Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Transkript

1 Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Čtvrtek 11:30 13:00 1. Struktura a replikace DNA ( , Mgr. M. Čudejková, Ph.D) 2. Metody molekulární biologie I ( , Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D) 3. Metody molekulární biologie II ( , Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D) 4. Transkripce genu a její regulace ( , Mgr. M. Čudejková, Ph.D) 5. Molekulární biotechnologie a transgenní organismy ( , Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D) 6. Translace a tvorba proteinů ( , Mgr. M. Čudejková, Ph.D) 7. Test ( )

2 Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Čudejková 1. Struktura a replikace DNA

3 Literatura: Alberts a kol.: Základy buněčné biologie Espero Publishing, 2000 Garrett & Grisham: Biochemistry 2nd ed., Saunders College Publishing, 1999

4 Nositelem genetické informace je DNA Griffith (1928) naočkoval baktérie způsobující penumónii do myší Směs tepelně denaturovaného virulentního typu S a nevirulentního typu R myši usmrtila Vysvětlení: typ R byl transformován typem S! Avery (1944) prokázal, že transformaci způsobuje DNA!

5 Griffithův pokus na myších

6 Další důkazy Lederberg a Tatum (1946) ukázali, že 2 kmeny E. coli lišící se autotrofií vůči aminokyselinám jsou schopny si vyměňovat geny

7 Další důkazy Hershey a Chase (1952) při studiu bakteriofágů, označili jeho DNA s 32 P a proteiny s 35 S Další generace bakteriofága produkovaná po infekci baktérií obsahovala 32 P (tedy DNA z původního bakteriofága), ale ne 35 S (z původních proteinů)!

8 Základní dogma molekulární biologie

9 Nukleové kyseliny, DNA a RNA (primární struktura) Polymery spojené 3' - 5' fosfodiesterovou vazbou Základní složky nukelových kyselin (monomery) tvoří: 1. fosfát zbytek kyseliny ortofosforečné 2. ribonukleosid (RNA) / deoxyribonukleozid (DNA): - ribóza (RNA) / deoxyribóza (DNA) - dusíkatá báze: - purínové (A, G) - pyrimidínové (T, C, U) AMP - Adenosinmonofosfát

10 Základní složky nukleových kyselin

11 RNA vs. DNA

12 Sekvence se vždy čte od 5' -konce k 3' konci V sekvenci genu to odpovídá od N-konce k C-konci proteinu DNA jeden typ, jedna úloha uložení genetické informace RNA - 3 základní typy a úlohy - ribosomální RNA (rrna) struktura a funkce ribosomu - mediátorová RNA (mrna) přenáší informace o genech - transferová RNA (trna) přenáší aminokyseliny Další typy RNA snrna, snorna, mikro RNA, atd.

13 Rozdíly mezi DNA a RNA Proč DNA obsahuje thymin? Cytosin samovolně deaminuje a vytváří uracil Enzymy opravující chyby v DNA jsou schopny rozpoznat tyto mutace a nahrazují takovýto uracil cytosinem Jak byl ale tyto enzymy rozpoznaly přirozený uracil od mutantního? DNA tedy obsahuje thymin (5-methyl-uracil) namísto uracilu Proč je DNA 2'-deoxy a RNA není? Vicinální -OH skupiny (2' a 3') v RNA způsobují její náchylnost k hydrolýze DNA, která neobsahuje 2'-OH je stabilnější Důvod genetický materiál musí být stabilní RNA je použita a poté degradována

14 Dvoušroubovice DNA (sekundární struktura) Erwin Chargaff měl data o párování bazí, ale nedokázal je interpretovat (A=T, G=C, zastoupení báz se mezi různymi organismy liší) Rosalinda Franklinová získala difrakční X-ray data vlákna DNA Francis Crick objevil, že je to šroubovice (helix) James Watson odvodil princip párování bazí prostřednictvím vodíkových vazeb Objev struktury DNA 1953 Rentgenový difraktogram svisle orientovaného vlákna DNA.

15 Antiparalelní dvoušroubovice Existuje několik konformací DNA Watson-Crickovská pravotočivá B-DNA, pravotočivá A-DNA, pravotočivá C-DNA, a levotočivá Z-DNA 13/08/konformacni-rodinydna.html

16 Struktura DNA a párování bazí

17 E. coli - průměr vlákna 2 nm, délka 1.6 x 10 6 nm, složená struktura (buňka E. coli má délku 2000 nm) Lidská DNA ~2 metry, jádro buňky 5 µm, DNA uložena ve formě chromatinu, histony

18 Struktura dvoušroubovice DNA

19 Terciární struktura DNA Prostorové uspořádání dvoušroubovice Nadšroubovicové vinutí - superhelix DNA (a nebo např. dvoušroubovice uzavřená do kruhu, nebo lineární dvoušroubovice připevněná o podklad) Terciární strukturu zabezpečují enzymy - topoisomerasy

20 Buňka obsahuje kompletní genetickou informaci o organismu

21 Strom života Bacteria, Archaea ~ genes, Eukaryotes ~ genes

22 Prokaryota

23 Struktura eukaryotní buňky

24 Chromosomy u člověka

25 Velikost genomů (bp base pairs) Amoeba dubia Homo sapiens ~ ~ Paradox hodnoty C (velikost genomu není v souladu s komplexitou organismu)

26 Velikost genomu

27 Velikost genomu

28 Porovnání velikostí různých genomů

29 Replikace DNA Semikonzervativní model Prokázali Matthew Meselson a Franklin Stahl (1958) pomocí izotopového značení Replikace DNA vede k vytvoření dvou DNA molekul, ve kterých je jedno vlákno z původní a druhé zcela nové

30 Replikace DNA Syntéza DNA začína v replikačních počátcích (typická sekvence, bohatá na AT, bakterie jeden rep. počátek, eukaryota více rep. počátků, iniciační proteiny) Syntéza DNA probíhá v tzv. replikačních vidličkách

31 Vlastnosti replikace DNA Nejlépe prozkoumány u E. coli, mnohé vlastnosti obecné Replikace je obousměrná - probíhá ve dvou replikačních vidličkách, které se pohybují v opačných směrech Dvoušroubovice musí být rozvinuta - helikasy Překroucení (supercoiling) musí být kompenzován - DNA gyrasa (topoisomerasa typu II) SSB proteiny (single strand binding) ochraňují jednovláknovou DNA před znovuspárováním

32 DNA replikace je semidiskontinuální: Vedoucí vlákno se replikuje průběžně Druhé vlákno se replikuje v protisměru prostřednictvím Okazakiho fragmentů, které musí být poté spojeny (Tuneko and Reiji Okazaki) Replikační vidlička

33 DNA-dependentní DNA-polymerázy syntetizují komplementární vlákno DNA jen jedním, a to 5-3 směrem! DNA-polymeráza nedokáže začít syntetizovat nové vlákno enzym primáza syntetizuje k DNA komplementární RNA primer, který pak DNA-polymeráza využije pro syntézu nového vlákna DNA RNA-primery jsou odstraněny a DNA je dosyntetizována opravnou DNA-polymerázou Okazakiho fragmenty jsou spojeny dohromady DNA-ligázou

34 Replikační vidlička a replikační aparát

35 Důkaz obousměrné replikace DNA

36 Enzymologie replikace DNA DNA polymerasa I (opravná DNA polymerasa) U baktérie E. coli Arthur Kornberg (1957) prokázal existenci DNA polymerasy I DNA pol I vyžaduje všechny 4 nukleotidy, templát a primer, který se páruje s templátem a vytváří krátký úsek dvoušroubovice Replikace probíhá od 5' k 3' - konci, nukleotidy jsou připojovány od 3'-konce vlákna DNA pol I katalyzuje kolem 20 cyklů polymerizace než se nové vlákno oddělí od templátu Pol I z E. coli je monomer, 928 aminokyselin (109 kda) Kromě 5'-3' polymerásové aktivity, enzym má také 3'-5' a 5'-3' exonukleasové aktivity

37 3-5 exonukleasová funkce (odstraňuje chybný/nepárový nukleotid) 5-3 exonukleasová funkce (vyštepuje primery RNA)

38 E. coli DNA Polymerasa I

39 DNA Polymerasa III Hlavní" polymerasa u E. coli = DNA-replikasa Deset rozdílných podjednotek Jádro" enzymu má 3 podjednotky - polymerasa exonukleasa - neznámá funkce β podjednotka vytváří prstenec kolem DNA Procesivita - 5 millionů bazí!

40 E. coli DNA Polymerasa III

41 DNA replikace u eukaryot Stejný princip jako u E. coli, ale komplexnější Lidská buňka: kopírování 6 miliard bp Mnoho počátků replikace: 1 na kbp Známo několik DNA polymeras DNA-polymerasa α - 4 podjednotky - polymerasová aktivita (procesivita = 200) - primasová aktivita - ne 3-5 -exonukleasová aktivita

42 Buněčný cyklus

43 Jiný způsob vzniku DNA RNA-řízená DNA polymerasa Howard Temin (1964) pozoroval, že inhibitory DNA syntézy zabraňují infekci buněk v kultuře RNA viry DNA tedy zprostředkovává replikaci viru. Temin a Baltimore (1964) nezávisle objevují RNA řízenou DNA polymerasu reverzní transkriptasu

44 Opravy poškozené DNA Základní rozdíl oproti RNA, proteinům, lipidům, atd. Všechny ostatní složky mohou být nahrazeny, ale DNA musí být zachována DNA v buňkách podléhá kontinuálnímu poškozování Buňky potřebují nástroje pro opravy chybějících, pozměněných nebo nesprávných bazí, opravy insercí a delecí, poškození UV zářením pyrimidinové dimery, přerušení vlákna, cross-link Existují dva základní mechanismy oprav: oprava chyb v párování bazí (mismatch repair) a opravy chemického poškození

45 Mutace odpovědná za vznik genetické choroby srpkové anémie

46 Opravy chyb v párování bazí (Mismatch repair) Opravné enzymové systémy kontrolují dvoušroubovici DNA a identifikují nesprávně párované báze, poté vyříznou chybný usek a nahradí jej. Příkladem je methylační dráha u E. coli. Methylace DNA probíhá po replikaci, takže tento systém identifikuje methylovaný řetězec jako původní a opraví nesprávně párovanou bázi na druhém řetězci.

47 Restrikční endonukleasy Baktérie dokážou zabránit ("restrict ) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli.

48 Opravy chemického poškození DNA Tvorba pyrimidinových dimerů působením UV záření Pyrimidinové dimery mohou být přímo opraveny enzymem fotolyasou

49 Opravy chemického poškození DNA Vystřihnutí a oprava: DNA glykosylasy odstraní poškozenou bázi a vytvoří AP místo. AP (Apurinic/apyrimidinic) endonukleasa rozštěpí poškozený řetězec, endonukleasa odstraní několik residuí okolo a mezera je vyplněna pomocí DNA polymerasy a DNA ligasy.

50 Oprava poškozené báze v DNA

51 Mechanismus genové rekombinace (rekombinační oprava) Obecná rekombinace: výměna homologních segmentů mezi dvěma molekulami DNA (crossing-over během meiozy) Robin Holliday (1964) navrhl model využívající jednovláknového naštípnutí v homologních místech. Dochází k rozvinutí dvoušroubovice a propojení (ligaci) dvou naštípnutých homologních řetězců vzniká Hollidayovo spojení (Holliday junction)

52 Holliday junction

53

54 ion.php?ani=169&cat=biology