MALDI TOF v klinické mikrobiologii

Transkript

1 MALDI TOF v klinické mikrobiologii MUDr. Josef Scharfen, CSc. Pracovní skupina pro správnou laboratorní praxi Společnost pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP Setkání uživatelů MALDI-TOF 1

2 Motto: Programy vždy dávají výsledky, ale je na uživateli, aby rozhodl, zda výsledek dává také smysl. Andrea Hansen Setkání uživatelů MALDI- TOF 2

3 Moto Akreditace má dávat záruky kvality výsledku vyšetření pro klienta / pacienta. V mikrobiologii pacientovi nejvíce uškodíme, pokud nezachováme vlastní smysl / podstatu oboru Setkání uživatelů MALDI- TOF 3

4 Definice lékařské mikrobiologie podle koncepce oboru LM umístěné na stránkách SLM a MZČR. Lékařská mikrobiologie se zabývá etiologií, patogenezí a imunogenezí onemocnění vyvolaných mikroorganismy s poskytováním diagnostických, interpretačních, terapeutických a epidemiologických podkladů. Vychází z vědeckých základů mikrobiologie a jejích dílčích oborů (bakteriologie, virologie, mykologie, parazitologie a antiinfekční imunologie) Setkání uživatelů MALDI- TOF 4

5 Klinická mikrobiologie Klinická mikrobiologie je aplikovaný obor lékařství postavený na klinickomikrobiologické diferenciální diagnostice. Poskytuje informace k diagnostice a léčbě infekčního onemocnění u konkrétního pacienta v kontextu klinické diagnózy, podklady pro kontrolu infekcí spojených se zdravotní péčí a pro kontrolu přenosných infekčních nemocí v komunitě. Je základem praktické diagnostiky na pracovištích lékařské mikrobiologie Setkání uživatelů MALDI- TOF 5

6 Specifické vlastnosti oboru lékařské mikrobiologie VZTAH MAKRO A MIKROORGANISMU INTERPRETACE VZTAHU M+M Kontrola kvality v přímé a nepřímé diagnostice První úroveň: Správnost metody Druhá úroveň: Správnost vyšetření Dokumenty mikrobiologických společností (minima, NSVP): KLINICKÁ PREAMBULE Setkání uživatelů MALDI- TOF 6

7 Podstata oboru lékařské mikrobiologie: VZTAH MAKRO A MIKROORGANISMU Setkání uživatelů MALDI- TOF 7

8 Podstata oboru lékařské mikrobiologie Předmětem vyšetření je vztah parazita a hostitele, který se za určitých okolností může projevit jako onemocnění etiologické agens identifikace citlivost na antibiotika. Mikrob není analyt, neexistují normální hodnoty nebo kritická rozmezí Setkání uživatelů MALDI- TOF 8

9 4 sféry oboru lékařské mikrobiologie cíle a prostředky 2. PACIENTI V NEMOCNICI Infekční kontrolní programy u infekcí spojených se zdravotní péčí (HCAI) OPATŘENÍ = CÍL 1.PACIENT Klinická konsilia a konzultace, CÍL = DIAGNÓZA A LÉČBA OPATŘENÍ = CÍL 3. PACIENTI V KOMUNITĚ prevence a epidemiologie komunitních infekcí PROSTŘEDEK 4.ŘÍZENÍ LABORATOŘE KLINICKÉ MIKROBIOLOGIE 2012SZÚDDVKMAMALDITOF Setkání uživatelů MALDI- TOF 9

10 4 sféry oboru lékařské mikrobiologie epidemiologické souvislosti (přenos infekce, rezistence na atb, hlášení) Pro diferenciální diagnostiku potřebujeme znát: 1. Anamnéza 1. Osobní 1. Léčba atb 2. Imunita 3. Abusus 4. očkování 2. Rodinná 3. Pracovní 1. Zemědělství 4. Nemocniční 5. Cestování v cizině 6. Sexuální 7. Kontakty s infekčním onemocněním 8. Epidemiologická situace v nemocnici, v komunitě a ve státě. 2. PACIENTI V NEMOCNICI (HAI) 1.PACIENT Klinická konsilia a konzultace 4.ŘÍZENÍ LABORATOŘE KLINICKÉ MIKROBIOLOGIE 3. PACIENTI V KOMUNITĚ prevence a epidemiologie komunitních infekcí Provádíme hlášení výsledků 1. podle vyhlášky ZÚ 2. Podle typu HCAI komisi NI Souvislosti 1. OBP v laboratoři 2. Bioterorismus 3. Typy zabezpečení (BSL 1,2,3,4) Setkání uživatelů MALDI- TOF 10

11 Robert Koch Etiologie infekčního onemocnění klinickomikrobiologická diferenciální diagnostika _SLM ČLS JEP_NSVP IDENTIFIKACE Setkání uživatelů MALDI- TOF 11

12 Kochovy postuláty Nemocné zvíře Zdraví zvíře 1 1) Mikroorganismus se musí masivně vyskytovat u všech organismů, které mají příslušné onemocnění, ale nesmí se vyskytovat u zdravých jedinců. Suspektní patogen Erytrocyty Nález v mikroskopickém preparátu Erytrocyty 2 2) Mikroorganismus musí být izolován z nemocného organismu v čisté kultuře. Kultivační vyšetření zdravého a nemocného zvířete Kultivačně negativní 3 3) Izolát musí způsobit u zdravého jedince typické onemocnění. Vykultivovaný patogen Nemocné zvíře Zdraví zvíře je naočkována izolátem patogenu 4 4) Mikroorganismus musí být znovu izolován z naočkovaného experimentálního hostitele a po identifikaci je identický s původním etiologickým agens. Suspektní patogen Kultivace Setkání uživatelů MALDI- TOF 12

13 Mikrob ve vztahu k hostiteli (člověk) obecná ve vztahu ke klinické mikrobiologii (aplikovaná) technologie ve vztahu ke klinické patologii Baktérie - biologie, taxonomie, základní výzkum Leeuwenhoek Linné Bergey Woese Člověk, onemocnění, etiologie, diferenciální diagnostika, klinická mikrobiologie / bakteriologie Pasteur Koch Gram prostředek Setkání uživatelů MALDI- TOF 13

14 Mikrob ve vztahu k hostiteli (člověk) obecná ve vztahu ke klinické mikrobiologii technologie ve vztahu ke klinické patologii Baktérie - biologie, taxonomie, základní výzkum Leeuwenhoek Linné Bergey Woese Člověk, onemocnění, etiologie, diferenciální diagnostika, klinická mikrobiologie / bakteriologie Pasteur Koch Gram Cíl,aplikace interpretace, vztah Setkání uživatelů MALDI- TOF 14

15 Co odlišuje klinickou mikrobiologii od ostatních laboratorních oborů? Klinickomikrobiologická diferenciální diagnostika! 1. Pro určení diagnózy infekčního onemocnění na základě vztahu makro a mikroorganismu, je nutná klinickmikrobiologická diferenciální diagnostika vycházející ze znalostí hostitele / pacienta: 1. normální (rezidentní) flóry 2. typických nozologických jednotek a jejich původců, 3. znalostí okolností (stav imunity, typ pacienta, místo pobytu pacienta (nemocnice, komunita, zahraniční cesty, anamnéza, komorbidity, předchozí atb léčba apod.) 2. Podle virulence v dané populaci dělíme mikroorganismy /patogeny na 1. Primární patogen, antagonismus 2. Potenciální patogen, antagonismus za určitých podmínek 3. Komensál, synergie 4. Saprofyt (neutrální vztah) PATOGEN P HOSTITEL H Setkání uživatelů MALDI- TOF 15

16 Zvláštní komplexní vyšetřovací postupy v bakteriologii 1. Identifikace mikroorganismu je zvláštní vyšetření uvnitř vyšetření (SOP), se svou vlastní interpretací a diferenciální diagnostikou 1. Interpretace výsledku identifikace se děje s pomocí znalostí taxonomie, nomenklatury a identifikačních metod (diferenciální diagnostika uvnitř metody fenotyp, genotyp, proteomika X diagnóza) 2. Vyšetření citlivosti izolátu na antibiotika je zvláštní vyšetření uvnitř vyšetření (SOP), se svou vlastní interpretací a diferenciální diagnostikou 1. Interpretace a diferenciální diagnostika uvnitř taxonu (fenotyp rezistence), na základě farmakokinetiky, mechanismů rezistence, diagnózy, anatomického systému, výsledek je semikvantitativní a kvantitativní informace o tom, že léčba antibiotiky bude pravděpodobně účinná (C= citlivost) nebo nebo pravděpodobně neúčinná (R = rezistentní). o výsledku léčby rozhoduje více proměnných než pouze in-vitro stanovení citlivosti nebo rezistence Setkání uživatelů MALDI- 16 TOF

17 Infekční onemocnění PATOGEN PROSTŘEDÍ HOSTITEL NEMOC ZÁVAŽNÉ ONEMOC NĚNÍ SMRT MANIFESTACE ONEMOCNĚNÍ V POPULACI Setkání uživatelů MALDI- TOF SUBKLINICKÉ, INAPARENTNÍ ONEMOCNĚNÍ 17

18 Co znamenají předchozí snímky? Kvalita mikrobiologického vyšetření je plně závislá na interpretaci výsledku uvnitř metody spolu s interpretací výsledku uvnitř konkrétního případu onemocnění, oboje lze shrnout do termínu klinicko-mikrobiologická diferenciální diagnostika Může tuto diferenciální diagnostiku provádět klinik? Pouze z části, protože nemá odpovídající znalosti o problematice patogenů a metod, kterými s prokazují. JE NUTNÁ VZÁJEMNÁ KOMUNIKACE, kterou zahajuje obvykle ten, kdo se chce něco dozvědět nebo něco důležitého sdělit, nikoli plošně, ale k vybraným vyšetřením podle závažnosti! Kde lze najít základní informace o dif. Dg? Jsou součástí SOP Setkání uživatelů MALDI- 18 pro příslušné vyšetření. TOF

19 150 2.generace 3.generace 300 Phoenix BD 16s rdna sekvenace 20-80% Vitek 2, BioMerieux 97%-100% Microscan Walkaway Siemens Nomenklatura LightCycler Roche 4,24 h Klasifikace 4 h 7500 RT PCR 1.generace API biomérieux 20-80% IDENTIFIKACE BAKTÉRIÍ 4.generace MALDI Biotyper MS Bruker Daltonics 97%-100% Biochem.ID BBL Crystal Vitek MS biomérieux 100 4,24,48 h 10 min Upraveno, podle: Santos AF et al. Evaluation of MALDI-TOF in microbiology laboratory, J Bras Patol Med Lab 2013,49,3, Setkání uživatelů MALDI-TOF 19

20 Výsledek MALDI TOF je nutno interpretovat s kultivační plotnou v ruce a s komplexní znalostí Setkání uživatelů MALDImikrobiologie TOF Jak se změnil myšlenkový postup při identifikaci pomocí MALDI-TOF? STÁLE PLATÍ KOCHOVY POSTULÁTY 20

21 Vandamme,P. et.al.: Polyphasic taxonomy, a consensus approach to Bacterial Systematics, Micr.Rev.1996, MALDI - TOF Setkání uživatelů MALDI- TOF 21

22 PACIENT Racionalita oborová Kontext medicíny Znalost a zkušenost Intuice. SEQ VALIDACE (FENOTYP) KULTIVACE MALDI-TOF Setkání uživatelů MALDI- TOF 22

23 UK Standards for Microbiology Investigations Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI- TOF MS) Test Procedure MUDr. Josef Scharfen, CSc. Pracovní skupina pro správnou laboratorní práci Společnost pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP

24

25 Scope of the document Předmět dokumentu This SMI describes the test procedure, MALDI-TOF MS and its use in the examination of clinical specimens as mentioned in the UK SMI Identification (ID) documents. This document includes the mechanism as well as the limitations of the technique in its use in diagnostic microbiology laboratories. Tento standard vyšetřovacího postupu popisuje postup testování MALDI-TOF MS a jeho použití při vyšetření klinických vzorků podle dokumentů v britských identifikačních standardech. Tento dokument obsahuje mechanismy a omezení techniky při použití v mikrobiologické laboratorní diagnostice.

26 Úvod-definice MALDI-TOF MS je měkká ionizační technika používaná v hmotové spektrometrii, která umožňuje analýzu biomolekul (jako DNA, proteiny, peptidy a cukry) a velkých organických molekul jako jsou polymery, dendrimery a jiné makromolekuly), které jsou fragilní a při ionizaci fragmentují vhodnými ionizačními metodami. Ionizace se spustí laserovým paprskem. Je to rychlý a vysoce spolehlivý analytický nástroj pro charakterizaci mnoha různorodých baktérií, s nimiž se setkáváme v klinické laboratoři. Tato technika se používá k analýze skladby mikrobiální stěny a stala se novou technologií pro identifikaci druhů.

27 Úvod-výhody při srovnání s ostatními ID technikami Rychlost: min x hod Jednoduchost přípravy vzorku Malá spotřeba materiálu (SZM) RUTINNÍ POUŽITÍ, KAPACITA PRO VELKÉ POČTY VZORKŮ. Nákladová efektivita při počátečních vysokých nákladech. Dostupnost databází (cena), není přímá srovnatelnost výsledků mezi systémy. Je možno vytvářet vlastní databáze.

28

29 Technické informace/omezení_1 uváděné informace se vztahují na všechny provozované systémy Přítomnost bakteriálních endospor (interference spekter) u Clostridium species. Rozlišení organismů: Escherichia coli x Shigella species Některé viridující streptokoky a pneumokoky, členové Candida albicans complex, atd. Výzvou je přímé rozlišení MRSA a MSSA Obtížná identifikace do species Mycobacterium, Burkholderia, Acinetobacter, Corynebacterium a betahemolytické streptokoky (u všech je vysoký stupeň genetické podobnosti)

30 Technické informace/omezení_2 Existující taxonomické databáze Existující databáze mohou být vylepšeny buď na stávajícím základu nebo lze vytvořit vlastní laboratorní databáze s místně důležitými bakteriálními kmeny nebo s kmeny, které nejsou dobře zastoupeny ve firemní databázi. Avšak, to vyžaduje spolehlivou molekulární identifikaci kmenů (příkladem může být Propionibacterium acnes, Eubacterium brachy, viridující streptokoky a pneumokoky, Pantoeaa agglomerans jako Enterobacter spp, Pandoraea pulminicola jako Sphingobacterium spiritivorum) Někdy je problém s nesprávným referenčním spektrem v databázi, ale ne u všech systémů.

31 Technické informace/omezení_3 Obtíže při lýze buněčné stěny Některé organismy mají pouzdro, které zabraňuje úspěšné lýze buněk a způsobuje slabý výtěžek extrakce a tudíž nevyhovující kvalitu spektra. To může vést k problémům při identifikaci. Příklady: Streptococcus pneumoniae x Streptococcus mitis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae. Klíčem k překonání těchto problémů je množství inokula a použitá metoda extrakce. Uživatelům se doporučuje testovat všechny izoláty v duplikátu, protože se obvykle koncentrace inokul v nánosech liší. Lepší inokulum dává lepší skóre a tím vzrůstá i pravděpodobnost správnost identifikace. Při použití vyšetření v duplikátu musí mít laboratoř smírčí strategii pro postupy. Tato strategie musí být součástí místní SOP.

32 Technické informace/omezení_4 Komerční platformy Každý výrobce používá při identifikaci mikroorganismů své vlastní algoritmy, databáze, software a interpretační kritéria, takže numerická data (spektrální skore) nelze mezi jednotlivými komerčními systémy přímo porovnávat. Poznámka: Je třeba zdůraznit, že některé MALDI- TOF MS komerční softwary nejsou schopny identifikovat Rizikovou skupinu patogenů 3 (bioteroristická agens), pro které je nutno zakoupit zvláštní databázi. To může potenciálně vést k dalšímu testování těchto izolátů k přesné identifikaci, čímž vzrůstá riziko expozice laboratorního personálu.

33 Technické informace/omezení_5 Kultivační média K neúspěšné identifikaci kmene může dojít kvůli použité kultivační půdě. Některé součásti médií např. u agaru s kolistinem a nalidixovou kyselinou nebo u tekutých půd mohou vyvolat interferenci. Jiné příklady neúspěšných identifikací vznikají u drobných nebo mukózních kolonií, vyšetřováním smíšené kultury, přenosem mezi terčíku, špatným vyčištěním destičky nebo přehozením pořadí inokulovaných terčíků. Chyba v umístění terčíků může být minimalizovaná vyšetřováním v duplikátech (se smířením rozdílných výsledků) a opakovaným vyšetřením v případech, kdy s výsledkem identifikace nesouhlasí morfologie kolonií nebo klinická data (viz diferenciální diagnostika).

34 Technické informace/omezení_6 Identifikace antimikrobiální rezistence Přímou detekci antimikrobiální rezistence nelze provádět pomocí MALDI-TOF MS, protože stav rezistence se neprojevuje změnou spekter. V současnosti není dostupná univerzální platforma pro rychlé určení antimikrobiální rezistence včetně ESBL + kmenů, která by mohla být implementována do provozu mikrobiologických laboratoří. Ačkoliv se MALDI-TOF stále více prosazuje v diagnostických laboratořích, má potenciál v průkazu produkce karbapenemázy, ale jsou třeba další zdokonalení a validace než se vyšetřování citlivosti stane rutinní praxí (UK). Hrabak J, Chudackova E, Walkova R. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (maldi-tof) mass spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to routine diagnosis. Clin Microbiol Rev 2013;26: Hrabak J, Studentova V, Walkova R, Zemlickova H, Jakubu V, Chudackova E, et al. Detection of NDM-1, VIM-1, KPC, OXA- 48, and OXA-162 carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2012;50:

35 Technické informace/omezení_7 Přímé testování klinických vzorků Tato technologie se ukázala jako velmi užitečná pro přímé testování klinických vzorků jako je moč, likvor a krev, což by vedlo k významnému zlepšení péče o pacienta a zkrácení TAT při vydání výsledku. I když existují komerční validované kity pro přímou extrakci z těchto vzorků (např. z pozitivních hemokultur), je třeba provést další studie ke zpracování vzorků z hemokultivačních lahviček a moči, a je třeba vylepšit databáze před tím, než si laboratoře vyberou mezi MALDI-TOF MS metodami a nově zaváděnými molekulárními metodami průkazu baktérií z kultivační půdy nebo ze vzorků. Jiným omezením může být i finanční stránka věci, svázaná s pořizováním doplňků k MALD-TOF MS.

36 Technické informace/omezení_8 Metody extrakce K úpravě vzorků pro vyšetření MALDI-TOF MS existuje několik extrakčních metod. Neexistuje žádná nejlepší doporučená extrakční metoda. Uživatelé by se měli ujistit o tom, že používají vhodnou extrakční metodu k získání přesných výsledků identifikace podle výrobce zařízení a měli by se také přesvědčit o konzistentnosti výsledků s databází typických spekter v knihovně. Např. kvasinky ke správné identifikaci vyžadují extrakci proteinu. Vláknité houby nemají standardní extrakční protokol a komerční databáze zatím neobsahují plné spektrum druhů pro identifikaci hub. Anaeroby se mohou identifikovat s pomocí chemické extrakce nebo z přímého nátěru na terčík. Někde se uvádí, že plná extrakce má horší výsledky. Viz příloha 2

37 Technické informace/omezení_9 Chyby v identifikaci K chybě může dojít při zadávání názvu do LIS. Důvodem může být i závada v databázi.

38 Technické informace/omezení_9 Výhody MALDI-TOF MS Identifikace pouze z 1 kolonie (ale ne u kvasinek, nebo mukózních kolonií) Riziko expozice infekcím je obvykle velmi nízké, protože baktérie ve vzorku jsou inaktivovány extrakcí. Velmi adaptabilní otevřený systém, který se dá lehce rozšířit uživatelem. Ekologická technika s malým uhlíkovým zatížením Vyžaduje minimální spotřební materiál Identifikuje baktérie, které se obtížně kultivují (mykobaktérie, bartonely, legionely, atd.) Spolehlivý při identifikaci klinicky relevantních anaerobů (bakteroidy, prevotely, aktinomycety a jiné grampozitivní baktérie) Užitečný při identifikaci klinicky relevantních kvasinek (kandidy)

39 1 Bezpečnostní rozvaha nebezpečné patogeny Veškerá práce, kde vzniká aerosol, se musí provádět v laminárním boxu. U patogenů na úrovni bezpečnosti BSL3 se práce musí provádět v laboratoři s plným zabezpečením typu BSL3 podle platných směrnic (patogeny typu Brucella, Bacillus anthracis, Mycobacterium sp. /u nás BSL2-3/, atd.) v k tomu určených laboratořích (u nás SZÚ, podle platných Národních vyhlášek)

40 1 Bezpečnostní rozvaha chemikálie Matrice jsou nízkomolekulární sloučeniny, kyseliny a látky prchavé povahy se silnou schopností absorpce v UV/IR oblasti. Na trhu jsou různé typy matricí pro práci s MALDI-TOF/MS s odlišnými vlastnostmi a použitím. Kyselina mravenčí se používá pro práci s klinickými vzorky. Koncentrovaná je vysoce leptavá (použití ochranných prostředků), je třeba velké opatrnosti, protože kyselina mravenčí má specifické toxické účinky u člověka (poškození optického nervu, poškození ledvin, kožní alergie po opakované expozici.). Pracovní riziko při kontaktu očí, kůže a respiračního traktu. Je třeba respektovat všechny národní vyhlášky OBP a lokální směrnice a další pravidla uvedená v souvisejích SOP, včetně poštovních a transportních směrnic.

41 2 Reagencie a vybavení rozdělení Podle vybavení a použité extrakce pracujte podle návodu výrobce. Existují 2 hlavní přístupy Čistá kultura (kolonie) na plotně. Doporučují se čerstvě narostlé kolonie (nárůst přes noc), v případě pomalu rostoucích baktérií až několik dnů. Plotny se před použitím nemají uchovávat při +4C, protože to negativně ovlivní kvalitu spektra, která se znehodnocuje v průběhu několika dnů. Pokud to je možné, skladujte při pokojové teplotě několik dnů. NEBO: klinický vzorek (přímo materiál z hemokultivační lahvičky, moč, likvor nebo proteinový extrakt). K dispozici jsou komerční extrakční kity pro hemokultivační bujón.

42 2 Reagencie a vybavení kontrola kvality Extrakční postup provádí kompetentní vycvičený personál. Všechny reagencie mají platnou dobu použitelnosti a jsou řádně uskladněny. Kontrola provedení extrakce pro MALDI-TOF se rutinně kontroluje pomocí vybraných bakteriálních kmenů, jejichž spektra jsou v aktuální databázi. Při jakýchkoliv změnách (reagencie, extrakční protokol) se v příslušné laboratoři provádí validace před rutinním zavedením do provozu. Tam, kde se zavádí modifikovaný extrakční protokol, uživatel se musí přesvědčit, že je kompatibilní se stávající databází. Pokud není kompatibilní, lze vytvořit novou databázi při použití modifikovaného protokolu s příslušnou validací. Pro dosažení přesných výsledků je třeba pravidelný servis a údržba přístroje. Pokud je přístroj velmi vytížen nebo se používá prašných nebo stísněných prostorách, musí být servis častější.

43 Výsledky 2 Reagencie a vybavení IT, interpretace výsledku Výsledky musí být řádně intepretovány a validovány v procesu diferenciální diagnostiky. V ČR je konsensuálně non lege artis validace a interpretace výsledku na dálku. Výsledky musejí být interpretovány s originální plotnou v ruce tím, kdo odečítal a indikoval identifikaci s použitím MALDI-TOF / MS. Žádný identifikační systém nedosahuje 100% přesnosti a MALDI-TOF/MS má množství známých slabin: klinický mikrobiolog musí přehodnocovat výsledky identifikace v laboratoři podle klinických projevů onemocnění a známých informací o pravděpodobné přesnosti identifikace. V případě potřeby indikuje použití alternativních metod.

44 3 organismy pro kontrolu kvality Pozitivní kontrola bakteriální testovací standard poskytovaný výrobcem se používá pro denní kalibraci a jako kontrola při každém běhu/matrix. Negativní kontrola měří se blank prázdné místo zakapané matricí poskytovanou výrobcem pouze k verifikaci, že destička byla správně vyčištěna. Poznámka: organismy používané pro kontrolu kvality jsou závislé na výrobci. Pracujte podle návodu výrobce.

45 4 Postup a výsledky_1 Čistá kultura (typicky jedna kolonie) je nabrána z Petriho misky a je nanesena s pomocí párátka, hrotu pipety nebo kličkou na destičku MALDI-TOF MS ve formě tzv. přímého nátěru. Kolonie mykotických organismů vyžadují před testováním extrakci (viz odstavec technická omezení).

46 4 Postup a výsledky_2 Poznámka: - Přímé nanášení na destičku se nesmí provádět s rizikovými organismy typu Mycobacterium sp., Brucella sp a Bacillus anthracis.). Rizikové organismy musejí být inaktivovány a potom musí být přidána kyselina mravenčí, která zabíjí většinu baktérií. Jakýkoliv rizikový organismus musí být před testováním extrahován za odpovídajících podmínek BSL3 z důvodů zabránění infekce personálu při zpracování. Je třeba zdůraznit, že ani kultivační médium, ani inkubační teploty a podmínky, nebo délka inkubace neovlivňují přesnost identifikace Setkání uživatelů MALDI- TOF 46

47 4 Postup a výsledky_3 Nános na destičce je pak převrstven 1 2 ul matrice. V případě, že přímá identifikace baktérií selže, lze suspenzi překrýt kyselinou mravenčí v acetonitrilu před přidáním matrice), v případě mykotických organismů se provede před překrytím matricí na destičce zpracování s etanolem a kyselinou mravenčí v acetonitrilu. Tomu se obvykle říká lýza na destičce (On Target Lysis). Matrice se musí přidávat v co nejkratší době, aby nedošlo k oxidaci vzorku na destičce. Po krátkém zasychání při pokojové teplotě je destička umístěna do ionizační komůrky hmotového spektrometru k vlastní analýze Setkání uživatelů MALDI- TOF 47

48 4 Postup a výsledky_4 Získá se hmotové spektrum, které se automaticky porovnává s databází hmotových spekter pomocí softwaru a tím je organismus identifikován. Uživatelé musejí při vyhodnocování identifikace postupovat podle doporučení výrobce při rozhodování o tom, zda je identifikace úspěšná buď na úrovni druhu nebo rodu. Poznámka: Většina baktérií se identifikuje už při provedení přímého nátěru bez potřeby další aplikace kyseliny mravenčí Setkání uživatelů MALDI- TOF 48

49 Příloha 1: vývojový diagram

50 Setkání uživatelů MALDI- TOF 50

51 Příloha 2: Návrh přípravy vzorků různých tříd mikroorganismů pro identifikaci MALDI-TOF MS

52 Literatura

53 Literatura

54 Závěr 1. Pro identifikaci mikroorganismů s použitím MALDI-TOF je nutná znalost a pochopení principů polyfázové taxonomie a identifikace. 2. Technologicky správně provedená identifikace není zárukou validity klinického výsledku. 3. Identifikace není samostatné vyšetření. Metoda je součástí dokonale provedených kultivačních vyšetření v rámci SOP pro příslušný biologický materiál s důrazem na preanalytickou fázi vyšetření. 4. Definitivní uzavření vyšetření je založené na interpretaci nálezu klinickým mikrobiologem v klinickém kontextu daného onemocnění, která vyplývá z klinickomikrobiologické diferenciální diagnostiky obsažené v NSVP (SOP) pro příslušný klinický materiál Setkání uživatelů MALDI- TOF 54

55 Děkuji vám za pozornost Setkání uživatelů MALDI- TOF 55