Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR)

Transkript

1 Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR)

2 QF-PCR Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR) představuje metodu vhodnou k rychlé diagnostice nejčastějších aneuploidií a umožňuje okamžitý management patologických těhotenství

3 QF-PCR Při analýze se využívá PCR amlifikace chromozom-specifických polymorfních STR markerů. Metody využíváme v prenatální i postnatální diagnostice a analýze potracených plodů

4 Klasické metody vyšetření Vyšetření karyotypu (hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu)

5 Klasické metody vyšetření Karyotyp je soubor všech chromosomů v jádřě buňky. V buněčných jádrech určitého druhu je konstantní do počtu, velikosti i tvaru chromozómů a jako takový se používá jako druhový znak je jeden ze základních objektů cytogenetiky hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu)

6 Vyšetření karyotypu základní metodou vyšetření karyotypu (nejen) v rámci prenatální diagnostiky chromozomálních aberací Výhody možnost prohlédnout celý karyotyp, zhodnotit strukturu každého jednotlivého chromozomu - a i jejich počet. Nevýhody časová náročnost klasické vyšetření karyotypu vyžaduje kultivaci získaných buněk ve speciálním médiu, což výrazně prodlužuje dobu, která uplyne mezi samotným odběrem vzorku a vydáním výsledku. - amniocentéza či odběr choriových klků je nutné počítat v průměru s minimálně dvoutýdenní lhůtou (výsledky CVS bývají obecně o něco dříve díky většímu růstovému potenciálu choriových buněk). - kordocentéza má v tomto případě značnou výhodu rychlého zpracování vzorku (obecně jen několik dní), neboť je odebírána fetální krev (velký růstový potenciál lymfocytů). omezená schopnost detekovat určité chromozomální přestavby malého rozsahu (například mikrodelece) určovat původ marker chromozomů apod. V této oblasti pak nastupují metody molekulární cytogenetiky jako je například FISH (fluorescent in-situ hybridization - fluorescenční in-situ hybridizace).

7 QF-PCR - nová metoda neboli kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction) speciální aplikací klasické PCR metody, sloužící k namnožení definovaného úseku DNA. V rámci prenatální diagnostiky se lze také setkat s označením amniopcr (v souvislosti s amniocentézou - jako metodou, použitou k získání vzorku). Tato metoda umožňuje vyloučit / potvrdit numerické odchylky vybraných chromozomů a to v extrémně krátkém časovém období jednoho, maximálně dvou dnů. Nejčastěji jde o chromozomy, jejichž numerické abnormality tvoří většinu (cca 90 %) chromozomálních aberací: 13, 18, 21, X a Y.

8 QF-PCR Ze vzorku AMC, CVS se pomocí některé ze standardních metod nejprve izoluje DNA. Polymerázová řetězová reakce-pcr

9 QF-PCR Pro vlastní PCR metodu jsou připravené speciální kity" s fluorescenčně značenými primery. Tyto primery ohraničují specifické lokusy na příslušných chromozomech (13, 18, 21, X a Y), které se pro potřeby této metody též označují jako markery. Jedná se o takové úseky, které obsahují vysoce polymorfní sekvence mikrosatelitní DNA - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats).

10 QF-PCR Metoda PCR amplifikuje STR oblasti a vytváří fluorescenčně značené amplikony za pomocí lokus specifických primerů

11 QF-PCR Multiplex PCR

12 QF-PCR Multiplex PCR 7 markerů pro diagnostiku chromosomu 21 7 markerů pro diagnostiku chromosomu 18 7 markery pro diagnostiku chromosomu 13 7 markerů pro diagnostiku chromosomů XY.

13 QF-PCR Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí automatického genetického analyzátoru. Relativní množství každé STR alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu píků, příp. jejich výšek. STR se liší mezi jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují trojice, čtveřice nebo pětice nukleotidů.

14 QF-PCR V případě diploidie, je signál dvou alel 1:1, když se jedná o homozygota, pak jeden peak s dvojitým signálem. Při trizomii dostaneme signál 2:1, 1:2, nebo 3 peaky 1:1:1. Chybějící chromozom X u Turnerova syndromu je detekován pomocí poměru X vs. 7. chromosom. U normální ženy je tento poměr 1:1, u postižené je 1:2.

15 QF-PCR DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má alely s různou velikostí)pro specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou v daném rozsahu Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1) DNA amplifikovaná z trinomických jedinců vykáže buď další pík (tři různé alely) se stejnou plochou nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu, než ten druhý Trizomický troj-alelický marker (poměr ploch 1:1:1) Trizomický dvoj-alelický marker (8.3: poměr ploch 2:1; 8.4: poměr ploch 1:2)

16 QF-PCR QF-PCR Homozygotní jedinci (mají alely se stejnou délkou) nebo monozomní vykážou pouze jeden pík Homozygotní/monozomní marker Jedinci homozygotní nebo monozomní jsou největším problémem pro testování abnormalit pohlavních chromozomů. Pokud použijeme STR specifické pro chromozom X, některé vzorky z normální ženy XX můžou vykázat homozygotní QF-PCR výsledek, který nelze odlišit od vzorků s jediným X, jako při Turnerově syndromu. Začleněním dalších STR markerů chromozomu X do analýzy redukuje pravděpodobnost homozygotnosti, ale neeliminuje ji zcela.problém monosomie X řeší 7X marker pro relativní kvantifikaci chromozomů 7 a X. Pro normální ženu je poměr 7X 1:1 Pro normálního muže a ženu s monosomií X je typický poměr 2:1 Normální žena s poměrem 7X 1:1.. Normální muž s poměrem 7X 2:1..

17 Artefakty QF-PCR Stutter píky jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR alela. Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku.. -A píky (obr. 8.9) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík) +A -A

18 QF-PCR Typical electrophoretogram (Mix 1) showing the profile of a trisomic sample (47, XY +21)

19 Hodnocení QF-PCR

20

21 Výhody QF-PCR odstraňuje nutnost opakovat některé testy s nejasným výsledkem (jako u kayotypizace), protože je každý syndrom analyzován pomocí mnoha STR současně. pro každý chromozom jsou zahrnuty i velmi krátké STR úseky, díky nimž lze analyzovat i částečně degradovanou DNA. test odhalí kontaminaci mateřskými buňkami, není nutné analyzovat současně vzorky rodičů. test zjistí i případný mosaicismus detekce Turnerova syndromu reagencie v alikvotech zjednodušují použití a snižuje možnost kontaminace. analýza trvá méně než 5 hodin, takže lze mít výsledky ještě týž den. Hands-on doba je cca 90 minut

22

23 Zdroje fetální DNA Invazivní výkony amniové fibroblasty při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH fetální krevní buňky při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matky

24 Neinvazivní výkony Zdroje fetální DNA fetální buňky v mateřské periferní krvi neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk v krvi matky je lze identifikovat až 27 let po porodu plodu - tato skutečnost znemožňuje využití fetálních buněk v neinvazivní prenatální diagnostice, protože ne jsme schopni spolehlivě rozlišit, ze kterého těhotenství buňky pocházejí. volná (nebuněčná) fetální DNA fetální DNA z plazmy matky množství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenství abnormálně vysoké hladiny fet. DNA u patologických těhotenství

25 Volná fetální DNA V krvi matky byla objevena v roce Dennis Lo volná fetální DNA rozptýlená v plazmě matky Fragmenty volné fetální DNA jsou v krevním oběhu matky detekovatelné zhruba od čtvrtého týdne těhotenství. velikost se pohybuje přibližně v rozmezí od bp, fragmenty nad 1 kb patří převážně matce Jejich zastoupení v poměru k volné mateřské DNA je v průměru kolem 10 % koncentrace se postupně zvyšuje I. trimestr do 3 % III. trimestr až 6 % fet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulace po císařském řezu za 4 30 min. po vaginálním porodu za cca 24 hodin

26

27 Odběr periferní krve matky odebírá se min. 8 ml periferné krve matky termíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata gynekologická, genetická určení krevní skupiny matky 12. týden riziko nedostatečného množství fetální DNA biochemický screening (MS AFP) týden většinou dostačující množství fetální DNA termín pro určení genotypu je do týdne

28 Možnosti detekce fetální DNA na OLG RH faktor Genotypizace RHD ( ex.7/ex10) Pohlaví plodu detekce sekvence specifické pro chromozom Y v krevní plazmě těhotných žen (gen SRY)

29 RH faktor Rh faktor byl poprvé popsán v roce 1939 (Landsteiner, Wiener). DNA studie prokazují přítomnost dvou forem Rh genu D a CE na chromozomu 1. D gen kóduje D antigen. Každá ze 4 alternativních forem CE genu produkuje jednu ze čtyř možných kombinací antigenů ce, CE, Ce, ce. Je prokázáno, že lidé s absencí D formy genu mají CE genovou formu a absence 400 aminokyselin dlouhého řetězce D antigenu nevede k jakékoliv dysfunkci erytrocytární membrány, již by bylo možno očekávat v souvislosti s nepřítomností tak významné molekulární struktury, která ovšem na druhé straně způsobuje velkou imunogenicitu spojenou s příchodem D antigenu do krve D- jedinců. Imunitní odpověď tedy spočívá v rychlé tvorbě protilátek anti-d a je způsobena kompletní absencí D antigenu na membráně erytrocytů D- fenotypu. Potenciálně silná imunitní odpověď na D antigen u D- příjemce je jednoznačným důvodem k pečlivému pretransfúznímu vyšetření.

30 RH faktor Význam Rh při hemolytické nemoci novorozenců Protilátky Rh systému, zejména anti-d a anti-c jsou schopny způsobit hemolytickou nemoc novorozenců. Anti-D jsou její nejčastější příčinou a objevují se povětšinou v kombinaci s dalšími protilátkami Rh systému anti-d+c, anti-d+e.

31 Genotypizace RHD genu gen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genem více různých protokolů detekce exonů exony 7 a 10 Roullilac 2007, Hromadníková 2003 exony 4, 5 a 10 Daniels 2004, Minon 2005, 2007 exony 5 a 10 Christiansen 2007 exony 5 a 7 Grootkerk 2006, Legler 2007 exony 4 a 7 Singleton 2000 komerční kity Devyser RHD kit (čeká na udělení CE-IVD) - exon 4

32 Genotypizace RHD genu doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola) kombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČR u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů) v ČR je zatím tato minorita zanedbatelná

33 Metodika genotypizace RHD genu Amplifikace RHD genu ve fetální DNA metoda kvantitativní fluorescenční PCR na real-time PCR Interní kontroly amplifikace amplifikační kontroly (β-globin) stanovení pohlaví gen SRY

34 Metodika stanovení pohlaví Amplifikace SRY genu ve fetální DNA metoda kvantitativní fluorescenční PCR na real-time PCR Interní kontroly amplifikace amplifikační kontroly (β-globin)

35 Stanovení pohlaví a Rh faktor - výsledek QF PCR (LightCycler 480)

36 Detekce fetálních aneuploidií

37 Testované metodické přístupy pro neinvazivní detekci fetálních aneuploidií založené na cfdna Tong Y.K et al Clinical Chemistry 52: Problém: Odlišení malé frakce fetální cfdna na pozadí maternální cfdna Řešení: využití genů o rozdílné expresi v maternálních tkáních a placentě (PLAC 4 placenta-specific 4, chrom. 21) a porovnání SNPs transkriptů (allelic transcript ratio) Slabina: Předpoklad stejné intenzity transkripce ze všech přítomných fetálních alel Lo Y.M. et al Nature Medicine 13: Problém: Odlišení malé frakce fetální cfdna na pozadí maternální cfdna Řešení: využití epigenetických rozdílů mezi maternálními tkáněmi a placentou (promotor genu SERPINB5 pro maspin,chrom. 18 hypometylován v placentě a hypermetylován v mateřských buňkách) a po bisiulfidové modifikaci vyšetřen poměr SNPs (epigenetic allelic ratio) Slabina: Bisulfidová modifikace degraduje DNA a snižuje analyzovatelné množství, hledány jiné metody obohacení fetální hypermetylované frakce

38 Detekce fetálních aneuploidií Digital PCR Hahn S, Lapaire O, Tercanli S, Kolla V, Hösli I. Expert Rev Mol Med 2011:13:e16

39

40 Detekce fetálních aneuploidií Next generation sequencing Hahn S, Lapaire O, Tercanli S, Kolla V, Hösli I. Expert Rev Mol Med 2011:13:e

41

42 na sklonku roku 2011 uvedení prvního komerčního testu Downova syndromu (MaterniT21 ) americké společnosti Sequenom( založeného na detekci volné fetální DNA, do praxe. v únoru 2012 tento test doplněn o detekci trizomie chromozómu 13 a 18 (MaterniT21 PLUS) sensitivita testu je 99,1% (T21), 99,9% (T18), 91,7% (T13). specificita stanovení je 99,9% (T21), 99,6% (T18), 99,7% (T13) březen 2012 validační studie Senhert et al. a Bianchi et al. vedly v k uvolnění testu Verifi prenatal test americké společnosti Verinata Health ( červen 2012 uveden na trh test Harmony prenatal test firmy Ariosa diagnostics ( opírající se o validační studie Sparks et al. a Norton et al.

43 Výsledky všech těchto prací ukázaly, že metodou masivního paralelního sekvenování lze odhalit téměř 100 % hledaných chromozomálních aberací, přičemž počet nevyhodnotitelných vzorků (příliš malé množství volné fetálnídna) byl zanedbatelně nízký.

44 28 června 2013 BGI Health a Asociace center lékařské genetiky ČR oznámili založení genetického testovacího centra v Praze,

45 Achondroplázie disproporcionální trpaslictví s krátkými končetinami, vzrůst v dospělosti průměrně 125 cm. patří k nejčastějším kostním dyspláziím (výskyt 1,5: živě narozených). Autozomálně dominantně dědičné onemocnění avšak až 90 % dětí se rodí na podkladě sporadických mutací (rizikovým faktorem zejména věk otce nad 36 let), homozygoti se většinou rodí mrtví. Porucha enchondrální osifikace všech kostí

46 Achondroplázie Dvě mutace v genu FGFR3 způsobují více než 99 % případů achondroplazie Obě mutace vedou ke stejnému změně proteinu FGFR glycin je nahrazen argininem v poloze 380 proteinu (Gly380Arg nebo G380R) rs FGFR3 (Exon 10) [G380R]

47 Fetální nukleové kyseliny - achondroplázie LightSNiP rs FGFR3 Přístroj HighResolutionMelting Analýza teploty tání

48

49