HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E)

Transkript

1 HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E) Ref /09

2 ÚČEL POUŽITÍ Sada HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E) je určena pro kvalitativní stanovení frakce transferinu ß2 v lidských biologických tekutinách. Cílem postupu je charakterizovat desialylovaná frakci transferinu imunofixací prováděno protilátkou označenou peroxidázou po elektroforéze na agarózovém gelu v poloautomatickém systému HYDRASYS. Každý agarózový gel v kitu HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E) je určen k analýze šesti vzorků. Pro diagnostické použití In Vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU Transferin ß2 je desialylovaná forma transferinu. Tato desialylovaná forma je ve velkém zastoupení přítomná v cerebrospinální tekutině (CSF) a perilymfě. Sialylovaná forma transferinu je normální složkou séra a CSF. Částečně až zcela desialylované formy jsou přítomny v nízkých zastoupeních v normálním séru zdravých pacientů. Přítomnost frakce transferinu ß2 v nosních a ušních sekretech naznačuje únik CSF. Zkouška je založena na elektroforetické separaci různých isoforem transferinu (sialylovaných a částečně až zcela desialylovaných forem) následované imunofixaci peroxidázou označené protilátce transferinu. Tato protilátka reaguje stejně se všemi formami transferinu. protilátky označené peroxidázou zesiluje citlivost a umožňuje detekci frakce transferinu ß2 v biologických tekutinách od koncentrace 8 až 10 μg/dl. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E) VAROVANÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č Agarózové gely (připravené k použití) 10 gelů Pufrované proužky (připravené k použití) 10 balení po 2 kusech Ředicí roztok pro vzorek CSF / A1AT / TRF (připravený k použití) 1 lahvička, 85 ml Saturační roztok (připravený k použití) 1 lahvička, 85 ml Ředicí roztok protilátky CSF / TRF (připravený k použití) 1 lahvička, 6 ml Promývací roztok A1AT / TRF (připravený k použití) 1 lahvička, 70 ml Rehydratační roztok (připravený k použití) 1 lahvička, 70 ml Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 (připravené k použití) 1 lahvička, 40 ml TTF1 (zásobní roztok) 1 lahvička, 0,5 ml TTF2 (zásobní roztok) 1 lahvička, 0,5 ml Aplikátory (připravené k použití) 1 balení po 10 kusech (6 zubů) Filtrační papíry - tenké 1 balení po 10 kusech Hřebeny z filtračních papírů 1 balení po 10 kusech (6 zubů) Filtrační papíry - silné 5 balení po 10 kusech v každém Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechna činidla ze stejné sady musí být vždy používána společně a podle pokynů uvedených v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumivý roztok ph 8,9 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu a imunofixaci bílkovin. Gely skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). (šipky na přední straně krabice musí směřovat nahoru). NEZMRAZUJTE. Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. Jsou stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu. Nepoužívejte : (I) kdy se vytvoří krystaly nebo sraženiny na povrchu gelu nebo jeho struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (II) jsou-li přítomny mikroby a plísně, nebo (III) když je v obalu gelu abnormální množství tekutiny (výsledek vypocení tlumivého roztoku z gelu v důsledku nesprávného skladování) SEBIA NÁVOD - Czech

3 2. PUFROVANÉ PROUŽKY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumivý roztok s ph 9,2 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované proužky fungují jako zásobník pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt gelu a elektrod. Pufrované proužky skladujte ve svislé poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě nebo v chladničce. (šipky na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku balení pufrovaného proužku. NEZMRAZUJTE. Pokud je balení otevřeno a pufrovací proužky vyschlé, zneškodněte je. 3. ŘEDICÍ ROZTOK NA VZOREK CSF / A1AT / TRF Ředicí roztok vzorku je připraven k použití. Obsahuje : přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Na ředění vzorků. Ředicí roztok pro vzorek skladujte v chladničce (2 až 8 C). Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Ředicí roztok nesmí obsahovat sraženiny. 4. SATURAČNÍ ROZTOK Saturační roztok je připraven k použití. Obsahuje : přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro nasycení všech vzorků železem. DŮLEŽITÉ : Před použitím se doporučuje saturační roztok dobře promíchat. Saturační roztok na antisérum může být uchováván při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky saturačního roztoku. POZNÁMKA : Během skladování může saturační roztok mít dvě fáze bez jakýchkoli negativních účinků na jeho vlastnosti. Horní fáze je bezbarvá a spodní fáze je žlutooranžová se velmi malými částicemi v suspenzi. Po mírném promíchání se roztok stane znovu homogenní a je plně použitelný. 5. ŘEDICÍ ROZTOK PROTILÁTKY CSF / TRF Ředicí roztok na antisérum je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 7,0 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Na ředění protilátky před použitím. Ředicí roztok na antisérum může být uchováván při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Ředicí roztok na antisérum nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKA : Během skladování se může barva ředicího roztoku změnit na žlutou, což nemá nepříznivý vliv na jeho vlastnosti. 6. PROMÝVACÍ ROZTOK A1AT / TRF Promývací roztok A1AT / TRF je připraven k použití. Obsahuje : tlumivý roztok s ph 10,5 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro vymývání agarózového gelu po odsávacím kroku, který následuje po inkubaci s peroxidázou značeném antiséru. Skladování, stabilita a známky zhoršování Promývací roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce a je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Promývací roztok nesmí obsahovat sraženinu. 7. REHYDRATAČNÍ ROZTOK Rehydratační roztok je připraven k použití. Obsahuje : přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K rehydrataci agarózového gelu před a po vizualizačním kroku, založeném na působení peroxidázy. Rehydratační roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Rehydratační roztok nesmí obsahovat sraženiny

4 8. ROZPOUŠTĚDLO TTF1 / TTF2 Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 je připraveno k použití. Obsahuje složky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro přípravu vizualizačního roztoku TTF, jak je popsáno v bodu 9. Skladování, stabilita a známky zhoršování Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 lze skladovat a je stabilní při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla TTF1 / TTF2. Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 nesmí obsahovat sraženiny. 9. TTF1 A TTF2-30 minut před použitím uložte lahvičky TTF1 a TTF2 při pokojové teplotě. - Každou lahvičku před přípravou pracovního vyvolávacího roztoku dobře homogenizujte promícháním. - Těsně před použitím připravte pracovní vyvolávací roztok TTF. Abyste vyloučili riziko srážení, přidávejte nezbytné reagencie v následujícím pořadí : 2 ml rozpouštědla TTF1 / TTF2, 50 μl TTF1, 50 μl TTF2 a 2 μl 30 % peroxidu vodíku (H 2 O 2 ). Vizualizace imunofixovaných bílkovin protilátkou označenou peroxidázou. Skladování, stabilita a známky zhoršování Lahvičky TTF1 a TTF2 skladujte v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítcích lahviček TTF1 a TTF2. Roztoky TTF1 a TTF2 nesmí obsahovat sraženiny. DŮLEŽITÉ : Po skladování při 2 8 C mají zásobní roztoky TTF1 a TTF2 pevné skupenství, ale při pokojové teplotě se snadno znovu rozpustí. Lahvičky TTF1 a TTF2 musí být umístěny v pokojové teplotě 30 minut před použitím. Každou lahvičku před přípravou pracovního vyvolávacího roztoku dobře homogenizujte promícháním. 10. APLIKÁTORY Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků na gel. Uskladnění Aplikátory skladujte v suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 11. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Nařezané bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Uskladnění Tenké filtrační papíry skladujte v suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 12. HŘEBENY Z FILTRAČNÍCH PAPÍRŮ Hřebeny z tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití určené k odsátí protilátky z povrchu gelů po provedení imunofixace. Uskladnění Hřebeny z filtračního papíru skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v suchém místě. 13. SILNÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Bločky tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití určené k odsátí nevysrážených bílkovin z povrchu gelů po provedení imunofixace, vymývání, rehydratace a přebytků vizualizačního činidla Uskladnění Tlusté filtrační papíry skladujte v suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVANÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. PROTILÁTKA ANTI-TRANSFERRIN(E) PER Lahvička antiséra (SEBIA, kat. č. 4748) obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidskému transferinu konjugované s peroxidázou. Antisérum je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky lyofilizovaného antiséra v 0,7 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok. Pro analýzu 6 vzorků zřeďte antisérum ředicím roztokem antiséra : 15 μl rozpuštěného antiséra anti-transferrin(e) - PER a 285 μl ředicího roztoku na antisérum. Dobře zamíchejte. K imunofixaci a vizualizaci izoforem transferinu rozdělených elektroforézou. Před rozpuštěním skladujte lyofilní anitsérum v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice

5 Rozpuštěné roztoky antiséra skladujte při 2-8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmrazeno (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců ; doporučuje se zmrazit v mikrozkumavkách se šroubovacími víčky, aby se zabránilo vypařování. Toto vypařování zvyšuje koncentraci, která vede k příliš vysoké intenzitě barvení během enzymatické vizualizace. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2 8 C nebo při - 18 / - 30 C DOBŘE homogenizujte rozředěné antisérum před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmrazené antisérum při 2-8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. POZNÁMKA : Antiséra mohou pocházet z různých zvířecích druhů. Nemíchejte dvě různé lahvičky s antiséry i když jsou stejné specifikace a při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičky pipety. POZNÁMKA : Během přepravy může být antisérum uchováno bez chlazení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. 2. PEROXID VODÍKU : H 2 O 2, 110 objemů (30 %) K přípravě vizualizačního roztoku TTF, jak je popsáno v části "TTF1 A TTF2". Uskladnění Peroxid musí být uchováván v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 C). Při dávkování vždy používejte čistou pipetu, abyste zabránili kontaminaci obsahu lahve. 3. FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 5 ml) je připraven k použití. Pro ředění viskózních vzorků. Skladujte při pokojové teplotě. Je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku Fluidil. Fluidil nesmí obsahovat sraženiny. 4. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 ml v každé) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 ml zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Pro promyti gelu po enzymatické vizualizaci a sušení. Pro promývání barvicího prostoru systému HYDRASYS. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Nepřidávat azid sodný. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 5. HYDRASYS PROMÝVACÍ ROZTOK Každá lahvička promývacího roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumivý roztok ph 8,7 ± 0,5. Prací roztok HYDRASYS je určen pro čištění barvicího prostoru HYDRASYS. Používejte pravidelně, například když se přístroj používá denně, čistěte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm

6 POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém HYDRASYS SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN PN 1200, HYDRASYS 2 PN 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING PN 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING PN 1203, HYDRASYS PN 1210 nebo PN 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING PN Vlhká zásobní komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS. 3. Vodicí tyčka šablony dodávaná se systémem HYDRASYS SEBIA. 4. Příslušenství pro HYDRASYS CSF, SEBIA, kat. č Pipety : 2 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl a 5 ml. 6. Pro optimální kvantitativní analýzu gelu : Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA or PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Odběr vzorků musí být v souladu s běžnými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Doporučuje se provádět analýzu s čerstvými vzorky nebo vzorky skladovanými v chladničce (2 až 8 C) po dobu až jednoho týdne. Pro delší skladovací doby uchovávejte vzorky zmrazené. Pro nosní a ušní sekrety je minimální požadovaný objem pro analýzu 10 μl. vzorků POZNÁMKA : Doporučuje se analyzovat současně vzorek sekretu a séra pacienta. Tato analýza pomůže interpretaci výsledků po densitometrickém snímání elektroforetického záznamu v případě kontaminace vzorku sekretu krví (viz odstavec Interpretace). Vzorek sekretu : - Smíchejte 1 objemový díl vzorku sekretu s 1 objemovým dílem saturačního roztoku, předem homogenizovaného jemným promícháním. - Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě. POZNÁMKY : - Je možné použít vyšší ředění vzorku sekretu. V takovém případě nejprve zřeďte vzorek ředicím roztokem CSF / A1AT / TRF a potom smíchejte se stejným objemem saturačního roztoku. - Inkubujte 2 až 5 minut při pokojové teplotě. - Když je vzorek velmi viskózní, doporučuje se ošetřit ho redukčním roztokem. Připravte redukční roztok obsahující 1 % beta-merkaptoethanolu (BME) v roztoku Fluidil. Smíchejte 1 objemový díl redukčního roztoku se 3 objemovými díly vzorku, promíchejte na vortexu a čekejte minimálně 15 min (maximálně 30 minut) a potom použijte standardní postup. - Když je vzorek odebrán tampónem, navlhčete tampón minimálním objemem saturačního roztoku a obnovte vzorek sekretu odstředěním. Vzorek séra : - Zřeďte 10krát vzorek séra v ředicím roztoku na vzorek CSF / A1AT / TRF a smíchejte 1 objemový díl tohoto zředěného vzorku séra s 1 objemovým dílem saturačního roztoku předem homogenizovaného jemným promícháním. - Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě. Pozitivní kontrola : Vzorek mozkomíšního moku (CSF) může být vyhodnocen jako pozitivní kontrola. - Smíchejte 1 objemový díl CSF s 1 objemovým dílem saturačního roztoku předem homogenizovaného jemným promícháním. - Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě. Negativní kontrola : Normální kontrolní roztok séra, SEBIA, kat. č. 4785, může být stanoven jako negativní kontrola. - Rozpusťte lahvičku normálního kontrolního roztoku séra podle pokynů v příbalovém letáku normálního kontrolního roztoku séra. - Zřeďte 75krát normální kontrolní roztok séra v ředicím roztoku na vzorek CSF / A1AT / TRF a smíchejte 1 objemový díl tohoto zředěného roztoku kontrolního séra s 1 objemovým dílem saturačního roztoku předem homogenizovaného jemným promícháním. - Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě. Kontrola polohy : Kontrolní ß2 Transferrin(e), SEBIA, kat. č. 4769, může být stanoven pro kontrolu polohy, ale frakce asialotransferinu () a disialotransferin u() jsou v elektroforetickém záznamu blíže ke katodě, než stejné frakce ve vzorcích séra nebo CSF. - Rozpusťte lahvičku kontrolního ß2 Transferrin(e) podle pokynů v příbalovém letáku kontrolního ß2 Transferrin(e). - Zřeďte 50krát ß2 Transferrin(e) kontrolní v ředicím roztoku na vzorek CSF / A1AT / TRF a smíchejte 1 objemový díl tohoto zředěného roztoku kontrolního séra s 1 objemovým dílem saturačního roztoku předem homogenizovaného jemným promícháním. - Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě. Následující tabulka obsahuje některé příklady přípravy podle typu vzorku k analýze, jak bylo popsáno výše. DŮLEŽITÉ : Před provedením analýzy je nezbytné inkubovat vzorek saturačním roztokem

7 Typ Objem vzorku (μl) Objem ředicího roztoku na vzorek CSF / A1AT / TRF (μl) Objem saturačního roztoku (μl) Konečné ředění vzorku Vzorek sekretu /2 Vzorek séra od pacienta /20 CSF /2 Normální kontrolní sérum /150 ß2 Transferrin(e) kontrolní /100 POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrový přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarosových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : nanesení vzorku, elektroforetickou migraci, inkubaci s činidly, přerušení enzymatické reakce, odsátí a závěrečné vysušení gelu. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely, nanesení reagentů a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. DŮLEŽITÉ : Nastavte pozici dynamické šablony tak, aby byly vyrovnány elektroforetické profily a jamky masky (viz uživatelský návod systému HYDRASYS / HYDRASYS 2). POZNÁMKA : Postup s HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E) může být prováděn s verzí softwaru systému HYDRASYS nebo verzí softwaru 2.2x systému HYDRASYS 2 a následujících verzích. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte přístroj HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře. - Naneste 10 μl zředěného vzorku do každé jamky (viz obr. 1). Aplikátor naplňte do 2 minut. - Naneste 10 μl ředicího roztoku na vzorek do jamek aplikátoru, které se nepoužívají. Doporučuje se předem identifikovat tyto jamky a označit je, aby se vyloučila amplifikace vzorku v těchto jamkách. - Vložte aplikátory do vlhké zásobní komory zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček) ; - Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po aplikaci posledního vzorku. Pro pozdější použití (až do 8 hodin) uložte celou komůrku do chladničky. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku vlhké komory. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte nahoru migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů. VAROVÁNÍ : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy! 4. Z nabídky přístroje vyberte program migrace "B2 TRF (SM) TTF". 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované proužky uchopením za plastové konce. Děrovanými konci plastového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastové vyztužení proužků směřovat k nosiči (viz obr. 2). 6. Vybalte agarózovou desku HYDRAGEL. - Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. VAROVANÍ : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. - Naneste 120 μl destilované nebo deionizované vody do dolní třetiny rámu vyraženého na termoregulační destičce migračního modulu. - Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (obr. 3). - Gel ohněte a zavěste dolů na hladinu vody (obr. 3). Ověřte, že nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky, a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 7. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NETLAČTE NA RÁMEČEK DOLŮ SILOU. 8. Vyjměte aplikátor z vlhké komory. Uchopte jej při tom za ochranný rámeček. - Ulomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Položte aplikátor do polohy č. 2 na rámečku. Pro zlepšení reprodukovatelnosti aplikace vzorků umístěte vždy aplikátory na stejnou stranu nosiče. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (obr. 4). 9. Uzavřete víčko migračního modulu. 10. Ihned zahajte postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda nejsou blokovány vzduchové otvory přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s tlumivým roztokem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. Probíhá aplikace vzorků do gelu. Migrace se provádí při konstantních 300 V a 20 C řízených Peltierovým jevem až do akumulovaných 105 Vh se systémem HYDRASYS a 115 Vh se systémem HYDRASYS 2 (přibližně 22 minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a víko se odjistí. Signál zní do zásahu obsluhy. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e AS" / "e ANTISERA" signalizující aplikaci antiséra. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během migrace zavřené

8 II. IMUNOFIXACE 1. Po skončení migrace otevřete víko. 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátor vzorku. 3. Zdvihněte oba nosiče a vyjměte je. - Vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. - Očistěte elektrody opatrným otřením vlhkou látkou. - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte šablonu pro aplikaci činidla 3 CSF následujícím postupem (viz obr. 5) : - Umístěte rámeček aplikační šablony na ukotvující trny (může být ponechána v modulu HYDRASYS po celou dobu). - Uchopte šablonu za okraj a položte jí do zářezů držáku. - Sklopte šablonu na gel. 5. Naneste 40 μl zředěného antiséra do každé stopy šablony pro nanášení reagentů. - Při pipetování reagentů se vyvarujte tvorby a nasávání bublin do špičky pipety. - Naneste reagenty (viz obr. 6) : - Pipetu držte v úhlu a při aplikaci špičku zlehka opřete o boční stranu jamky. - Opatrně vstříkněte reagent do jamky tak, aby nedošlo k zachycení žádných bublin vzduchu. 6. Uzavřete kryt modulu HYDRASYS. 7. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[INCUBATION]". IMUNOFIXACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace při 20 C trvá 10 minut a je řízena Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "aas (SM)" / "aantisera (SM)", která signalizuje nutnost odstranit antisérum. III. VYJMUTÍ ANTISÉRA 2. Odstraňte nadbytek reagentů pomocí filtračního papírového hřebenu (viz obr. 7). - Zasuňte hřeben pod úhlem 30 do slotů na dolním konci šablony tak, aby se zoubky dotýkaly svislé strany dále od obsluhy. - Lehce se dotkněte zoubky kapaliny tak, že sklopíte hřeben v úhlu 45 k hladině kapaliny. DŮLEŽITÉ : Hřeben musí zůstat nakloněn (45 ). Pokud jsou vztyčené, mohly by poškodit gel. 3. Spusťte analýzu stisknutím klávesy "START" na klávesnici. 4. Zbývající roztok antiséra odstraňte během 15 sekund odpočítávání. ODSTRANĚNÍ ANTISÉRA POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ K odsáván reagentů je vymezeno 15 vteřin při 20 C (řízeno Peltierovύm efektem). Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER" signalizující použití sacího papíru. IV. ODSÁTÍ GELU 1. Vyjměte hřeben z filtračního papíru. 2. Zkontrolujte, zda jsou reagenty naabsorbované, což je indikováno : - nepřítomností reagentů na gelu. - obarvením celé délky zubů. Je-li absorpce neúplná, vložte stejný hřeben z filtračního papíru znovu (ve stejné pozici) a opakujte manuálně postup odstranění. 3. Uchopte aplikační šablonu 3 CSF za výstupek, zdvihněte a odstraňte. 4. Položte na gel jeden tlustý filtrační papír : - Skloňte filtrační papír v úhlu přibližně Vyrovnejte dolní stranu filtračního papíru s okrajem gelu. - Položte filtrační papír na gel. VAROVANÍ : Pevně přitlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalého přilnutí ke gelu. 5. Uzavřete víčko migračního modulu. 6. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. 7. Očistěte šablonu pro nanášení reagentů 3 CSF pod vodou malým kartáčkem (například zubním). Ověřte, že je šablona před opakovaným použitím zcela suchá ; z jamek odstraňte kapky vody pomocí sacího papíru. NEPOUŽÍVEJTE ALKOHOL NEBO JINÁ ROZPOUŠTĚDLA NA ČIŠTĚNÍ ŠABLONY PRO NANÁŠENÍ REAGENTŮ CSF. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 20 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP. + e WASH" / "a THICK FILTER PAPER, e WASH" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést promývací roztok A1AT / TRF. V. OMYTÍ GELU 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu, 3. Připravte masku pro aplikaci reagentů R1 (viz obr. 8). 4. Při pipetování promývacího roztoku A1AT / TRF se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. 5. Otvorem v šabloně naneste 2,2 ml promývacího roztoku A1AT / TRF (obr. 9). Zkontrolujte, že je roztok rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru pod šablonou. - Pipetu držte kolmo. - Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. - Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víčko migračního modulu. 7. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici

9 PROMÝVÁNÍ GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 C. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a WASH + e PAP." / "a WASH, e THICK FILTER PAPER" signalizuje odstranění promývacího roztoku A1AT / TRF odpipetováním přebytku kapaliny a použitím tlustého filtračního papíru. VI. ODSTRANĚNÍ PROMÝVACÍHO ROZTOKU 2. Odstraňte promývací roztok. 3. Držte pipetu kolmo a lehce vtiskněte špičku do jamky (obr. 9). 4. Opatrně a postupně odstraňte promývací roztok. 5. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. Oblast gelu musí být rehydratována. VII.ODSÁTÍ GELU 1. Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víčko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 20 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým jevem. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "[BLOTTING]". Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP. + e REHYD 1" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 1" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést první rehydratační roztok. VIII. REHYDRATACE GELU 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu, 3. Připravte šablonu pro aplikaci reagentů R1 (viz obr. 8). 4. Aplikujte 2,2 ml rehydratačního roztoku otvorem v šabloně do prostoru pod ní (viz obr. 9). Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. 5. Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. - Pipetu držte kolmo. - Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. - Pečlivě a postupně vstřikujte roztok bez bublin pod šablonu. 6. Uzavřete víčko migračního modulu. 7. Zahajte rehydratační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. REHYDRATACE GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 C. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a REHYD1 + e PAP." / "a REHYDRATATION 1, e THICK FILTER PAPER" signalizuje nutnost nejprve odstranit rehydratační roztok a nanést silný filtrační papír. IX. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno v odstavci VI. 3. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. Oblast gelu musí být rehydratována. X. ODSÁTÍ GELU 1. Naneste jeden tlustý filtrační papír na rehydratovanou oblast gelu, jak je popsáno v části IV. 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víčko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 20 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a PAP. + e REHYD2" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATATION 2" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést druhý rehydratační roztok. XI. REHYDRATACE GELU 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migrační ho modulu, 3. Připravte šablonu pro aplikaci reagentů R1 (viz obr. 8). 4. Aplikujte 2,2 ml rehydratačního roztoku do prostoru pod šablonou (viz obr. 9). Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. 5. Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Naneste rehydratační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci V. 6. Uzavřete víčko migračního modulu. 7. Zahajte rehydratační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. REHYDRATACE GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 C. Po skončení inkubace zazní zvukový signál a teplota desky se zvýší s 20 na 30 C. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a REHYD2 + e TTF" / "a REHYDRATATION 2, e TTF", která signalizuje nutnost odstranit rehydratační roztok a nanést vizualizační roztok

10 XII.ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Šablonu nechte na místě. XIII. VIZUALIZACE 1. Naneste 1,2 ml vizualizačního roztoku TTF připraveného těsně před použitím do prostoru pod šablonu. Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. 2. Při pipetování vizualizačního roztoku TTF se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Naneste vizualizační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci V. 3. Uzavřete víčko migračního modulu. 4. Zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. INKUBACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 30 C. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a TTF + e PAP." / "a TTF, e THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit vizualizační roztok a nanést jeden silný filtrační papír. XIV. ODSTRANĚNÍ VIZUALIZAČNÍHO ROZTOKU 2. Odstraňte vizualizační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. XV.ODSΑVΑNΝ GELU 1. Naneste jeden tlustý filtrační papír na odkrytou oblast gelu, jak je popsáno v odstavci IV. 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víčko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. 5. Omyjte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně vysušte jemným absorpčním papírem. Před opakovaným použitím zkontrolujte, že je šablona R1 zcela suchá a odstraňte kapky z jamek poklepáním na měkkém papíru. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí trvá 3 minuty při 30 C a je řízeno Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva :"a PAP. + e REHYD3" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATATION 3" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést rehydratační roztok. XVI. REHYDRATACE GELU 2. Gel ponechejte na místě na desce v migračním modulu. 3. Připravte šablonu pro aplikaci reagentů R1. 4. Aplikujte 2,2 ml rehydratačního roztoku do prostoru pod šablonou. Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Naneste rehydratační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci V. 5. Uzavřete víčko migračního modulu. 6. Zahajte rehydratační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. REHYDRATACE GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace při 30 C trvá 5 minut a je řízena Peltierovým efektem. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a REHYD3 + e PAP. / "a REHYDRATATION 3, e THICK FILTER PAPER" signalizuje nutnost odstranit rehydratační roztok a nanést jeden silný filtrační papír. XVII. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. XVIII. ODSÁTÍ A VYSUŠENÍ GELU 1. Položte na gel jeden tlustý filtrační papír : 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víčko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. 5. Omyjte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně vysušte jemným absorpčním papírem. Před opakovaným použitím zkontrolujte, že je šablona zcela suchá a odstraňte kapky z jamek poklepáním na měkkém papíru. POZNÁMKA : Po vizualizačním kroku s TTF je možné pro očištění aplikační šablony R1 použít alkohol. Opláchněte vodou. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí trvá 3 minuty při 30 C a je řízeno Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit filtrační papír

11 XIX. VYSUŠENÍ GELU 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Zavřete kryt HYDRASYSU. 4. Vysoušení zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[DRYING]". VYSUŠENÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Gel vysušujte při 50 C po dobu 3 minut. Ozve se pípnutí signalizující nutnost otevření víka. 5. Otevřete víko. 6. Když je gel vysušen, ihned jej vyjměte k dalšímu zpracování. POZNÁMKY : - Po dokončení cyklu klesne teplota desky na 20 C za méně než 5 minut. Když je dosažena teplota 20 C, je možné zahájit novou migraci. - Umístěte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Otřete migrační plochu vlhkou látkou. XX. OMYTÍ A KONEČNÉ ZPRACOVÁNÍ GELU Po vysušení se musí gel bez prodlení promýt v barvicím prostoru pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL". Pokud byl tento prostor použit k barvení gelu, vyčistěte jej pomocí programu "WASH CHAMBER". 1. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz obr. 10). 2. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení / barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 400 ml odbarvovacího roztoku ; - nádoba na odpad je prázdná. 3. Připojení vedení činidel : Viz informace zobrazené na obrazovce přístroje (vyberte klávesu : VEDENÉ ČINIDEL). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužívané přívody. 4. Z menu přístroje vyberte promývací program "WASH ISOENZ / GEL" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Během promývání, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). 5. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete úchytky a vyjměte vysušený gel. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. 6. Pokud je nezbytné, skenujte gel pomocí SEBIA GELSCAN nebo plochým skenerem vybaveným softwarem SEBIA PHORESIS, vs. > 6.50 a programem snímání "β2 TRF". Gel je také možné snímat pomocí densitometru SEBIA HYRYS programem "HYDRAGEL Glycated hemoglobin". KONTROLA KVALITY Doporučuje se do každé řady analýzy zařadit vzorek CSF použitý jako pozitivní kontrola nebo kontrola polohy pro transferin (například ß2 Transferrin(e) kontrolní, SEBIA, kat. č. 4769). VÝSLEDKY Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Interpretace výsledků se provádí ve 2 krocích : kvalitativní analýza (vizuálním pozorováním) a následně kvalitativní analýza densitometrickým snímáním, pokud je zapotřebí. Na elektroforetickém záznamu je frakce transferinu ß2 nejblíže ke katodě, jedná se tedy o desialylovanou formu transferinu (viz elektroforetický záznam vzorku CSF pro určení pozice frakce transferinu ß2). Kvalitativní analýza Vizuální pozorování elektroforetického záznamu umožňuje detekci desialylované frakce transferinu (nebo-li frakce) ve vzorcích sekretu. Když je desialylovaná frakce transferinu více vizualizovaná, než frakce disialo transferinu, je vzorek pozitivní. Potom je možné vizuálně rozdělit vzorky kontaminované plasmou (vykazují sérový vzor s vysokými hladinami celkového transferinu) od vzorků, které nebyly kontaminovány (vykazují CSF vzor s nižší hladinou celkového transferinu) viz příklady elektroforetických záznamů). Kvantitativní analýza (pomůcka pro interpretaci densitometrického snímání) Kvantitativní analýza umožňuje stanovení relativního množství frakce a frakce ve vzorku sekretu. Ve všech případech (vzor CSF nebo séra) je vzorek pozitivní, když je poměr / vyšší než 1. Pokud je tento poměr rovný nebo nižší než 1, doporučuje se analyzovat sérum od stejného pacienta s cílem porovnat poměr / se vzorkem sekretu. Pokud je poměr / ze vzorku séra stejný nebo vyšší než ve vzorku sekretu, pochází měřený desialylovaný transferin ve vzorku sekretu z plasmy a výsledek analýzy bude pozitivní. Pokud je poměr / ze vzorku séra nižší než ve vzorku sekretu, část desialylovaného transferinu měřeného ve vzorku sekretu pochází z CSF a výsledek analýzy bude pozitivní

12 Následující tabulka představuje interpretaci výsledků podle poměru / získaných po densitometrickém snímání a pro typ analyzovaného vzorku (sekretu nebo séra). Analyzovaný vzorek Poměr Vzorek sekretu Vzorek séra Závěr / > 1 Analýza se nepožaduje Pozitivní / 1 / ze séra / ze vzorku sekretu / ze séra < / ze vzorku sekretu Negativní (znečištění plazmou) Pozitivní (část pochází z CSF) Omezení použití jiného antiséra než určeného dodavatelem sady pro sadu HYDRAGEL 6 ß2 TRANSFERRIN(E) může mít nepříznivý vliv na výsledky. Je třeba poznamenat, že transferin může být heterogenní (například, pokud jde o obsah kyseliny sialové) a že existují tři různé genetické varianty. Tyto formy mohou způsobovat problémy při interpretaci. Doporučuje se použít jiné identifikační techniky nebo se poradit se specializovanou laboratoří. Pro získání doplňujících informací je rovněž nutné analyzovat klinická data pacienta. Odstraňování závad a řešení problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". ÚDAJE O VÝKONU Byly použity standardní materiály, příprava vzorku a postupy. Všechny elektroforetické záznamy byly vyhodnoceny vizuálně. Po vizuální kontrole elektroforetických záznamů nebyly viditelné žádné rozdíly mezi opakováními. Byla dosažena dobrá reprodukovatelnost mezi gely a na gelu (přesnost). Reprodukovatelnost v rámci gelu Reprodukovatelnost na gelu byla prokázána na 3 různých vzorcích (včetně 2 vzorků mozkomíšního moku a 1 páru s 1 vzorkem sekretu pozitivním na frakci transferinu ß2 a vzorkem odpovídajícího séra) postupem HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E) na gelech ze stejné šarže. Každý vzorek mozkomíšního moku byl analyzován v 6 stopách na jednom gelu a pár vzorku sekretu pozitivního na frakci transferinu / vzorku séra byl analyzován třikrát na jednom gelu. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům v rámci gelu a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Postupem HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E) byla správně identifikována frakce transferinu ß2 imunofixací každého ze 3 analyzovaných vzorků a na každém gelu. Mezi opakováními nebyly pozorovány žádné rozdíly. Reprodukovatelnost mezi gely Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na 6 různých vzorcích (zahrnujících 4 vzorky sekretu pozitivní na frakci transferinu ß2, 1 vzorek séra a SEBIA ß2 Transferrin(e) Control). Tyto vzorky byly analyzovány desetkrát na gelech ze stejné šarže pomocí postupu HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E). Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům mezi gely a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Postupem HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E) byla imunofixací každého ze 6 analyzovaných vzorků a na všech gelech správně identifikována frakce transferinu ß2. Mezi opakováními nebyly pozorovány žádné rozdíly. Citlivost Sériové ředění bylo připraveno s jedním charakteristickým vzorkem obsahujícím frakci transferinu ß2 v množství 189 mg/dl a následně analyzováno postupem HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E). Minimální limit detekce transferinu ß2 je přibližně 8 μg/dl. Navíc přidání mozkomíšního moku do negativního vzorku sekretu prokázalo, že mozkomíšní mok lze postupem HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E) detekovat do minimální hladiny 2 %. Přesnost Studie shodnosti byla provedena na 46 různých vzorcích zahrnujících 8 vzorků sekretu pozitivních na frakci transferinu ß2, 19 vzorků mozkomíšního moku a 19 vzorků séra, mezi postupem HYDRAGEL ß2 TRANSFERRIN(E) a další elektroforézou v komerčně dostupném agarózovém gelu určenou pro detekci frakcí transferinu ß2 a osteo-durálního poškození. Studie prokázala 100 % shodu mezi oběma technikami : U 8 pozitivních vzorků sekretu : úplná shoda. U 19 vzorků mozkomíšního moku : úplná shoda. U 19 vzorků séra : úplná shoda. U analyzovaných vzorků byly výsledky získané jednotlivými postupy ve shodě a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku

13 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Bassiouny M, Hirsch BE, Kelly RH, Kamerer DB, Cass SP. Beta 2 transferrin application in otology. Am. J. Otol., 1992, 13 : Bell H, Tallaksen C, Sjaheim T, Weberg R, Raknerud N, Ørjasaerter H et al. Serum carbohydrate deficient transferrin as a marker of alcohol consumption in patients with chronic liver diseases. Alcohol Clin. Exp. Res., 1993, 17 : Bordure Ph, Delaroche O, Beauvillain Cl, Legent F. Fistules périlymphatiques : Diagnostic par la détection de la périlymphe dans l oreille moyenne par immunofixation de la ß2 transferrine. Ann. Oto-Laryngol. Chir. Cervicofac., 1994, 111 : Brian TDR, Snell D. Diagnosis of cerebrospinal rhinorrhea and the rhinologic approach to its repair. Laryngoscope, 1967, 77 : Delaroche O, Bordure P, Lippert E, Sagniez M. Perilymph detection by ß2-transferrin immunoblotting assay. Application to the diagnosis of perilymphatic fistulae. Clin. Chim. Acta, 1996, 245 : Druckert LG, Mathog RH. Diagnosis in persistent cerebrospinal fluid fistulas. Laryngoscope, 1977, 87 : Freek WC, Roelandse, Nico van der Zwart, Jan H Didden, Jenny van Loon, John HM Souverijn. Detection of CSF leakage by Isoelectric Focusing on Polyacrylamid Gel, Direct immunofixation of Transferrins and silver staining. Clin. Chem., 1998, 44 : Hackler R, Arndt T, Helwig-Rolig A, Kropf J, Steinmetz A, Schaefer JR. Investigation by isoelectric focusing of the initial Carbohydrate-Deficient Transferrin (CDT) and non-cdt Transferrin isoform fractionation step involved in determination of CDT by the Chron Alcol. D. assay. Clin. Chem., 2000, 46 : 4, Irjala K, Suonpaa J, Laurent B. Identification of CSF leakage by immunofixation. Arch. Otolaryngol., 1979, 105 : Jaeken J, Van Eijk HG, Van der Heul C, Corbeel L, Eeckels R, Eggermeont E. Sialic acid-deficient serum and cerebrospinal fluid transferrin in a newly recognized genetic syndrome. Clin. Chim. Acta, 1984, 144 : Kristiansson B, Andersson M, Tonnby B, Hagberg B. Disialotransferrin development deficiency syndrome. Arch. Dis. Child., 1989, 64 : Maheley MS, Odom GL. Complications following entrothecal injection of fluorescein. J. Neurosurg., 1966, 25 : Meurman OH, Irjala K, Suonpaa J, Laurent B. A new method for the identification of cerebrospinal fluid leakage. Acta Otolaryngol., 1979, 87 : Nealon DA, et al. : Thiol protecting reagent. Clin. Chem., 1981, 27 : Ritchies RF, Smith R. Immunofixation : General principles and application to agarose gel electrophoresis. Clin. Chem., 1976, 22 : Rouah E, Roger BB, Buffone GJ. Transferrin analysis by immunofixation as an aid in the diagnosis of cerebrospinal fluid otorrhea. Arch. Pathol. Lab. Med., 1987, 111 : Skedros DG, Cass SP, Hirsch BE, Kelly RH. Sources of error in use of beta 2-transferrin analysis for diagnosing perilymphatic and cerebral spinal fluid leaks. Otolaryngol. Head Neck Surg., 1993, 109 : Skedros DG, Cass SP, Hirsch BE, Kelly RH. Beta 2-transferrin assay in clinical management of cerebral spinal fluid and perilymphatic fluid leaks. J. Otolaryngol., 1993, 22 : Sloman AJ, Kelly RH. Transferrin allelic variants may cause false positives in the detection of cerebrospinal fluid fistulae. Clin. Chem., 1993, 39 : Stibler H. Carbohydrate-deficient transferrin in serum : a new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed. Clin. Chem., 1991, 37 : Storey EL, Anderson GJ, Mack U, Powell LW, Halliday JW. Desialated transferrin as a serological marker of chronic excessive alcohol ingestion. Lancet, 1987, i, Toquet J, Bordure P, Herman P, Gayet-Delacroix M, Delaroche O, Legent F. Usefulness of ß2 transferrin analysis and MR cisternography for the diagnosis of cerebrospinal fluid fistulas. Ann. Otolaryngol. Chir. Cervicofac., 1998 ; 115 : Tripathi RC, Millard CB, Tripathi BJ, Noranhe A. Tau fraction of transferrin is present in human aqueous humor and is not unique to cerebrospinal fluid. Exp. Eye Res., 1990, 50 : Verheeke P. On the Tau-protein in cerbrospinal fluid. J. Neurol. Sci., 1975, 26 : Weber PC, Bluestone CD, Kenna MA, Kelly RH. Correlation of beta 2-transferrin and middle ear abnormalities in congenital perilymphatic fistula. Am. J. Otol., 1995, 16 : Weber PC, Kelly RH, Bluestone CD, Bassiouny M. Beta L-transferrin confirms perilymphatic fistula in children. Otolaryngol. Head. Neck Surg., 1994, 11 : Zaret DL, Morrison N, Gulbranson R, Keren DF. Immunofixation to quantify ß2-transferrin in cerebrospinal fluid to detect leakage of cerebrospinal fluid from skull injury. Clin. Chem., 1992, 38 : Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept :