Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse"

Mária Matoušková
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse Mgr. Jana Zavadilová NRL pro pertusi a difterii Státní zdravotní ústav Aktuality v diagnostice virových a bakteriálních infekcí, , SZÚ

Státní zdravotní ústav Aktuality v diagnostice

2 Výběr vhodné laboratorní metody Nástup symptomů Kultivace PCR (týdny) Sérologie u novorozenců a malých dětí kultivace a PCR co nejdříve u očkovaných dětí a dospělých - pokud kašel trvá méně než dva týdny kultivace a PCR - pokud kašel trvá déle než dva týdny PCR a sérologie

PCR co nejdříve u očkovaných dětí a dospělých - pokud kašel trvá méně

3 Kultivace 100% specifická, sensitivita klesá s délkou trvání příznaků Faktory ovlivňující senzitivitu: o načasování odběru konec inkubační doby, a 2 týdny trvání příznaků o ATB terapie o spolupráce pacienta o technika odběru - výtěr nebo aspirát z nosohltanu, ne stěr z tonzil, nosu, laryngeální výtěr.

a 2 týdny trvání příznaků o ATB terapie o spolupráce pacienta o technika

4 Odběr materiálu na kultivaci Výtěr z nosohltanu ne vatový tampón Tampón ze syntetické bavlny na drátku s transportním médiem (Amies s aktivním uhlím) Aspirát z nosohltanu

drátku s transportním médiem (Amies s aktivním

5 Odběr na kultivaci a PCR ze zadní stěny nosohltanu Tampón jemně zasunout přes nosní průduch těsně podél nosní přepážky a po spodní stěně nosní dutiny až k zadní stěně nosohltanu. Několikrát jemně pootočíme a tampón vytáhneme. U dětí je nutná fixace! Obrázek podle M. Riffelmann, Kodaň 2010

6 Transport vzorků pro kultivaci Materiál přepravovat a uchovávat do zpracování při pokojové teplotě NE V LEDNICI! Materiál zpracovat v laboratoři v den odběru, optimum do 4 hodin Vhodný odběr v odběrovém místě mikrobiologické laboratoře

Materiál zpracovat v laboratoři v den odběru, optimum do 4

7 Charcoal agar (Regan-Lowe) neselektivní selektivní (+ cephalexin 40mg/l) Kultivační média Bordet Gengou neselektivní selektivní (+ cephalexin 40mg/l) ph půdy 7,4±0.2, čerstvá krev půda na kultivační plotně vylitá do výšky 5 7 mm, skladovat max. 2 týdny Kultivační podmínky C, minimálně 7 dní, denní odečítání ploten

8 Roste Bordetella pertussis na krevním agaru? Zkoušeno na: o Columbia Oxoid o KA základ č. 3 Imuna o KA univerzální základ Imuna Otestováno 70 kmenů Ano, ale jen na Columbia Oxoid krevním agaru Růst na KA neznamená, že se nejedná o B. pertussis

3 Imuna o KA univerzální základ Imuna Otestováno 70 kmenů

9 Makroskopická identifikace kolonií I B. pertussis vyrůstá za 48 až 72 hodin, vytváří drobné stříbřité polokulovité kolonie, při doteku kličkou se rozetřou (nepohybují se), po 3-4 dnech inkubace kolonie větší kapky rosy, na Bordet-Gengou agaru zóna hemolýzy ; ; faculty.matcmadison.edu/mljensen

kolonie, při doteku kličkou se rozetřou (nepohybují se), po 3-4 dnech inkubace

10 Makroskopická identifikace kolonií II B. parapertussis vyrůstá do 48 hodin, kolonie jsou větší, šedostříbrné, při delší inkubaci vpadlé do půdy, na Bordet-Gengou agaru výrazná zóna hemolýzy a černohnědý pigment

šedostříbrné, při delší inkubaci vpadlé do půdy, na

11 Identifikace bakteriální kultury Sklíčková aglutinace s diagnostickými séry - po izolaci čisté kultury (ne starší než 48 hodin) MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight Mass Spectrophotometry)

hodin) MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization -

12 Sérotypizace izolátů B. pertussis v NRL Monoklonální Ab proti fimbriím Známy 2 typy fimbrií Fim2 a Fim3 Rozeznáváme kmeny typu Fim2; Fim2,3 a Fim3 V současné době převažuje typ Fim3 Vzácně pasážováním může dojít ke změně sérotypu

13 Co dalšího děláme s izoláty B. pertussis? Grant IGA MZ ČR ( ) U izolátů provádíme: MAST MLST MLVA

Real-Time PCR Rychlá a vysoce citlivá metoda - význam hlavně u novorozenců a neočkovaných malých dětí Pozitivní výsledky i při ATB terapii (kultivace negativní) Jen v časné

14 Real-Time PCR Rychlá a vysoce citlivá metoda - význam hlavně u novorozenců a neočkovaných malých dětí Pozitivní výsledky i při ATB terapii (kultivace negativní) Jen v časné fázi onemocnění (po 3. týdnu klesá citlivost) Riziko kontaminace nižší než u klasického PCR pozor na kontaminaci z prostředí Riffelmann et al., 2005 J Clin Microbiol 43:4925-9

15 Odběr materiálu na PCR technika stejná jako u kultivace, jiná odběrová souprava Výtěr z nosohltanu Nylonový tampón na flexibilní plastové tyčince nebo odběrová souprava s tekutým médiem (Eswab, pro průkaz respiračních virů) Aspirát z nosohltanu

plastové tyčince nebo odběrová souprava s tekutým médiem (Eswab,

16 Transport vzorků pro PCR Nylonový tampón je přepravován suchý - v den odběru přepravovat při pokojové teplotě - při nutnosti skladování přepravovat zmrazený (-20 C) Odběrová souprava s tekutým médiem - v den odběru transport při 2-8 C - při nutnosti skladování zmrazit (-20 C) V laboratoři okamžitě zpracovat nebo skladovat při -20 C do zpracování

C) Odběrová souprava s tekutým médiem - v den odběru transport při 2-8 C - při

17 Real-Time PCR sekvence B. pertussis, B. parapertussis IS481 v mnoha kopiích u B.pertussis, ale není 100% specifická Tato sekvence se vyskytuje i u dalších bordetel: B. holmesii, B. bronchiseptica PT promoter (ptxa-pr)- sekvence specifická pro B. pertussis, ale má nižší sensitivitu IS1001 v rutinním provozu specifická pro B. parapertussis Reischl et al., 2001

holmesii, B. bronchiseptica PT promoter (ptxa-pr)- sekvence specifická pro B.

18 Real-Time PCR interpretace výsledků IS481 pozitivní a ptxa-pr pozitivní - infekce způsobená B.pertussis IS481 pozitivní - infekce pravděpodobně způsobená B.pertussis IS1001 pozitivní - infekce pravděpodobně způsobená B.parapertussis Riffelmann et al. 2005; Caro et al. 2009

pertussis IS481 pozitivní - infekce pravděpodobně způsobená B.

19 Využití odběrového systému ESwab Recovery of Bordetella pertussis from PCR positive nasopharyngeal samples is dependent on bacterial load (J. Clin. Microbiol. 12: ) Z této odběrové soupravy se úspěšně dařila kultivace B. pertussis u vzorků pozitivních v metodě Real-Time PCR Vzorky byly před odesláním ke kultivaci skladovány při 4 C max. týden Laboratoře, které používají tuto odběrovou soupravu poslat médium do NRL na kultivaci!

12: 4114-4115) Z této odběrové soupravy se úspěšně dařila kultivace B.

20 Sérologie pertuse I Nelze odlišit protilátky postinfekční od postvakcinačních Hodnota protektivní koncentrace protilátek proti pertusovému toxinu není stanovena nemá smysl plošně vyšetřovat Ab u ohrožených skupin, je známa pouze hodnota séropozitivity (tzn. reakce IS na setkání s PT) Riffelmann et al., 2010; Guiso et al., 2010; Watanabe et al., 2006

plošně vyšetřovat Ab u ohrožených skupin, je známa pouze hodnota séropozitivity (tzn.

Sérologie pertuse II Průkaz onemocnění (ELISA, IU/ml) stanovení dynamiky IgG Ab proti pertusovému toxinu v párových vzorcích Vyžaduje 2 vzorky séra (akutní a rekonvalescentní) s odstupem 3 týdnů -

21 Sérologie pertuse II Průkaz onemocnění (ELISA, IU/ml) stanovení dynamiky IgG Ab proti pertusovému toxinu v párových vzorcích Vyžaduje 2 vzorky séra (akutní a rekonvalescentní) s odstupem 3 týdnů - poskytuje pozdní, retrospektivní diagnózu Séra se vyšetřují současně v jedné laboratoři! Diagnostická sérologie nemůže být správně interpretována po dobu 1 roku od očkování acelulární pertusovou vakcínou (ap) u těchto pacientů kultivace, PCR Riffelmann et al., 2010; Guiso et al., 2010; Watanabe et al., 2006

22 Sérologie pertuse - interpretace výsledků Pro správné hodnocení - data odběru obou vzorků - datum narození pacienta - vakcinační anamnéza pacienta ELISA (Pertuse): jako signifikantní (svědčící pro proběhlé onemocnění) se hodnotí vzestup koncentrace Ab o 100% počáteční hodnoty (hodnota naměřená v prvním z párových sér) nebo pokles koncentrace Ab o 50% počáteční hodnoty (platí pro soupravy detekující IgG proti PT v IU/ml)

23 Doporučená literatura Guidance and protocol for the serological diagnosis of human infection with Bordetella pertussis (ECDC, Technical document) Guidance and protocol for the use of real-time PCR in laboratory diagnosis of human infection with Bordetella pertussis or Bordetella parapertussis (ECDC, Technical document) What to do and what not to do in serological diagnosis of pertussis: recommendations from EU reference laboratories (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: ) Recovery of Bordetella pertussis from PCR positive nasopharyngeal samples is dependent on bacterial load (J. Clin. Microbiol. 12: ) Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis /Bordetella parapertussis (WHO/IVB/04.14 manual)

24 Poděkování Laboratořím, které nám zasílají izoláty a séra ke konfirmaci Epidemiologie: MUDr. Kateřině Fabiánové Kolektiv laboratoře: MUDr. Daniele Lžičařové Haně Klemové Janě Šimlové

25 Děkuji za pozornost SZÚ- budova č patro, č.d. 17 Tel.: jzavadilova@szu.cz

Podobné dokumenty

PERTUSE LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

PERTUSE LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Jana Zavadilová Státn tní zdravotní ústav, Praha Konference Problematika Pertuse, 15.4. 2011 1 EU definice potvrzeného případu p padu pro pertusi vyhláš áška č.. 275/2010