Molekulárn. rní genetika

Transkript

1 Molekulárn rní genetika

2 Centráln lní dogma molekulárn rní biologie cesta přenosu genetické informace: DNA RNA proteiny výjimkou reverzní transkripce retrovirů: RNA DNA

3 Chemie nukleových kyselin dusíkaté baze: puriny (A,G) a pyrimidiny (T,C,U) A,G,T,C (DNA), A,G,U,C (RNA) vodíkové vazby A T, C G cukr: deoxyribóza, ribóza (pentóza) orientace 5-3, 3-5 (fosfodiesterová vazba mezi pozicí 5 jedné pentózy a pozicí 3 druhé pentózy) standardní zápis 5-3 kyselina orthofosforečná DNA člověka: stavební jednotka - nukleotid lineární dvoušroubovice v jádře buňky (chromatin / chromosomy) kruhová dvoušroubovice v mitochondriích tři formy DNA struktury A, B, Z pojem denaturace, renaturace, hybridizace, komplementarita

4 Lidský genom nukleotidových bazí/gameta cca genů délka asi 2m kódující / nekódující oblasti geny a genům podobné sekvence 20-30% a z toho pouhých 10% tvoří kódující DNA jedinečné sekvence / opakující se sekvence (repetitivní) repetitivní sekvence, např. DNA pro tvorbu rrna, histonů různě dlouhé repetice dinukleotidů (CA n ), trinukleotidů (CAG n ), telomery TTAGGG n ) strukturní změny v průběhu buněčného cyklu: DNA vlákno tvoří komplex s histony, struktura je pravidelná a vysoce organizovaná

5 Polymorfismy lidské DNA využívan vané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) SNP C / A TAGCCATCGGTA N GTACTCAATGATCAGCT G C T A 1

6 Polymorfismy lidské DNA využívan vané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) V 99.9% sekvence DNA se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.1% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DNA čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu prevalentních onemocnění. 2

7 DNA replikace semikonzervativní proces zajištění genetické identity dceřinných buněk probíhá v místech zvaných REPLIKON DNA-dependentní DNA-polymeráza syntéza pouze ve směru z toho důvodu nemůže probíhat plynule syntéza na antiparalelnímřetězci a musí se tvořit tzv. Okazakiho fragmenty složitý proces doprovázený řadou proteinů (primer / DNA-dependentní RNA-polymeráza)

8 gen

9 Přepis informace z genu - TRANSKRIPCE pracovní řetězec paměťový řetězec směr 5 3 jednovláknová mrna

10 Přepis informace z genu - TRANSKRIPCE DNA mrna, na základě komplementarity (T U) DNA-dependentní RNA-polymeráza aby mohl být gen přepisován, musí proběhnout kaskáda dějů (vliv dříve zmiňovaných transkripčních faktorů) před vlastním genem je oblast zvaná promotor, tam musí nasednout konkrétní stimulující enzym, který zároveň udá míru intenzity transkripce promotor má pro tyto vazby signální sekvence: TATA-box či CCAAT-box

11 Přepis informace z genu - TRANSKRIPCE přepis exonů i intronů nově vzniklé vlákno je chemicky upraveno, aby se vlastní informace v ní uložená nepoškodila a zároveň, aby byla molekula rozpoznána jakožto mrna, která má dále podléhat translaci (5 konec -čepička, 3 konec - polyadenilový konec, vystřižení intronů)

12 Translace přenos informace z mrna do sekvence AMK proces utváření polypeptidu se odehrává na ribozomech, které jsou tvořeny rrna a proteiny podjednotky 40S a 60S nutná přítomnost všech možných trna-amk, které se aktivují ATP translace je zahájena spojením iniciační trna s dalšími součástmi do komlexu se 40S podjednotky mrna svou 5 čepičkou nasedá do komplexu a je posunována do místa startovacího tripletu AUG, kterému odpovídá trna-met (40S a 60S se přiblíží) čtecí rámec ribozomální peptidy zajišťují peptidické vazby mezi AMK translace ukončena stop-kodonem

13 Tabulka kodódů pro konkrétn tní AMK

14 Posttranslační úpravy proteinů odstranění methioninu sbalení polypeptidu do 3D struktury chemická modifikace: přidání fosfátůči cukrů prekurzory proteinů jsou ve vhodných podmínkách štěpeny, aby získali svou funkčnost membránové proteiny a proteiny určené k exkreci jsou vybaveny v ER signální sekvencí glykoproteiny

15 Transkripce, translace - procvičen ení Proveďte všechny kroky vedoucí k tvorbě polypeptidu, který je kódován uvedeným úsekem paměťového řetězce DNA 5' ACATGGTCAGTGACACTGGAGTCAACTGAGAATC 3' Genetický kód 5' UUU 3' = Phe 5' UCU 3' = Ser 5' UAU 3' = Tyr 5' UGU 3' = Cys UUC = Phe UCC = Ser UAC = Tyr UGC = Cys UUA = Leu UCA = Ser UAA = stop UGA = stop UUG = Leu UCG = Ser UAG = stop UGG = Trp 5' CUU 3' = Leu 5' CCU 3' = Pro 5' CAU 3' = His 5' CGU 3' = Arg CUC = Leu CCC = Pro CAC = His CGC = Arg CUA = Leu CCA = Pro CAA = Gln CGA = Arg CUG = Leu CCG = Pro CAG = Gln CGG = Arg 5' AUU 3' = Ile 5' ACU 3' = Thr 5' AAU 3' = Asn 5' AGU 3' = Ser AUC = Ile ACC = Thr AAC = Asn AGC = Ser AUA = Ile ACA = Thr AAA = Lys AGA = Arg AUG = Met(start) ACG = Thr AAG = Lys AGG = Arg 5' GUU 3' = Val 5' GCU 3' = Ala 5' GAU 3' = Asp 5' GGU 3' = Gly GUC = Val GCC = Ala GAC = Asp GGC = Gly GUA = Val GCA = Ala GAA = Glu GGA = Gly GUG = Val GCG = Ala GAG = Glu GGG = Gly Start = start kodon ; stop = stop kodon (terminační kodon, nonsense - kodon)

16 Transkripce, translace - procvičen ení Proveďte všechny kroky vedoucí k tvorbě polypeptidu, který je kódován uvedeným úsekem paměťového řetězce DNA 5' ACATGGTCAGTGACACTGGAGTCAACTGAGAATC 3' + vlákno 3' TGTACCAGTCACTGTGACCTCAGTTGACTCTTAG 5' - vlákno 5' ACAUGGUCAGUGACACUGGAGUCAACUGAGAAUC 3' mrna met val ser asp thr gly val asn stop-kodon (terminační)

17 Genetické inženýrstv enýrství pozměnění genetického kódu umělými zásahy inzerce lidských genů do modelových organismů za účelem produkce konkrétních proteinů (např. inzulin) praktické uplatnění poznatků molekulární genetiky diagnostika dědičných chorob práce s kmenovými buňkami

18 Genová terapie oblast medicíny 21. století vpravení zdravého genu do nespecifického lokusu nahradí nefunkční gen v procesu homologní rekombinace se vyřadí nefunkční gen a normální gen se dostane na jeho místo v genomu nefunkční gen bude možné opravit pomocí selektivní reverzní mutace, která vrátí genu jeho běžnou funkci bude možné regulovat spínání a vypínání přepisu nestandardního genu ALE: nestabilita modifikované DNA v buňkách, zvýšená imunitní reakce na retroviry, navrácení nebezpečné infekční funkce pozměněných retrovirů, nepomůže u polygenní dědičnosti