Návod k použití. Devyser Resolution 13 v2 Kat. No.: 8-A Devyser Resolution XY v2 Kat. No.: 8-A012.2-XY. For in vitro Diagnostic Use

Transkript

1 Devyser Resolution 21 v2 Kat. No.: 8-A Devyser Resolution 18 v2 Kat. No.: 8-A Devyser Resolution 13 v2 Kat. No.: 8-A Devyser Resolution XY v2 Kat. No.: 8-A012.2-XY For in vitro Diagnostic Use Návod k použití Stránka 1 z 32

2 Obsah Obsah 2 1. Seznámení se systémem Devyser Resolution v2 4 Použití 4 Obsah soupravy 4 Postup 4 Princip metody 4 2. Upozornění 6 3. Symboly použité na štítcích 7 4. Požadovaný materiál Součástí kitu 8 Konfigurace 8 Složky Devyser Resolution 21 v2 8 Složky Devyser Resolution 18 v2 8 Složky Devyser Resolution 13 v2 8 Složky Devyser Resolution XY v Požadované položky, které nejsou v soupravě 8 Příprava reagencií 8 Extrakce DNA 8 Amplifikace 9 Detekce 9 Size Standard Souprava pro barevnou kalibraci 9 5. Skladování a nakládání se soupravou Požadavky na vzorek 11 Klinické vzorky 11 Postup a skladování 11 Kontroly Návod k použití Pracovní postup Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v Příprava vzorků a amplifikace PCR 12 Extrakce DNA 12 Přidání vzorku 12 Amplifikace Detekce 14 Příprava vzorků 14 Příprava vzorku pro kapilární elektroforézu 14 Příprava přístroje 14 Run Modules Výsledky a analýza 16 Stránka 2 z 32

3 Principy QF-PCR 16 Marker pro X chromozóm 18 Nepolymorfní markery 19 Pseudoautozomální XY markery 19 Přehled markerů Devyser Resolution v2 20 Přehled markerů Devyser Resolution 18 v2 20 Přehled markerů Devyser Resolution 13 v2 21 Přehled markerů Devyser Resolution XY v2 21 Provádění analýzy 22 Poměrová kritéria (Ratio Criteria RC) 22 Markery se dvěma píky 22 Markery se třemi píky 22 Výškový poměr 22 Interpretace výsledků 22 Troubleshooting 23 Artefakty PCR 24 Elektroforetické artefakty Klinická studie 27 Devyser Resolution v2 (8-A012.2) 27 Sensitivita 27 Specificita 27 Opakovatelnost Limitace použití Reference Upozornění zákazníkům Kontaktní informace 32 Stránka 3 z 32

4 1. Seznámení se systémem Devyser Resolution v2 Použití Souprava Devyser Resolution v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů 21. Souprava Devyser Resolution 18 v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů 18. Souprava Devyser Resolution 13 v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů 13. Souprava Devyser Resolution XY v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií chromozomů X a Y. Obsah soupravy Souprava Devyser Resolution v2 obsahuje reagencie připravené k použití pro PCR amplifikace genetických markerů. Postup DNA extrakce: Souprava Devyser Resolution v2 byla validována s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, kat. č ) pro extrakci DNA z lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, kat. č ) pro extrakci DNA z biopsií choriových klků. Amplifikace: Souprava Devyser Resolution v2 byla validována s využitím PCR cycleru ABI GeneAmp System Detekce: Genetické analyzátory Applied Biosystems (ABI 310, 3100, 3130, 3500, 3730) a MegaBACE podporující detekci Dye-Set DEV-5. Princip metody Kvantitativní fluorescenční PCR (QF-PCR) zahrnující amplifikaci, detekci a analýzu krátkých opakujících se sekvencí (STR) a konzervativních sekvencí. Pro amplifikaci chromozom specifických sekvencí se používají fluorescenčně značené primery, takže počet kopií každé sekvence odpovídá počtu příslušných chromozomů. Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí automatického genetického analyzátoru. Relativní množství každé alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu píků, příp. jejich výšek. Normální diploidní vzorek obsahuje příspěvek obou somatických chromozomů. Dvě alely chromozom specifické STR sekvence jsou detekovány jako dva píky v poměru 1:1, pokud je marker heterozygotní a jako jeden pík, pokud je marker homozygotní. Stránka 4 z 32

5 Detekce další alely prostřednictvím tří píků v poměru 1:1:1 nebo jako dva píky v poměru 2:1 resp. 1:2 znamená přítomnost další STR sekvence, která může znamenat přítomnost dalšího chromozomu, jako je tomu u trizomie. Stránka 5 z 32

6 2. Upozornění A. Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 sady byly ověřeny pomocí PCR celkový reakční objem 25 µl.změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. B. Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních zkumavek. Doporučujeme používat špičky s filtry. C. Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné šarže. D. Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou. E. Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky. F. Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou reagencií, postupující do prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro detekci.příprava reagencií a extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i spotřební materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se přenášet mezi těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru používejte rukavice a při jeho opouštění je vyměňte za nové.přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory. Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory. G. Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace musí splňovat požadavky ČSN pro nakládání s biohazardním materiálem. H. Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a reagenciemi si řádně omyjte ruce. Stránka 6 z 32

7 3. Symboly použité na štítcích Šarže Exspirace Výrobce Počet testů In vitro diagnostický medicínský prostředek Skladujte při teplotě nižší nebo rovné Katalogové číslo Stránka 7 z 32

8 4. Požadovaný materiál 4.1 Součástí kitu Konfigurace Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 sady obsahují reagencie pro analýzu 25 vzorků každého. Složky Devyser Resolution 21 v2 Barva víčka Barva Zkumavky Štítek Katal.č. Obsah soupravy Oranžová Čirá PCR Activator 4-A018 1 Žlutá Hnědavá Resolution 21 v2 4-A180 1 Složky Devyser Resolution 18 v2 Barva víčka Barva Zkumavky Štítek Katal.č. Obsah soupravy Oranžová Čirá PCR Activator 4-A018 1 Bílá Hnědavá Resolution 18 v2 4-A179 1 Složky Devyser Resolution 13 v2 Barva víčka Barva Zkumavky Štítek Katal.č. Obsah soupravy Oranžová Čirá PCR Activator 4-A018 1 Oranžová Hnědavá Resolution 13 v2 4-A178 1 Složky Devyser Resolution XY v2 Barva víčka Barva Zkumavky Štítek Katal.č. Obsah soupravy Oranžová Čirá PCR Activator 4-A018 1 Red Hnědavá Resolution XY v2 4-A Požadované položky, které nejsou v soupravě Příprava reagencií Plast pro termocykler Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry. Nepudrované chirurgické rukavice Extrakce DNA Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční soupravy. Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry. Stránka 8 z 32

9 Amplifikace Thermocycler: ABI GeneAmp PCR System 9700 v módu 9600.Pro použití jiných PCR thermocyclerů je nutno použít ramping: ohřev 0,8 C/s, chlazení 1,6 C/s. Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry. Detekce Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI 310, 3100, 3130, 3500, 3730) Metodika je validovaná na polymerech: POP-4 a POP-7 Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu 1x Genetic Analyzer Buffer Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry. Size Standard 560 SIZER ORANGE (Devyser cat.# 8-A402) nebo GeneScan 600 LIZ Size Standard (Life Technologies cat.# ) 4.3 Souprava pro barevnou kalibraci ABI 3100, 3130, 3730: Použijte kit DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) jako Any5Dye dye set. ABI 3500: Použijte DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) a vytvořte DEV-5 dye set. ABI 310 Matrix file generation: Použijte DEV-5 Dye Set SingleCap kit (Devyser cat# 8-A400). Zvolte soubor modulu GS STR POP4 (1 ml) G5.md5 Stránka 9 z 32

10 5. Skladování a nakládání se soupravou A. Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 C. B. Smíchané reakční mixy (připravené přidáním Resolution 21, 18, 13 a XY v2 Mix do PCR Activator) je možné skladovat při +2 to +8 C po dobu 7 dní nebo při méně než -18 C po dobu 90 dní. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování. C. Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR. D. Nemíchejte reagencie z různých šarží. Stránka 10 z 32

11 6. Požadavky na vzorek Klinické vzorky Souprava Devyser Resolution v2 je určena pro použití s lidskou genomovou DNA izolované z plné krve, amniové tekutiny a choriové tkáně. Postup a skladování Dle pokynů výrobce. Kontroly Je doporučeno používat vhodné kontroly v každém runu jako například zdravou DNA a negativní kontrolu (bez DNA). Stránka 11 z 32

12 7. Návod k použití 7.1 Pracovní postup Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 Smíchané master mixy (Mix + activator) je vhodné připravit před použitím a celý process dokončit v jednom dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den, připravte master mixy den následující. Aktivované reakční směsi se připraví přidáním každého z rezoluce 21, 18, 13 a XY v2 směsi oddělit zkumavky PCR aktivátoru. Devyser Resolution v2 byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µl. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Ujistěte se, že je Resolution Mix kompletně rozmražen. 1. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte. 2. Přidat 500 ul každého z Resolution v2 směsi na samostatné trubky PCR Activator. 3. Opatrně promíchejte reakční master mix několikerým nasátím pipetou od spodu zkumavky. 4. Vortexujte reakční master mix a lehce centrifugujte. 5. Napipetujte 20 µl smíchaného master mixu do PCR zkumavek. 6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte. 7. Pokračujte ke kroku 7.2 Smíchaný reakční master mix je stabilní při +2-8 C po dobu 7 dní a při méně než -18 C po dobu 90 dní. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování. 7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR Extrakce DNA Dle pokynů výrobce. Pokud chcete použít jinou izolační soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2.doporučená koncentrace DNA pro analýzu soupravou Devyser Complete v2 je 2 až 30 ng/pcr reakci(0,4-6 ng genomové DNA/µL vzorku). Přidání vzorku Vzorky a kontroly by měl být přidán na vyhrazeném místě odděleném od přípravy reagencie, amplifikační a detekční oblasti. Stránka 12 z 32

13 1. Přidejte 5 µl vzorku (0,4-6 ng genomové DNA/µL vzorek) do každé PCR zkumavky se smíchaným reakčním master mixem(z kroku 7.1) 2. Zkumavky uzavřete a krátce stočte. Amplifikace Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler. Pro ABI GeneAmp System 9700 nastavte ramp speed na 9600 mode. Pro použití jiných PCR termocyklerů použijte tento ramping: ohřev 0,8 C/s, chlazení 1,6 C/s. Amplifikační prostor: Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího teplotního profilu (přečtěte si manuál pro podrobné informace o programování termocykleru): 95 C 15 min 94 C 30 sec; 58 C 1 min 30 sec; 72 C 1 min 30 sec for 27 cycles 72 C 30 min 4 C FOREVER 1. Nastavte reakční objem 25 µl. 2. Spusťte amplifikaci (délka cca 3 hodiny). 3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z termocykleru, vložte je do stojánku a stočte. Odstředivka krátce sbírat obsah. Opatrně sejměte víčka, abyste zabránili kontaminaci aerosolem.amplifikovaný materiál nepřenášejte do předamplifikačních prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a detekčním prostoru. Stránka 13 z 32

14 7.3 Detekce Příprava vzorků Řiďte se manuály pro příslušný analyzátor ABI ohledně údržby a nastavení přístroje. Před spuštěním analýzy soupravou Devyser Resolution v2, přístroj musí být kalibrován na dye set DEV-5.Detaily v sekci 4.3. Příprava vzorku pro kapilární elektroforézu 1. Připravte nanášecí směs smícháním 2 µl velikostního standardu (560 SIZER ORANGE) s 100 µl Hi-Di TM Formamidu (směs stačí pro 6 jamek/zkumavek). 2. Vortexujte 15 s. 3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých zkukmavek v případě ABI310) napipetujte po 15 μl nanášecí směsi před vložením do analyzátoru. 4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/zkumavky s ELFO nanášecí směsí. 5. Uzavřete destičku/zkumavky. Příprava přístroje Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru s následujícím nastavením: Sample ID Dye Set: Any5Dye/DEV-5 Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a přístroje. Run Modules Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou injekčního napětí a injekční doby. ABI 310(Běh s modulem souboru "GS STR POP4 (1 ml) G5.md5") Run Parameters POP-4 Capillary length 47 cm Run temperature 60 C Injection voltage 15 kv Injection time 5-15 s Run voltage 15 kv Run time 40 min Stránka 14 z 32

15 ABI 3100/3130 Run Parameters Capillary length Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage Run time POP-4/POP-7 36 cm 60 C 1,5 kv 20 s 15 kv 1500 s ABI 3500 Run Parameters Capillary length Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage Run time POP-7 50 cm 60 C 1,6 kv 15 s 19,5 kv 1500 s Stránka 15 z 32

16 8. Výsledky a analýza Doporučené postupy pro diagnostiku aneuploidií pomocí QF-PCR byly stanoveny sdružením Clinical Molecular Genetics Society (UK) a Association for Clinical Cytogenetics (UK) a jsou dostupné na: Principy QF-PCR Chromozom specifické krátké opakované DNA sekvence (small tandem repeats STR) jsou amplifikovány PCR. Vizualizací fluorescenčně značených primerů můžeme kvantifikovat PCR produkty. Kvantifikace se provádí výpočtem plochy píku příslušné STR pomocí automatického DNA sekvenátoru. STR se liší mezi jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují čtveřice nukleotidů v každé alele. DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má alely s různou velikostí) pro specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou v daném rozsahu (viz obr. 8.1).STR marker, které jsou heterozygotní jsou považovány za informativní. Obr Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1) DNA amplifikované z trizomických jedinců vykáže buď další pík (tři různé alely) se stejnou plochou (obr 8.2), nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu než druhý pík (viz obr. 8.3.). Stránka 16 z 32

17 Obr Trizomický marker (poměr ploch 1:1:1) Obr Trizomický marker (poměr ploch 2:1 a 1:2) Přítomnost jen jednohu píku znamená homozygozitu (všechny alely mají stejnou délku) a jsou považovány za neinformativní. Jedinci, kteří jsou homozygotní nebo monosomický pro specifický STR marker mají jen jeden pík (obr. 8.4.). Stránka 17 z 32

18 Obr Homozygotní/monozomní marker Marker pro X chromozóm Markery T1 a T3 jsou nepolymorfní marker chromozómu X a mohou být použity pro určení počtu chromozómů X u monozomií chromozomu X. Markery X chromozómu jsou v sekvencích na chromozómu X a na autozomálních chromozómech amplifikovaných stejnou sadou primerů. Amplifikované markery jsou separovány podle délky. Markery X chromozómu jsou v sekvencích na chromozómu X a na autozomálních chromozómech amplifikovaných stejnou sadou primerů. Amplifikované markery jsou separovány podle délky. U zdravé ženy je poměr markerů 1:1 Stránka 18 z 32

19 Obrázek 8.5. Markery T1, T2 a T3 u zdravé ženy (poměr 1:1). Obrázek 8.6. Markery T1, T2 a T3 u muž ženy. Nepolymorfní markery Markery AMELXY a SRY jsou umístěny v nepolymorfních sekvencích na chromozómu X (AMELX) a chromozómu Y (AMELY a SRY) a jsou použity pro detekci přítomnosti Y chromozómu. AMELXY může být použit k určení relativního počtu chromozómů X a Y. Pseudoautozomální XY markery Markery XY2 a XY3 jsou polymorfní STR marker jsou umístěny na obou X a Y chromozómech. Marker ZFYX je ne-polymorfní marker (není to STR marker), který je přítomen na obou chromozómech X i Y. Tyto markery, pokud jsou informativní, mohou být použity pro určení celkového počtu pohlavních chromozómů.není možné určit, která alela je na X nebo na Y chromozómu. Stránka 19 z 32

20 Přehled markerů Devyser Resolution v2 ID Pozice 1 Markeru Velikost markeru (bp) 2 Barva fluoroforu 21A 21q21.3 D21S Modrá 21B 21q21.1 D21S Modrá 21C 21q22.3 D21S Žlutá 21D 21q22.13 D21S Žlutá 21H 21q21.3 D21S Red 21I 21q21.1 D21S Žlutá 21J 21q22.2 D21S Modrá 21K 21q21.2 D21S Zelená 21M 21q22.11 D21S Zelená 1. UCSC 2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy. Přehled markerů Devyser Resolution 18 v2 ID Pozice 1 Markeru Velikost markeru (bp) 2 Barva fluoroforu 18A 18p11.31 D18S Modrá 18B 18q12.3 D18S Žlutá 18C 18q12.3 D18S Žlutá 18D 18q22.1 D18S Zelená 18G 18q11.2 D18S Modrá 18I 18q21.31 D18S Žlutá 18J 18p11.31 D18S Žlutá 18M 18p11.32 GATA178F Red 18P 18q22.1 D18S Zelená 1. UCSC 2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy. Stránka 20 z 32

21 Přehled markerů Devyser Resolution 13 v2 ID Pozice 1 Markeru Velikost markeru (bp) 2 Barva fluoroforu 13A 13q12.12 D13S Zelená 13B 13q q21.33 D13S Modrá 13C 13q31.3 D13S Žlutá 13D 13q13.3 D13S Zelená 13E 13q22.1 D13S Žlutá 13F 13q12.2 D13S Modrá 13G 13q14.11 D13S Žlutá 13I 13q.31.1 D13S Zelená 13K 13q21.1 D13S červený 1. UCSC 2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy. Přehled markerů Devyser Resolution XY v2 ID Pozice 1 Markeru Velikost markeru (bp) 2 Barva fluoroforu AMELXY Xp22.2 / Yp11.2 AMELX / AMELY X = 104, Y = 110 (+/- 2bp) Zelená SRY Yp11.31 SRY 235 (+/- 2bp) Modrá ZFYX Yp11.31 / Xp22.11 ZFY / ZFX Žlutá sy625 Yq11.21 sy (+/- 2bp) Zelená T1 7q34 / Xq13-7 = 180 / X = 200 (+/- 2 bp) Zelená T2 Xq23 / 2p X= 118 / 2 = 121 (+/- 2 bp) Žlutá T3 3p24.2 / Xq = 137 X = 141 (+/- 2bp) červený X1 Xq26.2 DXS Zelená X2 Xq13.1 DXS Zelená X3 Xq XHPRT Žlutá X4 Xq21.33 DXS Modrá X5 Xq DXS Zelená X8 Xq21.31 DXS Modrá X9 Xq27.1-q27.2 DXS červený X10 Xp22.32 DXS Modrá XY2 Xq21.31 / Yp11.31 DXYS Modrá XY3 Xp22.33 / Yp11.32 DXYS červený Stránka 21 z 32

22 1. UCSC 2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy. Provádění analýzy Při provádění manuální analýzy identifikujete píky markerů v elektroforetogramu podle specifických velikostních rozpětí markerů uvedených v seznamu markerů. Vezměte, prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru během elektroforézy. Analýza heterozygótních marker s dvěma píky se provádí kalkulací poměru pík1/pík2. Pík1 je plocha píku kratšího fragmentu, pík2 je plocha píku delšího fragmentu. Viz níže poměrová kritéria pro interpretaci. Pro marker se třemi píky se poměr počítá z plochy od nejmenšího píku, tj. pík1/pík2/pík3. Homozygotní markery se označují jako neinformativní. Poměrová kritéria (Ratio Criteria RC) RC 1 je použit pro píky se vzdáleností <24bp RC 2 je použit pro píky se vzdáleností 24bp Poměr alel se nesmí kalkulovat v případě, že je vzdálenost/rozdíl mezi alelalmi vyšší než 40 bp, protože v tomto případě mohlo dojít k preferenční amplifikaci, která může ovlivnit poměry alel. Markery se dvěma píky Ratio 1:2 Neprůkazný 1:1 Neprůkazný 2:1 RC 1 <0,65 0,65-0,74 0,75-1,44 1,45-1,75 >1,75 RC 2 <0,65 0,65-0,74 0,75-1,54 1,55-1,75 >1,75 Markery se třemi píky Poměr Neprůkazný 1:1:1 Neprůkazný RC 1 <0,74 0,75-1,44 >1,45 RC 2 <0,74 0,75-1,54 >1,55 Výškový poměr Výškový poměr lze použít, když je poměr ploch hodnocen jako "inconclusive" (neprůkazný). Použijí se stejná poměrová kritéria, jako pro výpočet poměrů ploch. Interpretace výsledků K interpretaci výsledku jako normálního pro chromozóm je nutné mít minimálně dva informativní markery daného chromozómu a ostatní markery musí být neinformativní. Stránka 22 z 32

23 K interpertaci výsledku jako abnormálního pro chromozóm je nutné mít minimálně dva markery informativní jako abnormální a ostatní markery musí být neinformativní. Normální alelický pattern: Markerů se dvěma píky obdobné plochy/výšky, jejichž poměr je hodnocen 1:1. Abnormaníl alelický pattern: a) Markerů se dvěma píky odlišné plochy/výšky, jejichž poměr je hodnocen 2:1 nebo 1:2. b) Markery se třemi píky se stejnými nebo podobnými poměry výšky/plochy, jejichž poměr je hodnocen 1:1:1 Monosomy X pattern is determined by: a) All X and XY markers showing homozygous allelic pattern. b) Pokud píky AMELY a SRY nejsou detekovány. c) Marker T1 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde je poměr píků hodnocen jako 2:1. d) Marker T2 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde je poměr píků hodnocen jako 1:2. e) Marker T3 showing two peaks of differing height/area and the peak ratio is classified as 2:1. Můžou se objevit píky markerů s délkou mimo dané rozpětí, tyto v rámci systému Devyser Resolution v2 nehodnotíme. Poměr alel se nesmí kalkulovat v případě, že je vzdálenost/rozdíl mezi alelalmi vyšší než 40 bp, protože v tomto případě mohlo dojít k preferenční amplifikaci, která může ovlivnit poměry alel. Troubleshooting Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není detekován, může to mít řadu příčin:» Chromozomální mosaicismus» Copy number variation (CNV)» Microvarianty způsobené specifickými opakováními mutací» Částečná chromozomální trizomie» Stutter pík převyšuje, nebo překrývá specifický alelický pík.» Překryv barevného signálu mezi kanály» Elektroforetické spiky» Asymetrická amplifikace» Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony» Polymorfismus v oblasti nasedání primeru» Somatická microsatelitní mutace» DNA koncentrace je příliš vysoká, nebo příliš nízká.» DNA použitá v PCR je degradovaná.» Submicroskopická duplikace/delece některého z markerů» Velikost alela je rozdíl větší než 40 bp způsobuje šikmé poměry alel. Stránka 23 z 32

24 Ve výjimečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence AMELY kvůli mutaci v místě nasedání primeru. Ve vyjímečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence marker T1 kvůli poměr zkreslen kvůli mutaci v místě nasedání primeru. Pokud je získán normální I abnormální výsledek pro jeden chromozóm, je doporučeno použít jinou metodiku pro určení příčiny chyby. Počet variací (CNVs) byl pozorován u markerů 13A, 13B, 13C, 13D, 18B, 18C, 18D-1, 18D-2, 21B, 21C, 21G, X2, X3, XY3, AMELXY, ZFYX a T1. Pokud je elektroferogram nízké kvality, data není možné vyhodnotit.pcr produkt můžeme opakovaně nanést do analyzátoru a analyzovat znovu. Artefakty PCR Stutter píky (obr. 8.7) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR alela. Stutter píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů.typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku. Obr Stutter pík je označen šipkou. -A píky (obr. 8.8) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík). A píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů. Stránka 24 z 32

25 Obr A a +A píky jsou vyznačeny šipkami. Elektroforetické artefakty Během detekce může dojít k přesahu signálu mezi jednotlivými detekčními kanály (Obr 8.9). Crosstalk se jeví jako stejně vysoké vrcholy v sousedních barevných kanálech a měla by být vyloučena z analýzy. Obr 8.9. Pík přesahující ze green do blue kanálu je označen šipkou. Dye blobs se mohou objevit v rozsahu analýzy (obr. 8.10). Obecně platí, že barva dye blobs se objeví jako široký pík bez definovaného vrcholu jedné barvy a vyskytují se v datech relativně brzy na začátku. Stránka 25 z 32

26 Obr Dye blob je označen šipkou. Stránka 26 z 32

27 9. Klinická studie Pro testování kitu Devyser Resolution v2 bylo analyzováno 257 vzorků. Všechny výsledky analýzy kitem Devyser Resolution v2 byly porovnány s daty z karyotypování nebo QF-PCR analýzy. Z analyzovaných 257 vzorků bylo 225 normálních/zdravých a 30 mělo aneuploidii alespoň u jednoho z testovaných chromozomů. 255 vzorků mělo analyzovatelný výsledek a všechny se plně shodovaly s výsledky karyotypování. Tabulka 1. Výsledky testování 276 vzorků. Výsledek Devyser Resolution v2 Předchozí testování* Normální Trisomie Trisomie Trisomie Triploid , X , XXY , XYY , XXXX 1 1 Výrazná kontaminace mateřskými buňkami 1 1 Kontaminace dalších genotypem 1 1 Neinformativní 0 0 Celkem *) karyotypování a/nebo QF-PCR analýza Devyser Resolution v2 (8-A012.2) Sensitivita Definice: Podíl (%) pacientů s dobře definovanou chromozomální aberací ve zkušební hodnotě v rámci definované rozhodovací meze. Výsledek: >97% sensitivita Specificita Definice: Podíl (%) pacientů bez dobře definované chromozomální aberací a jejichž výsledky byly negativní ve zkušební hodnotě v rámci definované rozhodovací meze. Výsledek: >99% specifita Stránka 27 z 32

28 Opakovatelnost Definice: Stupeň (%) shody mezi měřeními provedenými na stejných vzorcích za rozdílních měnících se podmínek. Experimentální design: Normalní mužský vzorek (46, XY) byl amplifikován 102-krát při šesti různých podmínkách a prováděných různými operatory na různých PCR cyclerech a genetických analyzátorech. Všech 102 replikátů vyšlo stejně. Výsledek: >99% opakovatelnost Stránka 28 z 32

29 10. Limitace použití A. Používat tento product smí jen osoba vyškolená v technikách PCR a kapilární elektroforézy. B. Souprava Devyser Resolution v2 byla validována na použití s termocycylerem ABI Thermal Cycler GeneAmp Pokud chcete pro klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je nutná validace soupravy Devyser Resolution v2 pro tento cykler. C. Souprava Devyser Resolution v2 je validována s izolačními soupravami QIAamp DNA Blood Mini Kit pro extrakci DNA z plné lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit pro extrakci DNA z biopsií choriových klků.analýza s dalšími matricemi a izolačními soupravami nebyla validována a může způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky. D. Souprava Devyser Resolution v2 je určena pouze pro detekci specifických chromozomálních aneuploidií dle návodu k použití. Souprava nebyla testována pro detekci strukturálních změn, mozaiky ani abnormalit v jiných, než uvedených chromozomech. Výsledky obdržené použitím soupravy Devyser Resolution v2 mohou být aplikovány pouze na tkáně nebo specifické vzorky. Kontaminace mateřskými buňkami neo u placentálního masaicismu může způsobit nesrovnalosti mezi výsledky získanými soupravou Devyser Resolution v2 a jinými technikami. Stránka 29 z 32

30 11. Reference PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS AND CLINICAL MOLECULAR GENETICS. QF-PCR FOR THE DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY BEST PRACTICE GUIDELINES (2012), v3.01, January Stránka 30 z 32

31 12. Upozornění zákazníkům Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser Resolution v2 musí být interpretovány s přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta.devyser AB nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí. LIZ a GeneAmp jsou registrovanými obchodními známkami společnosti Life Technologies Corporation. GeneScan TM, POP-4 TM, POP-7 TM a Hi-Di TM jsou ochrannými známkami společnosti Life Technologies Corporation. Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům vlastněným třetí stranou. Stránka 31 z 32

32 13. Kontaktní informace Devyser AB Instrumentvägen 19 SE Hägersten SWEDEN Phone: Homepage: Technická podpora Phone: Stránka 32 z 32