Identifikace Polo kinázy a její exprese v průběhu buněčného cyklu

Transkript

1 1 Akademie věd České republiky Ústav živočišné fyziologie a genetiky Liběchov Martin Anger Identifikace Polo kinázy a její exprese v průběhu buněčného cyklu Školitel: Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc. Školitel specialista: Ing. Michal Kubelka, CSc.

2 2 Poděkování Rád bych touto cestou poděkoval svým školitelům Prof. MVDr. Janu Motlíkovi, DrSc., a Ing. Michalu Kubelkovi, Csc., za zajištění optimálních pracovních podmínek a odborné vedení při experimentální práci. Za inspirující úvod do vědecké práce na samém jejím počátku bych rád poděkoval Doc. MVDr. Josefu Derkovi, Csc., vedoucímu disciplíny imunologie na Ústavu mikrobiologie a imunologie, fakultě VVL, VFU Brno. Za kritické zhodnocení dosažených výsledků vděčím Ing. Josefu Fulkovi, CSc. Za spolupráci na přípravě, provedení a hodnocení experimentů bych rád poděkoval spolupracovníkům, Mgr. Jiřímu Klímovi, MVDr. Radkovi Procházkovi, CSc., a Mgr. Milanu Ešnerovi. Za vždy spolehlivou a precizně provedenou technickou pomoc bych rád poděkoval paní Lence Trávníčkové. Za laskavé přijetí ve své laboratoři a za pomoc s vedením experimentů bych rád poděkoval Ing. Petru Dvořákovi, CSc. a MVDr. Aleši Hamplovi, CSc., z Laboratoře Molekulární Embryologie MZLU Brno. Dokonalým zajištěním mé laboratorní práce a vřelým přijetím ve své laboratoři se velkou měrou na těchto experimentech podíleli spolupracovníci z laboratoře Oddělení Biotechnologie, TZV FAL v Mariensee, Německo. Jmenoval bych alespoň za všechny: Prof. Heiner Niemann, PhD., Dr. Joseph W. Carnwath, PhD., Dr. Wilfried Kues, PhD., a slečna Doris Herrmann.

3 3 Obsah: 1. Současný pohled na molekulární děje buněčného cyklu, rodina Polo kináz (jednotlivé kapitoly obsahují obrazovou přílohu) 1.1. Vstup buňky do buněčného cyklu Fáze buněčného cyklu Cykliny a na cyklinech závislé kinázy Regulace aktivity komplexů cyklin/cdk Regulace aktivity MPF Přirozené proteinové inhibitory Kontrolní body buněčného cyklu Buněčný cyklus zárodečných buněk Meiotická kompetence oocytů Znovuzahájení meiozy Aktivita MPF a jeho regulátorů v meioze Úloha MAP kinázy a MOS v meioze Úloha cyklinů jiných než cyklin B v průběhu meiozy Rodina Polo kináz Distribuce Plk mrna Sekvenční příbuznost Polo kináz Exprese Plk proteinu Lokalizace Plk během buněčného cyklu Dosud známé molekuly interagující s Plk Vztah Plk k aktivaci MPF Ostatní doposud identifikované molekuly Polo rodiny Cíl práce 37

4 4 3. Použité metody a laboratorní postupy Klonování fragmentu cdna prasečího Plk, Fnk, Snk Izolace prasečích fetálních fibroblastů, kultivační podmínky, synchronizační protokol, FACS analýza Měření Exprese mrna Plk, izolace RNA, semikvatitativní multiplex RT-PCR, RPA Kultivace prasečích oocytů Příprava antisér a monoklonálních protilátek Imunobloting Imunoprecipitace Výsledky a publikované vědecké práce Sekvence publikované v GeneBank vložen text 4.2. Publikace zaměřené na synchronizaci prasečích fetálních fibroblastů a expresi Plk v těchto buňkách vložen text 4.3. Předběžné výsledky analýzy exprese Plk v in vitro maturovaných prasečích oocytech na úrovni mrna a proteinu Závěr Použité literární prameny 56

5 5 1. Současný pohled na molekulární děje buněčného cyklu 1.1 Vstup buňky do buněčného cyklu Vývoj mnohobuněčných organismů byl podmíněn vznikem mechanismů umožňujících striktní kontrolu nad množením buněk. Události odehrávající se při množení buněk na molekulární úrovni jsou nesmírně komplikované a zdaleka ne plně poznané. Tyto procesy jsou souhrnně nazývány buněčným cyklem (Alberts et al. 1994). O tom, zda buňka vstoupí do buněčného cyklu a dojde tedy k jejímu rozdělení se rozhoduje u mnohobuněčných organismů již na úrovni tkání a orgánů. Buněčné dělení je proces ve většině případů vyžadující jednak kontakt buňky s okolím (zejména s mezibuněčnou hmotou ECM ) a pak také přítomnost mitogenních signálů v jejím bezprostředním okolí. To že buňka pro zahájení dělení vyžaduje více potvrzujících signálů je efektivní pojistka proti spontánní multiplikaci. Takto je umožněno mnohobuněčným organismům koordinovat složité pochody růstu a diferenciace tkání a orgánů v rámci celého organismu. Je známo, že zhoubné bujení není způsobeno pouze vyšší proliferační schopností buněk, je způsobeno množením buněk v místech, kde k tomu normálně nedochází, tj. když se buňky stávají nezávislé na kontrole proliferace (Huang a Ingber 1999). Jak si ukážeme v následujících kapitolách, zahájení buněčného dělení závisí na faktorech prostředí ve kterém se buňka vyskytuje, avšak samotný proces dělení je kontrolován vnitřními buněčnými faktory (Masui 1992).

6 Fáze buněčného cyklu Bylo zjištěno, že u buněk v průběhu buněčného cyklu dochází ke změnám stavu jaderné membrány a chromatinu. Tato původní pozorování, uskutečňovaná za pomoci světelného mikroskopu, umožnila roztřídit aktivity buňky probíhající při její multiplikaci do takzvaných fází buněčného cyklu. (Alberts et al. 1994): Klidová fáze (G0) je pravděpodobně nejméně prozkoumaným stavem buňky, jak ukázaly nedávné pokusy o její charakterizaci v souvislosti s přenosem jader (Wilmut a Campbell 1998). Tento stav lze navodit v tkáňových kulturách snížením hladiny fetálního séra v kultivačním médiu (Kues et al. 2000). Pro přechod do fáze G1 somatická buňka vyžaduje mitogenní signály a zpravidla také potvrzující kontakt s ECM (Alberts et al. 1994). Do G1 fáze se buňka dostane buď z M fáze po proběhlé mitoze v případě kontinuální proliferace, nebo z G0 fáze cyklu po předchozí stimulaci příslušnými růstovými faktory. Je to zpravidla nejdelší fáze buněčného cyklu (s výjimkou například krátké G1 u embryonálních kmenových buněk) a buňka v jejím průběhu velmi aktivně syntetizuje RNA a proteiny. Tato fáze buněčného cyklu je také klíčová z hlediska regulace buněčného dělení. Pokud je buňka v G1fázi v kontaktu s ECM a je vystavena působení rozpustných růstových faktorů, dojde u ní na molekulární úrovni k procesům zahajujícím buněčné dělení. Buňka překoná takzvaný Restrikčního bod (R point) (viz níže), vstoupí do S fáze a zahájí replikaci DNA (Alberts et al. 1994). I přes intenzivní výzkum v této oblasti jsou známy pouze některé mechanismy, které jsou pro vstup buňky do S fáze rozhodující. Klíčovou roli u somatických buněk zde hrají kontakty s ECM nebo jinými buňkami a rozpustné růstové signály působící přes membránové receptory. Pro překonání Restrikčního bodu a vstup do S fáze je přítomnost obou faktorů, tedy přímých kontaktů i rozpustných signálů zároveň, nezbytná (Huang a Ingber 1999). Signály generované těmito stimuly jsou následně signálními drahami přeneseny do jádra, kde dojde k příslušným změnám spojeným zejména s genovou expresí

7 7 a do cytoplasmy, kde dochází k aktivací klíčových molekul buněčného cyklu - cyklinů a na cyklinech závislých kináz (CDK). Poměrně dobře prozkoumaným mechanismem, klíčovým pro zahájení S fáze, je fosforylační modifikace molekul náležících do rodiny Retinoblastomových proteinů, zejména prb (Planas-Silva a Weinberg 1999). Tato molekula se nachází v ranné G1 fázi v hypofosforylovaném stavu, který umožňuje vazbu transkripčních faktorů nezbytných k aktivaci genů nutných pro zahájení S fáze. Komplexy cyklinů D a Cdk 4 a 6, později také cyklinu E a Cdk2 aktivované mitogenními signály jsou schopny fosforylovat prb proteiny. Tato fosforylace změní prostorovou konformaci molekuly prb, přičemž tato nová konformace už neumožňuje vazbu transkripčních faktorů. Pod vlivem uvolněných transkripčních faktorů dojde k aktivaci genů nutných pro zahájení S fáze. Molekulární podstatou kontrolního bodu nazvaného Restrikční bod je tedy konformační změna prb způsobená jeho fosforylací. Další procesy dělení buňky probíhají již víceméně nezávisle na signálech z jejího okolí (Alberts et al. 1994, Planas-Silva a Weinberg 1999), jinými slovy průběh buněčného cyklu je po překonání Restrikčního bodu vnitřní záležitostí buňky a organismus již nemá možnost do jeho událostí aktivně zasáhnout. Během S fáze buňka replikuje DNA. Tento proces je pečlivě zpětnovazebně kontrolován. Případné chyby vedou k zastavení buněčného cyklu a k aktivaci opravných mechanismů, jestliže není možno chybu odstranit, aktivují se apoptotické dráhy vedoucí k apoptóze (Moore et al. 1996, Alberts et al. 1994). Pokud je DNA replikována správně, buňka vstoupí do M fáze, což se morfologicky projeví kondenzací chromozomů a rozpadem jaderné membrány. V průběhu M fáze jsou DNA i cytoplasma rozděleny do nově vzniklých buněk za účasti velkého množství různých molekul a buněčných struktur, patrná je především účast mikrotubulárního aparátu. I tyto procesy jsou buňkou pečlivě monitorovány zpětnovazebně kontrolovány tak, aby došlo ke správné distribuci cytoplazmatického i genetického materiálu.

8 Cykliny a na cyklinech závislé kinázy Zahájení a průběh jednotlivých fází buněčného cyklu je umožněn řízenou aktivací katalytických komplexů složených z cyklinů a na cyklinech závislých kináz (CDK). Tyto komplexy přenášením fosfátových skupin modifikují vlastnosti proteinových substrátů, a jsou tak na molekulární úrovni zodpovědné za řadu procesů odehrávajících se v průběhu buněčného cyklu, jako například replikaci DNA, rozpuštění jaderné membrány, formování dělícího vřeténka, segregaci

9 9 chromozomů atd. Pomocí signálních kaskád jsou tyto komplexy napojeny na vnější prostředí buňky (Graňa 1995). Je zřejmé, že tak významné faktory by mohly být při ztrátě kontroly nebezpečné jak buňce tak i celému organismu. Aktivita těchto komplexů je proto kontrolována na mnoha úrovních. Na úrovni DNA a RNA řízenou transkripcí a translací, a na úrovni proteinů zejména posttranslačními modifikacemi a specifickou destrukcí označených molekul (Boulikas 1996, Brandeis a Hunter 1996). Zejména fosforylace, náležející mezi posttranslační modifikace je významným způsobem kontroly a můžeme říci, že kvantitativně i kvalitativně hraje klíčovou roli v regulaci mnoha buněčných procesů, buněčné dělení samozřejmě nevyjímaje (Mordret 1993, Hunter 1995). Kinázovofosfatázové dráhy využívající fosforylace se také zásadním způsobem podílí na přenosu signálu z povrchu buňky. Fosforylace během přenosu signálu umožňuje jeho amplifikaci, jako příklad je možno uvést aktivaci p90rsk drahou ERK1/ERK2 (Extracellular Regulated protein Kinases), nazývanou také MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases), kde dochází k amplifikaci signálu až x (Hunter 1995). Stimuly z vnějšího prostředí jsou přes membránové receptory napojeny na MAP kinázové dráhy, kdy v reakci na podněty z vnějšího prostředí aktivované molekuly MAPK fosforylují široké spektrum substrátů účastnících se mnoha pochodů uvnitř buňky. Substrátem MAPK jsou cytoplazmatické i nukleární proteiny (Gotoh et al. 1995). MAP kinázovou dráhu můžeme považovat za centrální signální a fosforylační dráhu proteinů v buňce (Mordret 1993, Errede et al. 1995). Je známo že kinázy závislé na cyklinech (CDK) se vyznačují značnou fylogenetickou konzervativností a kontrolují obdobným způsobem, ve vazbě na cykliny, průchod jednotlivými fázemi buněčného cyklu u všech doposud zkoumaných eukaryot (Murray 1994). Všechny CDK jsou strukturně příbuzné, zejména v doméně o velikosti 300 aminokyselin, ale i mimo tuto doménu je sekvenční homologie velmi vysoká a pohybuje se okolo 40%. Mimo sekvenční

10 10 příbuznosti jsou si podobné i molekulární hmotností, která se pohybuje okolo kda (Heitz et al. 1997). Všechny jsou aktivní pouze v komplexu s cyklinovou podjednotkou (Nigg 1995) u kterých je známá také vysoká sekvenční příbuznost (zejména ve 100 aminokyselinové doméně nazývané cyklin box ), také i molekulární hmotnost je u cyklinů podobná, pohybuje se v rozmezí kd (Heitz et al. 1997). V průběhu buněčného cyklu dochází k aktivaci rozdílných komplexů CDK a asociovaných cyklinů (Nigg 1995) Regulace aktivity komplexů cyklin/cdk Regulace aktivity komplexů cyklin/cdk umožňuje zdárný průběh jednotlivých fází buněčného cyklu. Tato regulace je závislá na několika klíčových faktorech. Mezi nejdůležitější z nich patří především typ cyklinů, který společně s CDK tvoří katalytický komplex. Exprese různých cyklinových molekul je pomocí regulace transkripce a translace a také posttranslačními modifikacemi řízena v průběhu buněčného cyklu tak, že jednotlivé komplexy cyklin/cdk jsou katalyticky aktivní pouze v určité fázi buněčného cyklu (Nurse 1994, Nigg 1995). Při přechodu buňky z G0 do G1 fáze buněčného cyklu hrají prvořadou roli cykliny typu D, jejichž exprese je stimulována růstovými faktory.

11 11 Nejvyšší hladiny i aktivity dosahují tyto molekuly v pozdní G1 fázi. Jejich partnerskými kinázami jsou CDK4 a CDK6. Následuje exprese cyklinu E, která se zčásti kryje s expresí D cyklinů, ale přetrvává déle, až do S fáze. Cyklin E je typickým G1 cyklinem a vrchol jeho exprese je v pozdní G1. Kináza asociovaná s cyklinem E je CDK2. Oba dva typy cyklinů, D i E se rozhodujícím způsobem podílejí na zahájení S fáze fosforylací molekul náležejících do rodiny Retinoblastomových proteinů. Hladina cyklinu E klesá po zahájení S fáze cyklu v důsledku jeho degradace a kináza CDK2 je dále asociovaná s cyklinem A. Syntéza cyklinu A je zahájena v pozdní G1 fázi uvolněním specifických transkripčních faktorů doposud vázaných na Retinoblastomové proteiny, kinázová aktivita je poprvé detekovatelná v S fázi a přetrvává až do G2/M. Lokalizace cyklinu A během S i G2/M fáze je v jádře, v místě syntézy DNA, což by mohlo znamenat, že cyklin A ovlivňuje proteiny podílející se na replikaci DNA. Vstup do mitozy je řízen MPF (mitotic promoting factor), který je složen z CDK1 a cyklinu B (Motlík a Kubelka 1990, Graňa 1995, Nigg 1995, Hunter 1995, Tieb et al ), podrobněji viz níže. Cyklinová podjednotka komplexu cyklin/cdk determinuje lokalizaci celého komplexu, tím i samozřejmě i výběr substrátů ke kterým má navázaná kináza přístup (Nigg 1995, Heitz a kol. 1997). Je známo, že některé cyklinové molekuly jsou různě distribuovány v buňce v důsledku vazby na rozdílné buněčné struktury. Typickým příkladem je cyklin B nacházející se v G2 a M fázi na centrosomu, v jádře, případně i volně v cytoplazmě (De Souza et al. 2000). Během buněčného cyklu se také mění fosforylační stav komplexů cyklin/cdk. Mimo řízenou expresi je to nejčastější způsob regulace aktivity těchto komplexů. Ve většině případů je fosforylačně regulovaná kinázová podjednotka komplexu, i když u některých organismů (mořská hvězdice, Xenopus, myš) dochází i k fosforylaci cyklinů. (Derua et al. 1997, Mitra a Schultz 1997).

12 Regulace aktivity MPF Nejlépe byla prozkoumána fosforylační regulace u CDK1 (Nigg 1995, Hunter 1995). Aktivita CDK1 je fosforylací regulována pozitivně i negativně v závislosti na místě fosforylace. Obdobná fosforylační místa slouží k regulaci i jiných CDK (Nigg 1995). V případě CDK1 je známo, že fosforylace na threoninu 14 a tyrozinu 15 (ležících uvnitř vazebného místa pro ATP) způsobí, že komplex cyklin B/CDK1 je neaktivní až do G2/M, kdy aktivovaná fosfatáza CDC 25C tyto fosfátové skupiny odejme a komplex aktivuje (Nigg 1995). Naopak, fosforylace CDK1 na treoninu 161 prostřednictvím CAK (Cyclin Activating Kinase) je nezbytným faktorem aktivace celého komplexu (Nigg 1995; Hunter 1995; Andersen et al. 1997). Toto fosforylační místo se nachází uvnitř domény označované jako T-loop a účastní se vazby komplexu cyklin- CDK1 na substrát. CAK je opět katalytický komplex složený z cyklinu H a CDK 7, jehož aktivita je také regulována fosforylačně (Shuttleworth 1990, Nigg 1996, Hunter 1995, Anderson et al. 1997). Aktivita CAK je u kultivovaných savčích buněk konstantní v průběhu celého cyklu (Hunter 1995, Martinez et al. 1997).

13 13 Časová posloupnost regulačních dějů u MPF je taková, že nejprve je nefosforylovaná CDK1 asociovaná s cyklinem a ihned poté je CDK1 fosforylována na všech třech fosforylačních místech. Obě inhibiční fosfátové skupiny udržují MPF komplex neaktivní až do té doby, než dojde ke kontrole bezchybné replikace DNA (Nigg 1996). Nakonec je defosforylací na Tyr-15 a Thr-14 komplex aktivován v době, kdy je buňka připravena vstoupit do M fáze (Gautier et al. 1991). Přítomnost dvou fosfátových skupin na různých aminokyselinách u CDK 1 je regulačně velmi výhodné, neboť pouze fosfatáza s duální aktivitou (CDC 25C) může tyto fosfátové skupiny odejmout a je tak zajištěno, že nemůže dojít k předčasné aktivaci komplexu jinými fosfatázami v buňce přítomnými (Hunter 1995). Kinázy fosforylující CDK1 na Tyr-15 a Thr-14 jsou WEE1 a MIK1 (Nigg 1995, Hunter 1995) a jejich aktivita je také řízena fosforylačně. Bylo zjištěno, že molekuly WEE1/MIT1 i CDC 25C jsou intenzivně fosforylovány v G2/M, avšak zatímco fosforylace WEE1/MIT1 jejich aktivitu snižuje, fosforylací CDC 25C je její fosfatázová aktivita zvýšena (Derua et al. 1997). CDC 25C je na přechodu G2/M fáze na N konci mnohočetně fosforylovaná což vede k 3-5 násobnému zvýšení její aktivity (Hunter 1995).

14 14 U savců jsou známy tři typy fosfatáz CDC 25: CDC 25 A, B a C, které jsou vysoce homologní v C terminální části, odlišují se však N koncem molekuly. CDC 25A se objevuje v G1/S fázi cyklu, CDC 25C v G2/M fázi, a funkce CDC 25B není zatím příliš prozkoumána (Hunter1995, Wickramasinghe 1995). U myši byla popsána také tkáňově specifická exprese genů pro CDC 25 nejen během embryonálního vývoje ale i u dospělce (Wickramashinge et al. 1995). Mezi MPF a CDC 25C existuje velmi úzký vztah který může vést k vzájemné aktivaci. Posloupnost těchto aktivačních dějů je pravděpodobně taková: malé množství fosforylované a tedy i aktivní CDC 25C defosforyluje prahové množství molekul MPF, který zpětně aktivuje více CDC 25C a tímto způsobem je pozitivní zpětnou vazbou aktivováno stále více MPF až dojde k typickým morfologickým projevům vysoké aktivity komplexu MPF (Hunter 1995). Je zřejmé, že tato vzájemná aktivace mezi MPF a CDC 25C je pouze jakási amplifikační zpětná vazba, a že aktivace prvních molekul CDC 25C je kontrolována doposud neznámou proteinkinázou (Derua et al.1997) Přirozené proteinové inhibitory Na regulaci aktivity komplexů cyklin/cdk se podílí také přirozeně se vyskytující proteinové inhibitory. Jedním z nich u nějž byla prozkoumána jeho funkce u obratlovců je p21. Tento protein inhibuje nejrůznější komplexy cyklin/cdk a to pravděpodobně blokováním interakce komplexu ze substrátem, popřípadě s CAK. Tvorba proteinu p21 může být stimulovaná proteinem p53 po detekci poškození DNA. Dojde k zastavení buněčného cyklu, viz níže. U terminálně diferencovaných buněk se však p21 exprimuje nezávisle na p53 a blokuje tak cyklus trvale (Graňa 1995). Dalším známým inhibitorem CDK je p27. Je známo, že jeho tvorba je stimulována TGF-β nebo kontaktní inhibicí růstu. Další z přirozených proteinových inhibitorů je p57, který také reaguje s různými komplexy cyklin/cdk, je rovněž nadměrně exprimován v terminálně

15 15 diferencovaných liniích a zastavuje buňky v G1 fázi. Proteinové inhibitory p16 a p15, na rozdíl od předchozích inhibitorů, inhibují pouze aktivitu komplexů cyklinů D s CDK4 a CDK6 (Nigg 1996). V poslední době je těmto přirozeným proteinovým inhibitorům věnována značná pozornost. Závěrem lze říci, že přirozené inhibitory CDK hrají důležitou roli při ovlivňování buněčného cyklu negativními signály z vnějšího či vnitřního prostředí. Mohou tak zastavit buňku v různých částech G1 fáze buněčného cyklu při řízení růstu a diferenciace buněk na úrovni tkání a orgánů. V pozdějších částech cyklu jsou součástí kontrolních mechanismů a mohou zastavit průběh buněčného cyklu v reakci na poruchy detekované vnitřními kontrolními mechanismy buňky (Graňa, 1995) Kontrolní body buněčného cyklu Poruchy vzniklé při replikaci, popřípadě distribuci genetického materiálu by mohly mít pro buňku a organismus katastrofální následky. Aby byla pravděpodobnost vzniku těchto poruch snížena na minimum jsou procesy buněčného cyklu mnohačetně zpětnovazebně kontrolovány vnitřními mechanismy buňky. Nejdůležitější mechanismy kontroly byly nazvány kontrolní body (checkpoints) (Graňa 1995). Můžeme říci, že hlavní kontrolní body buněčného cyklu se nachází v G1 a G2/M. První z obou kontrolních bodů nacházející se v G1 byl již diskutován v souvislosti s G1 fází buněčného cyklu, v literatuře je znám jako Restrikční bod. Kontrolní bod v G2/M brání rozdělení chybně replikované DNA v M fázi. Jedním z důležitých faktorů účastnících se v kontrole procesů replikace DNA, tedy v kontrolním bodu G2/M je molekula p53. Je známo, že tvorba p53 může být indukovaná ozářením buňky krátkovlnným zářením, které poškozuje DNA. Protein p53 je transkripční faktor, který indukuje expresi p21 a GADD45. Obě tyto molekuly se podílejí na zastavení replikace DNA a buněčného cyklu. Buňky s defektním p53 (například změněným mutací) tedy replikují DNA bez kontrolních mechanismů tohoto typu a může dojít k amplifikaci mutací (Graňa 1995). U buněk s poškozenou DNA je

16 16 v G2/M kontrolním bodě blokováno zahájení mitózy. Mezi prokázané účinky tohoto G2/M bloku patří například inaktivace centra pro organizaci mikrotubulů (MTOC), což je struktura nutná pro vybudování dělícího vřeténka a segregaci chromozomů (Su a Widwans, 2000).

17 Buněčný cyklus zárodečných buněk Během časného embryonálního vývoje obratlovců dochází k oddělení skupiny buněk označovaných jako primordiální zárodečné buňky. Tyto buňky posléze migrují do základů pohlavních orgánů. Zde dochází nejprve k jejich pomnožení mitotickou proliferací, po kterém následuje redukce počtu chromozomů v průběhu meiozy. Výsledkem všech těchto procesů jsou vysoce specializované buňky schopné vzájemnou kombinací obou pohlaví dát vznik totipotentní buňce ze které se vyvine během embryonálního vývoje celý organismus. Vzhledem k tomu, že obou linií zárodečných buněk jsou patrné rozdíly v průběhu meiozy, zaměřím se dále pouze na samičí buňky. Fáze mitotického množení oocytů probíhá u samic savců ještě během intrauterinního vývoje a je také ještě intrauterinně ukončena v diplotenním stadiu profáze I meiotického dělení, kdy množství DNA je 4C (Motlík a Kubelka 1990) Meiotická kompetence oocytů Další vývoj oocytu pokračuje takzvanou růstovou fází. Během této velmi dlouhé periody oocyty zvětšují svou velikost, probíhá syntéza a akumulace proteinů, RNA a organel, které tvoří zásobu pro pozdější meiotickou maturaci i časný preimplantační vývoj (Motlík a Kubelka 1990, Schultz 1996). Například oocyty myši zvětší svůj průměr z 15 na 80 µm, prasat z 30 na 120 µm (Hirao et al. 1995). Jakmile oocyty dosáhnou plné velikosti, čekají na hormonální signál ke znovuzahájení meiozy (Taieb et al. 1997, Mitra a Schultz 1996). Během růstu oocyty postupně získávají meiotickou kompetenci, která souvisí s velikostí, morfologickými změnami jádérka (kompaktizace) a s přeměnou folikulů, ve kterých se oocyty nachází na preantrální a antrální (Motlík a Kubelka 1990, Schultz 1996). Růstová fáze vývoje oocytu je aktivitou buňky porovnatelná s G1 fází mitotického cyklu (Motlík a Kubelka 1990) i když by se dalo říci, že se spíše jedná o atypickou G2, vzhledem k tomu, že oocyt má

18 18 DNA již replikovanou. Naproti tomu výskytem některých molekul, například cyklinů typu D je znovuzahájení meiozy podobné přechodu G0/G1 mitotického cyklu (Moore et al. 1996; Taieb et al. 1997). Před dosažením plné meiotické kompetence nejsou oocyty schopny ještě plnohodnotně reagovat na hormonální stimuly, což podle zjištění u Xenopa, není dáno nedostatkem receptorů, ale spíše neschopností tento signál zpracovat (nedostatečným množstvím MPF) (Motlík a Kubelka 1990). Meiotická kompetence jako funkční stav oocytu se nevyvíjí najednou, ale postupně, během růstu. Jak bylo zjištěno, oocyt, který je na hranici kompetentnosti k meioze, může prodělat GVBD (germinal vesicle breakdown, rozpuštění jaderné membrány), kondenzovat chromozomy, zformovat metafázní vřeténko a může přejít i do metafáze I. Není však schopen pokračovat dále za metafázi I ani při dlouhodobé kultivaci. Bylo zjištěno, že oocyt nemůže opustit metafázi I v důsledku vysoké aktivity MPF (Hampl a Eppig, 1995).

19 Znovuzahájení meiozy V reakci na hormonální stimulaci může plně vzrostlý oocyt nacházející se v profázi prvního meiotického dělení znovuzahájit meiozu. Tímto stimulem u savců je hormonální stimulus (LH peak) nebo ukončení inhibičního vlivu folikulárních buněk (Motlík a Kubelka 1990, Taieb et al. 1997). Morfologické projevy znovuzahájení meiozy (GVBD) nejsou patrné bezprostředně po hormonálním stimulu, ale je zde různě dlouhá doba latence, jejíž trvání je druhově závislé (1-2 hodiny u myši, hodin u prasete). Tato doba je nutná k přetransformování hormonálního impulsu signálními kaskádami na aktivní komplex MPF, který je zodpovědný za morfologické projevy znovuzahájení meiozy u všech eukaryot (De Vantéry et al. 1996).

20 20

21 Aktivita MPF a jeho regulátorů meioze Mezi hlavní morfologické projevy aktivity MPF při znovuzahájení meiozy patří GVBD (germinal vesicle breakdown)- kondenzace chromozomů a rozpad jaderné membrány. V některých experimentech však bylo prokázáno, že GVBD může být v oocytech ošetřených kyselinou okadaikovou způsobeno i aktivitou MAPK (Gavin et al. 1994). Aktivita MPF kolísá v průběhu meiotického zrání. Po indukci znovuzahájení meiozy musí nejprve dojít k aktivaci MPF fosfatázou CDC25C. Po GVBD zůstává aktivita MPF vysoká až do přechodu mezi metafází I a II, kde je možné detekovat pokles aktivity. Za tento pokles je odpovědné snížení hladiny cyklinu B, způsobené APC (anaphase promoting complex), který destruuje cyklin B. Tato změna v aktivitě MPF ovšem není tak markantní jako po proběhlé anafázi mitotického cyklu (Hampl a Eppig 1995, Taieb et al. 1997). Při vstupu do druhé metafáze aktivita MPF opět vzrůstá a zůstává vysoká u oocytů blokovaných v metafáze II působením CFS (cytostatic factor). Po aktivaci oocytu, ke které dochází během fertilizace opět rychle poklesne.

22 22 Podle dostupných údajů (de Vantéry et al. 1996) se množství CDK1 a cyklinu B u oocytů mění v průběhu růstové fáze. To bylo potvrzeno i v dalších experimentech, ve kterých bylo zjištěno, že v meioticky nekompetentních oocytech je pouze 17,5% CDK1 ve srovnání s kompetentními oocyty, naopak koncentrace cyklinu B1 je 6x větší v nekompetentních oocytech. Lze tedy říci, že během růstu oocytů koncentrace cyklinu B klesá a koncentrace CDK1 roste, koncentrace CDC 25C jako aktivátoru MPF roste 2-3x a koncentrace WEE1, inhibitoru MPF, klesá 2,5x. (Mitra a Schultz 1996). Z těchto údajů je zřejmé, že pro dosažení meiotické kompetence je u oocytů rozhodující spíše změna lokalizace, tedy i lokální koncentrace MPF, CDC 25C a WEE1/MIT1, než jejich absolutní množství. Zajímavé je, že ačkoli hladina a lokalizace těchto regulátorů buněčného cyklu se mění, množství RNA pro tyto proteiny zůstává stejné, takže rozdíly v množství proteinů musí být dány jinými mechanismy. Je možné, že mrna jsou překládány s jinou účinností, nebo že některé molekuly jsou stabilnější.

23 Úloha MAP kinázy a MOS v meioze Signály generované hormonální stimuly, nutné ke znovuzahájení meiozy, jsou šířeny v oocytech cestou proteinkinázových kaskád- MAP kinázy, c-raf (Motlík a Kubelka 1990, Taieb et al. 1997) nebo p90rsk (Kalab 1996). U jednotlivých obratlovců se časový sled aktivace MPF a MAPK poněkud liší, v závislosti na druhu. Bylo zjištěno, že u Xenopa a prasete je MAPK a MPF aktivována ve stejnou dobu (těsně před GVBD), zatímco u myši aktivace MPF (těsně před GVBD) předchází aktivaci MAPK (Motlík a Kubelka 1990). U Xenopa bylo zjištěno, že předčasná aktivace MAPK zabrání inaktivaci mikroinjikovaného komplexu cyklin B/CDK1. Je možné, že MAPK inaktivuje fosforylací WEE1/MIT1 (Abrieu et al. 1997). V oocytech Xenopa dochází po progesteronovém impulsu k aktivaci MAPK buď signální drahou vyžadující MOS (proteinový produkt protoonkogenu c-mos), nebo drahou s nutnou účastí Raf1 (Abrieu et al. 1997). Naproti tomu v oocytech myši (Verhlac et al. 1996), je k aktivaci MAPK MOS nutný vždy, neboť tato kináza se neaktivuje v oocytech MOS -/-. Bylo zjištěno, že Raf1 se na aktivaci MAPK u myši nepodílí (Verhlac et al. 1996). Jak již bylo shora uvedeno, MAPK se u myši aktivuje o něco později než MPF. MOS a MAPK se nepodílí ani na reaktivaci MPF na přechodu z M I do M II. Ukázalo se však že se obě kinázy podílí na organizace mikrotubulů a dělícího vřeténka během meiozy myšího oocytu (Verhlac et al. 1996). Po proběhlé meioze zůstavají oocyty u obratlovců blokovány v metafázi II, s vysokou aktivitou MPF pod kontrolou CSF (cytostatic factor) (Jessus et al. 1993, Mitra a Schultz 1996, Furuno et al. 1997). CSF stabilizuje cyklin B proti degradaci a brání tak spontánnímu poklesu aktivity MPF. Tento blok vyžaduje aktivitu MAPK. Na CSF bloku u Xenopa se podílí i MOS jehož mrna je v oocytech přítomna během oogeneze, avšak protein je možné detekovat až po progesteronovém impulsu (Gebauer a Richter, 1997). MOS je během zrání oocytů fosforylován, maximální aktivity dosahuje v době od GVBD až do

24 24 metafáze II (Masui, 1992). MOS je v oocytech Xenopa pravděpodobně přímo schopen aktivovat MEK (kináza nadřazená MAPK) a tak i MAPK (Sagata, 1997). Z uvedených experimentálních zjištění je zřejmé, že MOS je v ocytech Xenopa nutný pro zahájení zrání, pro přechod mezi dvěma fázemi meiozy, zahájení druhého meiotického dělení, pro blok v metafázi II jako základní komponenta CSF a zřejmě i pro udržení aktivního MPF (Sagata, 1997). Také oocyty myši jsou blokovány vysokou aktivitou CSF v bloku metafáze II. U myší je vysoká aktivita MPF v metafázi II způsobená rovnováhou mezi syntézou cyklinu B a jeho degradací neboť jak bylo zjištěno, inhibice syntézy proteinů aktivuje myší oocyty (Kubiak a kol, 1993). CSF u myší je vícesložkový komplex s nezastupitelnou účastí MOS a MAPK. RNA pro MOS se tvoří hlavně v době růstové fáze oocytů, hladina proteinu se zvýší po znovuzahájení meiozy a akumuluje se během celého meiotického zrání oocytů. MOS je také u myši faktorem nezbytným pro průběh meiozy. Mos -/- myši jsou schopné projít GVBD, ale nedojde u nich k vytvoření bloku v metafázi II a pokračují do metafáze III. Protein MOS je nutný pro aktivaci MAPK, předpokládá se tedy, že MOS je schopen udržet vysokou aktivitu MAP kinázy

25 25 v metafázi II blokovaných oocytech a tím zabránit v degradaci cyklinu B s následným poklesem aktivity MPF a přechodem do G1 (Hirao a Eppig, 1997). V průběhu meiotické maturace myších oocytů je MOS, tak jako u Xenopa, fosforylován (Gebauer a Richter, 1997). U myši, vzhledem k tomu, že MAPK a MOS jsou aktivovány později než MPF lze říci, že se MAPK a MOS pravděpodobně nepodílí na aktivaci MPF v GV oocytech (Sagata, 1997), není tedy nezbytným pro zahájení meiotického zrání, ale je nutnou součástí bloku v metafáze II. U myši i u Xenopa zabraňuje partenogenetické aktivaci neoplodněného vajíčka a vzniku haploidního genomu (Sagata, 1997) Úloha cyklinů jiných než cyklinu B v průběhu meiozy Méně je známo o účasti jiných cyklinů než cyklinu B v meiotické maturaci oocytů. Cyklin E je v oocytech Xenopa přítomen a jeho hladina stoupá do meiozy II současně s množstvím CDK2 (Tieb et al. 1997, Furuno et al. 1997) V oocytech Xenopa blokovaných v metafázi II je hladina cyklinu E vyšší než hladina A1, B1 a B2. Cyklin E je asociován s CDK2 a tento komplex se z

26 26 20% podílí na celkové aktivitě H1 kinázy (ostatní komponenty H1 kinázové aktivityjsou cyklin B/CDK1 a cyklin A/CDK1) (Taieb et al. 1997), naproti tomu u myši je všechna H1 kinázová aktivita připisována pouze MPF (Mitra a Schultz 1996). V oocytech Xenopa je možno detekovat i fosforylovanou formu cyklinu E. Cyklin E ve spojení s CDK2 pravděpodobně také inhibuje proteolytickou destrukci jiných cyklinů (Taieb et al. 1997) a podílí se tak na stabilizaci bloku v metafázi II (Poon et al. 1994). Na význam CDK2 pro maturaci oocytů existují protichůdné názory. Zatímco při použití antisense oligonukleotidů k inaktivaci CDK2 bylo zjištěno, že CDK2 je nutným faktorem bloku v metafázi II u Xenopa (Gabrielli et al. 1993), experimenty kdy byl použit p21 jako inhibitor CDK2 neprokázaly nezbytnost CDK2 v tomto bloku (Furuno et al. 1997). Cyklin A se začíná akumulovat v oocytech Xenopa během GVBD a je destruován z 80% po M I, ve stejném čase jako cyklin B (Taieb et al. 1997). Hladina cyklinu A, která by byla nutná ke spuštění GVBD je 2-3x vyšší než u cyklinu B. Uvádí se, že koncentrace cyklinu A v oocytech blokovaných v metafázi II u Xenopa je 10x nižší než cyklinu B (Jones a Smythe, 1996). Není známo proč v oocytech Xenopa je cyklin A asociován s CDK1 a ne s CDK2 jako v mitoickém cyklu a jaký význam má toto zjištění. Možné vysvětlení by mohlo být, že o vazbu na CDK2 je nucen cyklin A soutěžit s cyklinem E, kterého je ovšem několikanásobně více. Aktivita cyklinu A nemá pravděpodobně, vzhledem k jeho nízké hladině, význam pro zahájení první meiozy, nelze však vyloučit možnost, že by komplex cyklinu A/CDK1mohl fungovat jako spouštěcí mechanismus autokatalytické aktivace mezi MPF a CDC25C a tímto způsobem se podílet na GVBD (Sweeny et al. 1996, Taieb et al. 1997). Je známo, že u některých druhů, například u Xenopa (Howe a kol.1995) a myši (Sweeny et al. 1996), existují dva typy molekuly cyklinu A, A1 a A2, vykazující rozdílnou tkáňovou expresí. A1 se objevuje u dospělých jedinců

27 27 těchto druhů pouze v ováriích a v testes, tedy tam, kde se vyskytují buňky procházející meiozou, dále v embryu až do stádia gastrulace. A2 je detekovatelný v somatických buňkách, ale i v oocytech a embryích obou druhů. Zatímco u myši byl cyklin A1 detekován také v oocytech ve stadiu GV, u Xenopa syntéza cyklinu A1 nenastává dříve než v GVBD, což by mohlo znamenat, že kinázová aktivita asociovaná s cyklinem A1 není u Xenopa, na rozdíl od myši, nutná k GVBD (Ravnik a Wolgemuth, 1996, Sweeny a kol. 1996). Přesnější údaje o úloze cyklinu A během meiozy dosud chybějí. Bylo zjištěno, že oocyty Xenopa obsahují konstitutivně aktivní CAK během oogeneze, meiotické maturace a během prvních mitotických embryonálních cyklů. Toto zjištění vysvětluje, proč mikroinjekce cyklinu A nebo B vede k formování aktivního cyklin/cdk1 komplexu. (Taieb et al. 1997) Rodina Polo kináz Kinázy strukturně odlišné od CDK a nezávislé na cyklinech hrají důležitou roli v průběhu buněčného cyklu, zejména ty, které regulují aktivitu CDK. Jednou z nově identifikovaných skupin proteinkináz tohoto typu je rodina Polo kináz, viz níže. Tyto kinázy jsou nezbytné pro zdárný průběh buněčného cyklu u tak odlišných organismů jako jsou hmyz, kvasinky a savci (Sunkel a Glover 1988, Glover et al. 1996, Lane a Nigg, 1997, Golsteyn et al. 1998, Glover et al. 1998, Nigg 1998).

28 28 První molekula této skupiny byla identifikována koncem 80-tých let u Drosophila melanogaster u mutace polo (odtud byl odvozen název celé proteinkinázové rodiny, rodina Polo kináz), která vykazovala abnormální morfologické aberace v mitóze i meioze jako například chybnou segregaci chromozomů s poruchami mikrotubulárního aparátu v cytokinezi. Bylo dále zjištěno, že tyto poruchy úzce souvisí s funkcí dělícího vřeténka (Sunkel a Glover 1989, Fenton a Glover 1993, Lane a Nigg, 1997, Carmenet al. 1998). U savců byla molekula analogická k Polo kináze identifikována nejprve u myši (Clay et al. 1993, Clay et al. 1997) jako kináza objevující se při diferenciaci a buněčném cyklu hematopoetických progenitorových buněk, byla nazvaná Plk (Polo-like Kinase), později byla molekula Plk popsána i u člověka (Golsteyn et al. 1994) Distribuce Plk mrna Měření úrovně exprese RNA ukázala vysoký výskyt Plk mrna v proliferujících buňkách. Z tohoto důvodu je vyšší výskyt této molekuly ve všech embryonálních tkáních, avšak s postupujícím vývojem zárodku a následně pak u dospělců se exprese v tkáních snižuje. Jako vhodný příklad mohou posloužit myocyty srdečního svalu, které mají během embryonálního vývoje poměrně vysokou hladinu Plk, po narození však PLK téměř neexprimují (Georgescu et al. 1997).Výjimkou jsou ovária a testes dospělých jedinců kde je možno Plk mrna detekovat ve vysoké koncentraci i u dospělých jedinců (Matsubara et al. 1995). Údaje o expresi naznačují, že se jedná o faktor významný pro dokončení meiozy a vývoj časného embrya. V některých studiích bylo prokázáno, že Plk RNA vymizí při indukované terminální diferenciaci erytroidních buněk (Lake a Jelinek 1993). Kritickým faktorem pro regulaci hladiny mrna Plk je polyadenylační signál na 3 konci mrna, který je odstraněn po navozené terminální diferenciaci, transcript je pak rychle degradován (Lake a Jelinek 1993).

29 29 Maximální hladina mrna je detekovatelná v G2/M fázi buněčného cyklu, naopak v G1 fázi Plk mrna chybí. Je zjištěno, že úroveň exprese Plk mrna je regulována promotorem, který je aktivován na konci G1 fáze a zůstává aktivní až do G2/M (Brauninger et al. 1995, Uchumi 1997, Lane a Nigg, 1997). Mikroinjekcí mrna Plk lze stimulovat fibroblasty synchronizované v G0 ke vstupu do mitozy a konstitutivní exprese vede k nádorové transformaci myších fibroblastů (Smith et al. 1997) Sekvenční příbuznost Polo kináz Všechny doposud známé Polo kinázy jsou sekvenčně příbuzné, homologie je vyšší na N konci. Motiv 30 aminokyselin ležící těsně za polovinou na počátku C části molekuly označovaný jako Polo box, je vysoce fylogeneticky konzervativní. Tato doména je přítomna u všech polo kináz a je tedy znakem molekul náležejících do rodiny Polo kináz. Tento sekvenční motiv je pravděpodobně zodpovědný za lokalizaci molekuly v průběhu buněčného cyklu (Lee et al. 1998). C terminální část molekuly obsahuje regulační doménu nezbytnou pro inhibici aktivity Plk (Mundt et al. 1997) Exprese Plk proteinu Exprese proteinu kolísá tak jako exprese mrna v rámci buněčného cyklu není detekovatelný v G1, roste během S fáze, zůstává konstantní během G2/M a rychle klesá po M fázi (Holtrich et al. 1994). V některých experimentech bylo poukázáno na to, že Plk má u savčích buněk nějaký vztah k syntéze DNA v S fázi (Hamanaka et al. 1994). Tato zjištění byla ovšem v rozporu s novějšími nálezy (Lane a Nigg, 1996), kdy při mikroinjekci protilátek proti Plk do kultivovaných buněk nebyl pozorován vliv na průběh replikace DNA. Nejnovější experimenty ovšem prokázaly spojitost mezi Plk a replikací DNA. Tato spojitost je ovšem uskutečněna až v G2/M v kontrolním bodě monitorujícím už proběhlou replikaci DNA (Smits et al. 2000). viz níže.

30 30 Během G2/M je Plk fosforylována na serinu což vede ke zvýšení její kinázové aktivity. Bylo zjištěno, že defosforylace sníží aktivitu Plk 5-10x. Kinázovou aktivitu Plk je možno měřit za použití kaseinu jako substrátu (Hamanaka et al. 1995).V in vitro podmínkách může být Plk fosforylována aktivním komplexem MPF. Načasování aktivity Plk v G2/M u savců je stejné jako načasování aktivity MPF, naproti tomu u Drosophily je aktivita polo kinázy posunuta směrem k telofázi (Hamanaka et al. 1994).

31 31 Vzhledem k vysoké hladině Plk u rychle se množících buněk se zdá, že by exprese Plk mohla být měřítkem proliferační aktivity některých nádorů a mohla tak tedy odrážet stupeň jejich malignity (Holtrich et al. 1994, Wolf et al. 1997, Yuan et al. 1997). Nejnovější práce se zabývají i možností ovlivnit expresi,

32 32 popřípadě aktivitu Plk k ošetření nádorových buněk v rámci protinádorové terapie (Elez et al. 2000) Lokalizace Plk během buněčného cyklu Práce zaměřené na lokalizaci Plk během buněčného cyklu ukázaly, že Plk je v S fázi distribuovaná volně v cytoplazmě i v jádře. V M fázi buněčného cyklu se během profáze a metafáze nachází na dělícím vřeténku, během anafáze se přesouvá do ekvatoriální roviny dělícího vřeténka a v telofázi a během cytokineze je detegovatelná na postmitotických můstcích (Lane a Nigg, 1997, Arnaud et al. 1998, Wianny et al. 1998, Logarinho a Sunkel 1998). Podle některých údajů se nachází i na kinetochorách (Maro B., prezentace na EMBO pracovním setkání Meiotic maturation, září , Cuenca, Španělsko). Dá se proto předpokládat, že Plk se podílí nějakým způsobem na kontrole dynamiky dělícího vřeténka a segregaci chromozomů (Golsteyn et al. 1995, Lane a Nigg, 1996).

33 Dosud známé molekuly interagující s Plk Mezi molekuly, které byly identifikovány jako substráty Polo kináz, popřípadě molekuly, se kterými se Plk váže v některých stádiích buněčného cyklu patří: α, β i γ tubulin, kinesin-like-protein CHO1/MKLP-1 (Lee et al. 1995,Lane a Nigg, 1997, Tavares et al. 1996). Z dalších možných substrátù byly studovány WEE1/MYT1, tedy kinázy regulující aktivity MPF a CDC27 (jako složka APC) (Lane a Nigg, 1997, Kotani et al. 1998) a). Nejnověji byla identifikována interakce s Hsp 90 (Simizu a Osada 2000) Vztah Plk k aktivaci MPF Z některých experimentů vyplývá, že Plk by mohla mít vztah i k aktivitě MPF (Brassac et al. 2000) (Lane a Nigg, 1996, Karaiskou et al. 1998, Descombes a Nigg 1998, Qian et al Abrieu et al. 1998).

34 34 Pro tuto možnost svědčí substrátová specificita Plk, načasování aktivity během buněčného cyklu a prostorová lokalizace v G2/M. Jak již bylo uvedeno, autokatalytická aktivační smyčka mezi MPF a CDC25 vyžaduje buď startovní množství aktivního MPF, nebo CDC25. V G2/M jsou však oba v neaktivním stavu. Zahájit tento proces může buď kináza aktivující základní množství CDC 25C, nebo fosfatáza schopná aktivovat MPF. Vzhledem k tomu, že pro aktivaci MPF by byla nutná fosfatáza s duální aktivitou, neboť fosfátové skupiny se nachází na dvou různých aminokyselinách, zdá se pravděpodobnější, že nejprve je aktivovaná CDC 25C. To znamená, že aktivátorem by mohla být kináza se serin/treonin kinázovou aktivitou, která se nachází ve stejném buněčném kompartmentu a její aktivita se shoduje i časově s aktivací MPF. U Xenopa se podařilo prokázat, že takovou aktivující kinázou je kináza Plx, což je homolog Polo kinázy u tohoto druhu (Kumagai a Dunphy, 1996). Z dalších experimentů vyplývá, že tato kináza je schopná fosforylovat CDC25 nejen in vitro, ale i po přidání PLx do oocytárních extraktů Xenopa lze na SDS PAGE pozorovat fosforylovanou formu CDC 25C. Plx dále zvyšuje schopnost CDC25 defosforylovat a tím aktivovat MPF. Plx ale není schopná bez CDC 25C aktivovat v extraktech MPF přímo (Karaiskou et al. 1998, Karaiskou et al. 1999). Nejnovější experimenty ukázaly, že regulace aktivity Plk je závislá na replikaci DNA (Smits et al. 2000). Hypotetický model tedy vypadá tak, že v případě bezchybné replikace DNA se Plk podílí prostřednictvím CDC25C na aktivaci MPF a vstupu do mitózy. V případě, že replikace DNA neproběhla úspěšně, Plk není aktivována a nemůže tak aktivovat CDC25C a tedy nedojde ani k zahájení M fáze. Není však doposud zřejmé jaká je posloupnost aktivace Plk, MPF a CDC25C v tomto kontrolním bodě.

35 35 Exprese Plk byla za použití inhibitorů CDK studována i v v oocytech myši, kde bylo zjištěno, že mezi metafazí II a prvním mitotickým cyklem k destrukci proteinu Plk nedochází (Pahlavan et al. 2000). V mitotickém cyklu je

36 36 Plk u savců obdobně jako jiné molekuly buněčného cyklu destruována specifickou ubikvitinací (Ferris et al. 1998) Ostatní doposud identifikované molekuly Polo rodiny Zatímco u Drosophily, Saccharomyces a Schizosaccharomyces existuje pouze jeden zástupce této rodiny, u obratlovců je počet členů Polo rodiny vyšší (Lane a Nigg). Další identifikované kinázy, nazvané Fnk u myši (FGF- Inducible Kinase), Prk (Proliferation-Related Kinase) u člověka (Li et al. 1996, Chase et al. 1998) a dále Snk (Serum Inducible Kinase) u myši i u člověka patří mezi geny časné odpovědi (Simmons et al. 1992; Donohue et al. 1995), to znamená, že se ve formě mrna objevují už za krátkou dobu po mitogenní stimulaci buněk nachazejících se v G0 a zároveň to, že k expresi RNA u nich není třeba proteosyntézy. Obě kinázy se nachází v nerůznějších tkáních a orgánech, ale vždy se jedná o omezenou buněčnou populaci. Z několika nových experimentů se zdá, že tyto molekuly se neúčastní v buněčném cyklu tak jako Polo kináza, spíše souvisí s diferenciací buněk. Zcela recentně bylo zjištěno, že se podílí na mechanismech buňky monitorujících kontakt buňky s povrchem (Kauselmann et al. 1999, Holtrich et al. 2000). Dalšími příbuznými kinázami jsou Sak-A (Serum Activated Kinase) a Sak-B. Obě se vyskytují v rychle se množících tkáních během embryonálního vývoje, u dospělců se nachází exkluzivně v testes (Fode, et al. 1994; Fode a kol. 1996). Jejich funkce je doposud neznámá. Tyto dvě kinázy také, jako jediné, nemají ve své sekvenci takzvaný Polo box, typický pro všechny Plk, i když sekvenčně do této rodiny proteinkináz náleží.

37 37

38 38 2. Cíl práce Nové poznatky o molekulárních mechanismech řízení buněčného cyklu u prasete neslouží jen jako srovnávací studie k obvyklým modelovým zvířatům, zejména hlodavcům. Prase je v dnešní době stále častěji využíváno jako modelový organismus biomedicínského výzkumu, neboť svou stavbou i funkcí jednotlivých tkání, orgánů a orgánových systémů nám umožňuje se při studiu fyziologie i patologie životních procesů daleko více přiblížit k poměrům panujícím v lidskému organismu. Cíle naší práce jsme si stanovili takto: 1. Izolovat prasečí fetální fibroblasty a vypracovat optimální podmínky jejich kultivace in vitro. Pokusit se o jejich chemickou synchronizaci v různých stádiích buněčného cyklu. 2. Charakterizovat některé důležité regulátory buněčného cyklu prasečích fetálních fibroblastů náležící do nově popsané rodiny polo kináz. Získané poznatky budou použity ke studiu možností cíleného ovlivnění průběhu buněčného cyklu. 3. Prostudovat expresi molekul náležících do rodiny Polo kináz v různých fázích buněčného cyklu u synchronizovaných prasečích fetálních fibroblastů s přihlédnutím k praktickému využití kvantitativních změn v expresi jako markeru specifických fází buněčného cyklu a proliferační aktivity buněk. 4. Na modelu meitotické maturace prasečích oocytů in vitro prozkoumat vztah Plk zejména k aktivaci MPF a jeho regulátorů CDC25 a WEE1/MIT1.

39 39 3. Použité metody a laboratorní postupy: Pokud není uvedeno jinak, veškeré použité chemikálie byly dodány firmou Sigma Klonování fragmentu cdna prasečího Plk, Fnk, Snk: Pro zaklonování fragmentů uvedených molekul byla použita PCR metoda. Aby bylo na minimum omezeno množství chybně inkorporovaných nukleotidů použili jsme polymerázy Pfu (Stratagene). Tento enzym má velmi malou inkorporaci chybných nukleotidů za optimálních reakčních podmínek. 1µg celkové RNA isolované z prasečích fetálních fibroblastů pomocí RNeasy kit od (Qiagen) byl použit jako templát pro reverzně transkripční reakci. Reakční mix byl následujícího složení: PCR pufr II 1X (Perkin Elmer), 5mM MgCl 2 (Gibco), dntps 1mM každý (USB), RNase inhibitor 1 U/1 µl (Perkin Elmer), MuLV Reverse Transcriptase 2.5 U/1 µl (Perkin Elmer), oligo d(t) mm (Gibco), DEPC voda do objemu 40 µl. Reakce proběhla za následujících podmínek: 5 min 65 C, 10 min 25 C (v tomto bodě byla přidána reverzní transkriptáza ), 1 hodina 42 C, 5 min 75 C. Pro následující Pfu PCR bylo použito 5 µl RT reakce jako templát pro 100 µl PCR reakci. PCR reakce (100 µl) byla následujícího složení: reakční pufr pro klonovanou Pfu DNA polymeráza 1x (Stratagene), dntps 0.2 mm každý (USB), primery: horní 5- CGG ATC CGG CGA AAG AGA TCC CGG AGG TCC TAG T-3; dolní 5- CCT CGA GTT ACG GCT GGC CAG CTC CTT GCA GCA-3; 0.5 µl každého o koncentraci 100 µm (MWG zákaznický servis); klonovaná Pfu DNA polymeráza (Stratagene) 2.5 U. PCR program byl následující: 94 C 45 sec, 60 C 45 sec, 72 C 3 min, závěrečná extenze 72 C 10 min, 29 cyklů. Výsledné fragmenty bez primerových sekvencí (Plk 1579, Fnk 1007, Snk 952) byly poté

40 40 přečištěny na agarozovém gelu a zaklonovány do pgem vektorů za použití kitu pgem-t easy cloning kit (Promega), který je postaven na specifickém T-A klonování. Plazmidy byly poté použity k transfekci E. coli kmene DH5α. Dva nezávislé klony z každé molekuly byly osekvenovány komerčním servisem (TopLab, Německo) Izolace prasečích fetálních fibroblastů, kultivační podmínky, synchronizační protokol: FCS bylo dodáno Pracovištěm speciálních kultivačních sér, VFU, Brno. Primární fibroblasty byly izolovány z 25 denních prasečích fétů. Jednotlivé féty byly operačně vyjmuty z dělohy březí prasnice a byly z nich odstraněny břišní a hlavové části spolu s končetinami. Hřbetní části byly sterilně rozstříhány v předehřátém HBSS s trypsinem a po dobu 20 min byly ponechány tkáně v trypsinu. Po této době byla reakce ukončena přidáním FCS do koncentrace 10%. Větší zbytky tkáně byly odstraněny dekantací. Buňky byly promyty 3x v DMEM a poté inkubovány 20 min v kompletním DMEM z FCS 10% v termostatu s řízenou atmosférou 5% CO 2, 37 C. Po této době bylo odstraněno médium spolu s nepřisedlými buňkami. Adherentní buňky byly použity k další kultivaci. Fibroblasty byly pasážovány 2x v DMEM obsahujícím 10% FCS, 1 mm L-glutamin a penicillin/streptomycin. Po druhé pasáži byly buňky trypsinovány a uchovány v tekutém dusíku až do dalšího použití. Pro každý synchronizační experiment byly buňky 3 pasáže rozmraženy a kultivovány do 80% konfluence a následně synchronizovány dle synchronizačního protokolu. Synchonizační protokol: 1. buňky synchronizované ve fázích G0/G1 byly získány redukcí FCS (0,2%) ve DMEM po dobu 48 hodin. 2. buňky synchronizované na začátku S fáze byly získány za použití buněk synchronizovaných v G0/G1, které byly následně stimulovány 10% FCS v DMEM obsahujícím 6 µm Aphidicolin po dobu 14 hodin.

41 41 3. buňky v G2/M. K této synchronizaci byly použity buňky, které byly podle předchozího protokolu synchronizovány na začátku S fáze. Tyto buňky byly následně stimulovány 10% FCS v médiu bez Aphidicolinu po dobu tří hodin a pak synchronizovány 100 µm Butyrolactonem I (Affinity) v DMEM s 10% FCS po dobu 5 hodin. 4. buňky částečně synchronizované v různých částech buněčného cyklu byly získány stimulací buněk synchronizovaných v G0/G1 10% FCS po různě dlouhou dobu. Měření obsahu DNA Každý synchronizační experiment byl kontrolován pomocí FACS. K analýze buněk na tomto zařízení byl použit následující postup: buňky rostoucí na kultivačních lahvích byly 2x opláchnuty předehřátým PBS, trypsinovány a cetrifugovány 1000g/5min. Po resuspendování v PBS byly fixovány metanolem vymraženým předem na -20 C. RNA ve fixovaných buňkách byla odstraněna RNasou A (1mg/ml) po dobu 30 min. DNA byla obarvena pomocí propidium jodidu (20µg/ml). Profil DNA byl měřen pro každý experiment na průtokovém cytometru Becton Dickinson FACScan. 3.3 Měření Exprese mrna Plk byla měřena ve vzorcích synchronizovaných prasečích fetálních fibroblastů za použití dvou metod sloužících ke kvantifikaci RNA: enzymatické RT-PCR a neenzymatické RPA. Izolace RNA Po ošetření buněk podle synchronizačního protokolu byl proveden jejich oplach předehřátým PBS 3x na kultivační láhvi. Kultivační láhve byly uchovány v -80 C až do následné izolace RNA. K izolaci celkové RNA byl použit RNeasy Mini Kit (Qiagen). Po izolaci byla změřena koncentrace RNA, následně byla RNA alikvotována podle potřeby a zamražena na -80 C. Semikvatitativní multiplex RT-PCR: K RT reakci bylo použito 0.5 µg celkové RNA jako templát a objem reakce byl 40 µl. RT mix byl následující: PCR Pufr

42 42 II (Perkin Elmer) 1X, 5mM MgCl 2 (Gibco), dntps (USB) 1mM každý, RNase inhibitor (Perkin Elmer) 1 U/1 µl, MuLV Reversní transkriptáza (Perkin Elmer) 2.5 U/1 µl, Náhodné Hexamery (Perkin Elmer) 2.5 mm, a DEPC voda do výše uvedeného celkového objemu. RT reakce byla provedena za následujících podmínek: počáteční denaturace 5 min na 65 C, pak 10 min na 25 C (v tomto kroku byla přidána reverzní transkriptáza), 1 hodina na 42 C a nakonec 5 min na 75 C. Výsledná cdna byla uchována na -30 C až do zpracování. Ke kvantifikaci Plk mrna byla použita semikvantitativní multiplex RT-PCR byla použita s GAPDH jako vnitřním standardem. Sekvence primerů pro Plk byly následující: horní- 5-CTC CTG GAG CTG CAC AAG AGG AGG AA-3, spodní 5-TCT GTC TGA AGC ATC TTC TGG ATG AG-3. Sekvence primerů pro GAPDH byly: horní 5-GTT CCA GTA TGA TTC CAC CCA CGG CAA GTT-3 dolní 5-TGC CAG CCC CAG CAT CAA AGG TAG AAG AGT. Reakční objem PCR reakce byl 20 µl, 5 µl RT reakce bylo použito jako templát. PCR mix obsahoval: 1X PCR pufr (Gibco), 0.2 mm každého dntp (USB), 1.5 mm MgCl 2 (Gibco), primery 0.5 µm každý (MWG Biotech), Taq DNA polymeráza (Gibco) 2.5 U/100 µl. PCR reakce probíhala za následujících podmínek: počáteční denaturace na 94 C 1 min, následovaná : 94 C 15 sec, annealing 60 C 30 sec, elongace na 72 C 1 min, závěrečná extenze 72 C 5 min. PCR mix zpočátku obsahoval pouze primery pro Plk, primery pro GAPDH byly přidány během reakce po proběhnutí 5 cyklu. Tak bylo možno použít multiplex reakci i přes velký nadbytek GAPDH. Celkový počet cyklů byl 27 (5+22). Kontrolní reakce ke každému experimentu byly: jedna zkumavka bez cdna, a jedna pouze s totální RNA. PCR amplikony byly separovány na 1,5% agarózových gelech v prostředí TBE a ethidium bromidu. Výsledek byl zaznamenán pomocí CCD kamery a vyhodnocen denzitometricky. Kvantita signálu byla vyhodnocena pomocí Image Master 1D Elite V3.

43 43 Ribonuclease Protection Assay (RPA): Plasmidy obsahující prasečí GAPDH a Plk cdna inzerty byly použity na přípravu značených RNA sond. Před reakcí byly plazmidy linearizovány digescí restriktázami Bgl II (Plk) a Not I (GAPDH). Po štěpení byly plazmidy přečištěny na gelu. Délka chráněných fragmentů byla 224bp pro GAPDH a 458bp pro Plk. MAXIscript SP6/T7 Kit (Ambion) byl použit k syntéze sond značených [α- 32 P] (800 Ci/mmol, 20 mci/ml) UTP (Amersham) v in vitro transkripci. Po syntéze byly sondy vyčištěny na polyakrylamidovém gelu. K hybridizaci v roztoku byl použit 1µg celkové RNA izolované z každého intervalu. K hybridizaci bylo použito takové množství sondy, aby v každém intervalu byla v nadbytku nad stanovovanou RNA. Reakce byla uskutečněna za použití chemikálií z RPA II kitu (Ambion). Hybridizace byla ponechána přes noc na 42 C. Po digesci RNasou A + T1 byly chráněné fragmenty separovány na 5% polyakrylamidovém gelu. Signál z gelu byl následně detekován autoradiograficky. Exponované filmy byly po vyvolání skenovány CCD kamerou a signál byl analyzován pomocí Image Master 1D Elite V3. Gely byly také obarveny stříbrem za účelem detekce polohy RNA hmotnostních markerů Kultivace prasečích oocytů: Oocyty prasat byly získány z cyklujících prasniček na místních jatkách. Po poražení, paření a vykolení prasat byly vaječníky odděleny a aspirací buď přímo na jatkách nebo následně v laboratoři byly získány GV oocyty s plně vyvinutým kumulem. Kultivovány byly v M199 Hepes modifikovaném médiu z 10% FCS a 1,5 IU/ml FSH v kapkách na hodinovém sklíčku po dobu nutnou k dosažení konkrétního stádia meiotické maturace v termostatu v atmosféře 5% CO 2 a 38,5ºC pod parafínovým olejem Příprava antisér a monoklonálních protilátek: K imunizaci králíků a myší za účelem přípravy monoklonálních i polyklonálních protilátek byly

44 44 použity jako antigen fúzní proteiny připravené v E. coli. Inzerty z plazmidů pgex 4Z reprezentujících prasečí fragmenty Plk, Fnk a SNK byly překlonovány do expersních vektorů pet 30 a,b,c s přihlédnutím ke čtecímu rámci. Získané rekombinantní plazmidy byly použity k transfekci buněk E. coli kmene BL 21(DE3)Lys S. Indukce exprese byly provedena pomocí IPTG v koncentraci 0,5µM přes noc v teplotě 20ºC. Fúzní protein byl izolován pomocí S a His Tag komerčním kitem His Trap (Pharmacia Amersham). Vyčištěným fúzním proteinem byli imunizováni outbrední králíci plemene Novozélandský bílý podle individuálních imunizačních schémat. Po vykrvení králíků bylo sérum získáno standardním postupem (1 hodinu při laboratorní teplotě, přes noc při 4ºC v ledničce a následná centrifugace na odstranění krevního koláče). Sérum bylo dále uchováno v alikvotech při Sérum bylo použíto buď přímo, nebo se z něj izolují imunoglobuliny dvoustupňovou metodou: I. Srážení hrubé frakce imunoglobulinů 50% nasycením síranem amonným 1. centrifugace séra 3000 g, 30 min 2. za míchání při laboratorní teplotě přidáváme nasycený roztok síranu amonného do 50% nasycení séra 3. necháme reagovat při 4º C přes noc 4. centrifugujeme 3000g /30 min, pelety obsahují hrubou imunoglobulinovou frakci séra 5. rozpustíme sraženinu v PBS a odstraníme přebytek síranu, buď dialýzou proti PBS, nebo rychleji na koloně Sephadexu G-25 fine II. Izolace čistých imunoglobulinů na koloně Proteinu A: 1. ekvilibrujeme kolonu Proteinu A navázaného na Sepharose CL-4B ve vazebném pufru (100 mm Tris, ph 8) 2. k roztoku protilátek přidáme 1/10 objemu 1,0 M Tris, ph 8,0 3. zavedeme roztok protilátek na kolonu, pak propláchneme kolonu 10 objemy 100mM Tris, ph 8,0, poté 10 objemy 10 mm Tris, ph 8,0

45 45 4. eluujeme čisté protilátky z kolony 100mM glycinem ph 3.0. Eluce probíhá po krocích, 500 µl na jeden alikvot 5. eluáty jímáme do zkumavek Ependorf, do kterých byl předem napipetován roztok 1 M Tris ph 8,0, 50 µl na 500µl eluátu, aby nedošlo k poškození imunoglobulinů kyselým glycinovým pufrem 6. definujeme čistotu produktu na SDS PAGE a aktivitu protilátek v imunoblotu Monoklonální protilátka byla získaná ve spolupráci s Laboratoří molekulární embryologie na Mendlově zemědělské univerzitě v Brně. Příprava této monoklonální protátky se dá stručně popsat v těchto bodech : 1. imunizace mladých samic inbredního kmene BALB/c (Anlab) 200 µg rekombinantního proteinu, který byl použit pro přípravu antiséra, do břišní dutiny, opakovaná imunizace za 14 dní, po 7 dnech byla slezina vyjmuta, v IDMEM za pomoci skalpelu a skleněné stříkačky rozmělněna. Po dekantaci větších kousků byly buňky propláchnuty 3x IDMEM bez FCS a buňky byly naředěny na požadovanou koncentraci až 6 dní (podle životnosti buněk) před plánovanou fůzí byly rozmraženy buňky myelomové linie kmene BALB/c. Tato linie je selektována na enzymový defekt v HGPRT a TK. Před fúzí byly mechanicky uvolněny z tkáňových lahví, centrifugovány v IDMEM bez FCS 2x, spočítány a naředěny. 3. Fůze: obě buněčné populace byly smíchány poměru 1:10 ve prospěch slezinných buněk. Společně centrifugovány v IMDM bez FCS. Po slití do sucha byl přidán PEG C teplý v určeném množství a buňky byly opatrně promíchávány po dobu jedné minuty. Po uplynutí této doby bylo přidáno IDMEM předehřáté na 37 C k zastavení reakce. Médium bylo přidáváno po kapkách během 1,5 minuty. Centrifugujeme 2x v DMEM, poté v DMEM s 5% FCS, nakonec jsou po poslední centrifugaci buňky resuspendovány v DMEM s 20% FCS + 5x HAT (hypoxantin, amonopterin, thymidin) + 1x Hybridoma enhancing factor.

46 46 4. Kultivace hybridomů probíhala na 96 jamkových ELISA destičkách s rovným dnem. Od 3 dne po fůzi byla prováděna kontrola v inverzním mikroskopu na rostoucí kolonie. 5. kultivační médium z jamek s rostoucími koloniemi bylo testováno na přítomnost specifických imunoglobulinů v ELISA, kde antigenem byl fúzní protein. 6. touto metodou byly připraveny 2 hybridomy (PL12 a P1) které tvoří protilátky rozpoznávající Plk. Po klonování těchto hybridomů metodou hraničního ředění byly vybrány nejproduktivnější klony na výrobu protilátek Imunobloting : Připravujeme diskontinuální polyakrylamidový gel podle receptury uváděné firmou BioRad, o potřebné koncentraci (7,5 a 10 procentní). Vzorky buněk byly lyzovány ve vzorkovém pufru (Tris-HCl ph 7,6, mercaptoethanol, SDS bromphenol blue) v poměru 1:1 a denaturovány ve 100 C po dobu 3 minut. Poté byly nanášeny na horní zaostřovací gel. Dělení probíhalo na elektroforéze firmy BioRad, přenos na membránu byl proveden polosuchým způsobem (Fast Blot Biometra). Membrána byla ihned poté inkubována v TTBS s blokovacím agens (5% roztok želatiny nebo odtučněného mléka, nebo 2% roztok albuminu) podle potřeby, zpravidla 1-3 hodiny při laboratorní teplotě, nebo v lednici přes noc. Primární protilátky byly aplikovány na membránu v blokovacím roztoku v ředění, které je v rozsahu 1:100 až 1:5000, inkubace s protilátkou probíhaly většinou v chladu přes noc, v některých případech 1 hodinu za pokojové teploty. Sekundární protilátky byly používány různé provenience a potřebné specifity značené HRP, detekce se prováděla ECL Imunoprecipitace: se provádí z buněčného materiálu z tkáňových kultur nebo z izolovaných buněk, případně oocytů: 1. Médium bylo odstraněno a buňky opláchnuty teplým PBS bez Mg 2+ a Ca 2+.

47 47 2. Buňky byly lyzovány v RIPA lyzovacím pufru (150 mm NaCl, 50 mm Tris ph 8.0, 0.5% deoxycholát sodný, 0.1% SDS, 0.1 mm Na VO, 1% NP4O, aprotinin -zásobní roztok 1 mg/ml, z tohoto roztoku dáme 1µ/l ml RIPA, trypsin inhibitor - zásobní roztok 10 mg/ml, z tohoto roztoku dáme 1µl/lml RIPA. Lýza se provádí na ledu, pufr je předem vychlazen. 3. Lyzát byl centrifugován při 4 C g, 5 min 4. Předčištění lyzátu pomocí proteinu G 5µl na 150 µl lyzátu (Sigma P-4691), 60 min za stálého míchání, 4 C. 5. Centrifugace při g 4 C, 5 min na odstranění proteinu G. 6. Přidání protilátek do předčištěného lyzátu, 1µl antiséra na 300 µl lyzátu. Inkubace v lednici 2 hodiny za stálého míchání. 7.Centrifugace při 4 C, g, 5 min. 8.Protein G 5µl na 150 µl lyzátu, ponecháno v chladničce přes noc za stálého míchání. 9. Centrifugace při 4 C, g 5 min 5X. 10. Po poslední centrifugaci byl přidán příslušný objem 2x koncentrovaného vzorkového pufru, podle potřeby redukujícího nebo neredukujícího, proteiny byly denaturovány 100 C na 3 min, alikvoty byly zamraženy, na detekci byl použit imunobloting

48 48 4. Výsledky: 4.1. Sekvence publikované v GenBank: Plk-p (AF339021), Fnk-p (AF348425), Snk-p (AF348424). Jsou přiloženy specifikace jednotlivých sekvencí tak, jak jsou prezentovány v GenBank Publikace zaměřené na synchronizaci prasečích fetálních fibroblastů a expresi Plk v těchto buňkách: Kues WA, Anger M, Carnwath JW, Paul D, Motlik J, Niemann H. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biol Reprod Feb;62(2): Martin Anger, Wilfried A. Kues, Jiri Klima, Manfred Mielenz, Jan Motlik, Joseph W. Carnwath and Heiner Niemann EXPRESSION OF POLO-LIKE KINASE IN CELL CYCLE SYNCHRONIZED PORCINE FETAL FIBROBLASTS přiložen manuskript 4.3. Předběžné výsledky analýzy exprese Plk na úrovni mrna a proteinů v prasečích oocytech v průběhu zrání in vitro.

49 49 Předběžné výsledky analýzy exprese Plk na úrovni mrna a proteinů v prasečích oocytech v průběhu zrání in vitro. Měření exprese Plk mrna v průběhu meiotické maturace prasečích oocytů. Denzitometrická měření prokázala, že hladina Plk mrna je prakticky konstantní v průběhu zrání in vitro. Do každé RT-PCR reakce byla použita RNA izolovaná z 5 oocytů.

50 50 Měření exprese proteinů ukázalo, že celkové množství Plk proteinu je konstantní v průběhu zrání prasečích oocytů in vitro. V tomto experimentu byla srovnána exprese Plk v oocytech v normálním zracím médiu M199 (viz metodika) a v médiu M199 obsahujícím 100µM Butyrolacton I. Získané králičí polyklonální antisérum detekuje dvě formy Plk proteinu lišící se pohyblivostí na SDS gelu, což pravděpodobně koresponduje s fosforylačními změnami spojenými s aktivací Plk. Na každý interval bylo použito 50 oocytů.

51 51 Srovnávací studie získané králičí polyklonální protilátky a monoklonální protilátky, při přípravě obou byl použit stejný antigen. Ze srovnání obou vyplývá, že monoklonální protilátka na rozdíl od polyklonální zviditelňuje pouze jednu formu Plk. Každý interval představuje 50 prasečích oocytů v indikovaných stádiích meiotickho zrání.

52 52 Na membránu bylo přeneseno 100 prasečích GV oocytů rozdělených v SDS PAGE. Membrána s rozdělenými proteiny byla podélně rozříznuta a každá část membrány byla inkubována v jiné protilátce (srovnání polyklonální a monoklonální protilátky). Tento experiment potvrzuje, že monoklonální protilátka detekuje formu na SDS PAGE migrující rychleji, tedy pravděpodobně defosforylovanou, zatímco polyklonální detekuje obě formy Plk proteinu.