Roztroušená skleróza a měření T2 relaxačního času ve strukturách centrální šedé hmoty mozkové

Transkript

1 1. lékařská fakulta Univerzita Karlova, Praha Roztroušená skleróza a měření T2 relaxačního času ve strukturách centrální šedé hmoty mozkové Doktorská disertační práce MUDr. Andrea Burgetová Školitel: Doc. MUDr. Manuela Vaněčková, PhD. Radiodiagnostická klinika 1. LF UK, VFN Praha Přednosta: Prof. MUDr. Jan Daneš, CSc. Praha 2010

2 Poděkování Poděkovat bych chtěla především prof. MUDr. Zdeňkovi Seidlovi, CSc., vedoucímu oddělení magnetické rezonance za vytvoření podmínek, které umožnily vznik této práce, za jeho náměty a předání cenných zkušeností. Dále děkuji své školitelce Doc. MUDr. Manuele Vaněčkové, PhD., která se na práci spolupodílela svými radami a připomínkami. Dále patří mé poděkování prof. MUDr. Janu Danešovi, CSc., přednostovi radiodiagnostické kliniky za obecnou podporu výzkumné práce. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat matematikovi RNDr. Janu Krásenskému, jenž vytvořil databázový a prohlížecí informační systém Scanview, který byl při práci využíván a RNDr. Jaromíru Běláčkovi CSc. za pomoc při statistickém zpracování výsledků. Děkuji samozřejmě i všem pracovníkům oddělení magnetické rezonance a výpočetní tomografie, kteří se každodenně podílí na vyšetřování pacientů, protože bez jejich pomoci by tato práce nevznikla. 3

3 Obsah 1 Úvod Roztroušená skleróza a její zobrazování magnetickou rezonancí T2 hypointenzity v šedé hmotě mozkové Železo a jeho význam v mozku Pacienti a metodika Demografická charakteristika vyšetřovaného souboru MR analýza Statistická analýza Výsledky Diskuze Výhled do budoucnosti Závěry Souhrn Seznam literatury

4 Příloha Graf 1-6 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Graf 7-12 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle BPF Směrnice regresních přímek Seznam zkratek RS CNS MR T2W obraz FLAIR Gd-DTPA LL BPF TR TE TI FA Roztroušená skleróza Centrální nervový systém Magnetická rezonance T2 vážený obraz Fluid-attenuated inversion recovery Kontrastní látka pro MR (komplex gadolinia s chelátem, diethylenetriamine penta-acetic acid (DTPA = Pentetic Acid) Lesion load Brain parechymal fraction Time to repeat Time to echo Time to inversion Flip angle 5

5 FOV GraSE GE-T2* SE-T2 ROI Ncl. caudtatus T2 p R R 2 Field of view Gradient And Spin Echo Gradient Echo-T2* Spin Echo-T2 Region of interest Nucleus caudatus T2 relaxační čas Hladina významnosti Pearsonův korelační koeficient Koeficient vyjadřující (pokud je vynásoben 100) procenta rozptylu závisle proměnných ccl, ccr, pl, pr, tl a tr vysvětlených prostřednictvím "modelu dvou různoběžných přímek" nezávisle proměnných např. "RS x Věk" nebo "LL x Věk" (při LL reprezentované skupinami '1: <2cm^3', 2: 2cm^3<LL<5cm^3', 3: >5cm^3'). ccl ccr pl pr tl tp cll caput caudati levé caput caudati pravé putamen levé putamen pravé thalamus levý thalamus pravý vyšetřovaná skupina 6

6 1 Úvod 1.1 Roztroušená skleróza a její zobrazování magnetickou rezonancí Z tradičního pohledu je roztroušená skleróza (RS) autoimunitně vázaný chronický zánět centrálního nervového systému (CNS) vedoucí k demyelinizaci bílé hmoty. Novější poznatky ukazují, že již od počátku nemoci dochází také k axonálním ztrátám, které se však projeví později, až se vyčerpají rezervy CNS a jsou příčnou ireverzibilních neurologických změn (Trapp, 1998). RS je dnes považována za globální onemocnění CNS zahrnující změny zánětlivé, demyelinizační a degenerativní včetně mozkové atrofie (Havrdová, 2008). Diagnóza RS je složitá, v současné době neexistuje žádný spolehlivý specifický test. Diagnózu stanovujeme s větší či menší pravděpodobností na základě klinického vyšetření, průběhu onemocnění a paraklinických vyšetřovacích metod: magnetická rezonance (MR), vyšetření evokovaných potenciálů, likvoru a urodynamického vyšetření. MR se v současné době stala nejvýznamnějším paraklinickým nástrojem pro diagnostiku RS. Za patologické projevy RS v konvenčním MR zobrazení jsou považována ložiska zvýšeného signálu v T2W obraze a sekvenci FLAIR lokalizovaná převážně v bílé hmotě, která progredují v prostoru a čase. Vzhledem k faktu, že RS je charakterizovaná perivenulárním typem demyelinizace, jsou ložiska typicky lokalizovaná periventrikulárně a mají často protáhlý tvar (Dawsonovy prsty) změny okolo dlouhé osy medulární vény (Obr. 1). Další predilekční lokalizace 7

7 je juxtakortikálně a v corpus callosum. Lokalizace infratentoriálně v mozkovém kmeni, mozečku a v míšních strukturách výrazně zvyšují specificitu nálezu. Ložiska zvýšeného signálu v T2W obraze mají někdy korelát ve sníženém signálu v T1W obraze. V akutní zánětlivé fázi mohou léze porušit hematoencefalickou bariéru, což vede k jejich sycení po podání kontrastní látky (Ge, 2006, Mc Farland, 2002). Sycení léze může být homogenní či prstencové, velmi specifický postkontrastní obraz je inkompletní přerušovaný prstenec na periferii ložiska (Obr. 2a,b). Obr. 1. Hypersignální ložiska v bílé hmotě periventrikulárně a juxtakortikálně 8

8 Obr. 2a Hyposignální ložisko v T1WI Obr. 2b Po podání kontrastní látky se ložisko prstenčitě sytí V roce 2001 Mc Donald se svými spolupracovníky doporučil diagnostická kritéria pro RS, která byla modifikována v roce 2005 (Mc Donald, 2001,2005). Jako pozitivní vyšetření MR se interpretuje splnění alespoň tří ze čtyř níže uvedených podmínek (diseminace v prostoru) (Barkhof, 1997): 1. zvýraznění ložiska po podání Gd-DTPA nebo 9 hyperintenzních ložisek v T2W obraze 2. jedna nebo více infratentoriálních lézí 3. jedna nebo více juxtakortikálních lézí 4. tři nebo více periventrikulárních lézí 9

9 Aktivita onemocnění má 2 projevy: 1. zvětšení počtu ložisek zvýšeného signálu v T2W obraze (respektive modu FLAIR), 2. zvýraznění lézí po aplikaci Gd- DTPA. Tato kritéria byla na základě širokého konsensu nedávno opět revidována. (Swanton, 2006). Podle nových kritérií k diagnóze stačí jedna léze v T2váženém obraze v nejméně dvou ze čtyř lokalizací (perivetrikulárně, juxtakortikálně, infratentoriálně či v míše). Stanovení disseminace v čase vyžaduje na kontrolním vyšetření novou T2 hyperintenzní lézi. Nová kritéria nabízí vyšší senzitivitu 72%-60% (Mc Donald 2005) při zachování specificity 87%-88% (Mc Donald, 2005). Široké užití MR v diagnostice RS postupně ukázalo, že na konvenční MR viditelná T2 eventuálně FLAIR (fluid-attenuated inversion recovery) hyperintenzní ložiska ani enhancující léze často nekorelují s klinickým stavem a průběhem onemocnění (Barkhof, 1999). Tento jev se označuje jako klinicko radiologický paradox. Předpokládáme, že tato diskrepance má dva hlavní důvody. Tím prvním je různý patologický substrát makroskopických T2 hypersignálních lézí od prostého edému a zánětu přes ireverzibilní demyelinizační změny, gliózu a axonální ztráty (Lassmann H, 1998). Druhým důvodem je limitace konvenčních technik MR v zobrazení strukturálních změn na mikroskopické úrovni v tzv. normálně vyhlížející bílé a šedé hmotě (Allen, 1979; Loevner, 1995;Evangelou 2000). S cílem postihnout změny, které se skrývají v normálně vyhlížející mozkové tkáni a často stojí za neurologickými projevy pacientů se do diagnostiky RS zavádějí nové MR techniky (Vaněčková, 2008). Tyto metody zahrnují volumometrické zpracování konvenčně získaných MR obrazů: kvantifikace T2 hyperintenzních lézí (LL lesion load) (Vaněčková 2002, 2008, Sailer, 2001) měření mozkového objemu k detekci 10

10 atrofie a mozkové parenchymální frakce (BPF brain parechymal fraction) (Filippi,1996) a sledování přítomnosti T2 hypointenzních lézí v šedé hmotě, které bývají malé a při běžném hodnocení často unikají pozornosti. Nové MR techniky dále zahrnují tzv. nekonvenční metody: magnetizační transfer (Seidl, 1997; Wolff, 1994), MR spektroskopii (Miller, 2003),difúzně vážené obrazy (Iannucci, 2001), perfúzně vážené obrazy (Ge, 2007) a funkční MR (Ogawa, 1990). Od těchto nových MR technik se očekává, že pomohou přesněji rozkrýt patofyziologické změny probíhajících u RS, čímž se mohou zlepšit možnosti predikce klinického průběhu a především možnosti terapeutického ovlivnění choroby. Navíc mohou přispět k vyřešení výše zmiňovaného klinicko radiologického paradoxu. 11

11 1.2 T2 hypointenzity v šedé hmotě mozkové V poslední době je v literatuře týkající se RS věnovaná značná pozornost postižení šedé hmoty a T2 hypointenzním ložiskům v šedé hmotě kortikálně, subkortikálně a v centrální šedé hmotě. T2 hypointenzity, jejichž podkladem je s největší pravděpodobností železo, byly poprvé popsány Drayerem (Drayer, 1987), později Grimaudem (Grimaud, 1995). Bakshi v roce 2000 analyzoval ložiska sníženého signálu v T2 váženém obraze detailněji a především na větším souboru pacientů (Bakshi, 2000 ). Ukázal, že se vyskytují převážně v thalamech, v putamen, v kaudatech a rolandické šedé hmotě. Další studie demonstrovaly, že ložiska klinicky výrazně korelují s délkou nemoci, klinickým průběhem a stupněm neurologického deficitu. T2 hypointenzity v šedé hmotě pozitivně korelují také s mozkovou atrofií a celkovým objemem patologických T2 hyperintenzních ložisek a jsou mnohem významnějším prediktorem neurologického postižení a klinického vývoje RS než konvenční MR vyšetření (Bakshi, 2001;Bermel, 2005, Brass, 2006). Bermel se spolupracovníky ve studii, která se zabývala korelací T2 hypointenzit a velikostí atrofie zjistil, že T2 hypointenzity v šedé hmotě jsou nejlepším prediktorem rozvoje mozkové atrofie u neléčených pacientů s RS s potvrzenou relaps remitentní formou. Metodou regresní analýzy porovnával predikční potenciál T2 hypointenzit s ostatními měřitelnými parametry: s T1 hypointenzitami, T2 hyperintenzitami, a ložisky enhancujícími po kontrastní látce. Měřená data byla získána a potom porovnána vždy za jeden a potom za dva roky od prvního vyšetření (Bermel, 2005). v časovém intervalu 1roku a 2 let. Brass v další studii zase prokázal, že ložiska sníženého signálu v T2 váženém obraze těsněji 12

12 korelují s postižením kognitivních funkcí než konvenční T2 hyperintenzní léze a atrofie (Brass, 2006). V tomto kontextu je velmi pravděpodobné, že změny v šedé hmotě u roztroušené sklerózy se podílejí na výsledném obrazu nemoci a klinickém stavru nemocného. Akumulace železa je spojena s fyziologickým stárnutím mozku, jak již dříve prokázaly mnohé práce (Bakshi, 2001 Drayer, 1987 Schenck, 2004). To vedlo k myšlence zkoumat podíl železa na patofyziologii neurodegenerativních chorob. Patologická depozita železa byla prokázána především u Alzheimerovy choroby (Connor,1992; Honda, 2004), a Parkinsonovy choroby. (Berg,2006; Jenner, 1996), ale také u jiných neurodegenerativních nemocí. 1.3 Železo a jeho význam v mozku Železo patří v lidském těle mezi stopové prvky a má značný význam pro životní pochody v celém organizmu. Je zabudováno do hemoglobinu, myoglobinu a nachází se v aktivních centrech mnoha enzymů. Dále je transportní (transferinové) železo a zásobní železo ve formě ferritinu nebo hemosiderinu. V mozku se železo účastní mnoha neurobiologických procesů a má své místo v mozkovém metabolismu. Jeho největší význam je v transportu kyslíku, dále se podílí na syntéze myelinu a neurotransmiterů (Thompson, 2001). Homeostáza železa ve zdravém mozku je udržována složitými regulačními mechanismy. Železo organismus získává z potravy, vstřebává se ve střevě. V plazmě je železo transportováno ve formě transferinu a za normálních okolností je velká většina železa transferinu předávána v kostní dřeni erytroidním buňkám pro syntézu 13

13 hemoglobinu. Staré erytrocyty jsou destruovány fagocytovým systémem. Část uvolněného železa je skladována v buňkách tohoto systému ve formě ferritinu, část je uvolněno do plazmy, kde se váže na transferin a je znovu k dispozici pro potřeby erytropoézy. Transportní železo nacházející se v krvi nemůže přímo prostoupit hemocefalickou bariéru. Nejpravděpodobnější způsob překročení této bariéry je vazba železa na transferinové receptory na endoteliálních buňkách v mozku, tento komplex vstupuje do mozku tzv. endocytózou. Obecně jsou tyto transferinové receptory hlavním mediátorem transportu železa uvnitř mozku. Zvyšování množství železa a jeho ukládání v buňkách je funkcí nadbytku těchto transferinových receptorů a jejich ligand (Ke, 2003). Homeostáza železa je regulována mnoha proteiny. Obdobně jako v jiných tkáních také v mozku je zásobní železo ukládáno především ve formě ferritinu. Jsou popisovány 2 typy ferritinu, protein s těžkým a lehkým řetězcem, které v ukládání železa do buněk fungují komplementárně. Tzv.těžký ferritin efektivně uvolňuje železo a nachází se především v orgánech s vysokou utilizací železa, zatímco lehký ferritin je spojován s ukládaním železa (Connor, 1994; Levi, 1992). Železo vázané ve ferritinu je tzv. bezpečné železo, protože je obklopeno protektivními molekulami proteinu, které zabraňují reakci železa s okolními molekulami. Toxicita železa se projevuje tehdy, pokud dojde k poškození těchto protektivních molekul či se zvýší podíl volného železa v důsledku nedostatku ferritinu v buňkách (Gutteridge, 1992; Curtis, 2001). Neurotoxicita volného železa spočívá v biochemické reakci zahrnující tvorbu reaktivních oxidačních produktů cestou železem indukované oxidace hydroxylů (dvojmocné Fe daruje elektron hydroxylu). Výsledkem je volný hydroxylový radikál trojmocné železo(fenton, 1894). Hydroxylové radikály 14

14 jsou extrémně reaktivní a vedou k degradaci biomolekul a oxidační destrukci lipidů, které jsou důležité ve struktuře buňky, např. v buněčné membráně, což může být příčinou apoptózy. Akumulace železa byla prokázána během fyziologického stárnutí mozku (Fiehring and Sundermann, 1986; Hallgren, 1958; Pujol, 1992) nadměrné ukládání železa je spojováno s neurodegenerativními chorobami (Connor, 1992, Honda, 2004; Berg, 2006, Jenner, 1996). V poslední době roste zájem na odhalení úlohy železa a jeho významu také v patofyziologii RS, když některé studie prokázaly porušenou homeostázu železa u roztroušené sklerózy. Železo se akumuluje v reaktivní mikroglii, řada studií se také shoduje, že železem jsou obohaceny oligodendrocyty a myelin v normální i patologické tkáni (Schenk, 2004, LeVine, 1990, Dwork, 1988). Jedním z vysvětlení může být, že železo má souvislost s enzymy, které se účastní tvorby myelinu. V procesu demyelinizace a přerušení vulnerabilních axonů se potom může železo uvolňovat. Obecně jsou 2 teorie jak může železo souviset s patofyziologií RS. Za prvé, depozita železa jsou jen jakýmsi vedlejším fenoménem, který doprovází neurodegenerativní změny v šedé hmotě (Schenk, 2004; Bermel, 2003; Ciffeli, 2002). Za druhé, železo je mediátorem neurotoxicity a přímo se účastní patogeneze RS, když podporuje vznik volných radikálů a oxidačního stresu (Gutteridge, 1992). Jedinou neinvazívní metodou a nástrojem pro objektivní detekci zvýšeného ukládaní železa je T2 relaxometrie. Je metodou volby pro stanovení železa v mozku in vivo, jako jediná umožňuje výpočet koncentrace železa, přestože jen na základě empirické rovnice.t2 relaxometrie se v diagnostice RS řadí k nekonvenčním kvantitativním metodám, které umožňují detekovat změny v normálně vyhlížející mozkové tkáni, jež unikají konvenčním technikám MR (Chen, 1989, Neema, 2007). 15

15 Cílem naší práce je na základě měření T2 relaxačního času podat kvantitativní důkaz, že u pacientů s RS se v centrální šedé hmotě hromadí železo více než u zdravých kontrol. Dalším cílem je zjistit, jak souvisí hodnoty relaxačního času T2 v měřených strukturách s dalšími kvantitativně stanovovanými parametry u RS, s celkovým objemem ložisek v bílé hmotě (LL lesion load) a atrofií mozku, která je vyjádřena velikostí mozkové parenchymové frakce (BPF). Zatímco zkracování T2 relaxačního času a rozvoj mozkové atrofie reprezentují neurodegenerativní složku RS, LL je odrazem zánětlivé složky nemoci. 2 Pacienti a metodika 2.1 Demografická charakteristika vyšetřovaného souboru Soubor obsahuje údaje z vyšetření N = 117 zdravých kontrol (42 mužů a 75 žen). Muži byli ve věkovém rozpětí roků, průměrný věk 38,4±14,6 (medián 35,2 roků), ženy ve věkovém rozpětí12-74 roků, průměrný věk 37,5±12,8 (medián 34,3 roků). Dále soubor obsahuje údaje N = 970 pacientů s RS (282 mužů, 678 žen). Muži ve věkovém rozpětí 9-66 roků, průměrný věk 34,9±9,6 (medián 35.2 roků), ženy roků, průměrný věk 35,9±9,5 (medián 34,3) (Tab.1); z toho u 800 pacientů s RS byly uvedeny hodnoty proměnné Lesion Load (410 s LL < 2 cm^3; 164 s rozpětím hodnot LL mezi 2 cm^3 a 5 cm^3 a 226 s LL > 5 cm^3) a u 803 pacientů s naměřenými 16

16 hodnotami proměnné Brain Parenchymal Fraction (267 přiřazeno do skupiny s BPF < 84,25; 268 s BPF 84,25-86,35 a 268 s BPF > 86,35). Nemocní pocházejí z klinické databáze pacientů centra pro roztroušenou sklerózu Neurologické kliniky VFN v Praze. U všech byla diagnostikována klinicky definitivní RS, relaps remitentní forma. Skupina normálních kontrol se rekrutovala z řad zdravých dobrovolníků doplněných o pacienty s jinou diagnózou než RS, u nichž nebylo podezření na možné změny v metabolizmu železa (většinou byli vyšetřováni pro migrénu). Od všech vyšetřovaných byl získán informovaný souhlas. Tab.1 Demografická charakteristika vyšetřovaných souborů Soubor RS-muži RS-ženy Kont-muži Kont-ženy n= Věk (roky) Průměrný věk Medián Směrodatná odchylka

17 2.2 MR analýza Vyšetření byla provedena na magnetické rezonanci Gyroscan NT 1,5T firmy Philips, použita byla standardní kvadratická hlavová cívka. Vyšetřovací protokol vždy zahrnoval: T1 vážené obrazy (T1W/3D-SPGR), sekvenci FLAIR a sekvenci MultiechoGraSE k výpočtu relaxačního času (vše v transverzální rovině). Hodnoceny byly následující parametry: 1. Objem hyperintenzních lézí (LL) 2. Velikost atrofie (BPF) 3. Stanovení T2 relaxačního času (T2) ve vybraných strukturách centrální šedé hmoty. Ad 1. Objem plak RS (LL) byl v MR stanoven automaticky s pomocí softwaru speciálně vytvořenému k tomuto účelu na našem pracovišti (Vaněčková, 2002). Volumometrie ložisek se provádí na základě zvolené intenzity signálu, pomocí které definujeme ložiska jako oblasti s intenzitou vyšší než je nastavená úroveň signálu. Poté se automaticky spočítá objem těchto oblastí. Pro měření objemu plak byla použita sekvence FLAIR s následujícími parametry: TR = 11000ms, TE = 140ms, TI = 2600 ms, FA = 90, FOV = 256, THK/Gap = 1.5/0 mm. Definovali jsme mozkovou tkáň jako tkáň s hladinou intenzity signálu od 4000 a hyperintenzní léze s intenzitou signálu od Prvním krokem byla korekce přenosových charakteristik cívky. Dalším krokem bylo manuální odstranění signálových hyperintenzit v komorovém systému a aplikace 3 dimenzionálních 18

18 filtračních operátorů. Nakonec byla použita semiautomatická technika měření lézí. Rozptyl mezi skeny byl menší než 0.3%. Koeficient odchylky reprodukovatelnosti byl u malých objemů (LL < 1 cm^3) do 7 %, u velkých objemů (LL > 1 cm^3) menší než 1%. Ad 2. BPF (poměr objemu čisté mozkové tkáně vůči součtu mozkové tkáně a objemu likvorových prostor).objem mozkové tkáně byl rovněž spočítán na základě vhodně stanovené hladiny intenzity signálu, která nám definovala mozkovou tkáň. Pro stanovení objemu byla použita sekvence T1W/3D/FFE s těmito parametry: TR = 25ms, TE = 5ms, FA = 30, FOV = 256, THK = 1.0. Výpočet byl proveden s pomocí našeho speciálního softwaru (Vaněčková, 2002), který pracuje v několika krocích. Za prvé, nejvyšší hodnota intenzity pixelů pro každý obraz byla stanovena na Pro měření objemu je důležité, aby měla každá vrstva u každého měření během sledování identickou pozici. Proto jsme použili semiautomatický program pro prostorovou korekci, která byla prováděna ve třech směrech. Hranice mozkové tkáně byly určeny automaticky s možností manuální korekce a mozkový objem byl vypočítáván za předpokladu, že signálová intenzita mozkové tkáně je vyšší než Pro redukci šumu byl použit sférický Gaussův filtr (kernel 3x3x3). Objem mozku byl rozdělen na objem mozkové tkáně a objem likvorových prostor. Při poměřování atrofie obecně je nutné brát v úvahu normy zdravých jedinců, neboť objem mozkové tkáně se fyziologicky s věkem zmenšuje. Chyba v v měření objemu (reprodukovatelnost) byla stanovena na 0,3%, což vyplynulo z opakovaných měření. 19

19 Ad 3. K relaxometrii jsou potřeba minimálně 2 echa, ze kterých se vypočítá T2 relaxační čas z rovnice Int = A* exp (-TE / t 2 ). Tato formule je výsledkem řešení tzv. Blochových rovnic. Int je intenzita signálu,a je konstanta úměrná koncentraci protonů v daném místě, TE je time to echo nastavovaný pro použitou sekvenci a t2 je žádaný relaxační čas. K výpočtu T2 byla použita sekvence MultiechoGraSE s těmito parametry: TR 2633 ms, TE 20 ms, FA=90., FOV=230, THK/Gap=3.00/0 mm. Použili jsme 5 ech s TE odstupňovaným po 20ms (20,40,60,80,100s). Schéma sekvence je tedy následující: po 90stupňovém RF pulzu následuje v našem případě pět 180 stupňových pulzů. Po každém tomto pulzu se vytvoří echo, které je dále rozbito 3 gradientními pulzy na 3 podecha. Z toho vyplývá, že na jeden 90 stupňový pulz bylo sebráno 25 řádků k prostoru. Použili jsme sekvenci MultiechoGraSE (Gradient And Spin Echo) která je hybridní mezi sekvencemi GE-T2* and SE-T2 (tato se něco více blíží T2 než T2*), s cílem co možná nejvíce redukovat známé nevýhody samotných sekvencí GE-T2* a SE-T2. GE-T2* je významně zatíženo artefakty vyplývajícími z nehomogenity pole, navíc sekvence je susceptibilní i k jiným substrátům zkracujícím T2 relaxační čas. SE-T2 je zase ovlivněna nejen koncentrací železa, ale výrazně i obsahem vody, což může být problematické především v místech s přítomností zánětu a edému a v oblastech neuronálních ztrát. Navíc je sekvence časově delší, i když na druhé straně je výpočet T2 relaxačního času z SE-T2 snazší. Na začátku jsme na několika zdravých kontrolách a pacientech vyzkoušeli, že sekvence MultiechoGraSE poskytuje adekvátní výraz susceptibilního efektu v porovnání s výsledky měření GE-T2* a SE-T2 a je tedy vhodná pro kvantifikaci železa v mozku. Při použití této sekvence je klesání signálu prakticky exponenciální (tuto skutečnost jsme ověřili) a je tedy vhodná k výpočtu T2 relaxačního času. Ke konečnému rozhodnutí o 20

20 použití sekvence MultiechoGraSE přispěl i aspekt trvání sekvence - akceptovatelných 6 minut, když jsme uvažovali o větším souboru vyšetřovaných. Naším cílem je dále optimalizovat metodu, aby byla univerzálně použitelná. Relaxační čas jsme měřili ve vybraných strukturách centrální šedé hmoty oboustranně a to v bazálních gangliích - v caput caudati (cc), v putamen (p) a dále v thalamu (t). Do centra těchto struktur jsme pro účely měření manuálně umístili měřící objem (ROI, region of interest). V tomto objemu potom program automaticky vypočítával T2 relaxační čas (Obr.3a, b,c). Obr. 3a 21

21 Obr. 3b Obr. 3c Obr. 3a,3b,3c Uložení ROI do měřených struktur (ncl. caudatus, putamen, thalamus oboustranně) Důvody, proč jsme zvolili právě tyto struktury byly: 1. jejich dostatečná velikost 2. dobře definované hranice 22

22 3. důkazy v již dříve publikovaných pracích na základě přítomnosti T2 hypointenzit, že v těchto strukturách u pacientů s RS dochází k patologickému ukládání Fe (Bakshi, 2000) 4. potenciální důležitost jak pro kognitivní tak motorické funkce mozku (Castaigne, 1981). Hodnoty T2 relaxačního času v korové šedé hmotě jsme neměřili, přestože by to bylo jistě velmi zajímavé. Tyto struktury jsou však příliš malé pro přesné uložení měřícího objemu. Byli jsme si vědomi nebezpečí kontaminace hodnot okolním likvorem v důsledku takzvaného partial volume efektu, kdy pokud jsou malé struktury, jsou měřené hodnoty zkresleny signálem z okolních tkání. Thalamus byl zvolen jako kontrolní struktura, kde dle Hallgrena a Sourandera u zdravých jedinců k ukládání železa nedochází Hallgren a Sourander, 1958, na druhé straně je dle práce Bakshiho regionem, kde se u pacientů s RS častěji vyskytují T2 hypointenzity (Bakshi, 2000). 2.3 Statistická analýza Prostřednictvím korelačních matic (Pearson, Spearman) byla provedena analýza struktury závislostí mezi T2 relaxačními časy ve skupinách pacientů s RS a ve skupině kontrolní a dále v podskupinách pacientů s RS rozdělených dle LL a BPF. Byly testovány rozdíly mezi jednotlivými skupinami (t-testy, Kruskal-Wallisův a párový Friedmannův test), byl použit výpočet přes ANOVU. Formální srovnání T2 relaxačních časů v závislosti na věku bylo provedeno testováním rovnoběžnosti regresních přímek a prostřednictvím grafů. Formálně byla testována vždy rovnost tří směrnic u tří skupin LL 23

23 a tří skupin BPF a čtyř skupin kombinujících pacienty a kontroly s jejich pohlavím. Ve všech použitých testech byla hodnota p < 0,05 považována za statisticky významnou. Výpočty byly provedeny prostřednictvím statistického programu SPSS verze 16.0, grafická zobrazení v SW Statistica 8.0. Ve výše popsaném souboru s údaji z vyšetření N = 117 kontrol (42 mužů a 75 žen) a N=970 pacientů s RS (282 mužů, 678 žen), z toho u 800 pacientů s RS byly uvedeny hodnoty proměnné Lesion Load a u 803 pacientů s naměřenými hodnotami proměnné Brain Parenchymal Fraction, lze T2 relaxační časy považovat za normálně rozdělené u ncl.caudatus a putamen; u thalamu. U spojitě měřených LL a BPF data normálně rozdělená nejsou (výsledky normality založené na šikmosti, špičatosti a Kolmogorov-Smirnovovu testu - pokud vždy alespoň 2 z trojice těchto testů nezamítly hypotézu o normálním rozdělení, uvažujeme předpoklad normálního rozdělení pro danou proměnnou za akceptovatelný; v ostatních případech předpoklad normálního rozdělení považujeme za neadekvátní). Věk se nejeví jako normálně rozdělená veličina u pacientů s RS (Tab. 2). 24

24 Tab.2 Rozdělení dat u subjektů ve vyšetřovaných souborech 25

25 3 Výsledky 1/ Ověřili jsme na našem souboru zdravých kontrol, že v bazálních gangliích se T2 relaxační čas fyziologicky zkracuje s věkem v průběhu normálního stárnutí a vypracovali jsme normy zdravých jedinců. Zkracování T2 relaxačního času se potvrdilo na hladině statistické významnosti u putamen bez ohledu na pohlaví a mozkovou hemisféru (pro muže vlevo p = 0,001, R = -0,395, vpravo p = 0,034, R = -0,328, pro ženy vlevo p = 0,008, R = -0,305, vpravo p = 0,032, R = -0,248) a u ncl.caudatus pro zdravé ženy oboustranně (vlevo p = 0,023, R = -0,262, vpravo p = 0,01, R = -0,297); pro zdravé muže byly výsledky statisticky nevýznamné, pravděpodobně z důvodu nižšího výběrového rozsahu podsouboru mužů. Vzhledem k fyzilogickému zkracování T2 relaxačního času s věkem jsme při porovnávání museli zaručit stejné rozložení analyzovaných skupin spárováním vzhledem k věku. Pro oblast thalamu se T2 relaxační časy s věkem naopak prodlužovaly. V levém thalamu pro muže p = 0,0012, R = 0,484, pro ženy p = 0,1681, R = 0,161; v pravém thalamu pro muže p = , R = 0,524, pro ženy p = 0,001, R = 0,435. 2/ Analogická závislost na věku platí i pro BPF a LL. Pearson: r(bpf, Věk) = - 0,441; r(ll, Věk) = 0,266; r(bpf, LL) = -0,604; Spearman: s(bpf, Věk) = -0,458; s(ll, Věk) = 0,346; s(bpf, LL) = -0,597; ve všech případech je p < 0,001) (Tab.3,4) 26

26 Tab.3 Pearsonovy korelace Tab.4 Spearmanovy korelace 27

27 28

28 3/ Dále jsme zjistili, že rozdíly v T2 relaxačním čase mezi pohlavím jsou ve skupinách pacientů s roztroušenou sklerózou i u kontrolních subjektů statisticky nevýznamné. Obdobně nevýznamné jsme shledali i rozdíly mezi RS a kontrolami na úrovni jednotlivých pohlaví. (jedinou výjimku tvoří rozdíl mezi RS a kontrolami pro levé ncl. caudatus u žen [F(1,298)=5,160; p=0,024], což může být ale rovněž důsledkem významnějšího zastoupení žen v celém souboru (Tab. 5) (Graf 1-6 v příloze). 4/ Komparace T2 relaxačních časů u pacientů a kontrol v závislosti na věku (porovnání směrnic regresních přímek) prokázala, že u pacientů s RS se v bazálních gangliích (ncl. caudatus, putamen) ukládá železo více než u zdravých kontrol. Na hladině statistické významnosti se zvýšené ukládání potvrdilo u ncl. caudatus a putamen oboustranně; ncl.caudatus vlevo (R 2 = 0,13, p = 0,004), vpravo (R 2 = 0,09, p = 0,018), 29

29 putamen vlevo (R 2 = 0,17, p = 0,006), vpravo (R 2 = 0,11, p = 0,035). Například pro levé ncl. caudatus je výpočet T2 relaxačního času pro zdravé kontroly dle rovnice T2 = *Věk, pro pacienty RS T2 = *Věk 3. U thalamů se T2 relaxační časy v závislosti na věku naopak prodlužovaly, u pacientů RS bylo však prodlužování s věkem menší než u zdravých kontrol, v levém thalamu R 2 = 0,03, p = 0,122, v pravém thalamu R 2 = 0,05 p = 0,002. Například pro levý thalamus je výpočet T2 relaxačního času u zdravých kontrol dle rovnice T2 = *Věk, u pacientů RS T2 = *Věk (Tab. 6-11, Tab. 12) (Graf 1-6). 30

30 31

31 32

32 33

33 Tab.12: Hodnoty Pearsonových korelačních koeficientů (R) mezi T2 relaxačními časy a věkem vyšetřených osob (RS pacientů a zdravých kontrol) v 6 vyšetřovaných mozkových strukturách s vyznačenou hladinou významnosti (p) Pearson R RS pacienti Kontrolní skupina RS v. kontroly n= Ncl. caudatus sin. R = p < T2= *Věk 3 R = p = T2= *Věk R 2 =0.13 p = Ncl. caudatus dx. R = p < T2= *Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0.09 p = Putamen sin. R = p < T2= *Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0.18 p = Putamen dx. R = p < T2= ,14*Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0,12 p = 0,035 Thalamus sin. R = p = T2= *Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0,03 p = 0,122 Thalamus dx. R = p = 0.1 T2= *Věk R = p < T2= ,15*Věk R 2 =0,05 p = 0,002 p = statistická významnost N = počet vyšetřených osob 1 znaménko u korelačního koeficientu vždy vypovídá o typu kladné resp. záporné vzájemné závislosti T2 relaxačních časů a věku 2 vyznačená statistická významnost vypovídá o téže statistické významnosti lineárního regresního koeficientu v polynomiální regresi T2 relaxačního času na věku. 3 rovnice pro výpočet relaxačního času T2; čas T2 je v milisekundách, věk v rocích 4 statistická významnost rozdílů směrnic přímek závislosti T2 na věku mezi skupinou RS pacientů a normálními kontrolami 34

34 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Nucleus caudatus vlevo Graf 1 35

35 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Nucleus caudatus vpravo Graf 2 36

36 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Putamen vlevo Graf 3 37

37 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Putamen vpravo Graf 4 38

38 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Thalamus vlevo Graf 5 39

39 Srovnání T2 relaxačních časů u RS a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Thalamus vpravo Graf 6 40

40 5/ Komparace T2 relaxačních časů u kontrol a pacientů podle 3 skupin LL a BPF v závislosti na věku, bez rozdělení pohlaví (porovnání směrnic regresních přímek) vede k následujícím závěrům: 5a) Srovnání T2 mezi skupinami LL ve třech kategoriích (1:cLL < 2 cm^3; 2: 2 cm^3 < cll < 5 cm^3; 3:cLL > 5 cm^3) a skupinou kontrol (4:cLL) indikuje, že největší statisticky významné rozdíly v intenzitě poklesu T2 relaxačních časů v závislosti na věku byly zjištěny mezi kontrolami a skupinou 1:LL< 2 cm^3. Statistická významnost byla shledána v ncl. caudatus i putamen oboustranně; ncl.caudatus vlevo (R 2 = 0,14, p = 0,004), vpravo (R 2 = 0,10, p = 0,006), putamen vlevo (R 2 = 0,18, p < 0,001), vpravo (R 2 = 0,11, p = 0,011). Z porovnání pacientů RS vyplynulo, že největší statisticky významné rozdíly jsou mezi skupinami 3:LL >5 cm^3 a 1:LL < 2 cm^3 statistická významnost byla shledána v ncl. caudatus vlevo (R 2 = 0.14, p = 0.038) a v putamen sin (R 2 = 0.18, p = 0.001) (Tab. 13a,b - 18a,b, Tab. 19) (Graf 7-12). 41

41 Nucleus caudatus vlevo Ncl. caudatus vlevo 42

42 Ncl. caudatus vpravo Ncl. caudatus vpravo 43

43 Putamen vlevo 44

44 Putamen vpravo Putamen vpravo 45

45 Thalamus vlevo Thalamus vlevo 46

46 Thalamus vpravo Thalamus vpravo 47

47 Tab.19 Hodnoty Pearsonových korelačních koeficientů (R) mezi T2 relaxačními časy a věkem u vyšetřených osob v 6 mozkových strukturách podle LL s vyznačenou hladinou významnosti (p) Pearson R RS 1 LL<2cm^3 RS 2 2cm^3<LL LL>5cm^3 RS 3 5cm^3<LL RS 1 v. RS 3 Kontrol. skup. v.rs 1 n= Ncl. Caudatus sin. R = p < T2= *Věk 3 R = p = T2= *Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0,14 R 2 =0,14 p = 0,038 4 p = 0,004 4 Ncl. Caudatus dx. R = p < T2= *Věk R = p = T2= *Věk R = p < T2= *Věk R 2 =0,09 p = 0,109 R 2 =0,09 p = 0,006 Putamen sin. R = p < T2= *Věk R = p < T2= *Věk R = p < T2= *Věk R 2 =0,18 p = 0,001 R 2 =0,18 p < 0,0001 Putamen dx. R = p < T2= *Věk R = p < T2= *Věk R = p < T2= *Věk R 2 =0,11 p = 0,114 R 2 =0,11 p = 0,011 Thalamus sin. R = p = T2= *Věk R = p = T2= *Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0,03 p = 0,005 R 2 =0,03 p = 0,009 Thalamus dx. R = p =0.824 T2= *Věk R = p = T2= *Věk R = p = T2= *Věk R 2 =0,04 p = 0,022 R 2 =0,04 p < 0,0001 p = statistická významnost N = počet vyšetřených osob 1 znaménko u korelačního koeficientu vypovídá o typu kladné resp. záporné vzájemné závislosti T2 relaxačních časů a věku 2 vyznačená statistická významnost vypovídá o téže statistické významnosti lineárního regresního koeficientu v polynomiální regresi T2 relaxačního času na věku. 3 V rovnici pro výpočet relaxačního času T2 je čas T2 v milisekundách a věk v rocích 4 statistická významnost rozdílů směrnic přímek závislosti T2 na věku mezi oběma skupinami skupinami; 1 (LL < 2 cm^3), 2 (5 cm^3 < LL) 48

48 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle LL a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Nucleus caudatus vlevo Graf 7 49

49 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle LL a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Nucleus caudatus vpravo Graf 8 50

50 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle LL a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Putamen vlevo Graf 9 51

51 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle LL a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Putamen vpravo Graf 10 52

52 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle LL a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Thalamus vlevo Graf 11 53

53 Srovnání T2 relaxačních časů u RS dle LL a kontrolních subjektů Směrnice regresních přímek Thalamus vpravo Graf 12 54

54 5b/ Analogické srovnání T2 ve třech kategoriích BPF (1: BPF < 84,25; 2:84,25 <= BPF <= 86,35 ; 3:BPF > 86,35 cut-points odpovídají formálně 1. a 2. tercilu zjištěným z naměřených hodnot BPF vede k obdobným závěrům, statisticky významné rozdíly v intenzitě poklesu T2-relaxačních časů v závislosti na věku byly zjištěny mezi skupinami 1:BPF <= 84,25 a 3:BPF > 86,36, a to jmenovitě u ncl. caudatus vlevo (R 2 = 0,15, p = 0,015), vpravo (R 2 = 0,12, p = 0,014), putamen vlevo (R 2 = 0,20, p < 0,001), vpravo (R 2 = 0,12, p < 0,001) (Graf 7-12 v příloze). 55

55 Nucleus caudatus vlevo 56

56 Nucleus caudatus vpravo 57

57 Putamen vlevo 58

58 Putamen vpravo 59

59 Thalamus levý 60

60 Thalamus pravý 61

61 5c) Větší citlivost na porušení hypotézy o rovnoběžnosti regresních přímek byla zjištěna u BPF nežli u LL; Srovnatelná významnost s BPF tj. na hladině spolehlivosti 99,9% byla shledána pouze v levém putamen. Podle předpokladů je ukládání železa spojeno s neurodegenerací, jejímž odrazem je právě mozková atrofie tedy snížená BPF (Obr.4a,b), což by vysvětlovalo tak silné korelace mezi železem a BPF. Obr.4a Měření T2 v atrofickém mozku 62

62 Obr.4b Měření T2 v atrofickém mozku 6. Na úrovni bilaterálních dvojic měřených struktur byla testována stranová asymetrie. a) Směrnice u kontrol se liší u thalamu (s 99% spolehlivostí), jmenovitě u žen; b) U pacientů s RS se směrnice liší u putamen (s 99,9% spolehlivostí), jmenovitě u skupiny "LL < 2cm3"; indikace statisticky významné odlišnosti směrnic jsme našli rovněž u skupiny "84,25 < BPF <= 86,35", ale zde jen na hranici 95% spolehlivosti (navíc tento výsledek pravděpodobně neumíme interpretovat - může jít tedy o náhodnou indikaci způsobenou výběrovou chybou). Statisticky významné rozdíly, které svědčily pro predilekční zkracování T2 relaxačního času vlevo, byly zjištěny mezi dvojicí ncl. caudatus u kontrol [pro muže T(41) = 3,071; p = 0,001, pro ženy T(74) = 4,994; p < 0,001] a u pacientů s RS u žen [pro muže T(121) = 0,958; p = 0,340 - pro ženy T(224) = 3,071; p < 0,002]. Dále pro ncl. caudatus ve 63

63 skupině LL< 2 cm 3 [T(139 )= 2,954; p = 0,004] a u dvojice putamen (levé vs pravé) ve skupině LL > 5 cm 3 [T(79) = -2,879; p = 0,005]). Tyto výsledky byly ověřeny ještě neparametrickými testy (Friedmann, Wilcoxon), protože hodnoty veličiny T2 pro thalamus nebyly shledány jako normálně rozdělené (Tab ). 64

64 65

65 66

66 67

67 68

68 69

69 Ověření přesnosti metody Chyba stanovení T2 relaxačního času je zatím poměrně vysoká. Na souboru 33 pacientů, kteří měli 3 vyšetření krátce po sobě během 1 roku a 120 pacientů, u kterých proběhla 2 měření během 1 roku, jsme ověřili, že chyba měření je okolo 3%. Měření T2 je třeba dále propracovat, tuto chybu by bylo potřeba snížit alespoň na 0,5%, aby se dalo vyjadřovat k jednotlivým pacientům. 4 Diskuze Tradiční přístup k roztroušené skleróze byl postaven na zánětlivě demyelinizačních procesech v bílé hmotě CNS. V souladu s tím byl velký počet MR studií u pacientů s roztroušenou sklerózou zaměřen na detekci, popis a kvantifikaci lézí v bílé hmotě mozku a míchy. Tyto studie prokázaly vynikající senzititivitu konvenční MR pro detekci lézí v bílé hmotě, stejně jako pro sledování jejich vývoje v prostoru a čase. V důsledku toho se MR stala nejvýznamnějším paraklinickým nástrojem pro diagnostiku roztroušené sklerózy, sledování dynamiky lézí v bílé hmotě CNS a monitorování odpovědi na terapii. Zvýšené zapojení magnetické resonance do diagnostiky RS ale postupně ukázalo, že objem a lokalizace lézí v bílé hmotě měřených použitím konvenčních technik MR se jen částečně shoduje s klinickou manifestací nemoci včetně ireverzibilních postižení. Pro tuto diskrepanci se nabízí dvě hlavní vysvětlení. Za prvé nedostatečná specificita konvenční MR k heterogennímu 70

70 patologickému substrátu makroskopických T2 hyperintenzních lézí, který může zahrnovat široké spektrum změn od reverzibilního edému a zánětu k ireverzibilní demyelinizaci a axonálním ztrátám (Lassmann, 1998). Za druhé neschopnost konvenčních MR technik detekovat jemné strukturální změny, které se mohou vyskytovat v normálně vyhlížející bílé i šedé hmotě (Allen, 1979, Evangelou, 2000).Stále sílící pocit deficitu konvenční MR v zobrazování patologie u roztroušené sklerózy vedl k intenzívnímu hledání nových nekonvenčních technik magnetické rezonance, které by se daly využít k přesnější detekci rozsahu poškození u roztroušené sklerózy. Tyto snahy zdůrazňovaly důležitost axonálních ztrát u RS a důležitost postižení, které se může skrývat v normálně vyhlížející bílé a šedé hmotě. Výsledky měření novými technikami vedly k revizi definice roztroušené sklerózy, která je dnes považována za globální onemocnění CNS zahrnující zánět, demyelinizaci a neurodegeneraci. K novým MR technikám se řadí magnetizační transfer, MR spektroskopie, difúzně vážené obrazy, perfúzně vážené obrazy, funkční MR a dále volumometrické zpracování konvenčně získaných MR obrazů. Kvantifikace T2 hyperintenzních lézí (LL), měření mozkového objemu k detekci atrofie a mozkové parenchymální frakce (BPF) a sledování přítomnosti T2 hypointenzních lézí v šedé hmotě, které jsou většinou příliš malé, aby byly zachyceny při konvenčním MR vyšetření. Tyto T2 hypointenzity pravděpodobně reprezentují přítomnost depozit železa. Alternativním, ne však vzájemně se vylučujícím, vysvětlením změn v šedé hmotě zachycených kvantitativními MR technikami by mohla být Walleriánská degenerace neuronů vzniklá sekundárně při poškození axonů, které kříží léze v bílé hmotě (Filippi, 2001). 71

71 V poslední době výrazně vzrostl zájem na odkrytí úlohy a významu železa v patofyziologii RS. Železo je za normálních podmínek důležité pro transport kyslíku v mozku, transfer elektronů, syntézu neurotransmiterů a produkci myelinu. Ačkoliv postupné ukládání železa je pozorováno v mozku během fyziologického stárnutí, zvýšená akumulace železa v mozku byla popsána u mnoha chronických neurodegenerativních chorob: u Alzheimerovy choroby (Connor, 1992, Smith, 1995), u Parkinsonovy choroby (Youdim, 1991, Berg, 2006, Hirsch 1998) a dalších jako Huntingtonova chorea (Bartzokis, 1999), Hallervorden Spatzova nemoc (Pearce, 2006). Důkazy o přítomnosti železa u těchto chorob vedly k úvahám o možném podílu železa i u jiných onemocnění, které by mohly zahrnovat oxidační stres, např. epilepsie (Kabuto, 1998) či roztroušená skleróza. Drayer a Grimaud (Drayer, 1987, Grimaud 1995) byli první, kteří u pacientů s RS popsali ložiska sníženého signálu v T2 váženém obraze, regionálně lokalizované ve strukturách šedé hmoty mozkové. Drayer (1987) sledoval T2 hypointenzity na souboru 47 pacientů s roztroušenou sklerózou a u 25 z nich prokázal abnormální hypointenzity v thalamu a v putamen. Stupeň T2 hypointenzit byl korelován s přítomností T2 hyperintenzit. Hodnocení změn signálu v T2 vážených obrazech bylo prováděno vizuálně. Tato studie nekorelovala výskyt T2 hypointenzit s klinickým postižením. Další studie Grimaudova (1995) prokázala T2 hypointenzity v thalamu, ale ne v putamen, což bylo v rozporu s výsledky Drayera, ale také dalších studií (Bakshi, 2001, 2002, Brass, 2007). Diskrepance by mohla být vysvětlena použitou metodologií. Grimaud nepoužil párovaní dle věku, aby porovnal změny signálu u RS a věkově stejných zdravých kontrol, ale pro vizuální hodnocení struktur použil jako standard šedou kůru mozkovou, ačkoliv v kortexu se u roztroušené sklerózy mohou T2 72

72 hypointenzity vyskytovat podobně jako v subkortikálních strukturách. Z toho důvodu kortex není správným standardem pro srovnání. Dalším vysvětlením pro diskrepanci by mohl být poměrně malý soubor pacientů (n = 46). Bakshi a jeho spolupracovníci (Bakshi et al., 2000) ve svých studiích analyzovali detailněji a na větším souboru pacientů (n = 114) frekvenci, uložení a klinický význam T2 hypointenzit. Zjistili, že T2 hypointenzity významně korelují s trváním nemoci a stupněm neurologického deficitu. Studie dále prokázala, že T2 hypointenzity se objevují nejvíce v thalamu (v 57%), v putamen (ve 42%), v nucleus caudatus (ve 24%) a kortikálně v rolandické oblasti (v 8%). Na základě výsledků této práce jsme zvolili subkortikální struktury vhodné pro naše měření, do kterých jsme manuálně ukládali měřící objem (ROI) a poté počítali T2 relaxační časy (thalamus, putamen, ncl. caudatus). Měření v kortexu jsme se rozhodli vynechat z obavy, že by výsledky byli velmi ovlivněny okolními strukturami v důsledku tzv. partial volume efektu. Další studie souborů pacientů (n = 154) prokázala, že T2 hypointenzní ložiska výrazně pozitivně korelují se vznikem mozkové atrofie, jako marker centrální mozkové atrofie byla zvolena šíře 3. komory a parietální atrofie (Bakshi, 2001). Zde byla vyslovena hypotéza, že ložiska sníženého signálu v T2 váženém obraze by mohla u pacientů s relaps-remitentní formou RS predikovat rozvoj mozkové atrofie. V práci z roku 2002 Bakshi (Bakshi 2002) provedl na souborech 60 pacientů s roztroušenou sklerózou a 50 kontrol počítačově asistované měření T2 hypointenzit, zatímco předchozí práce byly založeny na vizuálním hodnocení T2 vážených obrazů. Studie opět porovnávala stupeň T2 hypointenzit s klinickými nálezy a s dalšími kvantitativně stanovovanými MR markery pro roztroušenou sklerózu. Opakovaně se potvrdilo, že T2 hypointenzity významně korelují s mozkovou atrofií a jsou přesnějším prediktorem neurologického deficitu a klinického vývoje u RS než 73

73 konvenční MR nálezy. Dále bylo zjištěno, že T2 hypointenzity významně korelují také s T2 hyperintenzními ložisky (s totálním objemem T2 hyperintenzních plak), naopak statisticky významná korelace s T1 hypointenzitami nebyla prokázána. Hypointenzní T1 ložiska u RS reprezentují těžké ireverzibilní tkáňové ztráty, méně často tranzientní změny. T2 hyperintenzní léze jsou mnohem více nespecifické a mohou zahrnovat širší záběr patologických změn. Jedním z možných vysvětlení pro korelaci T2 hypointenzit s T2 hyperintenzitami, ale ne s T1 hypointenzitami je podíl degenerace traktu, která může prodlužovat T2 ale ne T1 relaxační čas. Nedávno publikovaná studie (Neema, 2009) kvantitativně prokázala, že u roztroušené sklerózy skutečně dochází k prodlužování T2 relaxačního času v normálně vyhlížející bílé hmotě. V souladu s těmito hypotézami vykazují T2 hypointenzity těsnou korelaci s mozkovou atrofií. Bermel šel ve své studii ještě dál (Bermel, 2005) a sledoval na souboru 159 pacientů s RS, jak bude vztah T2 hypointenzit v centrálních strukturách šedé hmoty a atrofie ovlivněn terapií intramuskulárním interferonem beta 1a. V dvouletém klinickém testu byl pacientům podáván interferon beta nebo placebo. U těchto pacientů byly v průběhu studie sledovány T2 hypointenzity, BPF, totální objem T2 hyperintenzit a postkontrastně se sytících lézí (plak). V regresních modelech byly T2 hypointenzity opět potvrzeny jako nejlepší prediktor atrofických změn (BPF). V souvislosti s terapií interferonem studie ukázala, že T2 hypointenzity predikují progresi atrofie u pacientů léčených placebem, nikoliv však u pacientů léčených interferonem. Z toho by plynulo, že interferon beta by mohl mít určitý vliv na mozkovou atrofii. Bermel předpokládá, že by interferon mohl zasahovat do kaskády dějů, které jsou potencovány depozity železa jako mediátorem neurotoxicity. Ovšem je to jen hypotéza, druhou tezí je, že jde opět jen o epifenomén samotné roztroušené sklerózy. 74

74 V souhrnu všechny výsledky dříve publikovaných studií ukazují, že se u pacientů s roztroušenou sklerózou vyskytují T2 hypointenzity více než u zdravých kontrol a že železo, které je podkladem těchto T2 hypointenzit, by tedy mohlo být markerem pro roztroušenou sklerózu. To jen potvrzuje, že RS je globální CNS proces, který vedle typických ložisek v bílé hmotě zahrnuje patologické změny v normálně vyhlížející bílé i šedé hmotě, difúzní mozkovou atrofii a všeobecný hypometabolismus. Vedle demyelinizace v mozku probíhají další patologické procesy jako axonální ztráty, patologická akumulace železa a atrofie. Přestože žádná z výše uvedených studií přímo nekorelovala T2 hypointenzity u RS s patologickými histologickými nálezy, všeobecně se předpokládá, jak už je uvedeno výše, že jejich podkladem jsou depozita železa (Drayer, 2001, Grimaud 1995, Bakshi, 2000). Je prokázáno, že u pacientů s progresívní formou RS jsou zvýšeny hladiny ferritinu v likvoru (LeVine, 1999). Železo se hojně vyskytuje v oligodendroglii u normálního mozku, v abnormálním množství je přítomno v reaktivní mikroglii, améboidní mikroglii a v makrofázích u RS mozku (LeVine, 1997). V mozkové tkáni pacientů s roztroušenou sklerózou jsou narušeny normální distribuce vazeb ferritinu a transferrinu (Hulet, 1999). Patologické studie zase ukazují abnormální akumulaci železa (hemosiderin a ferritin) v RS mozku (Craelius, 1982, Drayer, 1987). Z toho vyplývá, že železo, které je makroskopicky reprezentováno T2 hypointenzitami, hraje důležitou roli v patofyziologii roztroušené sklerózy. Železo je příčinou lokálních změn v magnetické susceptibilitě. Pokud množství železa překročí určitou prahovou hodnotu, lze je detekovat na makroskopické úrovni, korelátem depozit železa je právě snížení signálu v T2 váženém obraze (Bakshi, 2000). 75

75 T2 relaxometrie detekuje železo v normálně vyhlížející šedé a bílé hmotě mozkové, tedy ještě před vznikem na MR viditelných T2 hypointenzit, které lze makroskopicky zachytit až když množství železa přestoupí určitý práh. Navíc T2 relaxometrie umožňuje výpočet koncentrace železa, i když jen na základě empiricky získané rovnice. Dle publikovaných údajů je T2 relaxační čas lineárně závislý na koncentraci železa ve tkáni, empirická rovnice byla odvozena z výpočtů závislosti koncentrace železa v bazálních gangliích na věku a závislosti T2 relaxačního času (T2) na věku (Hallgren, 1958, Schenker, 1993). Koncentrace železa (Fe) v (mg Fe/100 g tkáně) je dána rovnicí: (Fe) = 3,7/T2-35,8. Tato rovnice platí jen pro bazální ganglia. Řada studií in vitro (Gossuin, 2004) a in vivo (Metafratzi, 2001, Bartzokis, 2007) (Chen, 1989, Vymazal, 1996, Gotz 2004) prokázala v bazálních gangliích silnou korelaci mezi T2 relaxačním časem a koncentrací železa, což bylo podpořeno histologickými studiemi mozku. Naše práce poskytla kvantitativní důkaz zvýšeného ukládání železa v normálně vyhlížející tkáni - v bazálních gangliích (ncl. caudatus, putamen) in vivo u pacientů s RS ve srovnání se zdravými kontrolami, Pokles T2 relaxačního času se pro RS vůči kontrolám signifikantně lišil v ncl. caudatus i putamen oboustranně; levé ncl.caudatus (p = 0,004), pravé (p = 0,018), putamen vlevo (p = 0,006), vpravo (p = 0,035). Při rozčlenění dle pohlaví vyplynulo, že nejsou signifikantně významné rozdíly mezi pohlavími u pacientů s RS ani u zdravých kontrol, což je v rozporu se závěry Bartzokise a dalších (Bartzokis et al., 2007), přestože věkové rozpětí pacientů bylo obdobné, ale v souhlase se studií Pérana (Péran, 2009). Thalamus ukládání železa nevykazoval u zdravých kontrol, jak již popsali Hallgren a Sourander (Hallgren and Sourander, 1958), naopak jsme zaznamenali prodlužování T2 relaxačního času. U 76

76 pacientů s RS se T2 relaxační čas s věkem také prodlužoval, ale směrnice regresních přímek byla v obou thalamech podstatně méně strmější než u kontrolních subjektů, tedy i v thalamu zřejmě k určité zvýšené akumulaci železa u RS v porovnání s kontrolami dochází (Graf 5,6). Thalamus se svým složením liší od bazálních ganglií obsahuje více myelinu či může obsahovat drobné kapičky vody likvoru. Dle našich pozorování se u pacientů s RS v thalamu, na rozdíl od bazálních gangliích, také častěji vyskytují T2 hyperintenzní ložiska, jejichž podkladem může být edém, demyelinizace, zánět či glióza, které potom mohou ovlivnit výslednou hodnotu měřeného T2 relaxačního času. U pacientů s roztroušenou sklerózou bylo prodlužování T2 relaxačního času menší než u zdravých kontrol, tedy i zde lze jakýsi podíl železa v RS mozku předpokládat. Zvýšená akumulace železa u RS v porovnání s kontrolními subjekty byla jednoznačně prokázána v bazálních gangliích. Bazální ganglia mají četné reciproční spoje jak s kůrou, tak s thalamem či mezi sebou navzájem, železo v bazálních gangliích by mohlo být signálem, že zde došlo k přerušení vulnerabiních axonů. Zvýšená akumulace železa u RS pravděpodobně souvisí s neurodegenerativní komponentou nemoci, která v tradičním pojetí byla především autoimunitně zánětlivá. Protože podíl železa v mozku se zvyšuje během fyziologického stárnutí (Hallgren a Sourander, 1958, Fiehring a Sundermann, 1986), což potvrdila i naše měření T2 relaxačního času u zdravých kontrol, bylo nutno při statistických analýzách vyloučit vliv věku spárováním ve skupinách. Závislost na věku platí i pro spojitě měřené BPF i LL. Pearson: r(bpf, Věk) = -0,441; r(ll, Věk) = 0,266; r(bpf, LL) = -0,604; ve všech případech výše je p < 0,001. Nejvyšší korelace byly tedy zjištěny mezi LL a BPF, ale s opačným znaménkem. Z výše uvedeného vyplývá, že komparace T2-relaxačních časů podle skupin LL resp. 77