 ) Z tohoto vztahu vyplývá, že velikost změny genové četnosti, způsobená migrací, závisí na rychlosti migrace (tj. na hodnotě m) a na rozdílu genových četností mezi populací donorovou a recipientní. Za předpokladu konstatní rychlosti migrace m bude populace směřovat k rovnovážnému stavu, ve kterém bude q m = q 0. Průběh změn genových četností alely A 2 v jednotlivých generacích lze vyjádřit rovnicí: (1 m) t = (q t q m ) / (q 0 q m ) t = počet generací, q t = četnost alely A 2 v t-té generaci Rovnováha genových četností této alely mezi donorovou a recipientní populací nastane, jakmile q t = q m. XVI MUTACE Mutace jsou dalším systematickým procesem, který může vést ke změně genetické struktury populace. Takto se mohou uplatnit ovšem pouze rekurentní mutace, to jest mutace, které vznikají opakovaně v každé generaci a jejichž četnost je tak velká, že nemohou být z populace vyloučeny. To znamená, že musejí vznikat s pravděpodobností vyšší, než je hodnota variance volby, která ani ve velké panmiktické populaci není nulová. 231

233 Předpokládejme, že dominantní alela A 1 se rekurentní mutací změní v recesivní alelu A 2 a mutační rychlost této přímé mutace označme u. Jestliže p 0 je původní četnost alely A 1, tj. před mutací, potom četnost mutujících alel A 1 bude rovna součinu up 0 a nová četnost alely A 1 po jedné generaci bude p 0 up 0. Dále předpokládejme, že část recesivních alel A 2 zpětně mutuje na dominantní alelu A 1 mutační rychlostí v. Jestliže q 0 je původní četnost alely A 2, potom četnost mutujících alel A 2 bude rovna součinu vq 0 a četnost alely A 2 po jedné generaci bude q 0 vq 0. Změna četnosti alely A 2 v důsledku mutačního procesu bude rovna q = u p 0 v q 0 Z tohoto vztahu vyplývá, že velikost změny genových četností v důsledku mutace závisí na původních genových četnostech a na mutačních rychlostech přímých i zpětných mutací. Za rovnovážného stavu musí být změna genových četností způsobená mutačním procesem nulová ( q = 0 ), tedy rychlost vzniku přímých mutací musí být rovna rychlosti vzniku zpětných mutací (up 0 = vq 0 ). Rovnovážnou četnost q r alely A 2 snadno odvodíme z výše uvedených vztahů: q r = u / (u + v) Z toho plyne velmi důležitý závěr: rovnovážná četnost q r alely A 2 závisí pouze na mutačních rychlostech v obou směrech, nikoli na výchozích genových četnostech (na rozdíl od změny genových četností za jednu generaci v důsledku realizace mutačního procesu). Se zřetelem k obvyklým mutačním rychlostem spontánních mutací přímých ( ) a zpětných (o 1 a více řádů nižší než mutační rychlost příslušné přímé mutace) bude spění do rovnovážného stavu procesem velmi pomalým, probíhajícím po mnoho generací. Při podrobnější analýze všech uvedených vztahů lze dospět k závěru, že mutace v populaci by neměly být tak sporadicky se vyskytujícím jevem, jakým jsou. Příčina nespočívá pouze v mutačním procesu samém, ale v interakci mutace a selekce. XVI SELEKCE Selekce představuje takový zásah do populace, který rezultuje u některých genotypů ve zvýšení a u jiných ve snížení jejich příspěvku do společného gametového fondu populace. Jestliže určitý genotyp přispívá do gametového fondu více než odpovídá jeho relativní četnosti, hovoříme o selekci ve prospěch daného genotypu, nebo též o selekci pozitivní, v opačném případě o selekci v neprospěch daného genotypu, nebo též o selekci negativní. Selekce je tedy spojena s narušením proporcionality týkající se příspěvku jednotlivých genotypů do genového (gametového) fondu populace vzhledem k jejich poměrnému zastoupení. Selekce vztahující se k určitému genotypu může být různě účinná. Mírou účinnosti selekčního tlaku je selekční koeficient (s). Tento koeficient udává podíl genotypů, které nemohou přispívat do genového fondu populace. Selekční koeficient může nabývat všech hodnot v uzavřeném intervalu 0; 1 ; je-li pro určitý genotyp s = 0, znamená to, že proti němu nepůsobí žádný selekční tlak, je-li s = 1, znamená to, že takový genotyp vůbec nepřispívá do genového fondu populace (letalita). Selekční koeficient je veličina relativní, jejíž hodnota se odvozuje od referenčního genotypu v populaci. Za referenční genotyp je zpravidla vybírán ten, jehož příspěvek do gametového fondu je nejvyšší. Adaptivní hodnota 232

234 (w), jíž se vyjadřuje reprodukční zdatnost (fitness) takového genotypu, je rovna jedné (w = 1). Mezi adaptivní hodnotou a selekčním koeficientem platí vztah: w = 1 s Selekční koeficient tedy tvoří doplněk adaptivní hodnoty do jedné. Sama adaptivní hodnota je součinem relativní vitality (v) a relativní fertility (f): w = v f To znamená, že snížená reprodukční zdatnost může být důsledkem snížené vitality, snížené fertility, anebo snížené vitality i fertility. Pro genotyp s adaptivní hodnotou nižší než jedna (w 1) však v každém případě platí, že jeho příspěvek do gametového fondu je snížen (v krajním případě roven nule) a z hlediska populačně genetického je lhostejno, z jakých konkrétních příčin. Adaptivní hodnota a selekční koeficient jsou veličiny, vztahující se k určité populaci a proto jejich číselné hodnoty vyjadřují průměr pro daný genotyp v této populaci. Selekce působí vždy na určitý fenotyp, buď v jeho prospěch, nebo v jeho neprospěch. Protože však každý fenotyp je odrazem určitého genotypu (realizuje se v rámci primárně vymezeném genotypem), který je podstatný pro přenos genetické informace, zabýváme se při studiu selekce účinky selekčního tlaku na genotypové a genové četnosti a z nich vyplývajícími následky. (a) Selekce proti alele A 2 při úplné dominanci Účinek selekce budeme v tomto i dalších příkladech sledovat u autozomálního dvoualelového lokusu. Každý příklad je doplněn přehlednou tabulkou. Selekcí proti recesivní alele A 2 jsou při úplné dominanci ovlivněny genotypové četnosti recesivních homozygotů A 2 A 2 ; v každé generaci je jich vyřazeno sq 2. Tento jev se označuje jako genetická smrt a udává podíl z celkového gametového (genového) fondu populace, který je ztracen v důsledku sníženého příspěvku toho genotypu (nebo těch genotypů), proti němuž (nimž) působí selekční tlak, přičemž mírou této ztráty je hodnota selekčního koeficientu. Genetická smrt tedy není nutně totožná s mortalitou nebo morbiditou; letální efekt nastává pouze při s = 1. Potenciální vyjádření genetické smrti se označuje jako genetická zátěž. genotypy A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 celkem PČ p 2 2pq q 2 p 2 + 2pq + q 2 = 1 w s GČ/1 p 2 2pq q 2 (1 s) p 2 + 2pq + q 2 (1-s) = 1 sq 2 RČ p 2 /(1-sq 2 ) 2pq/(1-sq 2 ) q 2 /(1-sq 2 ) PČ = původní četnost, w = adaptivní hodnota, s = selekční koeficient, GČ/1 = genotypová četnost po jedné generaci selekce, RČ = relativní četnost Četnost alely A 2 po jedné generaci selekce bude: q 1 = pq + q 2 (1 s) / (1 sq 2 ) = q (1 - q + q sq) / (1 - sq 2 ) = q (1 - sq) / (1 - sq 2 ) 233

235 Změna četnosti alely A 2 za jednu generaci selekce bude: q = q 1 q 0 = q (1 - sq) / (1 - sq 2 ) q =... = - sq 2 (1 - q) / (1 - sq 2 ) (q 0 = četnost alely A 2 před selekcí, zde q 0 = q) Rovnovážný stav nastane, když q = 0. V případě, že by bylo s = 1, ihned po jedné generaci selekce by z účasti na reprodukci byli zcela vyloučeni všichni recesivní homozygoti (A 2 A 2 ) z důvodu letality nebo sterility. Alela A 2 by se však zachovala v genotypu heterozygotů A 1 A 2 a proto jakmile by selekční tlak pominul (nebo se alespoň snížil), recesivní homozygoti by znovu mohli určitým dílem, reflektujícím intenzitu selekce(s < 1), do genového fondu populace přispívat. Za jednu generaci selekce proti alele A 2 při s = 1 bude četnost této alely v populaci: q 1 = pq 0 /(1 - q 2 ) = (1 - q 0 ) q 0 / (1 - q 2 ) = q 0 / (1 + q 0 ), kde q 0 znamená četnost alely A 2 před selekcí. Četnost alely A 2 v další generaci při stejném selekčním tlaku bude q 2 = q 1 / (1 + q 1 ) = q 0 / (1 + 2q 0 ). V dalších generacích budou poměry obdobné, takže četnost alely A 2 po t-generacích při nezměněných podmínkách selekce lze vypočítat podle obecného vzorce: q t = q 0 / (1 + t q 0 ). Můžeme tedy také stanovit, za kolik generací (t) se četnost recesivní alely v populaci sníží na stanovenou hodnotu a to podle odvozeného vzorce: t = (q 0 q t ) / (q 0 q t ) = (1/q t ) (1/q 0 ) Za použití těchto vzorců lze demonstrovat obecně platný vztah mezi účinností selekce a počátečními genovými četnostmi. Největšího selekčního účinku je dosahováno při středních genových četnostech (p = q = 0,5). Směrem k oběma krajním hodnotám (tj. q 0, q 1) se účinek selekce nejprve výrazně snižuje, v jejich blízkém okolí se opět zrychluje a pak znovu zpomaluje (q = 0, q = 1). (b) Selekce proti alele A 1 při úplné dominanci genotypy A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 celkem PČ p 2 2pq q 2 p 2 + 2pq + q 2 = 1 w 1 - s 1 - s 1 GČ/1 p 2 (1 s) 2pq (1 s) q 2 p 2 (1 - s) + 2pq (1 s) + q 2 = = 1 s (1 q 2 ) RČ p 2 (1-s)/1-s(1-q 2 ) 2pq(1-s)/1-s(1-q 2 ) q 2 /1-s(1-q 2 ) PČ = původní četnost, w = adaptivní hodnota, s = selekční koeficient, GČ/1 = genotypová četnost po jedné generaci selekce, RČ = relativní četnost Četnost alely A 2 po jedné generaci selekce bude: q 1 = pq (1 - s) + q 2 / 1 - s (1 - q 2 ) = q (1 - q) (1 s) + q 2 / 1 s(1 q 2 ) = = q (1 s + sq) / [1 - s (1 - q 2 )] Změna četnosti alely A 2 za jednu generaci selekce bude: q = q 1 q 0 = {q (1 s + sq) / [1 - s (1 - q 2 )]} - q = = {[q (1 s + sq] - q [1 s (1 q 2 )]} / [1 s (1 q 2 )] = sq 2 (1 - q) / [1 - s (1 - q 2 )] (q 0 = četnost alely A 2 před selekcí, zde q 0 = q) Rovnovážný stav nastane, když q =

236 V případě, že by platilo s = 1, ihned po jedné generaci selekce by z účasti na reprodukci byli vyloučeni všichni dominantní homozygoti (A 1 A 1 ) i heterozygoti (A 1 A 2 ) a do genového fondu by přispívali pouze recesivní homozygoti A 2 A 2. Původní stav populace by se už neobnovil, ani kdyby selekční tlak zcela pominul (tzn. kdyby bylo s = 0). Dominantní alela A 1 by se mohla v takové populaci objevit pouze v důsledku buď mutace alely A 2 (případně pseudomutace jiné alely) na alelu A 1, nebo imigrace dominantních homozygotů a/nebo heterozygotů. (c) Selekce proti oběma homozygotům genotypy A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 celkem PČ p 2 2pq q 2 p 2 + 2pq + q 2 = 1 w 1 - s t GČ/1 p 2 (1 s) 2pq q 2 (1 t) p 2 (1 - s) + 2pq + q 2 (1 - t) = = 1 sp 2 tq 2 RČ p 2 (1-s)/(1-sp 2 -tq 2 ) 2pq/(1-sp 2 -tq 2 ) q 2 (1-t)/(1-sp 2 -st 2 ) PČ = původní četnost, w = adaptivní hodnota, s, t = selekční koeficienty, GČ/1 = genotypová četnost po jedné generaci selekce, RČ = relativní četnost Při tomto typu selekce se uplatňuje selekční tlak proti oběma homozygotům, pro každý z nich je použit jiný selekční koeficient (s, t). V případě, že by s = t = 1, pak by již po jedné generaci selekce do genového fondu populace přispívali pouze heterozygoti. Takový stav, označovaný jako balancovaná letalita, udržuje v heterozygotní formě obě alely a proto, když selekční tlaky proti homozygotům pominou (nebo se alespoň sníží, tedy s < 1, t < 1), mohou se oba typy homozygotů v populaci znovu objevit a přispívat do jejího genového fondu. Četnost alely A 2 po jedné generaci selekce bude: q 1 = [pq + q 2 (1 - t)] / (1 - sp 2 - tq 2 ) =... = (q - tq 2 ) / (1 - sp 2 - tq 2 ) Změna četnosti alely A 2 za jednu generaci selekce bude: q = q 1 q 0 = [(q - tq 2 ) / (1 - sp 2 - tq 2 )] - q =... = pq (sp - tq) / (1 - sp 2 tq 2 ) (q 0 = četnost alely A 2 před selekcí, zde q 0 = q) Rovnovážný stav nastane, když q = 0. Současně platí, že s p = t q, neboli q = s / (s + t), resp. p = t / (s + t). Rovnovážná genová četnost tedy závisí pouze na hodnotách obou selekčních koeficientů. (d) Selekce proti alele A 2 za nepřítomnosti dominance genotypy A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 celkem PČ p 2 2pq q 2 p 2 + 2pq + q 2 = 1 w 1 1 s/2 1 - s GČ/1 p 2 2pq (1 s/2) q 2 (1 s) p 2 + 2pq (1 s / 2) + q 2 (1 - s) = 1 - qs RČ p 2 /(1-qs) 2pq(1-s/2)/(1-qs) q 2 (1-s)/(1-qs) PČ = původní četnost, w = adaptivní hodnota, s, t = selekční koeficienty, GČ/1 = genotypová četnost po jedné generaci selekce, RČ = relativní četnost 235

237 Četnost alely A 2 po jedné generaci selekce bude: q 1 = [pq (1 s / 2) + q 2 (1 - s)] / (1 - sq) =... = [q (sq / 2) (1 + q)] / (1 - sq) Změna četnosti alely A 2 za jednu generaci selekce bude: q = q 1 q 0 = {[q - (sq / 2) (1 + q)] / (1 - sq)} - q =...= - [(sq / 2) (1 - q)] / (1 - sq) (q 0 = četnost alely A 2 před selekcí, zde q 0 = q) Rovnovážný stav nastane, když q = 0. Na základě stručných charakteristik výše uvedených typů selekcí lze vyvodit následující obecně platné závěry: (1) ve všech zmíněných případech účinek selekce závisí na její intenzitě (vyjádřené hodnotou selekčního koeficientu) a počátečních genových četnostech (2) selekce proti dominantním nebo recesivním homozygotům (resp. proti odpovídajícím genotypům za nepřítomnosti dominance) vede postupně k rovnovážnému stavu, při kterém je příslušná alela z populace eliminována (3) selekce proti oběma homozygotům vede k ustavení rovnováhy při zachování dominantní i recesivní alely v populaci. (e) Interakce mezi mutací a selekcí Působí-li selekce proti recesivní alele A 2, pak se rovnovážný stav při interakci mutace a selekce ustaví, když bude platit rovnost mezi rovnováhou pro mutaci a rovnováhou pro selekci proti této alele: up - vq = sq 2 (1 q) / (1 sq 2 ). Tento vzorec lze zjednodušit: hodnoty rychlosti zpětné mutace (v) a součinu vq jsou velmi malé a proto je můžeme zanedbat. Touto úpravou snadno odvodíme následující vztahy: u (1 q) = sq 2 (1 q) u = sq 2 q = u/s Z těchto vztahů vyplývají tři velmi důležité závěry: (1) při interakci mezi mutací a selekcí rovnováha závisí přímo úměrně na mutabilitě a nepřímo úměrně na selekčním koeficientu, výchozí četnosti alel (genů) na ustavení této rovnováhy nemají vliv. (2) při obvyklé mutační rychlosti vzniku spontánních přímých mutací, již velmi malý selekční tlak stačí k tomu, aby mutace byla v populaci udržována pouze ve velmi nízké frekvenci (3) ačkoli mutace je primární podmínkou biologické evoluce, sama o sobě se nemůže v evoluci významně uplatnit. Je pouze substrátem, vystaveným přírodnímu výběru (selekci), kterému přísluší rozhodující role v tom, zda určitá mutace v evoluci uspěje. XVI.1.3 DISPERZIVNÍ PROCES V malých populacích, které jsou výsledkem rozdělení základní velké populace na více subpopulací, dochází ke změnám genových četností, jejichž příčinou je nereprezentativnost vzorku gamet a zygot podílejících se na další generaci. Genové četnosti v malých populacích tedy podléhají náhodným fluktuacím v důsledku variance volby (kromě účinku systematických procesů, které v malých populacích také působí). Takto vzniklé změny genových četností považujeme za podstatu disperzivního procesu. 236

238 Disperzivní proces vede ke třem důsledkům: k diferenciaci mezi subpopulacemi, k redukci genetické variability uvnitř malé populace (resp. subpopulace) a ke zvýšení četnosti homozygotů v populaci na úkor heterozygotů. Předpokládejme, že: (1) se nultá (výchozí) generace velké populace rozdělí v první generaci na mnoho subpopulací (v přírodě takový jev může nastat vlivem geografických a ekologických podmínek, v případě hospodářských zvířat rozdělením velkého stáda na řadu menších, dále chovaných různými chovateli); (2) oplozování je omezeno na členy téže subpopulace (tzn. že subpopulace jsou vzájemně izolovány, migrace genů mezi subpopulacemi je vyloučena); (3) se jednotlivé generace nepřekrývají; (4) v každé subpopulaci je stejný počet tzv. chovných jedinců (tj. jedinců, kteří se podílejí na vytvoření nové generace, tedy přispívají do ní svými geny); (5) oplození uvnitř každé subpopulace je náhodné; (6) v žádné fázi disperzívního procesu neprobíhá selekce, všichni chovní jedinci přispívají do gametového fondu stejně; (7) se neuvažuje mutace. Z mnoha zygot se vyvíjí a přežívá jen omezený počet jedinců, počet chovných jedinců (N) je z generace na generaci stejný, průměrně na jednoho rodiče připadá jeden potomek. Průměrné rozdělení je zde Poissonovské (nikoli normální). Sledujme nyní tento model z hlediska variance genové četnosti. Každý jedinec nechť nese v lokusu dvě alely; potom N chovných jedinců obsahuje 2N alel v tomto lokusu. Průměrná hodnota četnosti alely A 2 pro celou základní populaci (q 0 ) bude rovna průměrné četnosti alely A 2 pro všechny subpopulace (q ), avšak v jednotlivých subpopulacích budou konkrétní četnosti alely A 2 kolem tohoto průměru rozptýleny. Proto lze změnu genové četnosti ( q ), vzniklou rozdělením základní populace na subpopulace během jedné generace, vyjádřit jako varianci: σ 2 q = p 0 q 0 / (2N) Tato variance tedy vyjadřuje změny genových četností, které vznikly v důsledku disperzívního procesu v mnoha subpopulacích po jedné generaci. V každé generaci se volba vzorku opakuje, avšak každá subpopulace již začíná od jiné hodnoty genové četnosti. Tato druhá volba vzorku gamet (a každá následující) vede k další disperzi. Proto rozptyl mezi subpopulacemi se z generace na generace zvyšuje, takže v t-té generaci je variance rovna: σ q 2 = p 0 q 0 [(1 [1 1/(2 N) t ] Každá subpopulace v každé generaci nabyde jiné genové četnosti alely A 2. Toto rozptylování je však omezeno krajními hodnotami genové četnosti: 0 a 1. Každá subpopulace jednou dosáhne jedné nebo druhé krajní hodnoty, z níž návrat již není možný; při q = 1 je alela v populaci fixována, při q = 0, je alela z populace ztracena. podílu p 0 subpopulací bude fixována alela A 1, v podílu q 0 bude fixována alela A 2. Jestliže p 0 = q 0 = 0,5, potom na konci disperzivního procesu bude mít jedna polovina subpopulací fixovánu alelu A 1 a jedna polovina alelu A 2. Z toho vyplývá, že podíl subpopulací s fixovanou alelou určitého lokusu je dán podílem počátečních genových četností, tj. četností v základní populaci. Dynamika celého disperzivního procesu je značně složitá a nelze se jí zde podrobněji zabývat. Uvedeme pouze některé základní vzorce, které vyplývají z popisu dynamiky disperzivního procesu. Podíl subpopulací, ve kterých lze očekávat fixaci alely A 2 činí X = q 0 3p 0 q 0 P, podíl subpopulací, ve kterých lze očekávat ztrátu alely A 2 činí Y = p 0-3p 0 q 0 P; podíl subpopulací, které obsahují alelu A 1 i A 2 je Z = 6p 0 q 0 P, kde P = [1 1/(2N)] t, t = t-tá generace od rozdělení základní populace. 237

239 Tento neusměrněný proces, probíhající v malých populacích a směřující k fixaci jedněch a eliminaci druhých alel, se označuje jako náhodný genový posun (neboli genetický drift). Protože vede ke zvyšování homozygotnosti a snižování heterozygotnosti, jsou jeho konečným produktem vysoce homozygotní populace, které můžeme považovat za linie. Lze tedy označení linie a dosud v textu použité označení subpopulace považovat za synonymní. V důsledku disperzivního procesu budou mít recesivní homozygoti ve všech subpopulacích průměrnou genotypovou četnost (q 2 )', kterou zjistíme z hodnoty variance genotypových četností mezi subpopulacemi. Protože se variance série pozorování stanoví jako rozdíl průměru čtverců jednotlivých pozorování (q 2 )' a čtverce jejich průměrů (q)' 2, platí vztah: σ q 2 = (q 2 ) ' - (q)' 2. Z poznatku, že q'= q 0 vyplývá, že (q)' 2 = (q 0 ) 2 a tedy čtverec průměrné genové četnosti vyjadřuje průměrnou genotypovou četnost homozygota A 2 A 2. Proto se v populaci jako celku zvyšuje četnost homozygotů, přičemž převyšuje původní četnost o hodnotu σ q 2. Variance genové četnosti se v subpopulacích, vzniklých rozdělením základní populace, z generace na generaci zvyšuje; tento proces obecně v t-té generaci popisuje vzorec: σ q 2 = p 0 q 0 {1 P}, kde P = [1 1/(2N)] t. S růstem variance σ q 2 roste o stejné číslo i genotypová četnost homozygotů. Protože platí σ q 2 = σ p 2, je možné vyjádřit údaje o tom, jak se vlivem disperzivního procesu budou měnit genotypové četnosti dominantních homozygotů A 1 A 1, heterozygotů A 1 A 2 i recesivních homozygotů A 2 A 2 : genotyp A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 A 2 genotypové četnosti p σ p0 2 2p 0 q 0-2σ q0 2 q 0 + σ q0 2 Dosud jsme vztahovali veškeré vlivy disperzivního procesu k jednomu lokusu v mnoha subpopulacích (liniích). Tyto vlivy se však mohou uplatnit i v mnoha lokusech jedné subpopulace (linie). To znamená, že se v každé subpopulaci v důsledku disperzivního procesu zvyšuje počet lokusů, pro které jsou její členové homozygotní a dvojnásobnou rychlostí klesá počet lokusů, pro které jsou heterozygotní. Náhodný genový posun může vést v malých populacích k rozsáhlým změnám v závislosti na velikosti těchto populací. Tyto změny jsou obdobné změnám, které by ve velké populaci mohly být způsobeny vlivem systematických procesů (např. v malé populaci může být přítomnost určitých prospěšných nebo škodlivých alel výsledkem náhodného genového posunu, kdežto ve velké populaci výsledkem působení selekčního tlaku). XVI.1.4 INBRÍDINK Tento termín se používá pro označení vzájemného nenáhodného oplozování na základě příbuznosti. Čím vyšší je při tom stupeň příbuznosti, tím vyšší je stupeň inbrídinku. Stupeň příbuznosti souvisí též s velikostí subpopulace (i když ne primárně); čím méně členů subpopulace čítá, tím vyšší pravděpodobnost spojení mezi příbuznými jedinci lze předpokládat. Zároveň je možné vlastnosti malých populací chápat jako důsledek inbrídinku. Měřítkem inbrídinku je koeficient inbrídinku (F), též zvaný koeficient příbuznosti, který udává pravděpodobnost, s jakou jsou obě alely v určitém lokusu identické původem. Koeficient inbrídinku je tedy veličinou vztahující se k jedinci, nikoli k populaci. Jeho hodnota je relativní číslo, protože je určena na základě srovnání dané populace s populací referenční, jejíž členy považujeme za navzájem nepříbuzné (F = 0). Nejprve se budeme zabývat inbrídinkem v idealizované populaci. Předpokládejme, že se velká panmiktická populace právě začíná rozdělovat na jednotlivé subpopulace, jejichž 238

240 členové nenesou ve svých genomech identické alely, dále že v každé populaci je N jedinců, kteří přispívají do gametového fondu stejným počtem gamet náhodně se spojujících v zygoty. Potom pro jeden lokus bude v genovém fondu subpopulace 2N různých druhů gamet a koeficient příbuznosti F = 1/(2N). V další generaci se uplatňují dva způsoby vzniku identických homozygotů: nová replikace [= 1/(2N)] a opakování předchozí replikace [= 1 1/(2N)]. Koeficient příbuznosti ve druhé generaci (od rozdělení základní populace) bude tedy: F 2 = 1/(2N) + [1 1/(2N)] F 1. Obecně v t-té generaci lze vypočítat koeficient příbuznosti podle vzorce: F t = 1/(2N) + [1 1/(2N)] F t-1 Podíl 1/(2N) představuje v idealizované populaci nový přírůstek inbrídinku v poslední generaci ( F), zbývající část vzorce označuje inbrídink pocházející již z dřívějších generací. Obecně v jakékoli populaci (nejen idealizované) bude v t-té generaci koeficient příbuznosti F t = F + (1 - F) F t-1 Vlivem inbrídinku v idealizované populaci nastanou tyto změny v genotypových četnostech: původní genotypová četnost dominantních homozygotů p 0 2 se zvýší o F p 0 q 0, recesivních homozygotů q 0 2 se rovněž zvýší o F p 0 q 0, kdežto původní genotypová četnost heterozygotů se sníží o F 2p 0 q 0. Panmiktický index (P) je doplňkem koeficientu inbrídinku do jedné: P = 1 F. V t-té generaci je panmiktický index poměrem heterozygotů t-té generace a generace výchozí: P = H t /H 0. Podíl dosud nefixovaných alel bude činit 6p 0 q 0 (1 F). Nyní se budeme zabývat inbrídinkem v neidealizované (přesněji řečeno v méně idealizované) populaci. V reálných populacích především není konstantní počet N jedinců, kteří přispívají do gametového fondu. Zavádí se termín efektivní počet chovných jedinců (= efektivní velikost populace), označovaný N e. Je to číslo, které nahrazuje skutečný počet jedinců v reálné populaci počtem, který by vedl ke stejné změně koeficientu inbrídinku a ke stejné změně genových četností, jako kdyby se jednalo o populaci idealizovanou. Podle Wrighta je možné N e určit pro bisexuální organizmy. V případech, kde existuje rozdílný poměr samců a samic, je třeba varianci volby uvažovat pro obě pohlaví odděleně; platí 1/N e = 1/(4N m ) + 1/(4N f ) N f = aktuální počet samic, N m = aktuální počet samců Přírůstek koeficientu inbrídinku ( F) za jednu generaci bude: F = 1/(8N f ) + 1/(8N m ) Jestliže je počet jedinců v jednotlivých generacích různý, lze efektivní velikost populace určit přibližně podle vzorců: t = počet generací 1/N e = 1/t [(1/N 1 + 1/N /N t )] N e = t / (1/N 1 + 1/N /N t ) 239

241 XVI.2 POPULACE AUTOGAMNÍ Ideální autogamní populace je složena pouze ze dvou (nebo více) čistých linií, tj. dominantních homozygotů a recesivních homozygotů. Za rovnovážného stavu je v ní četnost dominantních homozygotů rovna četnosti recesivních homozygotů: P + Q = 1, H = 0 P = Q = 0,5 Je-li P = Q = 0,5, neuplatňuje se žádný ze systematických procesů narušujících rovnováhu. V reálných populacích je však úplná autogamie jevem výjimečným. Přesněji řečeno, autogamní druhy rostlin jsou spíše převážně autogamními druhy, protože v jejich populacích se v určité četnosti heterozygoti vyskytují (i když tato četnost je zpravidla nízká, řádově v jednotkách procent). Proto i velká autogamní populace spěje k rovnováze, avšak odlišné od Hardy - Weinbergovy rovnováhy, charakteristické pro populace panmiktické. Průběh spění k rovnováze v autogamní populaci můžeme sledovat na modelu, ve kterém všichni jedinci ve výchozí (nulté) generaci budou heterozygoti, tzn. H = 1, P = Q = 0. Za nepřítomnosti vlivu systematických procesů rušících rovnováhu lze změny genotypových četností v jednotlivých generacích vyjádřit vzorci: P t = (2 t 1) /2 t + 1 H t = 2 / 2 t + 1 Q t = (2 t - 1) / 2 t + 1 P t, H t, Q t = genotypové četnosti dominantních homozygotů, heterozygotů, resp. recesivních homozygotů v t té generaci. Z těchto vzorců vyplývá, že genotypové četnosti v autogamní populaci závisejí pouze na počtu generací, nikoli na výchozích genotypových četnostech. Četnosti heterozygotů se v každé generaci sníží na polovinu. Po řadě generací se tak vytvoří populace složená téměř zcela pouze ze dvou (sledujeme-li jeden alelový pár) nebo více (sledujeme-li více alelových párů) čistých linií, nicméně přítomnost heterozygotů bude zachována (byť ve velmi nízké četnosti). Snadno dovodíme, že četnosti heterozygotů ve sledu po sobě následujících generací se budou snižovat tím pomaleji, čím více lokusů budeme uvažovat. V reálné autogamní populaci vždy existuje určitý podíl autogamie (a) a určitý podíl alogamie (c). Potom v takové populaci platí: a + c = 1. S ohledem na uplatnění alogamie u autogamních druhů rostlin je možné změny genotypových četností v jednotlivých generacích při spění populace do rovnovážného stavu vyjádřit těmito vzorci: P t+1 = P t + 1/4 a H t c (4P t Q t H t 2 ) H t+1 = H t - 1/2 a H t c (4P t Q t H t 2 ) Q t+1 = Q t + 1/4 a H t c (4P t Q t H t 2 ) Změna genotypové četnosti heterozygotů mezi dvěma generacemi je: H = H t+1 H t = -1/2[a H t c (4P t Q t - H t 2 )] Pokud populace spěje k rovnováze, bude se hodnota ΔH postupně snižovat a při dosažení rovnováhy v úplně autogamní populaci bude rovna nule, protože četnost heterozygotů v takové populaci je rovněž rovna nule (H = 0). 240

242 V reálné autogamní populaci je však i za rovnováhy přítomen určitý podíl heterozygotů. Četnost heterozygotů za rovnováhy je v tomto případě závislá pouze na podílu alogamie (neboli překřížení), neboť: H = c / (c+1) Rovnováha v autogamních populacích může být - podobně jako v populaci panmiktické narušována působením systematických procesů (migrace, mutace, selekce), přičemž se samozřejmě uplatňují specifika těchto populací. Na doplnění: Populační a evoluční genetika. 241

243 XVII. MIMOJADERNÁ DĚDIČNOST Největší část genetické informace eukarytických buněk je obsažena v buněčném jádru, kde jejich genofory jsou jednotlivé chromozomy. V buňkách prokaryot, které nemají vytvořeno buněčné jádro v morfologickém smyslu, je analogem eukaryontického chromozomu prokaryotický chromozom, uložený v cytoplazmě. Minoritní část genetické informace je obsažena v cytoplazmatických strukturách, tedy mimo buněčné jádro, v podobě molekul DNA mitochondrií, chloroplastů a plazmidů. Pro cytoplazmatický (mimojaderný) genetický materiál jako celek se používá označení plazmon. Cytoplazmatická dědičnost se vyznačuje některými specifiky, která ji odlišují od dědičnosti jaderné: (1) matroklinní dědičnost je takový způsob dědičnosti, při kterém je fenotypový projev hybrida shodný s fenotypovým projevem mateřského jedince. Vede k tomu, že výsledky reciprokých křížení nejsou identické. Jako příklad lze uvést cytoplazmaticky podmíněnou pylovou sterilitu u některých druhů rostlin (např. kukuřice) nebo dědění znaků, determinovaných mitochondriálními geny, pouze v mateřské linii. (2) somatické štěpení je důsledkem nerovnoměrné distribuce mitochondrií, chloroplastů i plazmidů do jednotlivých buněk při buněčném dělení (na rozdíl od striktně rovnoměrné distribuce chromozomů). Proto množství mimojaderné genetické informace varíruje mezi buňkami v závislosti na počtu cytoplazmatických faktorů dědičnosti v jednotlivých buňkách. Příkladem může být panašování u rostlin jako projev chloroplastové dědičnosti. U některých druhů rostlin jsou známy případy matroklinní dědičnosti neschopnosti syntézy chlorofylu. U typu dědičnosti, označovaného jako albomaculatus, nejsou recesivní alely cl předávány zygotě pylem. Proto při křížení samičí bílé (bezchlorofylové) rostliny se samčí zelenou rostlinou budou v potomstvu všechny rostliny bílé (bezchlorofylové). Tento typ dědičnosti se vyskytuje např. u druhů rodu Nicotiana, Petunia, Zea. Při reciprokém křížení budou v potomstvu všechny rostliny zelené. U typu dědičnosti, označované jako paralbomaculatus, přecházejí recesivní alely pylovým zrnem do zygoty. Proto se při křížení bílé (bezchlorofylové) samičí rostliny se zelenou samčí rostlinou v potomstvu objeví rostliny bílé i zelené, avšak převažovat budou rostliny bílé (bezchlorofylové). Naopak při reciprokém křížení mezi potomky budou převažovat rostliny zelené nad bílými. Typ paralbomaculatus se vyskytuje např. u rodu Pelargonium. (3) plazmon obsahuje jen nepatrný zlomek všech genů v buňce. Plazmonové geny zpravidla kódují bílkoviny, které jsou specifické pro normální fungování příslušné organely (mitochondrie, chloroplastu), případně nejsou pro buňku nepostradatelné (plazmidy). Autonomie procesů souvisejících s expresí genetické informace mitochondrií a chloroplastů není absolutní, protože v řadě případů existuje interakce mezi jadernými a cytoplazmatickými geny, resp. závislost exprese cytoplazmatických genů na expresi genetické informace obsažené v jaderném genomu. Příkladem může být schopnost nálevníků Paramecium aurelia vylučovat paramecin. Jedinci genotypu KK a někteří jedinci genotypu Kk obsahují v cytoplazmě tzv. částice κ sestávající z proteinové oblasti (tělísko R) a virové částice. Toxin (paramecin) působí na jedince genotypu kk, kteří částice κ neobsahují a jsou vůči tomuto toxinu senzitivní. Trvá-li konjugace mezi jedincem genotypu KK a jedincem genotypu kk dostatečně dlouhou dobu, vzniklí hybridi genotypu Kk budou obsahovat částice κ a budou produkovat toxin, ke kterému sami budou odolní. Naopak, bude-li konjugace mezi jedinci uvedených genotypů trvat krátkou dobu, během níž nebudou moci být přeneseny cytoplazmatické částice κ z cytoplazmy donora (KK) do cytoplazmy recipienta (kk), nebudou heterozygotní potomci Kk obsahovat částice κ. V důsledku toho tito heterozygoti 242

244 nebudou produkovat paramecin a budou vůči němu senzitivní; to znamená, že se budou fenotypově projevovat jako jedinci genotypu kk, kteří částice κ nikdy neobsahují a jsou proto vždy senzitivní vůči paramecinu. (4) některé mimojaderné determinanty jsou infekční. Mezi ně patří například bakteriální epizomy a někteří intracelulární symbionti. (5) mimojaderné geny nelze mapovat do genetických map jaderných genů, avšak je možné stanovit pořadí genů a vzdálenosti mezi nimi na příslušném genoforu (tj. plazmidové, mitochondriální či chloroplastové DNA). Některé znaky, podmíněné cytoplazmatickými determinantami dědičnosti, se významně uplatňují v praxi. Například cytoplazmatická sterilita se využívá při šlechtění rostlin. Tato sterilita je podmíněna cytoplazmatickými geny (mitochondriálními, plastidovými), které se přenášejí na potomstvo prostřednictvím cytoplazmy vaječné buňky, takže pylově sterilní potomstvo se tvoří pouze na rostlinách pylově sterilních. K udržování sterility slouží křížení samičí rostliny s plazmotypem S (cytoplazmatická sterilita) se samčí rostlinou s plazmotypem F (normální cytoplazma). Samčí pylová sterilita (CMS) je podmíněna interakcí genů cytoplazmatických s geny jadernými. Plazmotypy S a F spolupůsobí s jedním nebo více jadernými geny. Některá alela (nebo některé alely) těchto jaderných genů poskytuje s plazmotypem S pylově sterilní rostliny; většinou se jedná o alelu recesivní, označovanou symbolem ms nebo rf. Dominantní alela Ms (resp. Rf) s plazmotypem S vede k obnově fertility; v této souvislosti proto hovoříme o některých genech jako o obnovitelích (restorter) samčí pylové fertility. Na CSM lze nahlížet jako na formu genetické kastrace a jako na významný prostředek udržování vhodných (zejména hybridních) genotypů. Na doplnění: - Mimojaderná dědičnost: základní informace. Obr.: Schéma mitochondriální a chloroplastové dědičnosti. Zdroj: 243

245 Obr.: Fenotypová variabilita znaku determinovaného mitochondriálním genomem. Zdroj: 244

246 Obr.: Cytoplazmatická samčí sterilita (CMS) a produkce hybridních semen. Zdroj: Obr.: Schéma homoplasmie a heteroplazmie při mitochondriální dědičnosti. Zdroj: 245

247 XVIII. GENOVÉ MANIPULACE Genové manipulace představují rozsáhlý soubor metod a technik, využívaných k analýze genomů, jednotlivých genů, genetickému mapování, podrobnému studiu mutageneze a karcinogeneze, transgenoze, klonování a při řešení řady dalších závažných problémů nejen čistě genetikých. Jsou nepostradatelné v genomice a proteomice. Mnohé z nich se již významně upatňují ve společenské praxi (farmaceutický průmysl, šlechtitelství a plemenářství, genetická diagnostika, GMO apod.). V krátkém přehledu jsou níže uvedeny základní prostředky, metody a techniky používané při genových manipulacích. XVIII.1 TRANSDUKCE Transdukcí se rozumí přenos DNA z donorové buňky do recipientní, zprostředkovaný bakteriofágem (virem). Rozlišuje se transdukce nespecifická, při které fág (virus) může přenášet jakýkoli gen nebo plazmid donorové buňky, a transdukce specifická, při které fág (virus) přenáší pouze určitý gen (určité geny) z buňky donorové do buňky recipientní. Transdukující fágy (viry) obsahují ve svém genomu část chromozomu nebo plazmid donorových buněk. V hostitelské buňce vyvolávají lyzogenní infekci, v jejímž průběhu vznikají transdukanti: (a) rekombinantní rekombinací mezi homologickými (nebo téměř homologickými) oblastmi chromozomu recipientní buňky a fragmentu chromozomu donorové buňky, přenášené fágem; fág včleněný do bakteriálního chromozomu se označuje jako profág. Replikace přenesené části chromozomu donorové buňky se tak stane součástí replikace chromozomu recipienta. Přenesený gen se může exprimovat v recipientní buňce, do jejíhož chromozomu se integroval a ve všech generacích buněk, odvozených od této recipientní buňky (pokud nebyl transdukovaný fragment chromozomu zpětně vyštěpen). Zejména transdukanti tohoto typu se uplatňují při genových manipulacích, protože transdukcí navozená změna genotypu je stabilní; (b) abortivní, kteří v cytoplazmě pouze obsahují nerekombinující a nereplikující se fragment chromozomu donorové buňky přenesený transdukujícím fágem. Po rozdělní buňky abortivního transdukanta nese v cytoplazmě vždy pouze jedna buňka fragment chromozomu donora a pouze v ní se také může gen, obsažený v tomto fragmentu, exprimovat. Z toho je zřejmé, že podíl abortivních transdukantů se z generace na generaci snižuje a teoreticky je v jednotlivých generacích roven (1/2) t z celkové velikosti populace, t = počet generací. Abortivní transdukanti se po čase vyředí a mají proto při genových manipulacích pouze omezený význam; (c) plazmidoví přenosem plazmidu z donorové buňky. Protože se plazmidy replikují relativně nezávisle na replikaci bakteriálního chromozomu, mohou se namnožit a při buněčném dělení distribuovat do všech buněk potomstva. Pokud je do plazmidu zabudován cizí gen, může se exprimovat v buňkách, ve kterých bude obsažen. Kromě toho se mohou některé plazmidy též integrovat do chromozomu recipienta a současně s ním se množit a případně experimovat vlastní geny; takto integrované plazmidy se nazývají epizomy. Při nepřesném vyštěpení epizomu nebo profága z chromozomu recipienta může být do dalších buněk přenesena část jeho chromozomu; takto se původně recipient může stát při další transdukci donorem genetického materiálu. 246

248 Obecně jsou transdukujícím fágem přenášeny fragmenty DNA bakteriálního chromozomu nebo plazmidy donorového kmene, v němž daný fág působí lytickou infekci. Při maturaci fágových částic se do kapsidů náhodně vsune místo fágové DNA velikostně odpovídající malý fragment chromozomu nebo plazmid donorové buňky. Transdukce byla popsána např. u rodů Acinetobacter, Bacillus, Escherichia, Mycobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Shigella, Staphylococcus. Obr.: Schéma transdukce. Zdroj: 247

249 Obr.: Schéma průběhu transdukce. Zdroj: l 248

250 Obr.: Schéma průběhu transdukce (okračování). Zdroj: l 249

251 XVIII.2 TRANSFORMACE, TRANSFEKCE Transformací se rozumí přenos izolované DNA z donorové buňky do recipientní za vzniku transformantů, tj. recipientních buněk, které cizí DNA přijaly. Mohou vzniknout transformanti: (a) rekombinantní, když izolovaná DNA rekombinuje s určitou oblastí chromozomu recipienta. Podobně jako u rekombinantních transdukantů i zde se včleněná DNA z donorové buňky replikuje současně s replikací chromozomu a může se (za adekvátních podmínek) exprimovat v recipientní buňce a v buňkách jejího potomstva; (b) plazmidoví, když do recipientní buňky byl přenesen plazmid z donorové buňky, který se v recipientní buňce a jejím potomstvu replikuje a dědí jako autonomní replikon. Plazmidy lze přenášet nejen intraspecificky, ale i interspecificky; to je jeden z hlavních důvodů jejich širokého uplatnění při genových manipulacích. Pro tranformaci platí několik obecných zásad. Transformovány mohou být pouze tzv. kompetentní buňky, tzn. buňky, které jsou propustné pro molekuly DNA určité velikosti. Při genových manipulacích lze permeabilitu dočasně upravit (např. enzymaticky), nebo cizí DNA přímo vpravit do cytoplazmy bakteriální buňky, resp. do jádra eukaryotické buňky (elektroporace, mikroinjekce). K transformaci se obvykle používají úseky dsdna, jejichž velikost musí být přiměřená poměrům recipienta a jejíž primární struktura musí vykazovat dostatečně vysoký stupeň homologie s DNA recipienta, aby se mohla uskutečnit rekombinace. Transfekcí se rozumí infekce hostitelské buňky čistou (izolovanou) fágovou (virovou) nukleovou kyselinou, tj. zbavenou reziduí bílkovinného obalu fágové (virové) částice. Transfekci lze uskutečnit buď přímou aplikací izolované nukleové kyseliny do hostitelské buňky, anebo prostřednictvím mutantního pomocného viru s nízkou účinností výsevu. V obou případech je však nutné disponovat kompetentními hostitelskými buňkami, tj. buňkami, které nejen cizí nukleovou kyselinu přijmou, ale umožní její replikaci, tvorbu fágových (virových) proteinů a sestavení nových částic, včetně jejich uvolnění z buňky. Obr.: Transformace (Griffithův experiment, 1928). Zdroj: 250

252 Obr.: Transformace fragmentem DNA a plazminem. Zdroj: Obr.: Transformace prostřednictvím Ti plazmidu Agrobacterium tumefaciens. Zdroj: 251

253 Obr.: Využití transformace při transgenózi. Zdroj: l 252

254 XVIII.3 KONJUGACE Konjugací se rozumí přenos DNA z donorové buňky do recipientní, realizovaný v průběhu spojení donorové buňky s recipientní. Recipientní buňka, která přijme touto cestou DNA od donorové buňky, se nazývá transkonjugant. Rozeznávají se dva základní typy transkonjugantů: (a) rekombinantní, kteří vznikají v důsledku rekombinace donorové DNA s DNA chromozomu recipienta. Potomstvo rekombinantních transkonjugantů lze považovat za geneticky stabilní, protože fragment donorové DNA se stal součástí genomu recipienta a jako jeho součást je podroben stejným základním genetickým procesům (replikace, transkripce, translace); (b) plazmidoví, kteří vznikají v důsledku přenosu konjugativního plazmidu z donorové buňky do recipientní v průběhu konjugace. Plazmid se v recipientní buňce replikuje a dědí jako autonomní replikon. Konjugace byla prokázána například u rodu Escherichia, Mycobacterium, Pasteurella, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Shigella, Vibrio. Podmínkou jejího uskutečnění je přítomnost konjugativního plazmidu v donorové buňce. Buňky s takovým plazmidem ve volném (autonomním) stavu se označují jako F +, buňky, které takový plazmid nemají, se označují jako Fˉ. F plazmid je tvořen kružnicovou dsdna. Při interakci mezi F + - bakterií a Fˉ - bakterií se vytvoří spojení mezi F-pilusem a proteinovým receptorem na povrchu buňky Fˉ. Následně vytvořeným cytoplazmatickým spojem mezi oběma partnerskými buňkami dochází k přesunu jednoho řetězce DNA F-plazmidu 5 - koncem od místa ori, ve kterém byl předtím plazmid endonukleázovou aktivitou naštěpen, do buňky Fˉ. V recipientní buňce se podle přesunutého řetězce F plazmidu, fungujícího jako matrice, syntetizuje komplementární nový řetězec. Obdobně se nasyntetizuje podle řetězce F - plazmidu, který zůstal v donorové buňce, druhý řetězec. F plazmid se může vyskytovat v bakteriální buňce nejen v autonomním, ale též v integrovaném stavu, tzn. včleněný do bakteriálního chromozomu. Konjugací vzniká z recipientní buňky merozygota, tedy buňka, která obsahuje kromě vlastní genetické informace pouze část genetické informace (chromozomu) donorové buňky; tato část chromozomu donorové buňky v merozygotě se označuje jako exogenot, s ní homologická oblast chromozomu recipientní buňky se označuje jako endogenot. Buňky, které obsahují integrovaný F plazmid, se označují jako Hfr buňky (high frequency of recombination); vyznačují se výrazně zvýšenou četností rekombinace oproti buňkám s F plazmidem v autonomním stavu anebo bez F plazmidu. Při konjugaci fungují jako buňky F + a proto mohou konjugovat s buňkami Fˉ; merozygoty vzniklé po takové konjugaci se chovají jako buňky Fˉ a proto mohou konjugovat s buňkami F +. Význačným znakem Hfr kmenů je, že každý z nich má umístěn počátek ori u jiného genu, takže při konjugaci dochází k přenosu genů donora do recipienta v různém pořadí. Plazmid, který reverzibilně přechází z autonomního stavu do integrovaného se označuje jako F ; takový plazmid obsahuje úsek bakteriálního chromozomu, přičleněný k vlastní DNA F plazmidu při jeho nepřesném vyštěpení z bakteriálního chromozomu při přechodu z integrovaného do autonomního stavu. Kmeny buněk, které pocházejí z buněk, v nichž F - plazmid vznikl, anebo do nichž byl F - plazmid při konjugaci přenesen, se označují jako F - kmeny. 253

255 Obr.: Schéma průběhu konjugace. Zdroj: l 254

256 Obr.: Přehledné schéma konjugace Zdroj: l 255

257 XVIII.4 KLONOVÁNÍ DNA Pod termínem klonování lze rozumět v podstatě namnožení požadovaných fragmentů DNA prostřednictvím vektorů (plazmidy, fágy, kosmidy, fágmidy, viry) ve vhodném hostiteli, přičemž bývají překonány přirozené interspecifické bariéry. Vektor je element autonomně se replikující v hostitelských buňkách (obvykle bakteriálních). Mezi nejčastěji používané vektory se řadí plazmidy a fágy, dále kosmidy, fágmidy a některé viry. Inzert je fragment DNA nesoucí gen, který chceme klonovat. Inzert se inkorporuje do vektoru a v něm se integruje do jeho DNA (chromozomu) za vzniku rekombinantní molekuly DNA. Tyto procesy se obvykle realizují za katalytického účinku restrikčních endonukleáz (restriktáz): naštěpením donorové molekuly DNA na specifických místech se získá požadovaný fragment a vnese se do naštěpeného místa DNA vektoru. Kromě restriktáz se uplatňují i další enzymy (nukleázy, polymerázy, ligázy, polynukleotidylkinázy, topoizomerázy apod.). Vektor s integrovaným inzertem se následně transportuje do hostitelské buňky, ve které je schopen replikovat se. Jako základních prostředků tohoto transportu se často používá fágů a plazmidů pro jejich přirozenou schopnost vniknout do bakteriální buňky a v ní při vlastní replikaci namnožit zároveň integrovaný inzert. Po určité době kultivace bakteriální kultury, ke které byl přidán vektor, se provede selekce kolonií obsahujících vektor s integrovaným fragmentem cizí DNA (např. na selektivním médiu obsahujícím antibiotikum proti němuž použitý plazmid nese geny rezistence). Vyselektované kolonie se dále množí. Tím je gen klonován. Je-li potřeba, může být molekulárně-genetickými metodami z bakteriálních buněk vektor izolován a integrovaný fragment cizí DNA (inzert) vyštěpen. Celá procedura klonování je ve skutečnosti mnohem náročnější, než jak vypadá při tomto letmém nástinu. V další části si jednotlivé etapy částečně přiblížíme. Plazmidy jsou malé kružnicovité molekuly dsdna autonomně se replikující v bakteriálních buňkách. Některé se mohou integrovat do bakteriálního chromozomu hostitelské buňky a replikovat se jako jeho součást; takové plazmidy se označují jako epizomy. Epizomy se však mohou za určitých podmínek z chromozomu uvolnit a dále existovat v autonomním stavu, tj. nezávisle na bakteriálním chromozomu. V jedné bakteriální buňce se může někdy vyskytovat i více druhů plazmidů (tzv. plazmidy kompatibilní), jindy pouze jeden druh (tzv. plazmidy inkompatibilní). Některé plazmidy se mohou přenášet mezi bakteriálními buňkami při konjugaci, kterou navozují (tzv. plazmidy konjugativní), jiné toho schopny nejsou (tzv. plazmidy nekonjugativní). Řada plazmidů nese geny rezistence na některá antibiotika (tzv. R plazmidy). Naproti tomu Col plazmidy nesou geny kódující syntézu kolicinů, tj. látek typu antibiotik, které produkují některé bakterie z čeledi Enterobacteriaceae; bakteriální kmen, který obsahuje Col plazmidy a syntetizuje kolicin, se nazývá kolicinogenní kmen. Pro účely klonování jsou vhodné plazmidy ne příliš velké (obvykle < 10 kb), dobře pronikající do hostitele a úspěšně se v něm množící, nesoucí alespoň jeden snadno selektabilní marker (např. R-plazmid) a obsahující vhodná restrikční místa pro inzerci cizí DNA (často se používá uměle připravený úsek, tzv. polylinker, do kterého je nakoncentrováno několik specifických restrikčních míst pro určité restriktázy). Mezi frekventovaně používané plazmidy patří plazmid pbr322; je to konjugativní plazmid, zkonstruovaný rekombinacemi několika jiných plazmidů, nese dva selektabilní markery (rezistence na ampicilin a tetracyklin), obsahuje kolem 20 unikátních míst pro restriktázy (většinou v oblasti genu pro tetracyklinovou rezistenci nebo v jeho okolí), replikuje se v E. coli. Od tohoto plazmidu byl odvozen plazmid pbr325, který navíc nese 256

258 gen pro chloramfenikolacetyltransferázu (CAT) inaktivující chloramfenikol a tím způsobující rezistenci vůči tomuto antibiotiku. Dalším vhodným plazmidem je pat153. Jedná se o plazmid, u kterého byla odstraněna oblast navozující konjugaci, což není tak podstatné z hlediska vlastních genových manipulací, ale z hlediska menšího rizika šíření ATB-rezistence v případě infekce osob při manipulaci s plazmidy. Pro včleňování klonovaných genů do genomů rostlin se obvykle používá Ti plazmid Agrobacterium tumefaciens. Konstantní část tohoto plazmidu tvoří tzv. T DNA (transferred DNA), která svou inzercí do genomu hostitelské rostliny je schopna vyvolat mutaci. Včlenění T-DNA může vést k nové biosyntéze cytokininů a auxinů, které mohou v rostlinných pletivech vykazovat transformační účinek a vést k jejich přeměně v nediferencovaný nádor, tzv. crown-gall tumor. Ve vztahu k těmto nádorům lze rozlišit dva typy Ti plazmidů: typ oktopinový a typ nopalinový. Oba nesou geny pro syntézu nádorově specifických látek, opinů, které pro samotné A. tumefaciens jsou jednak výživovým substrátem, jednak indukují přenost Ti - plazmidu mezi buňkami tohoto bakteriálního druhu. Část genomu Ti - plazmidu se může trvale integrovat do genomu rostliny. Fágy jsou bakteriální viry. Jako takové jsou schopny infikovat hostitelskou bakteriální buňku, replikovat se v ní a reprodukovat nové fágové částice. DNA bakteriofágů může být kružnicová jednořetězcová (např. fág M13, ΦΧ174), nebo lineární dvouřetězcová (např. fág λ dsdna s kohezními konci, T-sudé fágy - dsdna s permutovanými geny, tzn. že fágové částice téhož druhu se liší pořadím genů kromě genu prvního a posledního, T liché fágy dsdna s nepermutovanými geny). Jsou známy též RNA fágy s lineární jednořetězcovou RNA (např. fág f2). Po adsorpci fága na povrchu senzitivní bakteriální buňky penetruje DNA (resp. RNA) fága do cytoplazmy hostitelské buňky, kdežto fágový kapsid zůsává na jejím povrchu. Infekce, která vede k replikaci fága, syntéze bílkovin kapsidu a sestavení nových fágových částic s následnou lýzí bakteriální buňky, se označuje jako infekce lytická a bakteriofágy, které jsou schopny indukovat pouze lytickou infekci se označují jako fágy virulentní. Kromě lytické infekce existuje ještě infekce lyzogenní, která nevede k produkci nových fágových částic a lýzi hostitelské bakteriální buňky, ale k tzv. lyzogennímu stavu, ve kterém je fág rekombinačním procesem včleněn do bakteriálního chromozomu jako tzv. profág. Bakteriofágy, které mohou indukovat lyzogenní (i lytickou) infekci se označují jako mírné, neboli temperované fágy. Fág ve stavu profága se replikuje současně s replikací bakteriálního chromozomu a jako jeho součást je při dělení bakteriální buňky přenášen do dalších generací. Za určitých podmínek se profág může z bakteriálního chromozomu vyštěpit a lyzogenní infekce se může změnit v infekci lytickou, v jejímž průběhu jsou produkovány nové fágové částice. Vzhledem k tomu, že vyštěpení profága z bakteriálního chromozomu není vždy zcela přesné, mohou nově vzniklé fágové částice obsahovat fragmenty bakteriálního chromozomu, které mohou transdukcí přenést do nově infikovaných hostitelských buněk a rekombinací je integrovat do jejich chromozomů. Právě schopnost temperovaných fágů včlenit se do chromozomu bakteriální buňky a přenášet cizí DNA (resp. fragmenty DNA) mechanizmem transdukce se využívá při genových manipulacích. Některé fágy různých genotypů mohou při smíšené infekci téže bakteriální buňky vést k hybridním formám, které obsahují DNA jednoho genotypu a kapsid složený z proteinů, kódovaných DNA fága odlišného genotypu; hovoří se o tzv. fenotypovém míšení. Tato relativní nezávislost obsahu kapsidu a jeho složení představuje při genových manipulacích rovněž značné pozitivum, neboť umožňuje do hlavy fága inkorporovat cizí DNA (např. plazmidovou). 257

259 Mezi vektory typu fága se rozlišují dva základní typy: (1) inzerční, ve kterých se z fága vyštěpí neesenciální oblast a to tak, aby po ligaci vzniklých volných konců molekuly DNA bylo získáno alespoň jedno unikátní místo pro některý restrikční enzym, (2) substituční, ve kterém se vyštěpí neesenciální oblast fága a substituuje se cizorodou DNA. K nejčastěji používaným bakteriofágům patří fág λ. Jedná se o lyzogenní fág, jehož hostitelem je E. coli. Zpravidla se používá různým způsobem upravený. Dalším je fág M13, jehož výhodou je, zejména při mutagenezi in vitro nebo při sekvenování, že obsahuje ssdna. Rekombinantními technikami lze relativně snadno připravit chimerické molekuly DNA fága s cizí DNA a jimi transformovat hostitelské buňky. Fagmidy jsou hybridní vektory sestávající převážně z plazmidové DNA a přičleněného úseku fágové DNA s místem ori (počátek replikace). Replikují se v bakteriální buňce stejně jako plazmidy; výhodou je, že po infekci hostitele pomocným fágem vytvářejí při replikaci ssdna. Kosmidy jsou též hybridní vektory nesoucí některé sekvence DNA plazmidu (místo ori, oblasti se selektabilními markery) a místo cos fága λ. Nukleázy používané při klonování a podobných genových manipulacích patří jak mezi exonukleázy, tak mezi endonukleázy. Používají se především s cílem naštěpit molekulu nukleové kyseliny, nebo ji degradovat. DNázaI je endonukleáza štěpící a degradující dsdna i ssdna na oligo- a mononukleotidy. Nukleáza S1 působí na ssdna a RNA, je neúčinná na dsdna, dsrna a hybridy DNA x RNA. Exonukleáza III vykazuje aktivitu ve směru 3 5 nebo od míst zářezů v dsdna, λ exonukleáza ve směru 5 3, Bal 31 nukleáza má exonukleázovou aktivitu v obou směrech. Rnáza A je účinná na šechny typy RNA, Rnáza H specificky degraduje hybridy DNA x RNA a proto se používá k jejich detekci. Restriktázy (restrikční enzymy, restrikční endonukleázy) jsou enzymy, které rozpoznávají vysoce specifické sekvence oligonukleotidů (většinou tetra- až hexanukleotidy), velmi často typu palindromů, a v nich štěpí molekulu DNA za vzniku fragmentů s kohezními nebo tupými konci (viz schéma). Jsou izolovány z mikroorganizmů. Jejich označení sestává ze zkratky názvu bakteriálního druhu (popř. kmene), z něhož pocházejí a z číslice (většinou římské), která označuje typ restriktázy, např. Hpa I = restriktáza izolovaná z Haemophilus parainfluenzae, typ I. Schéma vzniku fragmentů DNA s kohezními a tupými konci po štěpení EcoR I a Hpa I. Eco RI: specifická sekvence GAATTC, štěpí G/AATTC 5 GAATTC G paattc > 3 CTTAAG.5 3 CTTAAp G 5 Komplementární kohezní (lepivé) konce (paatt, TTAAp) se mohou snadno párovat. HpaI: specifická sekvence GTTAAC, štěpí GTT/AAC 5 GTTAAC.3 5 GTT paac > 3 CAATTG.5 3 CAAp TTG 5 tupé (zarovnané) konce. 258

260 Restriktázy, které rozpoznávají stejnou specifickou sekvenci a štěpí ji ve stějném místě, se označují jako izoschizomery. Například BamHI a BstI štěpí G/GATCC. Restriktázy, které rozpoznávají stejnou specifickou sekvenci, ale štěpí ji na různých místech, se označují jako heteroschizomery. Některé restriktázy rozpoznávají různé specifické sekvence, avšak jednovláknové konce DNA, které po štěpení vzniknou, jsou navzájem komplementární (např. BamHI a BclI). Polymerázy jsou enzymy, které katalyzují polymeraci nukleotidů při syntéze komplementárního řetězce DNA nebo RNA zpravidla podle matrice. Polymeraci zahajují od krátkého oligonukleotidu zvaného primer. DNA-polymeráza I vykazuje polymerační aktivitu ve směru 5 3 a též exonukleázovou aktivitu v obou směrech (5 3 i 3 5 ). Klenowův fragment DNA-polymerázy I je část molekuly DNA-polymerázy I, ze které byl odstraněn úsek, zodpovědný za exonukleázovou aktivitu této polymerázy; Klenowův fragment tudíž vykazuje pouze aktivitu polymerázovou. Taq DNA-polymeráza je termostabilní DNA-dependentní DNA-polymeráza izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Teplotní optimum pro polymerační reakci se u této polymerázy pohybuje kolem 70º C a proto nachází uplatnění především při polymerázové řetězové reakci (PCR). Terminální deoxyribonukleotidyltransferáza je DNA-polymeráza, která nevyžaduje matrici, ale je nutný minimálně trinukleotidivý primer, od něhož zahajuje polymeraci ve směru 5 3. Může též katalyzovat prodlužování řetězce ssdna na 3 - konci. Ligázy jsou enzymy, které participují na procesu vzájemného spojování sousedních nukleotidů katalýzou tvorby fosfodiesterových vazem. T4 DNA-ligáza, izolovaná z bakteriofága T4, katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby v dsdna s kohezními i tupými konci. V klonovacích technikách se uplatňuje hlavně při ligaci linkerů a adaptorů k linearizovaným vektorům a inzertům, nebo k ligaci vektorové DNA (po naštěpení restriktázou) k inzertu. RNA-ligáza katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi ribonukleotidy obdobně jako DNA-ligáza a proto se používá při práci s RNA. Topoizomerázy se aplikují za účelem dosažení relaxace superhelixové DNA; využívá se jejich schopnosti indukovat dočasné jednořetězcové zlomy na molekule DNA a tím snížit intramolekulové pnutí. Existuje celá řada enzymů, které modifikují molekuly nukleových kyselin. Některé z těchto modifikací jsou nepostradatelné při molekulárně-genetických procedurách. Alkalická fosfatáza defosforyluje (d)ntp, ale nehydrolyzuje fosfodiesterové vazby. Používá se proto např. při defosforylaci linearizovaných molekul plazmidů se záměrem zamezit jejich spontánní religaci před inzercí klonovaného fragmentu DNA. EcoRI-metyláza specificky metyluje molekulu adeninu za vzniku N6-metyladeninu ve třetím nukleotidu rozpoznávací sekvence restriktázy EcoRI (5 GAmetyl-ATTC 3 ), čímž je tato sekvence chráněna před účinkem EcoRI. Metylace je často se vyskytujícím přirozeným prostředkem ochrany bakterií před vlastními restrikčními enzymy; metylace molekuly DNA v místě specifické rozpoznávací sekvence pro určitou restriktázu zpravidla znemožňuje realizovat štěpení řetězce touto restriktázou. Metylázy se proto používají k blokaci restrikčních míst při konstrukci cdna. Molekuly DNA, resp. fragmenty molekul DNA vektoru a inzertu je možné (a často nutné) před jejich spojením vhodně upravit. K tomuto účelu se používají též tzv. linkery a adaptory, které obsahují specifickou rozpoznávací sekvenci pro určitou restriktázu. Je-li třeba, lze inzert za použití příslušné restriktázy zpětně vyštěpit. Linkery jsou nasyntetizované oligonukleotidy obsahující rozpoznávací místo pro určitou restriktázu nebo více restriktáz. Linker lze ligovat k fragmentu DNA s tupými konci, poté restriktázou (jejíž rozpoznávací místo linker obsahuje) naštěpit za vzniku 259

261 kohezních konců a následně ligovat k DNA linearizovaného vektoru s kohezními konci komplementárními ke kohezním koncům linkerem modifikovaného fragmentu DNA (viz schéma). Schéma funkce linkeru: linker fragment DNA linker NNGAATTCNN XXXXX NNGAATTCNN NNCTTAAGNN XXXXX NNCTTAAGNN ligace NNGAATTCNNXXXXXNNGAATTCNN NNCTTAAGNNXXXXXNNCTTAAGNN štěpení RE a odstranění linkeru N, N, G AATTCNNXXXXXNNG A,A,T,T,C,N,N N,N,C,T,T,A,A GNNXXXXXNNCTTAA G,N,N + AATTNNNNNNN NNNNNNNTTAA linearizovaný vektor (s kohezními komlementárními konci) ligace AATTCNNXXXXXNNGAATTNNNNNNN GNNXXXXXNNCTTAANNNNNNNTTAA inzert ligovaný pomocí linkeru k linearizovanému vektoru Pozn.: V důsledku přítomnosti komplementárních kohezních konců je možná cirkularizace inzertu ligovaného pomocí linkeru. Toho se využívá především tehdy, když DNA vektoru (např. plazmidu) je kružnicová. 260

262 Adaptory jsou obdobou linkerů, avšak jeden jejich konec (3 -OH) je tupý a druhý (5 ) kohezní; 5 - konec se defosforyluje, aby se zamezilo religaci (mezi OH-skupinou na 3 konci a OH-skupinou takto vzniklou na 5 - konci ligace není možná). Adaptor je syntetizován tak, aby kohezní konec obsahoval rozpoznávací místo pro určitou restriktázu (resp. více restriktáz). Tupým koncem se adaptor liguje k fragmentu DNA (inzertu), čímž vznikne přímo DNA s lepivými konci, která po fosfokinázování na 5 - koncích může být ligována k DNA vektoru (analogicky jako při použití linkeru). Procedury, vedoucí k získání a reprodukci vektoru s včleněným fragmentem cizí DNA, můžeme shrnout do těchto hlavních kroků: (1) izolace vektoru (např. plazmidu), linearizace jeho DNA (za použití nukleáz, restriktáz, příp. topoizomeráz) a defosforylace na 5 - koncích (alkalickou fosfatázou) (2) izolace DNA donora (za použití RNázy k odstranění reziduí RNA, purifikace izolované DNA) a příprava fragmentu této DNA, který bude použit jako inzert (aplikace nukleáz a restriktáz, preparativní elektroforéza apod.) (3) ligace fragmentu DNA (inzertu) k vhodnému linkeru nebo adaptoru (použití ligázy) (4) štěpení specifickou restriktázou za vzniku produktu s kohezními konci (v případě použití linkeru) nebo kinázování na 5 - koncích (v případě použití adaptoru) (5) ligace upraveného inzertu k linearizované DNA vektoru (6) cirkularizace vektoru (např. plazmidu) s včleněným inzertem; jako nepovinný krok je možná metylace rozpoznávacích míst pro restriktázy vhodnou metylázou (7) transformace (transdukce apod.) hostitelské buňky připraveným vektorem (8) selekce klonů obsahujících inzert (resp. vektor s včleněným inzertem) pomocí zvoleného selektabilního markeru (či více selektabilních markerů) Pokud je cílem klonování pouze namnožit určitý úsek DNA, použitý jako inzert, není třeba dosáhnout jeho exprese v buňkách hostitele. Naopak, jestliže záměrem přenosu určitého eukaryotického genu je jeho exprese v hostitelské prokaryotické nebo eukaryotické buňce (organizmu), je třeba k přenosu použít tzv. expresivní vektor. Expresivním vektorem může být plazmid, upravený tak, že kromě oblasti pro včlenění inzertu obsahuje ještě příslušné regulační sekvence, umožňující jeho expresi. Existuje rovněž celá řada konstruktů fungujících jako expresivní vektory. Pokud se týká exprese inzertu v eukaryotických buňkách, musí expresivní vektory disponovat zejména silným promotorem; tuto funkci mohou plnit některé promotorové sekvence virů, které infikují buňky eukaryot. K přenosu určitého genu do hostitelské buňky je též možno použít transfekce nebo transdukce. Virem přenášený gen se může exprimovat v hostitelské buňce po začlenění virového genomu do chromozomu hostitele, tj. po přechodu viru do stadia proviru. Některé vektory nesou inducibilní promotory. Aktivita těchto promotorů je závislá na přítomnosti induktoru příslušný gen se transkribuje pouze v přítomnosti induktoru, po jeho odstranění transkripce ustává. Zvláštním typem vektorů jsou tzv. kyvadlové vektory (shuttle vectors), které jsou schopné replikovat se v prokaryotických i eukaryotických buňkách. Výhodou je, že se klonované geny mohou při přenosu z prokaryotického hostitele do eukaryotického (nebo naopak) subklonovat. Kyvadlové vektory nacházejí uplatnění naříklad při experimentální mutagenezi: určitý gen, u něhož má být studován mutační projev, může být namnožen prostřednictvím kyvadlového vektoru v bakteriální kultuře, odtud prostřednictvím tohoto vektoru přenesen do eukaryotického recipienta, v něm exponován mutagennímu agens a zpět stejným vektorem přenesen do bakteriálního hostitele, ve kterém bude sledován mutační projev daného genu. 261

263 XVIII.5 GENOVÉ KNIHOVNY Genové knihovny jsou soubory různých úseků DNA (genů), vzniklé jejich naklonováním v hostitelských (bakteriálních) buňkách, které byly transformovány nebo infikovány specifickými vektory, z nichž každý obsahoval více či méně definovaný inzert. Konstruují se dva základní typy genových knihoven: (1) genomové knihovny, odvozené od genomové (jaderné) DNA. V optimálním případě obsahují všechny geny daného organizmu. Obecný postup konstrukce genomové knihovny spočívá v izolaci konkrétního genu (úseku DNA) z donorové DNA obvykle za použití vhodné restriktázy, jeho včlenění do vektoru a vpravení takto připraveného vektoru do hostitelské buňky. V případě, že je jako vektor použit fág, je třeba před infekcí hostitele umožnit jeho sestavení (= packaging) in vitro. (2) cdna knihovny (complementary DNA), v nichž obsažené klonované úseky DNA jsou komplementární k mrna, ze které byly reverzně transkribovány. Obecný postup konstrukce cdna knihovny spočívá v izolaci mrna, její reverzní transkripci, syntéze řetězce komplementárního k získané ss-cdna, včlenění získaného produktu (ds-cdna) do vektoru a jeho vpravení do hostitelské buňky. Je-li jako vektor použit fág, je třeba před infekcí hostitele umožnit jeho sestavení in vitro. Chceme-li při klonování určitého eukaryotického genu dosáhnout jeho exprese a syntézy normálního genového produktu, je nutné použít jako výchozí materiál mrna, protože prokaryotický hostitelský organizmus nedisponuje systémem, který by uskutečnil posttranskripční úpravy primárního transkriptu. Navíc musí být použit tzv. expresivní vektor, tj. vektor, ve kterém je inzert pod vlivem vhodného promotoru v hostitelské buňce transkribován a translatován. Kterýkoli požadovaný klon lze z genomové i cdna knihovny získat za použití vhodných selekčních metod (např. hybridizace se sondou). XVIII.6 MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ METODY XVIII.6.1 IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN V současné době existuje velké množství různých modifikací základních izolačních metod. Zde si pouze uvedeme hlavní zásady, které mají obecnou platnost. Jednak je třeba si uvědomit, jaký organizmus a jaká jeho část je zdrojem nukleových kyselin. V každém případě je třeba získat suspenzi jednotlivých buněk nebo několikabuněčných klastrů. Pracujeme-li s orgány nebo tkáněmi, musíme jejich buňky nejprve alespoň částečně rozvolnit (fyzikálně, enzymaticky). Dále je třeba uvolnit obsah buněk. U živočišných buněk to lze poměrně snadno provést hypotonací, u buněk baktérií, hub a rostlin je třeba nejprve odstranit buněčnou stěnu a s uvolněnými protoplasty dále manipulovat obdobně jako s živočišnými buňkami. Po uvolnění buněčného obsahu je nutné odstranit maximum nežádoucích, balastních buněčných komponent vhodnými purifikačními metodami (vyvázání kationtů kovů chelatačním činidlem, enzymatická degradace proteinů proteinázou, preparativní elektroforetické dělení apod.), aby byla získána co nejčistší DNA nebo jednotlivé druhy RNA. V případě izolace DNA plazmidové, chloroplastové či mitochondriální je třeba získat frakce plazmidů, chloroplastů, mitochondrií (zpravidla ultracentrifugací v hustotním gradientu), v případě izolace RNA frakci ribozómů apod. U izolované DNA (RNA) je účelné ověřit její čistotu (např. fotometricky v UV oblasti, spektroskopicky, fluorimetricky) a provést kvantifikaci (tj. stanovit množství izolované nukleové kyseliny). Je-li třeba, získaná frakce obsahující nukleovou kyselinu, se přečiští (zopakováním některých fází izolace, elektroforeticky). 262

264 XVIII.6.2 HYBRIDIZACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Nukleové kyseliny mohou i za podmínek in vitro hybridizovat a podle reakčních podmínek produkovat hybridní molekuly DNA x DNA, DNA x RNA, RNA x RNA se vzájemně komplementárními řetězci. Metod, založených na této vlastnosti nukleových kyselin, se široce využívá například při identifikaci genů a původce biologického materiálu, v molekulárně genetické diagnostice, při studiu struktury a exprese genů, mutagenezenebo evolučních vztahů mezi různými taxony. Hybridizaci nukleových kyselin lze provést, jestliže jsou vlákna obou typů hybridizujících molekul v roztoku, nebo jestliže vlákna jednoho typu jsou v roztoku a vlákna druhého typu jsou zakotvena na pevném nosiči; zejména druhý způsob se aplikuje při hybridizaci se sondou. Existuje řada metod, založených na principu hybridizace nukleových kyselin. V těchto metodách se často používají různé molekulární sondy. Sondy jsou úseky DNA nebo RNA, resp. synteticky připravené oligo(deoxy)ribonukleotidy používané k identifikačním účelům. Vhodné značení sondy (radioaktivním izotopem, enzymem, protilátkou, fluoroforem apod.) se využívá k snadnější detekci produktu hybridizace (autoradiografie, barevná změna chromogenu způsobená enzymatickou reakcí, detekce fluorescence nebo chemiluminiscence). Níže jsou stručně popsány základní metody této kategorie. (1) SOUTHERNŮV BLOTTING je jednou ze základních metod identifikace specifických fragmentů DNA na bázi hybridizace molekul nukleových kyselin. Fragmenty DNA, rozdělené elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu za denaturačních podmínek (tj. ssdna), jsou z elektroforetického bločku přesávány vertikálně orientovaným kapilárním přenosem v prostředí vhodného pufru na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu a na té se fixují. Přesáté fragmenty DNA, fixované na membráně, jsou následně hybridizovány se značenou sondou o známé deoxyribonukleotidové sekvenci. Po uskutečněné hybridizační reakci následuje adekvátní způsob detekce místa hybridizace, tj. místa, kde se sonda spojila s komplementárním fragmentem DNA, fixovaným na membráně. Dnes již existuje několik variant tohoto klasického provedení Southernova blottingu, z nich uveďme např. elektroblotting (urychluje proces přesávání), dot-blot nebo spot-blot ( kapka analyzované DNA hybridizuje se sondou zakotvenou na pevném nosiči). (2) NORTHERN BLOTTING je analogií Southernova blottingu, avšak místo DNA se používá v hybridizační proceduře RNA. (3) WESTERN BLOTTING je obdobou Southernova blottingu, aplikovanou na proteiny. Některé odlišnosti se týkají detekce: membrána, na kterou se protein z elektroforetického bločku přesál, se inkubuje s protilátkou proti určité bílkovině. Je-li taková bílkovina na membráně přítomna, uskuteční se imunologická reakce typu antigen protilátka. Místo reakce se potom vizualizuje za použití další značené protilátky proti protilátce, použité k lokalizaci přesáté bílkoviny a produkt reakce se vhodným způsobem deteguje. (4) HYBRIDIZACE IN SITU (ISH) se provádí za použití molekulární sondy v permeabilizovaných buňkách na mikroskopických preparátech (cytologických, histologických). Značené sondy hybridizují s komplementárními úseky DNA nebo RNA uvnitř fixovaných buněk na preparátu. Detekce místa hybridizace se provádí metodou, vhodnou pro použitý způsob značení sondy. ISH nachází široké uplatnění např. v histopatologii k diferencování morfologicky nerozlišitelných buněk, k průkazu velmi malých 263

265 chromozomálních aberací, sekvencí onkogenů, genomů virů a dalších intracelulárních parazitů. Jedna z variant ISH, fluorescenční hybridizace in situ (FISH), je vhodná především k detekci specifických sekvencí DNA na preparátech metafázních i interfázních chromozomů; detekce místa hybridizace imunochemicky značené sondy s buněčnou DNA se provádí prostřednictvím fluorescenčně značených protilátek proti imunochemické značce sondy. Na doplnění: Animace hybridizace a restrikce Obr.: Southernův blotting. Zdroj: 264

266 Obr.: Northern blotting. Zdroj: Obr.: Westrn blotting. Zdroj: 265

267 XVIII.6.3. POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) Polymerázová řetězová reakce je metoda amplifikace fragmentu DNA in vitro. Fragment DNA, získaný obvykle za použití vhodné restriktázy, se vloží do reakční směsi, jejímiž hlavními složkami jsou specifické primery, dntp a DNA-polymeráza v iontově vyváženém reakčním prostředí (pufru). Reakce probíhá v termocykleru při cyklicky se měnících teplotách. Na začátku každého cyklu se nejprve amplifikovaná DNA denaturuje při teplotě kolem 95 C. Poté při nižší teplotě (kolem 60 C) dochází k anelaci, tj. ke komplementárnímu připojení primerů ke konci každého řetězce denaturované DNA. V další fázi cyklu při teplotě kolem 70 C dochází k extenzi, tj. syntéze (prodlužování) nukleotidového řetězce; tato syntéza začíná od 3 - konce primeru připojením 5 - konce dntp komplementárního k nukleotidu řetězce DNA, na který je tento primer navázán a pokračuje za katalytické aktivity DNA-polymerázy po celé délce amplifikovaného fragmentu. Po dokončení extenze se celý cyklus denaturace anelace extenze zpravidla mnohokrát opakuje. Po poslední extenzi dochází k terminaci PCR. Prostřednictvím PCR lze namnožit fragmenty DNA na požadované množství volbou počtu cyklů (n). Počet amplifikovaných fragmentů je teoreticky roven 2 n, tzn. zvyšuje se exponenciálně s počtem cyklů. Je patrné, že PCR skýtá možnost namnožit požadovaný úsek DNA bez použití vektorů, což je velkou předností této metody. Existuje několik modifikací a typů PCR. RT-PCR je variantou PCR, jíž předchází reverzní transkripce izolované RNA a získaná cdna se použije jako matrice. K amplifikaci lze tedy jako výchozí materiál použít i RNA. NESTED PCR je dvoustupňová amplifikace, vhodná zejména za situace, kdy je k dispozici pouze nepatrné počáteční množství DNA. Při této modifikaci PCR se používají dva typy primerů: vnější a vnitřní. Vnitřní primery jsou lokalizovány uvnitř oblasti (úseku) vymezené vnějšími primery. V prvním stupni se amplifikuje úsek DNA pomocí vnějších primerů. Ve druhém stupni se získaný amplifikát použije k amplifikaci kratšího úseku za použití vnitřních primerů. ALELOVĚ SPECIFICKÁ PCR je vhodná k detekci mutace, která nevytváří nové nebo neruší určité stávající restrikční místo. Při tomto typu PCR se používají tři primery: jeden tvoří zvolenou normální hranici amplifikovaného úseku DNA, druhý je komplementární k standardní (nemutované) sekvenci a třetí je komplementární k mutantní sekvenci. Detegovaná mutace tvoří hranici amplifikovaného úseku a je zakryta příslušným primerem. Jestliže se mutace typu substituce nachází na 3 - konci primeru, potom primer komplementární k standardní sekvenci bude hybridizovat pouze se standardní sekvencí, kdežto primer komplementární k mutantní sekvenci bude hybridizovat pouze s mutantní sekvencí. PCR IN SITU je variantou PCR, při které se vlastní reakce realizuje v permeabilizovaných buňkách přímo na cytologických nebo histologických preparátech. Produkty reakce lze detegovat některou z metod používaných při ISH (tzv. nepřímá PCR in situ) nebo některou z metod detekce značených komponent (primerů, amplifikovaných fragmentů) PCR (tzv. přímá PCR in situ). 266

268 Obr.: Celkové schéma PCR. Zdroj: 267

269 Obr.: PCR jednotlivé kroky. Zdroj: Obr.: Průběh PCR v reálném čase (real-time PCR). Zdroj: 268