Testování inhibičního potenciálu reaktivátorů acetylcholinesterasy in vitro

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmakologie a toxikologie Testování inhibičního potenciálu reaktivátorů acetylcholinesterasy in vitro Diplomová práce Školitel specialista: PharmDr. Jana Ţďárová Karasová Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Marie Vopršalová, CSc. Hradec Králové 1 Vendula Šepsová

2 Prohlašuji, ţe jsem tuto diplomovou práci na téma Testování inhibičního potenciálu reaktivátorů acetylcholinesterasy in vitro vypracovala samostatně pod vedením školitele specialisty PharmDr. Jany Ţďárové Karasové a vedoucí práce PharmDr. Marie Vopršalové, CSc. Uvedla jsem všechny pouţité prameny a literaturu, jejichţ seznam je uveden na konci práce. V Hradci Králové dne Podpis: 2

3 PODĚKOVÁNÍ: Ráda bych zde poděkovala vedoucí práce paní doktorce Marii Vopršalové za konzultace a čas, který věnovala mé práci. Velké díky patří PharmDr. Janě Ţďárové Karasové za odborné vedení, pomoc v laboratoři, cenné připomínky a taky ochotu a čas, který mi poskytla během realizace celé práce. Děkuji kolektivu zaměstnanců Katedry toxikologie Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany za příjemné pracovní prostředí a dále díky všem, kteří jakkoliv přispěli k dokončení této diplomové práce. 3

4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Vendula Šepsová Školitel: PharmDr. Marie Vopršalová, Csc. Název diplomové práce: Testování inhibičního potenciálu reaktivátorů acetylcholinesterasy in vitro Nervově paralytické látky (NPL) patří mezi organofosfátové inhibitory (OFI), které se ireverzibilně váţí na acetylcholinesterasu (AChE). Neurotransmiter acetylcholin (ACh) tedy není rozkládán a jeho zvýšená koncentrace poté způsobuje nadměrné dráţdění cholinergních receptorů, tzv. akutní cholinergní krizi. [Patočka, 4] V této studii byly sledovány vztahy mezi strukturou a inhibiční účinností reaktivátorů AChE, tyto znalosti mohou být dále vyuţity při navrhování struktur nových periferně působících inhibitorů AChE s reverzibilním účinkem. Mechanismu periferní inhibice AChE se jiţ dnes vyuţívá při profylaxi otrav NPL. Reverzibilní inhibitor se naváţe na AChE a tím brání NPL tento enzym inhibovat. Reverzibilní inhibitory AChE jsou dále vyuţívány v léčbě myastenie gravis či v anestetické praxi k zvratu působení podaných myorelaxancií [Brufani, 1997], kde je zvýšení koncentrace ACh na nervosvalové synapsi ţádoucí pro obnovení fyziologické funkce svalu [Palin, 2]. Inhibiční potenciál reaktivátorů AChE byl stanovován in vitro. Inhibiční účinnost kaţdého reaktivátoru byla stanovena po proměření schopnosti inhibovat AChE v kaţdém bodě koncentrační řady od 1-1 aţ po 1-8 mmol/l. Reaktivátor inhiboval enzym, úhoří AChE, po dobu 1 min. Poté byl přidán pufr s DTNB a ATCh. Pro zvýšení validity měření byly stanoveny hodnoty oximolýzy, které byly následně odečteny od hodnot absorbance, aby nedocházelo k odečtu falešně pozitivních výsledků. 4

5 Byl zjištěn nárůst inhibičního potenciálu u biskvarterních reaktivátorů AChE s oximovými skupinami v poloze ortho, vzhledem k jiným polohám na pyridinovém jádře. Zároveň byl vyšší inhibiční potenciál prokázán i u biskvarterních oximů s delším spojovacím řetězcem (1 uhlíků). Také substituce ve spojovacím řetězci zvyšovala inhibiční potenciál oximů vůči AChE. 5

6 ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of farmacology and toxicology Candidate: Vendula Šepsová Supervisor: PharmDr. Marie Vopršalová, Csc. Title of diploma thesis: Inhibiotin potencial of acetylcholinesterase reactivators - in vitro testing. Nerve agents belong to the group of OFI that irreversibly binds to acetylcholinesterase (AChE). Neurotransmitter acetylcholine (ACh) is not degraded and its increased concentration causes excessive aggravation of cholinergic receptors, known as acute cholinergic crisis [Patočka, 4]. The main aim of this study was to compare the relationship between structure and inhibitory effect of AChE reactivators. This knowledge can be used in designing structures of new peripherally acting AChE inhibitors with a reversible effect. The mechanism of peripheral inhibition of AChE is already used for prophylaxis of nerve agent poisoning. The mechanism of action is that reversible inhibitor binds to AChE, it prevents binding of nerve agent on this enzyme. Reversible AChE inhibitors are also used in the treatment of myasthenia gravis and in anesthetic practice, to reverse the action of muscle relaxants administered [Brufani, 1997], where the increased concentration of ACh at the neuromuscular synapses is desirable to restore the physiological function of muscles [Palin, 2]. Inhibitory potential of AChE reactivators was determined in vitro. The inhibitory effect each reactivator was measured by its ability to inhibit every point in the concentration range from 1-1 to 1-8 mmol/l. Reactivators inhibited enzyme, eel AChE, for 1 min. A buffer with DTNB and ACh was then added. Values of oximolysis were determined to increase the validity of measurement, which were subsequently subtracted from the absorbance values to avoid reading false-positive results. An increase of the inhibitory potential of AChE reactivators with bisquaternary oximes groups in the ortho position was found, in comparison with 6

7 other positions on the pyridine nucleus. Simultaneously, the higher inhibitory potential was also demonstrated bisquaternary oximes with longer connecting chain (1 carbons). Also, substitution on the coupling chain increased the inhibitory potential against AChE. 7

8 OBSAH ÚVOD CÍL TEORETICKÁ ČÁST Myasthenia gravis (MG) Patofyziologie Nervosvalový přenos Acetylcholinový receptor Svalová kontrakce Porucha nervosvalového přenosu Příznaky a symptomy MG Druhy MG Séropozitivní MG s autoprolátkami proti ACh receptorům Séronegativní MG s autoprotilátkami proti MuSK Séronegativní MG s negativními protilátkami proti MuSK MG asociovaná s nádorem brzlíku (thymomem) Léčba MG Inhibitory acetylcholinesterasy Imunosupresiva Tymektomie Plazmaferéza Reaktivátory AChE Struktura reaktivátorů AChE Fyzikálně-chemické vlastnosti reaktivátorů AChE Farmakokinetika reaktivátorů AChE Mechanismus účinku reaktivátorů AChE METODIKA Princip metody Příprava základních roztoků Postup měření inhibičního potenciálu reaktivátorů AChE Zpracování výsledků VÝSLEDKY DISKUZE. 8

9 ZÁVĚR...45 SEZNAM ZKRATEK 46 LITERATURA A PRAMENY

10 ÚVOD Myasthenia gravis nepatří mezi často vyskytující se choroby. Toto autoimunitní onemocnění se vyznačuje především ochablostí svalů. Nejčastěji bývají postiţeny svaly oka, obličeje, šíje, svaly končetin. Dále slábne funkčnost dýchacího svalstva, coţ nejvíce ohroţuje ţivot nemocného. Tyto symptomy vznikají z důvodu nedostatku neurotransmiteru acetylcholinu (ACh), který působí na nikotinových acetylcholinových receptorech (nachr). ACh umoţňuje přenos nervového vzruchu z periferního nervstva na sval. Je shromaţďován ve vezikulech, po zvýšení akčního potenciálu nastává vylití vezikulů do synaptické štěrbiny a navázání neuromediátoru na nachr. K ukončení působení tohoto neurotransmiteru je v synaptické štěrbině přítomna acetylcholinesterasa (AChE), která rozloţí ACh na cholin a kyselinu octovou. Látky zabraňující správné funkci esteras jsou inhibitory a zvyšují nabídku ACh v synaptické štěrbině. Inhibitory AChE se uţívají v zemědělství jako pesticidy a herbicidy (paraoxon, parathion). Dále pak mohou být vyuţity v terapii Alzheimerovy choroby či myastenie gravis (galanthamin, pyridostigmin). Další velkou skupinu tvoří organofosforové inhibitory (OFI) pouţívané armádami jako bojové chemické látky (sarin, soman, VX). K léčbě po zasaţení OFI byly vyvinuty reaktivátory AChE (oximy). Jsou to mono- nebo biskvartérní pyridinové sloučeniny s jednou či více oximovými skupinami. Pyridinová jádra u biskvarterních oximů bývají spojena řetězcem. Jejich funkcí je znovuobnovení aktivity inhibované AChE. Aby byly oximy schopné vytěsnit OFI z vazby na AChE, musí mít k danému enzymu alespoň nějakou afinitu. Míra afinity se dá vyjádřit inhibičním potenciálem těchto látek. Jelikoţ molekula reaktivárorů obsahuje kladně nabitý dusík, který způsobuje omezení v prostupu přes HEB, působí tedy převáţně na periferii. Tyto vlastnosti vytvářejí dobrý základ pro vznik nové skupiny léčiv proti myastenii gravis, kdy je potřeba účinně zvýšit mnoţství ACh na nervosvalové ploténce, tedy na periferii. Součastná terapie MG je zaloţena na nepřímých parasympatomimeticích (edrofonium, pyridostigmin, distigmin). MG je klasifikována jako autoimunitní onemocnění. K léčbě se proto nasazují mimo inhibitory AChE také imunosupresiva 1

11 (azathioprim), dále jsou podávány kortikosteroidy. V některých případech je volena i operace (odstranění brzlíku). 11

12 1. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo zaměřit se na reaktivátory AChE, převáţně na sledování jejich inhibičního potenciálu. Tyto látky slouţí primárně jako funkční antidota po zasaţení organismu organofosfáty. Jejich hlavní funkcí je tedy obnovovat inhibovanou AChE. Díky kladně nabitému dusíku ve své struktuře nepronikají přes HEB, působí tedy převáţně na periférii. Reaktivátory musí mít určitou míru afinity k AChE a zároveň afinitu k organofosfátům, aby mohly zabránit vzniku kovalentní vazby. K vyjádření afinity oximových reaktivátorů k AChE slouţí hodnoty inhibičního potenciálu. Zároveň bylo sledováno jaký vliv má struktura reaktivátoru na jejich inhibiční potenciál. Dřívějšími studiemi bylo prokázáno, ţe největší vliv na reaktivační potenciál, co se týče struktury reaktivátoru, má počet a poloha oximových skupin, délka spojovacího řetězce mezi pyridinovými jádry a nebo substituce v tomto spojovacím řetězci. Snaţili jsme se zjistit, jaká je závislost mezi těmito strukturními vlivy a inhibičním potenciálem. Skupina dvaceti osmi reaktivátorů byla změřena v několika koncentračních řadách a poté byla vypočtena IC 5. Získané znalosti o ovlivnění inhibičního potenciálu strukturou reaktivátoru by měly slouţit jako podklad pro syntézu nových inhibitorů AChE, které by méně prostupovaly přes HEB. Tyto inhibitory by mohly být vyuţity jako potencionální léčiva při terapii autoimunitního onemocnění myastenii gravis. 12

13 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Myasthenia gravis (MG) Označení myasthenia gravis vzniklo spojením řeckého slova myasthenia, coţ v překladu znamená chorobnou slabost svalů, s latinským výrazem gravis, překládaným jako váţný nebo těţký. Nejběţnější formou MG je chronické nervosvalové onemocnění charakterizované kolísající ochablostí různých svalových skupin. Postihuje všechny rasy, obě pohlaví a jakýkoliv věk. [online, ] Bylo vypozorováno, ţe častěji onemocněním trpí mladší ţeny ( aţ 3 let) a starší muţi (nad 5 let). [online, ] Běţnou příčinou vzniku nemoci je získaná imunologická abnormalita, kdy je u většiny postiţených zvýšena hladina protilátek proti AChR nebo je zvýšena hladina autoreaktivních T lymfocytů v těle pacienta. Někdy je prokázána i genetická abnormalita v nervosvalovém spojení Patofyziologie Nervosvalový přenos Neurotransmiter ACh je syntetizován v cytoplazmě nervového zakončení z cholinu (přijímán ze synaptické štěrbiny) a acetyl-co-a (syntetizován v mitochondriích z prekurzorů) enzymem acetylcholintransferasou. ACh je transportován prostřednictvím specifických proteinů do vezikul, kde je skladován. Akční potenciál (AP), který dosáhne nervového zakončení, iniciuje vstup iontů Ca 2+ do nervového zakončení napěťově řízenými kanály a umoţní splynutí membrány vezikul s plazmatickou membránou nervového zakončení. Následuje vylití obsahu vezikul exocytózou do synaptické štěrbiny. Uvolněný ACh pak působí na postsynaptické receptory (a vyvolává parasympatomimetické účinky), nebo na presynaptické autoreceptory, kdy reguluje výdej ACh. Molekula ACh je velmi krátce (asi 2 ms) 13

14 navázána na receptor a po uvolnění je okamţitě hydrolyzována AChE na cholin a acetát. [Lincová, 2] Acetylcholinový receptor ACh je schopen interagovat se dvěma typy cholinergních receptorů - muskarinovými a nikotinovými. Na nervosvalové ploténce se nachází muskulární typ nikotinového receptoru. Tento pentamerní receptor se skládá ze čtyř typů podjednotek 2 α, β, δ, ε nebo γ. Kaţdá podjednotka receptoru prochází čtyřikrát membránou. Uspořádáním podjednotek vytváří v membráně iontový kanál pro kationy K +, Na +, Ca 2+ K aktivaci receptoru dojde, pokud se na něj naváţí dvě molekuly ACh na podjednotky α, tím dojde ke změně konformace receptoru a otevření kanálu. Tímto kanálem vstupuje Na + do buněk. [Lincová, 2] Takto je přenesen akční potenciál (vzruch) z neuronového zakončení na sarkolému Svalová kontrakce Po depolarizaci sarkolémy nastává vyplavení Ca 2+ ze sarkoplazmatického retikula. Ca 2+ se naváţe na troponin C, tím je odstraněn inhibiční účinek troponinu I a dochází k interakci aktin-myozin, a tedy ke kontrakci příčně pruhovaného svalstva. Po zastavení toku Ca 2+ nastává relaxace svalstva Porucha nervosvalového přenosu Špatná funkce neuromuskulárního přenosu u pacientů s MG je způsobena blokádou AChR autoprotilátkami. Tyto protilátky se dají prokázat u % postiţených myasthenií. U některých pacientů se na blokádě mohou podílet protilátky proti svalově specifické tyrosinkináze (MuSK), která umoţňuje inkorporaci AChR do postsynaptické membrány. V mladším věku hraje významnou roli v imunopatogenezi MG brzlík (thymus), který v období dospívání reguluje formování imunitního systému. [Piťha, 4] V brzlíku se lymfocyty učí rozpoznat látky tělu vlastní a cizorodé. 14

15 Na rozhraní dřeně a kůry brzlíku se hromadí špatné autoreaktivní lymfocyty T a B. Tyto T lymfocyty stimulují specifické B lymfocyty k tvorbě protilátek proti AChR. Ve dřeni jsou přítomny myoidní buňky produkující a exprimující AChR, cytokeratin a svalově specifický troponin. Ve zdravém brzlíku probíhá eliminace T lymfocytů, které mají navázány antigeny proti AChR. U MG však dochází k patologickým změnám brzlíku a tím k narušení jeho funkce. Velmi často lze u pacientů s MG pozorovat hyperplazii brzlíku nebo jeho nádor (thymom) Příznaky a symptomy MG MG se neprojevuje běţnými příznaky, jako je třeba horečka nebo bolest. První subjektivní příznaky, které pacient pociťuje, většinou souvisí s ochablostí okohybných svalů, které jsou vnímány zejména jako rozmazané či dvojité vidění. Typické pro pacienty trpící MG, je také to, ţe jejich svaly jsou nejsilnější ráno a v průběhu dne slábnou, tento proces je pak zvláště urychlen po námaze. [Lippincott, 8] Lidi s MG lze rozpoznat díky jejich spadlým očním víčkům a problémům s artikulací. Výraz v jejich tvářích je smutný a unavený. Potíţe nastávají i při příjmu potravy. Ţvýkací svaly rychle ztrácejí sílu a dochází k zhoršení kvality rozmělnění jídla, slábnutí se projevuje i u polykacích svalů. Ochabuje i svalstvo končetin, horních častěji neţ dolních. Ţivot ohroţující je postiţení dýchacích svalů. Při slabosti bránice a interkostálních svalů má dechová nedostatečnost (dyspnoe) inspirační charakter. Pokud jsou výraznější expirační potíţe, je více postiţeno svalstvo abdominální. [Špalek, 8] Druhy MG Séropozitivní MG s autoprolátkami proti ACh receptorům Tato forma se vyskytuje u -85 % pacientů s MG. Autoprotilátky IgG, které jsou přítomny u 1 % počtu nemocných, způsobují významnou redukci funkčních ACh receptorů. Protilátka se naváţe na dva sousední AChR a aktivuje komplement. Dochází tak k postupnému zániku receptorů. [Špalek, 7] Redukce 15

16 receptorů vede ke zpomalení neuromuskulárního přenosu, coţ se klinicky projeví jako svalová slabost a rychlá unavitelnost Séronegativní MG s autoprotilátkami proti MuSK U 15- % pacientů nastává zlepšení klinického stavu po výměně plazmy (plazmaferéze). Její efekt spočívá v odstranění autoprotilátek. Muscle specific kinase (MuSK) je specifická svalová tyroxin kináza, která je součástí membrány svalového vlákna a má klíčovou úlohu při vývoji neuromuskulárního spojení. Jakým mechanismem působí autoprotilátky proti MuSK postsynaptickou poruchu nervosvalové transmise je v současnosti stále nejasné. [Špalek, 7] Séronegativní MG s negativními protilátkami proti MuSK Séronegativní MG se vyskytuje u pacientů s okulárními nebo generalizovanými příznaky, kteří nemají autoprotilátky ani proti AChR ani proti MuSK. Brzlík (thymus) bývá u této formy hypeplazický s germinativními centry. Tento nález spolu s efektivní thymektomií svědčí o účasti thymu v patogenezi onemocnění. [Špalek, 8] MG asociovaná s nádorem brzlíku (thymomem) 1-15 % pacientů s MG má thymom. Tito pacienti mají vţdy v krvi přítomné autoprotilátky proti AChR a nikdy nemají autoprotilátky proti MuSK. Thymom exprimuje celý řád antigenů, zejména titin a ryanodinový receptor. [Špalek, 8] 16

17 Léčba MG Cílem léčby je dosáhnout co nejrychlejšího zlepšení s pouţitím nejjednodušší terapie s co nejmenšími vedlejšími účinky. Proto je nutné ke kaţdému pacientovi přistupovat individuálně Inhibitory AChE Mechanismus účinku inhibitorů AChE je zvyšování mnoţství ACh na nervosvalovém spojení. Po navázání inhibitoru na AChE nedochází k rozkladu ACh. ACh se hromadí a zvyšuje se tak počet moţných interakcí mezi ACh a jeho receptorem. Tím se zlepšuje neuromuskulární přenos. Podávání nepřiměřeně vysokých dávek inhibitorů AChE však můţe vyvolat cholinergní krizi, která je obtíţně rozeznatelná od myastenické krize (slabosti krčních a dýchacích svalů, pocení, nesrozumitelné řeči). [Suchopár, 9] Mezi zástupce inhibitorů AChE patří edrofonium, který se jako jediný váţe pouze na aniontové místo enzymu, a to svou kladně nabitou částí molekuly. Takto vzniklá vazba má charakter vazby iontové, a tak inhibiční účinek trvá pouze několik minut. Edrofonium se pouţívá k diagnóze MG, rozlišení cholinergní a mysthenické krize, ke stanovení optimální dávky léčiva a k antagonizování účinku kompetitivních myorelaxancií. [Lincová 2; Suchopár 9] Další inhibitory patří do skupiny karbamátů. Je zde řazen neostigmin (Syntostigmin) působí 3-6 hodin. Nejvíce uţívaný je pak pyridostigmin (Mestinon), který má prolongovaný účinek (6 hod.) a minimální vedlejší účinky. Výjimečně jsou předepsány ambenonium (Mytelase) nebo distigmin (Ubretid). Jelikoţ je u nich popsáno zvýšené riziko vzniku cholinergní krize, uţívají se v minimálním mnoţství. [Lincová, 2] Další skupinu inhibitorů AChE tvoří organofosforové sloučeniny, které se však váţou ireverzibilně, a proto nejsou k terapii MG vhodné. 17

18 Imunosupresiva Při nedostatečné léčbě inhibitory AChE se nasazují glukokortikoidy. Mají především protizánětlivý a imunosupresivní účinek. Prednison i methylprednisolon vyţadují zcela individuální dávkování. Společné je, ţe terapie začíná pomalým zvyšováním jednotlivých dávek a při ukončení léčby se zase dávky postupně sniţují. Glukokortikoidy díky svým neţádoucím účinkům (osteoporóze, hypertenzi, centrální obezitě, glaukomu atd.) nejsou vhodné k chronické terapii. Proto se začalo vyuţívat kombinací glukokortikoidů s azatioprinem. Jeho účinek nastupuje aţ po 2-3 měsících léčby. [Piťha, 4] V posledních letech se do terapie zavádí nová léčiva jako cyklosporin, mykofenolát mofetyl, tacrolimus nebo rituximab. [Spring, 1] Tymektomie Tymektomie je pouţívána jako standardní metoda k navození dlouhodobé klinické remise. Pozitivních výsledků je dosahováno především u pacientů v dětském věku (do 15 let). Za kladný faktor pro dosaţení příznivého výsledku lze povaţovat i věk roků. Mezi další pozitivní faktory patří hyperplazie thymu, také co nejkratší trvání MG od vzniku onemocnění a diagnóza seropozitivního typu MG s autoprotilátkami proti AChR. [Seybold, 1999] Plazmaferéza Tato metoda spočívá v eliminaci protilátek působících proti AChR nebo MuSK. Dochází k separaci erytrocytů a jejich reinfuzi zpět do krevního řečiště společně s koloidním roztokem, většinou albuminem. Odstraní se tak z těla patologické protilátky. Plazmaferéza se provádí kaţdý druhý den, a to 3-5krát. [Piťha, 4] 18

19 2.2. Reaktivátory AChE Reaktivátory AChE jsou označovány také jako kauzální antidota. Patří mezi látky uţívané v terapii otrav způsobených OFI. Jejich úkolem je vyvázat inhibitor z aktivního místa enzymu AChE a zabránit tak vzniku kovalentní vazby. Po odstoupení inhibitoru z kavity enzymu dochází k obnově jeho původní funkce. Mezi nejznámější zástupce uţívané v praxi patří: pralidoxim - 2-PAM; 2-hydroxyiminomethyl-1-methylpyridinium chlorid), obidoxim - Toxogonin ; 1,3-bis-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-2-oxapropan dichlorid), trimedoxim - 1,3-bis(4-hydroxyimonomethylpyridinium)propan dobromid) a HI- 6-1-(2-hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(4- karbamoylpyridinium)- 2-oxapropan dichlorid). [Kassa, 2] Ţádný z dosud známých reaktivátorů však není schopen uspokojivě reaktivovat AChE inhibovanou všemi typy OFI. [Musílek, 5] Obr. č. 1. Přehled struktur reaktivátorů 19

20 Struktura reaktivátorů AChE Reaktivátory AChE jsou označovány také jako oximy, protoţe obsahují v molekule funkční oximovou skupinu (R-CH=NOH), která je při fyziologickém ph lidského těla částečně disociována na nukleofilní oximátový anion. [Kuča, 3] Chemická struktura reaktivátorů AChE zásadně ovlivňuje proces reaktivace AChE inhibované jak NPL, tak organofosforovými pesticidy. [Kuča, 6] Jedním ze základních strukturních poţadavků při syntéze účinného reaktivátoru AChE je zavedení kladného náboje do jeho struktury. Tento kladný náboj má vliv na afinitu reaktivátorů k aktivnímu místu AChE. Čím větší je afinita těchto látek k AChE, tím větší je pravděpodobnost, ţe nový reaktivátor AChE bude reaktivovat organofosfonáty inhibovanou AChE. [Cabal, 3] Podle počtu kladně nabitých dusíků, které zajišťují afinitu k enzymu, rozdělujme oximy na monokvarterní (monopyridinové), jejichţ zástupcem je například pralidoxim, a biskvarterní (bispyridinové), coţ je třeba obidoxim. Další vliv na účinnost a rychlost reaktivace má poloha a počet oximových skupin navázaných na pyridinových jádrech. Tato nukleofilní skupina je schopna zvrátit vznik kovalentní vazby mezi inhibitorem a AChE. Struktura biskvarterních reaktivátorů se ještě můţe lišit tvarem či délkou spojovacího řetězce. V posledních letech byly vyuţity jiţ známé poznatky o vlivu struktury oximu na reaktivační proces a na Katedře toxikologie FVZ v Hradci Králové a spolupracujících pracovištích (Korea, Austrálie, Turecko, Brazílie, ) byla syntetizována široká škála struktur nových reaktivátorů. Označují se jako K-substance. V současnosti u nich probíhá in vitro a in vivo testování. Z těchto nově syntetizovaných reaktivátorů jsou testovány oximy K27 a K48. Vykazují nízkou toxicitu a lepší účinnost v reaktivaci AChE in vitro inhibovanou různými organofosfáty zahrnujícími jak NPL tabun a VX, tak i pesticidy. [Kassa, 6] Oxim K27 vykazuje dobré výsledky při reaktivaci AChE inhibované NPL (kromě cyklosarinu a somanu) a také je schopen velmi dobré reaktivace AChE při otravách způsobených širokou škálou pesticidů. [Kuča, 1] Nově připravený reaktivátor s označením K3 by mohl v budoucnu nahradit obidoxim, jelikoţ K3 má vyšší reaktivační účinnost vůči AChE inhibované tabunem. Jeho efektivita je dokonce vyšší i při niţších koncentracích, tedy

21 těch, kterých je po podání terapeutických dávek reálně dosaţeno v organismu. [Kovarik, 9] Fyzikálně chemické vlastnosti reaktivátorů AChE V současnosti stále nebyl nalezen širokospektrý reaktivátor AChE účinný vůči všem typům OFI. Účinnost reaktivátorů také úzce závisí na rychlosti dealkylace (stárnutí) komplexu AChE-inhibitor. V důsledku tohoto procesu dochází ke vzniku ireverzibilní kovalentní vazby. Rychlost stárnutí (aging) závisí jak na délce kontaktu AChE s inhibitorem, tak i na chemické struktuře inhibitoru. [Patočka, 4] Při intoxikaci somanem probíhá dealkylace velmi rychle, proto je povaţována za nejhůře léčitelnou otravu těmito typy inhibitorů. Nejvyšší rychlost reaktivace AChE inhibované somanem byla stanovena po podání oximu HI-6. [Cabal, 4] Tento reaktivátor má také nejširší spektrum účinku ze všech doposud syntetizovaných reaktivátorů. Oxim HI-6 byl zaveden do antidotní výbavy AČR. Naopak otrava látkou VX, která vykazuje nejvyšší toxicitu vůči teplokrevným organismům, je z hlediska terapie zvladatelná nejlépe. [Prymula, 2]. Toxicita látky VX je dána především její vysokou stálostí v prostředí, nízkou těkavostí a dobrou rozpustností v tucích. Navíc organismy nemají vhodné detoxikační enzymy pro její odbourání. [Bajgar, 1991] Jako první NPL byl vyvinut tabun. Standardně uţívané reaktivátory AChE nejsou vůči této otravné látce dostatečně účinné. Důvodem slabého reaktivačního účinku se zdá být přítomnost volného elektronového páru lokalizovaného na amidickém dusíku, který je příčinou ztíţeného nukleofilního ataku oximů. HI-6 jako oxim s nejširším vyuţitím nedosahuje u tohoto typu intoxikace takové účinnosti jako třeba trimedoxim, obidoxim či nově syntetizovaný oxim K3. Jako účinné se jeví i další nové struktury, K27 a K48. [Kassa, 6] 21

22 Farmakokinetika Reaktivátory jsou podávány většinou ve formě solí (chloridy, bromidy, methylsulfonáty apod.) Typická je intramuskulární aplikace. Terapeutická dávka je účinná, pokud je aplikovaná v mnoţství pohybujícím se v miligramech na kilogram zasaţeného jedince (pralidoxim 15-3 mg/kg, max. 12g/24 hod., obidoxim 3 mg/kg, max. 75 mg/24 hod. [Ševela, 2]). Po podání oximu je sledováno několik farmakokinetických parametrů. Nečastěji to bývá hodnota maximální koncentrace (c max ), které v krvi nebo mozku reaktivátor dosáhne. Dále se sleduje čas (t max ), kdy tato maximální koncentrace nastane. Thompsom et al. [1987] navrhl systém podání pralidoximu pouţívaného při otravách OFI. Nejdříve je vhodné podat bolus. Poté se pokračuje v kontinuální infuzi, aby se dodrţovala hladinu pralidoximu v krvi větší 4 μg/ ml. Koncentrace odpovídající mnoţství 4 μg/ ml nebo vyšší je jiţ schopná prokazatelně reaktivovat AChE v organismu. Reaktivátory jsou látky nesoucí náboj, v jejich molekule je kvarterní dusík a po aplikaci dochází k vzniku oximátového anionu. Tato struktura zajišťuje účinnost oximu, ale zároveň zamezuje prostupu přes hematoencefalickou bariéru (HEB). Vylučování oximů probíhá z 99 % močí. [Sidell a Groff, 1971] Rychlost eliminace se u jednotlivých reaktivátorů liší. Například obidoxim se eliminuje dvakrát rychleji neţ trimedoxim. [Karasová Ţďárová, 1] 22

23 Mechanismus účinku reaktivátorů Poté, co je AChE zainhibována, mohou následovat tři odlišné děje: 1) Můţe docházet k spontánní defosforylaci a samovolné obnově funkce enzymu. 2) K navrácení funkčnosti dochází také po přidání reaktivátoru. K oximům mají organofosfáty vyšší afinitu neţ k AChE, coţ zaručuje vysoce nukleofilní oximová skupina. 3) V posledním případě dochází k tzv. stárnutí komplexu, při kterém probíhá dealkylace a tyto vzniklé sloučeniny jsou uţ nereaktivovatelné. Tento proces (aging) probíhá u různých NPL odlišnou rychlostí. Poločas dealkylace somanu je 5 min., sarinu 12 hod. a u VX je tato rychlost zanedbatelná. [Bajgar, 4] Efektivita reaktivace enzymu záleţí tedy na typu pouţité NPL a také na reaktivatelnosti inhibované AChE pouţitým oximem. Obr. č. 2: Proces reaktivace AChE oximy 23

24 3. METODIKA 3.1 Princip metody Ke stanovení inhibičního potenciálu jednotlivých reaktivátorů byla pouţita standardní Ellmanova metoda [Ellman, 1961] modifikovaná dle Bajgara. [Bajgar, 1972] Měření byla prováděna na spektrofotometru Helios Alpha (Electroncorporation, Velká Británie) při vlnové délce 412 nm. Při této vlnové délce lze nejlépe detekovat produkt reakce mezi 5,5 - dithiobis(2-nitrobenzoovou kyselinou) (DTNB) a acetylthiocholinem (ATCh). [Šinko, 7] Princip této reakce je následující. Substrát ATCh jodid je štěpen AChE na thiocholin a příslušnou kyselinu (kyselinu octovou). Thiocholin dále reaguje s DTNB, kde rozštěpí sulfidický můstek, sám se naváţe na jednu vzniklou SH- (thiolovou) skupinu. U druhé poloviny molekuly DTNB kyseliny 5-merkapto-2- nitrobenzoové dochází ke konjugaci dvojných vazeb. Tento produkt reakce je fotometricky stanovován. 1. Rozštěpení ATCh AChE S N O acetylthiocholin acetylcholinesteráza O O kyselina octová N S thiocholin 24

25 2. Rozštěpení S-S můstku a vazba thiocholinu na DTNB O 2 N NO 2 N thiocholin S HO O S S DTNB O OH O 2 N NO 2 HO O S S N S O OH 3. Konjugace dvojných vazeb kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoové NO 2 NO 2 S O OH S O OH Obr. č. 3: Princip Ellmanovy metody 25

26 3.2. Příprava základních roztoků Fosfátový pufr (,1 M, ph 7,6): směs připravená firmou Sigma Aldrich rozpuštěna dle doporučného postupu výrobce. ATChJ:,29 g bylo rozpuštěno v destilované vodě na objem 1ml. DTNB:,1 g bylo rozpuštěno v 5 ml fosfátového pufru (,1M ph 7,6). AChE: Do pufru se přidávala úhoří AChE. Měřila se aktivita roztoku AChE. Základní aktivita AChE byla upravena tak, aby objem uţitý v měření inhibičního potenciálu reaktivátorů (9 μl) odpovídal potřebám měření. Reaktivátory: připravena koncentrační řada od 1-1 do 1-8. Př. HI-6 :,377 g rozpuštěno v 1 ml fosfátového pufru (koncentrace 1-1 ). Z tohoto roztoku odpipetováno,1 ml a přidáno,9 ml pufru, tím byla získána koncentrace 1-2. Stejně se postupovalo až do koncentrace Postup měření inhibičního potenciálu reaktivátorů Do jednorázové plastové kyvety o objemu 1 ml bylo napipetováno 9 μl úhoří AChE. Po minutě bylo přidáno 1 μl reaktivátoru o zvolené koncentraci (od 1-1 do 1-8 ). Tato směs byla 1 minut inkubována při laboratorní teplotě (22 ± 2 C). Poté bylo přidáno μl DTNB, μl,1m fosfátového pufru o ph 7,6 a reakce byla odstartována přidáním 1 μl ATCh jako substrátu reakce. Celý obsah kyvety byl promíchán a kyveta byla ihned vloţena do spektrofotometru, kde byla změřena hodnota absorbance při standardní vlnové délce 412 nm. Oximy ve vyšších koncentracích jsou schopny štěpit vazby v DTNB a tudíţ můţe docházet k odečtu falešně pozitivních výsledků. Tento jev byl eliminován 26

27 změřením tzv. oximolýzy, kdy byla do kyvety místo úhoří AChE přidána destilovaná voda. [Jun, 8; Sakurada, 7] Byla měřena aktivita enzymu a oximolýza. Poté byla odečtena hodnota oximolýzy od hodnoty dříve naměřené aktivity enzymu po přidání příslušné koncentrace oximu. [Šinko, 6] Ke kaţdé koncentrační řadě reaktivátoru byl také připraven slepý vzorek, kde byl oxim nahrazen stejným objemem (1 μl) destilované vody. Byla tak změřena aktuální aktivita enzymu neovlivněného oximem. Takto získaná hodnota pak odpovídala 1 % aktivity enzymu Zpracování výsledků Do počítačového programu Prisma 4. byly zadány procentuální hodnoty odpovídající aktivitě enzymu po přidání jednotlivých koncentrací reaktivátorů AChE. Z těchto údajů byla vypočítána hodnota IC 5 v odpovídajícím časovém intervalu (1 min), coţ je, při které klesne aktivita enzymu na 5 % aktivity původní. Takto byla určena IC 5 u 28 strukturně rozdílných oximů. 27

28 procenta aktivity enzymu 4. VÝSLEDKY K zjištění inhibičního účinku jednotlivých oximů bylo nutné změřit změny v aktivitě enzymu AChE po přidání reaktivátorů v koncentracích od 1-1 do 1-8 mmol/l. Tyto hodnoty byly zpracovány do grafu a byla stanovena hodnota koncentrace reaktivátoru AChE odpovídající IC 5. Čím je hodnota tohoto čísla menší, tím větší má reaktivátor schopnost inhibovat AChE. Testované reaktivátory se lišily svojí strukturou. Největší strukturní vliv na jejich reaktivační potenciál má délka spojovacího řetězce, poloha a počet oximových skupin. Tyto strukturní závislosti byly v této práci zkoumány v souvislosti ovlivnění jejich inhibičního účinku vůči AChE. Tabulku č. 1 tvoří nejpočetnější skupinu reaktivátorů lišící se spojovacím řetězcem. Byly vybrány biskvarterní reaktivátory, jejichţ spojovací řetězec čítal od jednoho do dvanácti uhlíků. Tab. č. 1: Přehled vzorců bispyridinových reaktivátorů s uhlíkatým spojovacím řetězcem 1C- 12C a hodnoty jejich IC 5. K 154 (1C) 1 IC5 =,

29 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu K 191 (2C) 1 IC5 =, Trimedoxim 1 IC5 =, K 74 (4,4) 1 IC5 =,

30 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu K 35 (5C) 1 IC5 =, K 194 (6C) 1 IC5 =, K 39 (7C) 1 IC5 =,

31 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu K 197 (8 C) 1 IC5 =, K 31 (9C) 1 IC5 =, K 338 (1C) 1 IC5 =,

32 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu K 339 (11C) 1 IC5 =, K 3 (12C) 1 IC5 =, Potenciál inhibovat AChE postupně rostl od 1C spojovacího řetězce aţ po 1C. Nejvyšší inhibiční potenciál byl naměřen u reaktivátoru K 338, jehoţ řetězec obsahuje deset uhlíků. Od 11C spojovacího řetězce se začal inhibiční potenciál opět sniţovat. 32

33 procenta aktivity enzymu Graf č. 1: Srovnání trendů v hodnotách IC 5 u biskvarterních reaktivátorů se spojovacím řetězcem 1C-12C.. Další skupinu tvořily monokvarterní reaktivátory s rozdílným umístěním oximové skupiny v poloze ortho, meta či para na pyridinovém jádru. Hodnoty jejich inhibičního účinku jsou zaznamenány v tabulce č. 2. Nejvíce vzrostl inhibiční potenciál u reaktivátoru 3PAM, který má oximovou skupinu v poloze meta. Tab. č. 2: Přehled vzorců monopyridinových reaktivátorů s rozdílným umístěním oximové skupiny a hodnoty jejich IC 5. 2PAM 1 IC5 =,

34 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu 3PAM 1 IC5 =, PAM 1 IC5 =, Třetí skupinu (tabulka č.3) tvořily biskvarterní reaktivátory spojené tří uhlíkatým řetězcem a měnícími se v polohách oximových skupin. V této skupině se projevil největší vliv oximových skupin v poloze ortho na obou pyridinových jádrech. Nejvyšší inhibiční potenciál měl tady reaktivátor K 5. Další skupina se oproti minulé lišila délkou spojovacího řetězce. Ten není tří, ale čtyřuhlíkatý a opět je sledován vliv polohy oximových skupin na pyridinech. Stejně jako v předešlé skupině opět prokázal nejvyšší inhibiční potenciál oxim, který měl oximové skupiny alokované v polohách ortho, coţ byl reaktivátor K

35 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu Tab. č. 3: Přehled vzorců bispyridinových reaktivátorů s 3C spojovacím řetězcem, které mají rozdílné umístění oximových skupin a hodnoty jejich IC 5. K 5 (2,2) 1 N 2 Br N CH=NOH CH=NOH IC5 =, K 99 (3,3) 1 HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =, Trimedoxim 1 IC5 =,

36 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu K 7 (2,3) CH=NOH CH=NOH 1 N (CH 2 ) 3 N 2 Br IC5 =, K 8 (2,4) 1 CH=NOH 2 Br N (CH 2 ) 3 N CH=NOH IC5 =, K 9 (3,4) HON=HC 2 Br N (CH 2 ) 3 N CH=NOH 1 IC5 =,

37 procento aktivity enzymu procento aktivity enzymu procento aktivity enzymu Tab. č. 4: Přehled vzorců bispyridinových reaktivátorů s 4C spojovacím řetězcem, které mají rozdílné umístění oximových skupin a hodnoty jejich IC 5 K 33 (2,2) 1 N CH=NOH 2 Br N CH=NOH EC5 =, K 11 (3,3) 1 HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =, K 74 (4,4) 1 HON=HC N 2 Br N CH=NOH EC5 =, koncentrace reaktivátorů 37

38 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu Poslední skupinu shrnutou v tabulce č. 4 tvoří reaktivátory, u kterých byly změněny spojovací řetězce. V této skupině byl sledován vliv substituce kyslíkového atomu do spojovacího řetězce na inhibiční potenciál těchto látek. Došlo k výraznému navýšení inhibičního účinku u reaktivátorů AChE, které obsahovaly kyslík ve spojovacím řetězci. V tabulce jsou srovnávány dvě v praxi uţívané látky trimedoxim a obidoxim a dvě látky nově syntetizované. Tab. č. 5: Přehled vzorců trimedoximu, obidoximu, K74 a K75 a hodnoty jejich IC 5. Trimedoxim 1 IC5 =, Obidoxim 1 HON=HC N 2 Cl O N CH=NOH IC5 =,

39 procenta aktivity enzymu procenta aktivity enzymu K 74 (4,4) 1 HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =, K 75 1 HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =,

40 5. DISKUZE Léčba MG je individuální, vţdy upravena přímo dle potřeb jednotlivého pacienta. Nejčastěji v terapii uţívanou skupinou léčiv jsou v současnosti inhibitory AChE. Tyto látky zvyšují mnoţství, a tudíţ i dostupnost ACh na nervosvalové ploténce, tím zlepšují přenos signálu pro svalovou kontrakci. Dále se také pouţívají imunosupresiva. Mezi nejznámější patří azathioprin, mykofenolát, mofetil nebo cyklosporin. Také je doporučováno podání kortikosteroidů, a to i přesto, ţe mechanismus jejich účinku u MG není přesně znám. Je známo, ţe kortikoidy působí na imunitní systém, například sníţením produkce cytokinů. [Juel, 7] Z této skupiny léčiv je nejčastěji podáván prednison. V menší míře bývá vyuţívána výměna plazmy, intravenózní podání imunoglobulinů nebo tymektomie, ta především u pacientů se změněnou strukturou brzlíku. Ideální léčba MG v současnosti neexistuje. Pokud bude v budoucnu objevena, mělo by po podání dojít k eliminaci abnormální autoimunitní reakce bez jakéhokoliv negativního ovlivnění imunitního systému. [Sieb, 5] Inhibitory AChE jsou povaţovány pouze za symptomatickou terapii MG. Efektivní dávky těchto léčiv jsou schopny redukovat myastenické slabosti. Na druhou stranu se u nich projevují vedlejší účinky související se zvýšením muskarinové aktivity jako nauzea, zvracení, pocení a slinění. Díky menším neţádoucím účinkům pyridostigminu na gastrointestinální trakt je lépe snášen neţ neostigmin. [Juel, 7] V současnosti je na poli výzkumu patrná snaha o nalezení stejně působících léčiv, ale s výrazně menšími neţádoucími účinky. Hlavní podmínkou je, aby inhibitory AChE pouţívané k léčbě MG působily v periferním kompartmentu, nepřestupovaly přes HEB. Tuto podmínku u součastných léčiv zajišťuje kladný náboj v jejich struktuře. Naproti tomu inhibitory AChE s centrálním působením se podávají při terapii Alzheimerovy choroby. V této situaci je bezpodmínečně nutný prostup přes HEB. K součastným terapeutikům (rivasigmin, donepenezil a galantamin) byl nově zaveden memantin, inhibitor N-metyl-D-aspartát receptorů. Cílem výzkumu je najít substance, které budou sniţovat tvorbu patogenních proteinů beta-amyloidů, které další polymerací vytváří loţiska neurodegenerace, tzv. plaky. [Robles, 9] Třetí skupinu pouţití inhibitorů AChE tvoří organofosforové sloučeniny, které se uţívají v zemědělství jako pesticidy (paraoxon, parathion) či ve vojenství jako bojové

41 chemické látky, známé jako NPL. [Kuča, 6] Dále se s nimi můţeme v menší míře setkat v průmyslu, kde se těchto sloučenin vyuţívá jako změkčovadel. Terapie intoxikace po zasaţení OFI zahrnuje podávání anticholinergik jako antidotní terapie. [Bajgar, 1985] Dále jsou podávány kauzální antidota (reaktivátory), coţ jsou látky, které navracejí AChE její fyziologickou funkci. Oximy mají za úkol vyvázat inhibitor z aktivního místa AChE. V AČR se momentálně pro léčbu zasaţení NPL vyuţívá kombinace 2 mg atropinu s reaktivátorem obidoximem (2 mg). Tyto látky jsou obsaţené v autoinjektoru Combopenu. Další moţnou cestou aplikace je profylaktické podání reaktivátorů AChE transdermálně, tedy ve formě náplastí. V praxi pouţívanou náplastí je TRANSANT, jehoţ účinnou látku tvoří v současnosti nejširokospektřejší oxim HI-6. Tento způsob podání u oximů nevyuţívá ţádná jiná země na světě. Forma náplasti nám dovolí dosáhnout účinných hladin reaktivátoru v krvi ještě před intoxikací. K zlepšení profylaktické účinnosti dojde při současné aplikaci TRANSANTU s PANPALEM, coţ je profylaktická směs z pyridostigminu a dvou centrálně anticholinergně působících látek - benaktyzinu a trihexylfenidylu. [Vachek, 1993] Ve struktuře AChE se nacházejí dvě aktivní centra. Jedno z nich je označováno jako anionické centrum, zde dochází k vazbě kladně nabitých částí molekul, mezi něţ patří nativní substrát ACh. Stejným mechanismem se váţou také OFI, včetně NPL. Anionické centrum je tvořeno karboxylovou skupinou kyseliny glutamové. Druhé centrum se nazývá esteratické. Dochází zde ke kovalentní vazbě substrátu nebo inhibitorů na OH-skupinu serinu. Pokud dojde k vazbě inhibitorů vznikají více či méně stabilní konjugáty. Hlavní terapeutickou funkcí reaktivátorů oximového typu je rozštěpit tuto vznikající vazbu dříve neţ dojde k tzv. zestárnutí (neţ dojde k dealkylaci ve struktuře inhibitoru a vzniku ireverzibilní kovalentní vazby). K tomu, aby oxim působil přímo v aktivním místě AchE, je nutná přítomnost oximové skupiny ve struktuře reaktivátoru AChE. Oximová skupina se při fyziologickém ph lidské krve disociuje na nukleofilní oximátový anion, a tím získává potřebnou afinitu k vznikající vazbě v komplexu enzym-inhibitor. Je tudíţ zřejmé, ţe správnou funkci reaktivačního procesu velmi výrazně ovlivňuje struktura podaného reaktivátoru. Reaktivační účinnost tedy závisí na přítomnosti kladného náboje v molekule. Další podmínkou je alespoň jedna oximová skupina. Navíc i poloha těchto (této) skupin(y) ovlivňuje reaktivační účinnost. U biskvarterních reaktivátorů tato účinnost závisí také na délce a tvaru spojovacího řetězce. 41

42 Právě díky přítomnosti kladného náboje (kvartérního dusíku) a náboje na vznikajícím oximátovém anionu a také celkové hydrofilitě molekuly oximů velmi omezeně prostupují přes HEB jejich koncentrace v mozku dosahuje pouze kolem 4-1 % plazmatické hladiny. [Lokre, 7] Tyto hodnoty v mozku však byly naměřeny po podání neterapeutických dávek. Kdyţ se zkoumaly hodnoty prostupu reaktivátorů přes HEB při podání terapeutických dávek, u jediného obidoximu byly naměřeny hodnoty v mozku o něco málo vyšší neţ 1 % koncentrace v plazmě. [Ţďárová Karasová, 1] Prostup kvarterních reaktivátorů AChE přes HEB není v souladu s jejich vypočítanými logp. [Kalász, 9] Jejich přechod přes HEB můţe být vysvětlen aktivací transportních systémů inkorporovaných do HEB. [Lokre, 7] Jedním z prvních oximů, u kterého byly testovány farmakokinetické parametry (i prostup přes HEB), byl pralidoxim. Následovaly biskvarterní reaktivátory. Bylo zjištěno, ţe monokvartérní reaktivátory přes HEB prostupují více neţ biskvarterní. Vysvětlením lepší penetrace můţe být jejich niţší molekulová hmotnost a pouze jeden kvartérní dusík v jejich molekule. [Lokre, 7] U bispyridinových reaktivátorů znesnadňuje prostup skrz HEB jejich řetězec spojující pyridinové kruhy. Zvyšuje ionizaci molekul reaktivátorů AChE a proto je sníţena schopnost penetrace přes HEB. [Kassa, 5] Dále se zdá, ţe penetraci ovlivňuje poloha a typ substituentů na pyridinovém jádře. Z výsledků získaných přímým stanovením koncentrace oximů v mozku, které byly podány v terapeutických dávkách, lze odvodit závěr, ţe biskvarterní reaktivátory AChE nedosahují v mozku minimálních terapeuticky účinných koncentrací. [Karasová Ţďárová, 1] Testováním účinku reaktivátorů vůči AChE bylo zjištěno, ţe oximy, jejichţ primárním úkolem je obnovovat funkci inhibované AChE, mají schopnost tento enzym i inhibovat. Struktura reaktivátoru tedy ovlivňuje jak reaktivační [Gray, 1984], tak i inhibiční účinek těchto látek. Hlavní cílem této studie bylo stanovit inhibiční potenciál reaktivátorů AChE a hledat strukturální závislosti, které vedou k zvyšování toho efektu vůči AChE. První skupinu testovaných reaktivátorů tvořily bispyridinové oximy (obě oximové skupiny v polohách para na pyridinech), které se lišily délkou uhlíkatého spojovacího řetězce. Sloučeniny s řetězcem do tří uhlíků mají minimální inhibiční potenciál. K sníţení aktivity úhoří AChE na 5 % je zapotřebí dosáhnout ve směsi koncentrace 1-1 mmol/l oximu, coţ je koncentrace v organismu reálně nedosaţitelná. 42

43 S rostoucím počtem uhlíků ve spojovacím řetězci roste i schopnost inhibovat tento enzym. Maxima inhibičního účinku je dosaţeno u řetězce dlouhého deset uhlíků, kde je aktivita enzymu sníţena při koncentraci reaktivátoru AChE odpovídající řádově 1-4. Této koncentrace jiţ můţe být reálně v organismu dosaţeno při podání dávek vyšších neţ terapeutických. [Karasová, 1] Pokud dojde k dalšímu prodluţování řetězce, mění se působení těchto látek na AChE - schopnost inhibovat tento enzym roste a zároveň dochází k poklesu reaktivační účinnosti. Proto mají reaktivátory, pouţívané v mnoho státech jako antidota při intoxikaci OFI, převáţně krátký spojovací řetězec (C 3 -C 4 ). Inhibiční účinek reaktivátorů vychází se samotné podstaty jejich reaktivačního účinku. Aby se tato léčiva mohla dostat do kavity enzymu a vyvázat inhibitor, musí sama vykazovat afinitu k tomuto aktivnímu místu. Na anionickém centru AChE se za běţných podmínek navazuje kladně nabitý kvarterní dusík nativního substrátu ACh. Pro správnou funkci reaktivátoru je vhodné zachovat, co nejpodobnější rozměry molekuly jako u ACh. Proto nejúčinnější reaktivátory obsahují kladný náboj a jejich spojovací řetězec má 3-4 uhlíky, coţ odpovídá délce spojující kationtovou část s esterovou skupinou ACh. Reaktivátory AChE na rozdíl od OFI nevytvářejí s AChE kovalentní vazbu. Jsou to tzv. reverzibilní inhibitory AChE. Protoţe reaktivátory s tří nebo čtyřuhlíkatým řetězcem jsou pouţívány jako kauzální antidota při otravě OFI, byl u nich podrobněji sledován vliv polohy oximových skupin na pyridinových jádrech na inhibiční účinek oximů vůči AChE. Nejvyššího inhibičního potenciálu dosáhl reaktivátor, který měl navázány oximové skupiny v poloze 2,2 a to jak u tří (IC 5 =,422) tak u čtyřuhlíkatého (IC 5 =,16) řetězce. Další změny v inhibiční účinnosti byly pozorovány u monokvarterních reaktivátorů, kde byla opět měněna poloha oximové skupiny na pyridinovém jádře. U tohoto typu oximů byla zaznamenána nejvyšší schopnost inhibice úhoří AChE u reaktivátoru s oximovou skupinou v poloze 3. Nebyl zde patrný velký rozdíl mezi jednotlivými polohami. Všechny koncentrace oximů odpovídající IC 5 se pohybovaly v řádu 1-2. Poslední skupina oximů byla nejvíce strukturálně různorodá. Opět byly pouţity biskvartérní reaktivátory AChE s tří neb čtyřuhlíkatým spojovacím řetězcem. V těchto řetězcích byl jeden z uhlíků substituován jiným atomem (kyslíkem), popřípadě byla zaměněna jednoduchá vazba za dvojnou. Kolem dvojné vazby není moţná rotace jako kolem vazby jednoduché, řetězec neumoţňuje tak flexibilní prostorovou orientaci pyridinového kruhu ve štěrbině anionického místa AChE. Dvojná vazba je také oproti 43

44 vazbě jednoduché kratší. Substituce kyslíku za jeden z uhlíků ve spojovacím řetězci vedla k sníţení koncentrace oximu, při níţ je stanovena hodnota IC 5 z původních 5 x 1-2 na 3 x 1-2. Zavedení dvojné vazby do řetězce zapříčinilo sníţení inhibiční schopnosti, nicméně toto sníţení nevedlo k posunům v řádech u hodnot IC 5. Cílem této práce bylo zjistit, jestli reaktivátory AChE mají nějaký inhibiční potenciál a jaký vliv na to má jejich struktura. Z výsledků vyplývá, ţe délka i tvar spojovacího řetězce a také poloha oximových skupin mají vliv na schopnost těchto látek inhibovat AChE. Pravděpodobně je zvýšení či sníţení inhibičního potenciálu oximů, stejně jako je tomu při změnách v reaktivační účinnosti, způsobeno změnou v interakcích volných elektronových párů. [Kuča, 6] V průběhu této studie byly odhaleny strukturní závislosti, které mohou dále slouţit jako zásadní poznatky pro syntézu nových inhibitorů, které nebudou prostupovat přes HEB a jejich inhibiční schopnost bude vyšší neţ u standardně zavedených léčiv. Se sníţením schopnosti těchto látek prostupovat přes HEB by mohlo dojít k sníţení mnoţství neţádoucích účinků. Tyto nově navrhnuté struktury reverzibilních inhibitorů mohou být také vyuţity k profylaxi otrav NPL, terapii MG a případně také v anestetické praxi k zvratu působení podaných myorelaxancií na nervosvalové ploténce. [Brufani, 1997] 44

45 ZÁVĚR Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda mají reaktivátory AChE, pouţívané jako kauzální antidota při intoxikaci OFI, samy schopnost inhibovat AChE a jakou roli hraje struktura reaktivátoru na inhibiční potenciál těchto látek. Vše bylo testováno in vitro. Největší vliv na reaktivační potenciál oximů má délka spojovacího řetězce, poloha a počet oximových skupin a substituce ve spojovacím řetězci. Proto byly testovány reaktivátory, které se lišily ve všech těchto strukturálních parametrech. Byly testovány oximy s rozdílnou délkou spojovacího řetězce (jeden aţ dvanáct uhlíků). Dále byly stanoveny inhibiční schopnosti biskvarterních oximů, které byly spojeny tří a nebo čtyřuhlíkatým řetězcem a jejichţ oximové skupiny se nacházely v různých polohách na pyridinovém jádře. Nakonec byl stanoven inhibiční potenciál u látek, jejichţ spojovací řetězec byl substituován kyslíkem, či byla nahrazena vazba jednoduchá vazbou dvojnou, přičemţ zbytek molekuly reaktivátoru byl totoţný. Námi zjištěné výsledky prokázaly nárůst inhibice postupně od látek s jedním uhlíkem ve spojovacím řetězci aţ po spojovací řetězec obsahující deset uhlíků. Tento reaktivátor (K 338) měl nejvyšší inhibiční potenciál ze všech námi sledovaných struktur. Reaktivátory s delším spojovacím řetězcem neţ deset uhlíků uţ měly potenciál inhibovat AChE niţší. Díky dalšímu sledovanému parametru, poloze oximových skupin na pyridinovém jádře, bylo zjištěno, ţe inhibici AChE zvyšují polohy ortho a polohy para ji sniţují. Substituce kyslíku ve spojovacím řetězci vedla ke zvýšení inhibičního potenciálu reaktivátorů AChE. Zavedení dvojné vazby do spojovacího řetězce naopak sniţovalo inhibiční potenciál. 45

46 SEZNAM ZKRATEK ACh acetylcholin AChE..acetylcholinesterasa AChR.acetylcholinový receptor AČR Armáda České Republiky ATChJ acetylthiocholin jodid BOL bojové otravné látky CNS.centrální nervový systém DTNB..dithionitrobenzoová kyselina FVZ.Fakulta vojenského zdravotnictví HEB.hematoencefalická bariéra ChE.cholinesterasa IC 5..inhibiční koncentrace IgG...imunoglobulin G MG...myasthenia gravis MuSK...svalově specifická kinasa nachr.nikotinové acetylcholinové receptory NPL..nervově paralytické látky OFI..organofosforové inhibitory 46