PŘÍPRAVA A IN VITRO TESTOVÁNÍ INHIBITORŮ ACETYLCHOLINESTERASY PYRIDINIOVÉHO TYPU

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV PŘÍPRAVA A IN VITRO TESTOVÁNÍ INHIBITORŮ ACETYLCHOLINESTERASY PYRIDINIOVÉHO TYPU DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor: Anna Kopečková Školitel: prof. PharmDr. Martin Doleţal, Ph.D. Školitel specialista: doc. PharmDr. Kamil Musílek, Ph.D. Ak. rok: 2011/12

2 Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu. Diplomová práce vznikla za podpory grantu SVV Ministerstva školství, mládeţe a tělovýchovy ČR. V Hradci Králové dne Anna Kopečková 2

3 Tímto chci poděkovat doc. PharmDr. Kamilu Musílkovi, Ph.D. a prof. PharmDr. Martinu Doleţalovi, Ph.D. za jejich pomoc a rady při zpracování této práce. Díky patří také Mgr. Ondřeji Benkovi a celému kolektivu laboratoře za jejich ochotu a skvělou pracovní atmosféru. 3

4 Obsah 1 Abstrakt Úvod Seznam zkratek Teoretická část Acetylcholin Cholinergní receptory Nikotinové receptory Muskarinové receptory Cholinesterasy Butyrylcholinesterasa Acetylcholinesterasa Hydrolýza acetylcholinu Inhibice acetylcholinesterasy Rozdělení inhibitorů Mechanismus inhibice Reverzibilní karbamátové inhibitory Další reverzibilní inhibitory Irreverzibilní inhibitory Nervově paralytické látky Rozdělení NPL Otrava NPL Terapie otravy Profylaxe intoxikace NPL Reverzibilní inhibitory AChE Experimentální část Syntetická část Obecná část Postup syntézy In vitro stanovení inhibičních paramentrů Princip Ellnamovy metody Postup měření

5 5.2.3 Výsledky měření Diskuse Závěr Pouţitá literatura

6 1 Abstrakt Název: Syntéza a in vitro testování inhibitorů acetylcholinesterasy pyridiniového typu. Autor: Anna Kopečková Nervově paralytické látky jsou extrémně toxické sloučeniny. Jako profylaktika otrav těmito látkami se v AČR pouţívají reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy (AChE). Cílem práce bylo nasyntetizovat nové potenciální inhibitory a jejich aktivitu ověřit in vitro. Navrţené sloučeniny měly asymetrickou biskvarterní molekulu. Jejich struktura vycházela z molekul isochinolinu a 4-benzylpyridinu spojených variabilními alkylenovými spojovacími řetězci. (5 12 členů). Syntéza probíhala ve dvou krocích. Reakce prvního i druhého kroku probíhaly při 70 C v prostředí acetonitrilu. Sloučeniny byly poté přečištěny a jejich totoţnost potvrzena NMR spektry, hmotnostní spektrometrií a elementární analýzou. Pro stanovení inhibičních potenciálů byla pouţita Ellmanova metoda. Bylo nasyntetizováno 8 sloučenin. Všechny sloučeniny vykázaly měřitelný inhibiční potenciál (hodnoty IC mol/l). Nejsilnějšími inhibitory se ukázaly sloučeniny s heptylenovým a decylenovým spojovacím řetězcem (IC 50 0,05 µm). Selektivita vůči AChE klesala s rostoucím spojovacím řetězcem. 6

7 Title: Synthesis and in vitro evaluation of pyridinium type acetylcholinesterase inhibitors Author: Anna Kopečková Nerve agents are extremely toxic substances. As prophylactics against these compounds, reversible acetylcholinesterase (AChE) inhibitors are used in the Czech Army. The goal of the thesis was to synthesise new potential inhibitors and evaluate their in vitro inhibition activity. The compounds were designed as asymmetrical bisquaternary molecules. Their structure was derived from isochinoline and 4-benzylpyridine; these two molecules were connected with variable connecting linkages (5 12 carbons). The synthesis involved two steps. Reactions of both steps took place in acetonitrile at 70 C. Afterwards, the compounds were purified and their identity was confirmed with NMR-analysis, mass spectrometry and elementary analysis. The Ellman's method was used for the inhibitory potential evaluation. Eight compounds were succesfully prepared. All of them showed promising inhibitory potential (IC 50 values mol/l). The stronges inhibitors were compounds bearing heptylenic and decylenic connecting linkage (IC 50 0,05 µm). The selecitivity towards AChE decreased with prolonging connecting linkage. 7

8 2 Úvod Organické sloučeniny fosforu jsou široce vyuţívané sloučeniny. První byly syntetizovány v 19. století ve Francii. Původně měly slouţit jako insekticidy v zemědělství. Další sloučeniny toho typu byly syntetizovány i v průběhu 20. století. Jelikoţ se jedná o sloučeniny vysoce toxické, našly uplatnění i jako bojové otravné látky. Postupně se pro ně vţil název nervově paralytické látky (NPL) [1]. Jejich syntéza je relativně snadná, proto mohou organofosfáty představovat bezpečnostní riziko. Poměrně častá je i náhodná otrava při jejich pouţívání v zemědělství. NPL působí na organismus mechanismem ireverzibilní inhibice enzymu acetylcholinesterasy (AChE). V důsledku toho dochází k hromadění acetylcholinu na synapsích. Léčba spočívá v podání anticholinergik, antikonvulziv a reaktivátorů AChE [2]. Jediné schválené profylaktikum proti otravě organofosfáty v České Republice je pyridostigmin-bromid. Patří mezi reverzibilní karbamátové inhibitory AChE. V případě expozice NPL pak komplex pyridostigmin-ache slouţí jako zdroj aktivního enzymu. Ve své struktuře má pyridostigmin kvarterní dusík, proto neproniká přes hematoencefalickou bariéru. Z toho důvodu je preventivně podáván v kombinaci s centrálně působícími anticholinergiky. Má však celou řadu neţádoucích účinků [3]. Cílem této práce byla syntéza nových kvarterních inhibitorů AChE jako moţné náhrady pyridostigminu. Jejich aktivita byla testována in vitro. Součástí práce je literární rešerše zaměřená na tuto problematiku. 8

9 3 Seznam zkratek AD ACh AChE Asp BChE BuOH CNS DTNB EtOAc Glu HEB His IAChE IMS machr MeCN nachr NPL OP PAS Phe Ser TNB Trp Alzheimerova nemoc acetylcholin acetylcholinesterasa asparagin butyrylcholinesterasa butanol centrální nervová soustava 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina ethyl-acetát glutamin hematoencefalická bariéra histidin inhibitor acetylcholinesterasy intermediární syndrom muskarinový receptor pro acetylcholin acetonitril nikotinový receptor pro acetylcholin nervově paralytická látka organofosforová sloučenina periferní anionické místo, peripherial anionic site fenylalanin serin 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina tryptofan 9

10 4 Teoretická část 4.1 Acetylcholin Acetylcholin (ACh, Obr. 1) je jeden z nejhojnějších neurotransmiterů. Vyskytuje se v zakončeních pregangliových vláken sympatiku i parasympatiku, postgangliových vláken parasympatiku, somatických motorických vláken inervujících příčně pruhované svaly a zajišťuje uvolňování adrenalinu z dřeně nadledvin [4]. Dále má acetylcholin významnou roli v CNS, kde se podílí na procesu učení a paměti. Poruchy cholinergní neurotransmise jsou pak spojovány se vnikem Alzheimerovy nemoci, epilepsie, schizofrenie, autismu a různých typů závislostí [5]. Kromě toho je rozšířen i v řadě buněk mimo nervový systém. Jeho výskyt je potvrzen v epiteliích (dýchacího systému, trávicího traktu, epidermis), mesoteliálních, endoteliálních, gliových a cirkulujících krevních buňkách (destičkách, mononukleárech). V nich se účastní regulace důleţitých buněčných funkcí, jako je mitóza, lokomoce, ciliární aktivita nebo mezibuněčný kontakt [6]. Obrázek 1 Struktura acetylcholin-chloridu ACh je syntetizován v plazmě cholinergních neuronů z bazického alkoholu cholinu a acetyl-coa (acetyl-koenzym A) pomocí enzymu cholinacetyltransferasa. Takto syntetizovaný ACh je skladován ve vezikulách nervových zakončení, ze kterých je uvolněn do synaptické štěrbiny na základě vzestupu intracelulární koncentrace iontů kalcia po příchodu vzruchu [4]. Volný ACh se váţe na příslušné receptory postsynaptické membrány, dále pak i na receptory presynaptické (autoreceptory), pomocí kterých se reguluje mnoţství uvolněného neurotransmiteru [4]. Působení ACh je rychle ukončeno hydrolýzou enzymem acetylcholinesterasou (AChE). 10

11 4.1.1 Cholinergní receptory Rozlišujeme dva základní typy cholinergních receptorů: nikotinové (nachr) a muskarinové (machr). Jejich název je odvozen od jejich agonistů, přírodních alkaloidů nikotinu a muskarinu [7] Nikotinové receptory nachr patří do skupiny ligandem řízených iontových kanálů. Jsou to transmembránové proteiny, které jsou tvořeny pěti podjednotkami: dvěma α, jednou β, δ a γ nebo ε, které jsou uspořádány symetricky kolem osy kolmé k povrchu membrány [8]. Vzniklý pentamer ohraničuje pór, který je specificky propustný pro sodné, draselné a vápenaté ionty [9]. nachr mohou existovat v několika konformačních stavech: klidový (uzavřený), aktivní (otevřený) a desenzitizovaný (uzavřený). Ty mezi sebou mohou volně přecházet. Po navázání ligandů, agonistů nebo kompetitivních antagonistů, ale také alosterických efektorů dochází ke změně rovnováhy mezi jednotlivými konformacemi. Po navázání ACh tak dojde k otevření kanálu. Vazebné místo pro ACh se nachází na extracelulární části α domén [8] Kategorizace nikotinových receptorů V lidském těle můţeme rozlišit dva podtypy nikotinových receptorů: neuronální a muskulární [4].Ty se liší svou lokalizací a strukturou. Muskulární nachr zajišťují přenos vzruchu na nervosvalové ploténce. Skládají se z podjednotek α 1, β 1, γ, δ a ε [8]. Neuronální nachr se nacházejí v CNS a na postsynaptické membráně ve vegetativních gangliích. Jsou tvořeny různými podjednotkami α a β s odlišnými farmakologickými a biofyzikálními vlastnostmi. Jejich exprese se mění v průběhu ţivota a je dávána do souvislosti se vznikem řady nemocí jako je Alzheimerova demence nebo schizofrenie [10]. 11

12 4.1.3 Muskarinové receptory Muskarinové receptory patří do skupiny receptorů spřaţených s G-proteinem. Jsou tvořeny sedmi transmembránovými doménami Kategorizace muskarinových receptorů U savců bylo identifikováno pět machr podtypů (M 1 M 5 ), z nichţ kaţdý je výsledkem exprese jiného genu. Aktivace receptorů M 1, M 3 a M 5 má účinky excitační, receptorů M 2 a M 4 pak inhibiční [11]. machr se vyskytují jak v CNS, tak na periferii. V CNS jsou zastoupeny hlavně receptory M 1. Ty byly dále nalezeny i v parietálních buňkách ţaludku. Jejich aktivace vede ke stimulaci CNS a zvýšení sekrece kyseliny chlorovodíkové. Receptory M 2 se vyskytují hlavně v srdeční svalovině, kde mají inhibiční účinek. Sniţují sílu stahu a zpomalují srdeční frekvenci. Dále způsobují presynaptickou inhibici v centrálním i periferním nervovém systému. M 3 receptory se vyskytují v exokrinních ţlázách a hladké svalovině. Jejich aktivace zvyšuje svalový tonus a sekreci ţláz. V cévách naopak způsobují svalovou relaxaci, a tím i vasodilataci. Význam receptorů M 4 a M 5 zatím není dostatečně prozkoumán [4],[12]. 12

13 4.2 Cholinesterasy Cholinesterasy jsou skupinou enzymů patřící do rodiny esteras. Jsou to, stejně jako jiné proteasy, serinové hydrolasy. Je pro ně charakteristická zvýšená afinita k esterům cholinu, které za optimálních podmínek hydrolyzují rychleji neţ jiné esterasy. V lidském těle se nacházejí dva typy cholinesterasy. Prvním je acetylcholinesterasa (AChE, EC ), která přednostně štěpí menší molekuly, jako jsou estery kyseliny octové. Druhý typ hydrolyzuje i větší molekuly a je tedy méně substrátově specifický. Nazývá se butyrylcholinesterasa (BChE, EC ) [13] Butyrylcholinesterasa BChE, nazývaná téţ pseudocholinesterasa či nespecifická esterasa, hydrolyzuje butyrylcholin čtyřikrát rychleji neţ acetylcholin. Přednostně rozkládá i další substráty, např.: kokain nebo lokální anestetika [14]. V lidském těle se nachází v plazmě, játrech, plicích, srdci a mozku [15]. Přesná funkce BChE zatím není známá. Doposud bylo objeveno, ţe můţe slouţit jako scavenger toxických molekul (např. heroinu) [16], podílí se na metabolismu lipoproteinů [17] a hraje roli při vzniku amyloidového prekurzorového proteinu. Navíc se její aktivita zvyšuje s věkem a u pacientů s Alzheimerovou nemocí, zatímco aktvivita AChE zůstává nezměněna. Toto dělá z BChE potenciální cíl pro léčbu AD [18]. BChE můţe být inhibována organofosforovými sloučeninami (OP). Úbytek její aktivity, tak můţe slouţit jako indikátor otravy OP. Exogenně podaná BChE je testována jako jedna z moţností profylaxe otravy OP [19] Acetylcholinesterasa Acetylcholinesterasa je membránově vázaný enzym, který hraje významnou roli v cholinergním přenosu. Štěpí neurotransmiter acetylcholin na centrálních i periferních cholinergních synapsích. V nadbytku se vyskytuje i v jiných tkáních a orgánech v plicích, erytrocytech či bránici. Její hlavní funkcí je rychlé ukončení účinku ACh [20]. 13

14 Struktura AChE AchE je, stejně jako řada dalších enzymů, glykoprotein. Její molekulová hmotnost činí přibliţně Skládá se ze 12 β-skládaných listů obklopených 14 α-helixy. Její podrobná struktura je v dnešní době jiţ docela dobře prozkoumaná. Nejnápadnější je hluboká a úzká štěrbina vedoucí k aktivnímu místu, která je obklopena 14 aromatickými zbytky. Štěrbina proniká více jak do poloviny enzymu a při svém základu se rozšiřuje [21] Aktivní místo Aktivní místo je uloţeno na dně aromatické štěrbiny. Skládá se ze dvou podjednotek, esteratické a anionické. Esteratická podjednotka obsahuje tzv. katalytickou triádu, sloţenou ze tří aminokyselin, histidinu (His440), glutaminu (Glu327) a serinu (Ser200). Tyto tři zbytky tvoří planární pole, které připomíná katalytické triády jiných serinových proteas. Anionickou podjednotku tvoří tryptofan (Trp84) a dvě molekuly fenylalaninu (Phe330, Phe331). Aromatický zbytek tryptofanu interaguje s kladně nabitou částí molekuly substrátu, a tím zajišťuje její správnou orientaci [21] Vnější anionické místo Při ústí prohlubně, ve které je uloţeno aktivní místo, se nachází vnější anionické místo (peripherial anionic site, PAS). To se podílí na upevnění substrátu uvnitř štěrbiny. Jeho hlavní fyziologickou rolí je urychlení hydrolýzy acetylcholinu při malých koncentracích substrátu. Nejdůleţitější aminokyseliny jsou asparagin (Asp74) a tryptofan (Trp289). Dále se předpokládá, ţe působí jako stabilizátor enzymu. Při nadbytku substrátu, dojde k jeho navázání na PAS a tím ke změně konformace enzymu a sníţení katalytické aktivity [22] Hydrolýza acetylcholinu Hydrolýza acetylcholinu probíhá ve dvou na sebe navazujících krocích. Nejprve dojde k napadení karbonylové skupiny ACh hydroxylovou skupinou serinu aktivního místa. Tím dojde k tvorbě dočasné kovalentní vazby mezi substrátem a enzymem. Celá reakce je podpořena imidazolovým dusíkem histidinu, který s OH-skupinou serinu vytváří vodíkový můstek. Následuje odštěpení cholinu, který je kotransportem s Na + ionty přijímán zpět do presynaptických nervových 14

15 zakončení, kde slouţí k syntéze nových molekul acetylcholinu. Acetylovaný enzym podléhá rychlé spontánní hydrolýze, čímţ dojde ke vzniku kyseliny octové a uvolnění aktivního místa [23]. (Schéma 1) Schéma 1 Hydrolýza acetylcholinu. 15

16 4.3 Inhibice acetylcholinesterasy Inhibitory způsobují sníţení aktivity AChE. Tím dochází k hromadění ACh na všech cholinergních nervových zakončeních, tj. ve vegetativních gangliích, na nervosvalové ploténce i na efektorech parasympatiku. Výsledný efekt je nepřímo cholinomimetický. Inhibice AChE je významná jak z terapeutického, tak toxikologického pohledu [4] Rozdělení inhibitorů Inhibitory AChE (IAChE) lze dělit z různých hledisek. Podle chemické struktury rozlišujeme 3 typy inhibitorů: Alkoholy s kvarterním dusíkem Estery kyseliny karbamové karbamáty Estery kyseliny fosforečné a fosfonové ogranofosfáfy Další kritérium dělení mohou představovat fyzikálně-chemické vlastnosti: Sloučeniny s kvarterním dusíkem mají kladný náboj, díky němuţ nemohou pronikat přes hematoencefalickou bariéru (HEB), a mají tak jen účinky periferní. Sloučeniny s terciárním dusíkem naopak přes HEB prostupují a vykazují tak účinky i centrální. Nejdůleţitější klasifikace je podle délky enzymatické inhibice, tedy doby, po kterou je enzym vyřazen ze své funkce. Trvání inhibice závisí na chemické struktuře IAChE, na tom, jaký typ vazeb s AChE tvoří. Dle toho hlediska rozlišujeme: Reversibilní inhibitory AChE hydrolýza trvá 0,5 6 hodin Irreversibilní inhibitory AChE hydrolýza trvá aţ stovky hodin [24]. 16

17 4.3.2 Mechanismus inhibice IAChE mohou regovat jak s anionickou či esteratickou podjednotkou aktivního místa (kompetitivní inhibitory) tak s periferním anionickým místem (nekompetitivní inhibitory). Princip účinku je podobný. Karbamáty a organofosfáty vytvářejí s enzymem kovalentní vazbu. Reverzibilita tohoto procesu závisí na hydrolyzovatelnosti vazby [4]. Karbamáty jsou stejně jako ACh degradovány dvoustupňovou hydrolýzou, protoţe jsou substrátem AChE. Jejich kovalentní vazba k enzymu je však stabilnější a dekarbamoylace probíhá podstatně pomaleji neţ deacetylace. Doba potřebná k obnovení aktivity enzymu je od 30 minut do 6 hodin a odvíjí se od konkrétní struktury jejich molekuly [25]. Cílem inhibice u organofosfátů je, na rozdíl od ostatních inhibitorů, esteratická podjednotka aktivního místa. Vazba, kterou tvoří se serinovým hydroxylem, je obzvláště stabilní. Hydrolyzuje buď velmi pomalu (v řádu stovek hodin), nebo vůbec. Organofosfáty jsou navíc málo specifické a v organismu reagují i s dalšími serinovými hydrolasami [26]. Existují i sloučeniny, které se na molekulu AChE váţou nekovalentní vazbou. Cílem je anionická podjednotka aktivního místa nebo periferní anionické místo. Např.: edrofonium tvoří s anionickým místem iontovou vazbu, která je reverzibilní (Obr. 2) [27]. Obrázek 2 Edrofonium-chlorid. 17

18 4.3.3 Reverzibilní karbamátové inhibitory Karbamátové inhibitory jsou strukturní obdobou acetylcholinu. Chemicky jsou to estery kyseliny karbamové obsahující ve své molekule terciární nebo kvarterní dusík. Mezi tyto sloučeniny řadíme např. pyridostigmin-bromid, neostigminbromid či fysostigmin (Obr. 3). Obrázek 3 Karbamátové inhibitory. Karbamáty mají mnoho způsobů vyuţití. V zemědělství slouţí jako insekticidy. Široké uplatnění nalezly téţ v medicíně. Lékařská věda se zaměřuje na jejich cholinomimetické vlastnosti. Účinky na organismus vyplývají z hromadění ACh na jednotlivých typech receptorů. Zvláště výrazná je aktivace machr. Dochází ke zpomalení tepové frekvence a tím ke sníţení srdečního výdeje. V zaţívacím a urogenitálním traktu je zvýšen tonus hladkého svalstva, zároveň stoupá exkrece exokrinních ţláz. V oku je navozena mióza [4]. Terapeuticky se karbamáty vyuţívají k léčbě pooperačních atonií gastrointestinálního traktu, atonií urogenitálního traktu či sníţení nitroočního tlaku při glaukomu [4]. Dále pak k léčbě autoimunitní choroby Myasthenia gravis. K výše vyjmenovaným indikacím se s výhodou pouţívají sloučeniny obsahující ve své molekule kvarterní dusík. Takto nabité molekuly pak téměř neprochází přes HEB a tím ušetří pacienta neţádoucích centrálních účinků [28]. 18

19 Karbamáty obsahující ve své molekule terciární dusík jsou pak pro svoje centrální účinky vyuţívány k symptomatické léčbě Alzheimerovy nemoci [29], [30]. Jedno z dalších vyuţití reverzibilních inhibitorů spočívá v profylaxi před otravou organofosfáty [31] Další reverzibilní inhibitory Jak jiţ bylo zmíněno výše (viz kap ) existují i reverzibilní inhibitory, které se váţí na molekulu AChE nekovalentní vazbou. Jsou to sloučeniny rozmanité struktury, které se v dnešní době vyuţívají především k terapii Alzheimerovy nemoci. V praxi jsou z této skupiny zavedeny donepezil a galantamin (Obr. 4) [32]. Obrázek 5 Další inhibitory AChE 19

20 4.3.5 Irreverzibilní inhibitory Do velké skupiny ireverzibilních inhibitorů acetylcholinesterasy patří některé organické sloučeniny fosforu, tzv. organofosfáty. Tyto sloučeniny byly původně syntetizovány jako insekticidy pro zemědělské účely (např. paraoxon nebo parathion, Obr. 6) Během druhé světové války se nově vyvinuté organofosfáty začaly pro svou vysokou toxicitu označovat jako nervově paralytické látky (např.: soman, sarin, tabun, látka VX a další). Pro snadnou syntézu, dostupnost výchozích látek a poměrně jednoduchý způsob pouţití jsou tyto sloučeniny hrozbou i v současnosti, a to hlavně v souvislosti s činností teroristických skupin. Jsou tedy významné hlavně toxikologicky [1]. Obrázek 6 Organofosforové insekticidy Struktura organofosforových inhibitorů Organofosfáty jsou deriváty kyseliny fosforečné, fosfonové či jejich thioanaloga. Jejich struktura je popsána obecným Schraderovým vzorcem (Obr. 7) pro organofosforové sloučeniny. Zbytky R 1 a R 2 bývají vodík, alkyl, cykloalkyl, aryl, alkyloxy, alkylthio a amino skupiny. Substituent X je acylový zbytek (nestabilní halogen-, kyano-, substituovaná či rozvětvená alifatická, aromatická nebo heterocyklická skupina) [33]. 20

21 Obrázek 7 Schraderův vzorec Mechanismus účinku Mechanismus účinku organofosforových sloučenin spočívá v inhibici enzymu AChE. Organofosfáty tvoří kovalentní vazbu se serinovým hydroxylem esteratické podjednotky aktivního místa, přičemţ dochází k odštěpení části molekuly inhibitoru (odstupuje substituent X ve Schraderově vzorci). Tím vzniká fosforylovaný enzym, který je stabilní, jelikoţ rychlost defosforylace se pohybuje ve stovkách hodin. Syntéza enzymu de novo je rychlejší a inhibice je tak povaţována za ireverzibilní [1]. (Schéma 2) Schéma 2 Reakce AChE a organofosfátu. I kdyţ je spontánní hydrolýza pomalá a terapeuticky nevyuţitelná, lze docílit regenerace inhibovaného enzymu, a to pouţitím silně nukleofilních látek, tzv. reaktivátorů AChE [4]. Později po inhibici organofosforovou sloučeninou dochází ke stárnutí enzymu. To je chemická reakce, při které dochází k dealkylaci komplexu inhibitor-enzym. Vazba se tím stává nereaktivovatelnou a inhibice je trvale ireverzibilní. Rychlost stárnutí je závislá na struktuře inhibitoru. Nejpomaleji stárne enzym inhibovaný látkou VX, nejrychleji pak komplex soman-ache [1]. (Schéma 3) Schéma 3 Stárnutí komplexu enzym-op 21

22 Biotransformace Metabolismus organofosfátů probíhá, stejně jako u ostatních xenobiotik, ve dvou krocích. OP jsou většinou lipofilní sloučeniny. Biotransformační reakce tak obvykle vedou ke vzniku více polárních sloučenin, jejichţ toxicita můţe být výrazně pozměněna. V podmínkách in vivo rozlišujeme aktivaci a detoxikaci. Aktivační reakce lze definovat jako metabolickou přeměnu neaktivního OP na aktivní sloučeninu, nebo aktivního OP na jiný aktivní OP. Detoxikace organofosfátů zahrnuje jejich biotransformaci na netoxické sloučeniny. Detoxikace neboli degradace je nejdůleţitější reakcí v metabolismu OP v těle, a aktivace sama nakonec ústí v detoxikaci. Z tohoto hlediska je výhodnější zdrţet se klasického dělení biotransformace na fázi I a fázi II a zaměřit se na reakce aktivační a detoxikační. Přeměna neaktivních sloučenin na aktivní se realizuje pomocí pěti hlavních reakcí: 1. Oxidativní desulfurací thiofosfátové skupiny. Tím vznikají toxičtější oxo-deriváty. (př.: parathion, malathion) 2. Oxidací sulfidové skupiny za vzniku sulfoxidů nebo sulfonů (př.: fenthion, disulfoton) 3. Oxidací amidové skupiny, čímţ se tvoří N-oxidy, nebo N-dealkylované sloučeniny (př.: dikrotofos, monokrotofos) 4. Hydroxylací alkylových skupin. To dává vzniknout cyklickým fosfátům nebo ketonům (př.: chlorfenvinfos) 5. A dalšími neoxidativními reakcemi (př.: dichlorvos, trichlorfon) Metabolická detoxikace zpravidla probíhá rozštěpením jedné z vazeb na fosforu za vzniku negativně nabité molekuly. Štěpeny mohou být dva typy vazeb: anhydridová nebo alkylesterová. Negativní náboj na fosforu neumoţňuje OP být anticholinergně aktivní. Vznikající metabolity jsou daleko méně toxické a také hydrosolubilní, takţe mohou být rychle eliminovány močí. Acylový radikál nebo odstupující skupina obvykle obsahují hydroxy-, amino- nebo thio- skupinu, které snadno podléhají konjugačním reakcím a rychlé exkreci. Na biotransformaci OP se podílí celá řada enzymatických systémů. Některé se účastní aktivace, zatímco jiné hrají důleţitou roli v detoxikaci. Jsou to: 22

23 Monooxidasy, které mají účinek aktivační. Patří k nim systém NADPHcytochrom P450 reduktasa a monooxidasy obsahující flavin. Esterasy, zajišťující detoxikaci fosfotriesterasy, karboxylesterasy A redoxní systém glutationu [34]. 23

24 4.4 Nervově paralytické látky Nervově paralytické látky (NPL) patří strukturně mezi organofosfáty. Jde o sloučeniny extrémně toxické, které našly vyuţití především jako bojové látky Rozdělení NPL NPL se podle svých fyzikálně-chemických vlastností dělí do dvou velkých skupin: V-látky jsou kapaliny. Jsou viskózní a v čistém stavu bezbarvé. Jelikoţ se jedná o sloučeniny málo těkavé, přetrvávají v ţivotním prostředí po velmi dlouhou dobu. Jsou dobře rozpustné v tucích a organických rozpouštědlech, zatímco ve vodě se téměř nerozpouštějí. Tyto jejich lipofilně-hydrofilní vlastnosti jsou příčinou jejich vysoké toxicity při intoxikaci přes kůţi. Mezi zástupce této skupiny řadíme látku VX (O-ethyl-S-(2- diisopropylaminoethyl)-methylthiofosfonát, Obr. 8) a látku VR (O-isobutyl-S-(2-diethylaminoethyl)-methylthiofosfonát). Obrázek 8 Látka VX. G-látky jsou téţ kapaliny a stejně jako V-látky jsou bezbarvé, avšak jejich viskozita je spíše podobná vodě. Jsou lépe rozpustné ve vodě a dobře se rozpouštějí i v organických rozpouštědlech. Jsou to sloučeniny bez zápachu a na rozdíl od předchozí skupiny jsou vysoce těkavé, proto jsou nejčastější otravy skrze dýchací cesty. Ve vnějším prostředí jejich toxicita přetrvává pouze hodin. Tuto skupinu zastupují sarin (GB, O-isopropylmethylfluorofosfonát), soman (GD, O-pinakolylmethylfluorofosfonát) tabun (GA, 24

25 O-ethyldimethylamidokyanofosfát) a cyklosin (GF, O-cyklohexylmethylfluorofosfonát) [35]. (Obr. 9) Obrázek 9 G látky Otrava NPL Brány vstupu Nervově paralytické látky mají vesměs lipofilní charakter. Do organismu tak mohou pronikat mnoha branami: kůţí, přes sliznici dýchacích cest či trávicího ústrojí. Zde přestupují do krve, kterou jsou dopravovány na cílové místo. V krevním řečišti reagují s řadou bílkovin krevní plasmy, např.: BChE a dalšími enzymy. Do místa účinku se tak dostane pouze zlomek z původního mnoţství sloučeniny. Interakce s těmito proteiny nevyvolává ţádné příznaky a můţe být vyuţita k diagnostickým či terapeutickým účelům [2] Klinický obraz intoxikace Patogeneze otravy organofosfáty probíhá ve třech fázích. Jako první se rozvíjí akutní cholinergní krize. Po ní následuje intermediární syndrom a nakonec pozdní neurotoxický syndrom [2] Akutní fáze Akutní fáze nastupuje bezprostředně po intoxikaci. Hromadění ACh na nervových zakončeních vede k rozvoji akutní cholinergní krize. Podle aktivace jednotlivých receptorů rozlišujeme příznaky nikotinové, muskarinové a centrální. 25

26 Nikotinové symptomy na muskulárních nachr se projevují jako záškuby, třes a tonicko-klonické křeče. To můţe vyústit ve svalovou paralýzu a smrt následkem zástavy dechu. Udušení je nejčastější příčinou smrti při otravě NPL. V důsledku aktivace neuronálních nachr dochází k přechodnému zvýšení krevního tlaku. Muskarinové příznaky jsou poměrně rozsáhlou a rozmanitou skupinou, danou rozmístěním machr v těle. V respiračním traktu dochází k bronchokonstrikci a zvýšení sekrece hlenu. Zvýšení tonu hladkého svalstva vede k nevolnosti, zvracení, tenesmu a průjmu. Postiţený se zvýšeně potí a sliní. Dále se projevuje zúţení zornic (mióza), slzení a porucha akomodace. V srdci nastává zvýšení tonu parasympatiku a tím i bradykardie a pokles krevního tlaku. Příznaky centrálního typu se projevují jako závratě, nespavost, emoční labilita, poruchy koncentrace a zmatenost. Postupující útlum CNS vede ke komatu a depresi dechových a kardiovaskulárních center [36], [37] Intermediární syndrom (IMS) Intermediární syndrom zahrnuje komplexní změny, které vznikají následkem prolongované inhibice aktivity AChE s neuromuskulární klinickou manifestací. Dochází k němu po hodinách od expozice. Projevuje se svalovou ochablostí, která postihuje hlavně dýchací svaly a bránici, dále pak svaly končetin a svaly inervované hlavovými nervy. IMS je povaţován za jeden z hlavních příčin úmrtí v souvislosti s otravou NPL. Nicméně s příslušnou terapií, která je převáţně podpůrná a zahrnuje umělé dýchání, se zasaţený plně uzdraví během 8 12 dnů [38] Pozdní neurotoxický syndrom Tento syndrom nastupuje 7 21 dní po otravě NPL. Vyznačuje se poškozením neuronů periferního nervového systému, coţ se projevuje svalovou ochablostí končetin a poruchou senzorických funkcí. Přesný mechanismus poškození není znám, ale předpokládá se inhibice neurotoxické esterasy. Následkem toho dochází k demyelinizaci a degeneraci axonů. V závislosti na rozsahu poškození je defekt trvalý nebo dojde k částečné regeneraci [39]. 26

27 4.4.3 Terapie otravy Základem léčby otravy NPL je podání tří typů léčiv: anticholinergik, antikonvulziv a reaktivátorů AChE. Anticholinergika s antikonvulzivy spadají mezi funkční antidota, tedy sloučeniny určené k symptomatické terapii. Tyto léky neodstraňují příčinu, ale tlumí následky. Reaktivátory AChE se řadí mezi antidota kauzální [2] Funkční antidota Anticholinergika Jsou to sloučeniny, které se váţou na AChR a blokují tak působení nahromaděného acetylcholinu. Při terapii se podávají tak dlouho, dokud se neobjeví první příznaky předávkování. Nejpouţívanější látkou je atropin. Je spolu s obidoximem součástí náplně autoinjektoru Combo-Pen, který je určen pro první pomoc v polních podmínkách a je ve výbavě mnoha armád. Atropin však nemá centrální účinky. Mezi sloučeniny s centrálními účinky patří benaktyzin a biperiden [40]. (Obr. 10) Obrázek 10 Anticholinergika Antikonvulziva Dříve pouţívané barbituráty byly dnes jiţ zcela nahrazeny benzodiazepiny. Tyto sloučeniny potencují účinek kyseliny γ-aminomáselné na jejích receptorech, tím dochází k hyperpolarizaci postsynaptických membrán. Benzodiazepiny tlumí 27

28 křeče a sniţují úzkost zasaţených. Nejčastěji se pouţívá diazepam (Obr. 11), který je, stejně jako atropin s obidoximem, k dispozici ve formě autoinjektoru pro pouţití v polních podmínkách [41]. Obrázek 11 Diazepam Kauzální antidota reaktivátory AChE Reaktivátory AChE jsou sloučeniny, které vytěsňují NPL z jejich vazby na AChE. Základem jejich struktury je kombinace kvartérního dusíku a velmi nukleofilní oximové slupiny. V dnešní době pouţívané reaktivátory jsou pyridiniové sloučeniny substituované oximovou skupinou v poloze 2 nebo 4. Mechanismus reaktivace spočívá v odštěpení zbytku OP a uvolnění AChE. Kladně nabitá část molekuly reaktivátoru reaguje s anionickým místem enzymu a oximová skupina se tak dostává do těsné blízkosti zablokovaného serinového hydroxylu. Nukleofilní část molekuly tak můţe napadnout vazbu OP-AChE. Vzniká komplex reaktivátor - enzym, který se rychle rozpadá. Reaktivátor je eliminován na netoxické produkty. (Schéma 4) Schéma 4 Reaktivace AChE Léčba reaktivátory musí být zahájena před tím, neţ dojde ke stárnutí enzymu. Díky svému náboji tyto sloučeniny neprocházejí HEB a působí tak pouze 28

29 periferně. Navíc dosud neexistuje univerzální reaktivátor. Výběr konkrétního se tak odvíjí od pouţité NPL. Příkladem je obidoxim-dichlorid, pralidoxim-chlorid nebo asoxim-dichlorid [42]. (Obr. 12) Obrázek 12 Reaktivátory AChE. 29

30 4.5 Profylaxe intoxikace NPL Léčba otravy je značně limitovaná. K podání oximu musí dojít poměrně rychle, jinak jiţ není moţno AChE reaktivovat. Výzkum se tedy zaměřuje i na postupy a sloučeniny, které by umoţnily intoxikaci zabránit. Z protichemických opatření lze jmenovat pouţití prostředků individuální ochrany (ochranný oděv popř. ochranná maska) nebo včasné odmoření zasaţené pokoţky. K tomu se vyuţívají různé absorpční materiály, např.: bentonit součást individuálního protichemického balíčku (IPB vzor 80) ve výbavě AČR. Z farmakologicky účinných látek se vyuţívají reverzibilní inhibitory AChE a scavengery Reverzibilní inhibitory AChE K prevenci před otravou NPL se pouţívají reverzibilní inhibitory karbamátového typu. Jako jediné jsou schválené pro pouţití v humánní medicíně. Profylakticky se vyuţívá jejich schopnosti reverzibilně inhibovat AChE. Tím chrání aktivní místo proti NPL. NPL je tak v organismu rychle metabolizována na netoxické produkty. Komplex AChE-karbamát podléhá spontánní hydrolýze a tím se uvolňuje dostatečné mnoţství volného enzymu. Inhibice AChE, i kdyţ jen reverzibilní, vede ke vzniku řady neţádoucích účinků. Při podání vyšších dávek dochází ke zvýšené salivaci, bronchiální sekreci či kardiální arytmii. Tento stav můţe vyústit aţ do akutní cholinergní krize. Proto se současně s karbamáty podávají i anticholinergika. Řada inhibitorů navíc neproniká přes HEB, zde se s výhodou vyuţívá centrálně působících anticholinergik [3]. Nejčastěji pouţívanou látkou je pyridostigmin-bromid. Po perorálním podání je snadno absorbován a jeho účinek trvá cca 8 hodin. Ve své molekule obsahuje kvarterní dusík, a tak nemá centrální působení. Je vyuţíván řadou armád NATO. AČR má ve své výbavě pyridostigmin zaveden pod firemním názvem PANPAL. To je směsné profylaktické antidotum skládající se ze dvou tablet. Tableta A obsahuje benaktyzin-chlorid (8 mg) a trihexyfenidyl-chlorid (6 mg), tableta B pak pyridostigmin-chlorid (35 mg) [1]. 30

31 Ve výzkumu jsou i sloučeniny, které mají odlišnou strukturu od karbamátů. Od jejich selektivního účinku vůči AChE je očekáváno sníţení neţádoucích účinků. Takovou látkou je například huprezin A. [43] (Obr. 13) Obrázek 13 Huprezin A Scavengery Scavengery jsou molekuly schopné neutralizovat neurotoxické organofosforové sloučeniny předtím, neţ dosáhnou svého biologického cíle. Rozlišujeme dva typy scavengerů, stechiometrické a katalytické. Mezi stechiometrické scavengery řadíme AChE a BChE. Fungují tak, ţe na sebe naváţí molekulu OF a tím jí zabrání inhibovat AChE. Nejpokročilejší výzkum je zatím u BChE. BChE tvoří s NPL komplex 1:1, to znamená, ţe jedna molekula enzymu naváţe jednu molekulu inhibitoru. K dosaţení efektivní protekce je třeba podat zhruba 250 mg BChE/ 70 kg váhy. Velká mnoţství enzymu se získávají buď z plazmy, nebo rekombinantně. Tato profylaxe je však velmi nákladná. Lepších výsledků je dosaţeno současným podáním reaktivátoru, čímţ vznikne pseudo-katalytický scavenger. Katalytické scavengery, enzymy schopné hydrolyzovat OP, jsou lepší altenativou. Organofosfáty jsou substráty těchto enzymů, proto je poměr enzym: OP značně výhodnější, neţ u stechiometrických inhibitorů. Díky tomu bude moţno podávat menší dávky. Předmětem intenzivního výzkumu jsou dva enzymy. Prvním je bakteriální fosfotriesterasa. Molekulovým designem byla zvýšena její enantioselektivita proti nejúčinnějším OP. Problémem zůstává její imunogenita. Další slibnou látkou je lidská paraoxonasa 1 [19], [44] Další možnosti profylaxe V AČR se také vyuţívá profylaktického podání reaktivátoru asoximu ve formě transdermální náplasti. Nese firemní označení TRANSANT. Z náplasti se do 31

32 oběhu postupně uvolňuje účinná látka, při zasaţení NPL by tedy okamţitě došlo k reaktivaci AChE [1]. 32

33 5 Experimentální část 5.1 Syntetická část Obecná část Chemikálie a rozpouštědla byly dodány firmou Sigma-Aldrich (Česká Republika) a pouţity bez dalšího přečištění. Reakce 1. kroku byly monitorovány pomocí TLC (DC-Alufolien Cellulose F, Merck, Německo). Jako mobilní fáze byla pouţita soustava BuOH:CH 3 COOH:H 2 O 5:1:2. Reakce 2. Kroku byly monitorovány pomocí TLC (TLC Silica gel 60 F 254, Merck, Německo). Jako mobilní fáze byl pouţit methanol s 1% přídavkem triethylaminu. Detekce byla provedena pod UV při 254 nm a Dragendorffovým činidlem. Teploty tání byly měřeny na bodotávku PHMK 05 (VEB Kombinat Nagema, Radebeul, Německo) a nejsou korigovány. NMR spektra byla měřena na přístrojích Varian Mercury-VxBB 300 ( MHz pro 1 H a MHz pro 13 C; Varian Corp., Palo Alto, CA, USA) a na Varian Gemini 300 (300 MHz pro 1 H, 75 MHz pro 13 C, Palo Alto CA, USA) za pomoci doc. PharmDr. Jiřího Kuneše, CSc na Katedře anorganické a organické chemie. Elementární analýza byla provedena na přístroji EA 1110 CHNS instrument (CE Instruments, Milano, Italy) na Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv. ESI-MS spektra byla měřena s pouţitím vysokotlaké kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie v Centru pokročilých studií. HP1100 HPLC systém byl dodán z Agilent Technologies (Waldbronn, Německo). Skládá se z vakuového zplynovače G1322A, kvartérní pumpy G1311A, autosampleru G1313A a kvadrupólového hmotnostního spektrometru MSD1456 VL vybaveného zdrojem elektrosprayionizace. Dusík pro hmotnostní spektrometr byl získán z dusíkového generátoru Whatman Data byla odečtena v pozitivním iontovém módu s ESI sondou o napětí 4000 V. Tlak rozprašovaného plynu byl ustaven na 35 psig. Teplota sušícího plynu byla 335 C a průtok 13 l/min. 33

34 5.1.2 Postup syntézy krok Dibromoalkan (0,0387 mol) byl rozpuštěn v 10 ml acetonitrilu (popř. ethylacetátu) a vpraven do dvouhrdlé baňky. Isochinolin (0,00774 mol) byl rozpuštěn v 7 ml rozpouštědla a připraven do stříkačky. Roztok isochinolinu byl postupně přikapáván k roztoku dibromalkanu pomocí injekční pumpy a směs byla zahřívána na olejové lázni pod zpětným chladičem při teplotě 70 C po dobu hodin. Poté byla směs ochlazena na laboratorní teplotu. Produkt byl z roztoku vysráţen přidáním etheru (100 ml) a ponechán přes noc v chladničce (5 C). Rozpouštědlo bylo odlito a výsledný produkt byl přečišťován rekrystalizací z acetonu nebo ethyl-acetátu. Obrázek 14 Nákres aparatury Schéma 5 První krok syntézy. 34

35 krok 0,5 g monokvarterní látky bylo spolu s 4-benzylpyridinem (v poměru 2:3) rozpuštěno v 10 ml acetonitrilu. Směs byla zahřívána pod zpětným chladičem po dobu hodin při teplotě 70 C. Následně byla reakční směs ochlazena na laboratorní teplotu. Produkt byl vysráţen přilitím etheru (80 ml) a ponechán v lednici přes noc. Rozpouštědlo bylo slito, popř. odfiltrováno za sníţeného tlaku. Biskvarterní produkt byl přečištěn několikanásobným povařením s 5 ml acetonu. Schéma 6 Druhý krok syntézy. Pouţité dibromoalkany: 1,5-dibromopentan; 1,6-dibromohexan; 1,7-dibromoheptan; 1,8-dibromooktan; 1,9-dibromononan; 1,10-dibromodekan; 1,11-dibromoundekan; 1,12- dibromododekan. 35

36 (1) 5-bromopentyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba 26.5 h Výtěţek 21 % T. t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), 8.86 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-3), 8.63 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-4), 8.50 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-8), 8.37 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5), (m, 1H, H-7), (m, 1H, H-6), 4.75 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), 3.55 (t, 2H, J = 6.6 Hz, Br-CH 2 ), (m, 2H, N + - CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, N + -(CH 2 ) 2 -CH 2 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 60.28, 34.70, 31.38, 29.40, ESI-MS: m/z 356 [M] (kalkulováno pro [C 14 H 16 Br 2 N] ). EA: vypočítáno: % C, 4.77 % H, 3.90 % N; nalezeno: % C, 5.19 % H, 4.12 % N. 36

37 (2) 6-bromohexyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba h Výtěţek 43 % T. t. neměřena (amorfní sloučenina) 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), 8.84 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-3), 8.62 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-4), 8.50 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-8), 8.36 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-5), (m, 1H, H-7), (m, 1H, H-6), 4.73 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), (m, 2H, Br-CH 2 ), (m, 4H, N + -CH 2 - CH 2, Br-CH 2 -CH 2 ), (m, 4H, N + -(CH 2 ) 2 -(CH 2 ) 2 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 60.52, 34.93, 31.92, 30.16, 26.83, ESI-MS: m/z 370 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 15 H 18 Br 2 N] ). EA: neměřeno (amorfní sloučenina) 37

38 (3) 7-bromoheptyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba h Výtěţek 14 % T. t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), 8.86 (d, 1H, J = 6.81 Hz, H-3), 8.74 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-4), 8.38 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-8), (m, 2H, H-5, 7), (m, 1H, H-6), 5.10 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), 3.33 (t, 2H, J = 6.7 Hz, Br-CH 2 ), (m, 2H, N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br-CH 2 -CH 2 ), (m, 6H, N + -(CH 2 ) 2 -(CH 2 ) 3 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 61.27, 33.94, 32.36, 31.69, 28.03, 27.67, ESI-MS: m/z 384 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 16 H 20 Br 2 N] ). EA: vypočítáno: % C, 5.47 % H, 3.62 % N; nalezeno: % C, 5.57 % H, 3.82 % N. 38

39 (4) 8-bromooktyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba h Výtěţek 21 % T. t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), 8.85 (d, 1H, J = 6.80 Hz, H-3), 8.62 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-4), 8.50 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-8), 8.37 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5), (m, 1H, H-7), (m, 1H, H-6), 4.73 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), 3.51 (t, 2H, J = 6.8 Hz, Br-CH 2 -), (m, 2H, N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br CH 2 -CH 2 -), (m, 8H, N + -(CH 2 ) 2 - (CH 2 ) 4 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 60.58, 35.12, 32.02, 30.32, 28.13, 27.70, 27.26, ESI-MS: m/z 399 [M] (kalkulováno pro [C 17 H 23 Br 2 N] ). EA: vypočítáno: % C, 5.78 % H, 3.49 % N; nalezeno: % C, 6.21 % H, 3.81 % N. 39

40 (5) 9-bromononyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba h Výtěţek 12 % T. t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), 8.85 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-3), 8.62 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-4), 8.50 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-8), 8.37 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5), (m, 1H, H-7), 8.08 (m, 1H1 H-6), 4.73 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), 3.50 (t, 2H, J = 6.7 Hz, Br-CH 2 -), (m, 2H, N + - CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br CH 2 -CH 2 -), (m, 10H, N + -(CH 2 ) 2 - (CH 2 ) 5 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 60.59, 35.10, 32.06, 30.34, 28.47, 28.20, 27.84, 27.32, ESI-MS: m/z [M + ] (kalkulováno pro [C 18 H 25 BrN] 334). EA: vypočítáno % C, 6.07 % H, 3.37 % N; nalezeno % C, 6.23 % H, 3.46 % N. 40

41 (6) 10-bromodecyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba h Výtěţek 36 % T. t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ) δ (ppm) 9.93 (s, 1H, H - 1), 8.64 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H - 3), 8.45 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H - 8), 8.42 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H - 4), 8.21 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H - 5), 8.15 (t, 1H, J = 7.5 Hz, H - 7), 7.97 (t, 1H, J = 7.6 Hz, H - 6), (m, 2H, N + -CH 2 ), 3.13 (t, 2H, J = 6.7 Hz, Br-CH 2 ), (m, 2H, N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br-CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, N + -CH 2 -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br-CH 2 -CH 2 -CH 2 ), (m, 8H, N + - CH 2 -CH 2 -CH 2 -(CH 2 ) 4 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ) δ (ppm) , , , , , , , , , 62.36, 36.01, 32.67, 28.82, 28.77, 28.48, 28.26, 27.88, ESI-MS: m/z 348 [M + ] (kalkulováno pro [C 19 H 27 BrN] ). EA: vypočítáno: % C, 6.34 % H, 3.26 % N; nalezeno: % C, 6.70 % H, 3.30 % N. 41

42 (7) 11-bromoundecyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba h Výtěţek 9 % T.t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), (m, 2H, H- 3,4), 8.38 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-8), (m, 2H, H-5, 7), (m, 1H, H-6), 5.07 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), 3.36 (t, 2H, J = 6.8 Hz, Br-CH 2 -), (m, 2H, N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br CH 2 -CH 2 -), (m, 14H, N + -(CH 2 ) 2 -(CH 2 ) 7 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 61.48, 34.11, 32.67, 31.85, 29.23, 29.21, 29.17, 28.98, 28.56, 28.00, ESI-MS: m/z 440 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 20 H 28 Br 2 N] ). EA: vypočítáno % C, 6.59 % H, 3.16 % N; nalezeno % C, 6.71 % H, 3.54 % N. 42

43 (8) 12-bromododecyl-1-(2-isochinolinium)-bromid Reakční doba 28.5 h Výtěţek 50 % T. t C 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, H-1), (m, 1H, H- 3), 8.62 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-4), 8.50 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-8), 8.37 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-5), 8.26 (t, 1H, J = 7.6 Hz, H-7), 8.08 (t, 1H, J = 7.6 Hz, H-6), 4.73 (t, 2H, J = 7.4 Hz, N + -CH 2 ), 3.50 (t, 2H, J = 6.7 Hz, Br-CH 2 -), (m, 2H, N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Br CH 2 -CH 2 -), (m, 16H, N + -(CH 2 ) 2 - (CH 2 ) 8 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , 60.60, 35.10, 32.09, 30.35, 28.72, 28.62, 28.30, 27.96, 27.37, ESI-MS: m/z 454 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 21 H 30 Br 2 N] ). EA: vypočítáno: % C, 6.38 % H, 3.06 % N; nalezeno: % C, 6.26 % H, 3.20 % N. 43

44 (9) pent-1,5-diyl-1-(4-benzylpyridinium)-1 -(2-isochinolinium)-dibromid Reakční doba 23 h Výtěţek 99 % T. t. neměřena (amorfní sloučenina) 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, Chin H-1), 9.05 (d, 2H, J = 6.7 Hz, Pyr H-2, 6), (m, 1H, Chin H-3), 8.63 (d, 1H, J = 6.8 Hz, Chin H-4), (m, 1H, Chin H-8), (m, 1H, Chin H-5), (m, 1H, Chin H-7), (m, 3H, Chin H-6, Pyr H-3, 5), (m, 5H, Ph), 4.75 (t, 2H, J = 7.3 Hz, N + -CH 2 ), 4.57 (t, 2H, J = 7.4 Hz, Br-CH 2 -), 4.28 (s, 2H, Pyr-CH 2 -Ph), (m, 4H, N + -CH 2 -CH 2, Br CH 2 -CH 2 -), (m, 2H, N + -(CH 2 ) 2 -CH 2 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , , , , , , , , 64.83, 60.03, 59.41, 29.73, 29.57, ESI-MS: m/z 525 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 26 H 27 Br 2 N 2 ] ). EA: neměřena (amorfní sloučenina) 44

45 (10) hex-1,6-diyl-1-(4-benzylpyridinium)-1 -(2-isochinolinium)-dibromid Reakční doba 27 h Výtěţek 29 % T. t. neměřena (amorfní sloučenina) 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, Chin H-1), 9.39 (d, 2H, J = 6.6 Hz, Pyr H-2, 6), 8.91 (d, 1H, J = 6.8 Hz, Chin H-3), 8.64 (d, 1H, J = 7.0 Hz, Chin H-4), 8.53 (d, 1H, J = 8.3 Hz, Chin H-8), (m, 3H, Chin H- 5, Pyr H-3, 5), (m, 1H, Chin H-7), 8.09 (t, 1H, J = 7.6 Hz, Chin H-6), (m, 2H, Ph H-2, 6), 7.81 (t, 1H, J = 7.4 Hz, Ph H-4), 7.64 (t, 2H, J = 7.8 Hz, Ph H-3, 5), (m, 4H, N + -CH 2 ), (m, 6H, N + -CH 2 -CH 2, Ph-CH 2 ), (m, 4H, N + -CH 2 -CH 2 -CH 2 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , , , , , , , , 60.61, 60.33, 30.34, 30.11, 30.01, 24.74, ESI-MS: m/z 539 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 27 H 29 Br 2 N 2 ] ). EA: neměřena (amorfní sloučenina) 45

46 (11) hept-1,7-diyl-1-(4-benzylpyridinium)-1 -(2-isochinolinium)-dibromid Reakční doba 27 h Výtěţek 8 % T. t. neměřena (amorfní sloučenina) 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, Chin H-1), (m, 2H, Pyr H-2, 6), (m, 1H, Chin H-3), 8.62 (d, 1H, J = 6.7 Hz, Chin H-4), 8.51 (d, 1H, J = 8.3 Hz, Chin H-8), 8.37 (d, 1H, J = 7.2 Hz, Chin H-5), (m, 1H, Chin H-7), 8.05 (m, 3H, Chin H-6, Pyr H-3, 5), (m, 5H, Ph), 4.72 (t, 2H, J = 7.6 Hz, Chin N + -CH 2 ), 4.53 (t, 2H, J = 7.5 Hz, Pyr N + -CH 2 ), 4.28 (s, 2H, Ph-CH 2 ), (m, 2H, Chin N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 2H, Pyr N + - CH 2 -CH 2 ), (m, 6H, N + -CH 2 -CH 2 -(CH 2 ) 3 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , , , , , , , , , 60.49, 59.80, 30.61, 30.30, 30.19, 27.67, 25.08, ESI-MS: m/z 553 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 28 H 31 Br 2 N 2 ] ). EA: neměřena (amorfní sloučenina) 46

47 (12) okt-1,8-diyl-1-(4-benzylpyridinium)-1 -(2-isochinolinium)-dibromid Reakční doba h Výtěţek 16 % T. t. neměřena (amorfní sloučenina) 1 H NMR (300 MHz, CD 3 Cl d 6 ): δ (ppm) (d, 1H, J = 5.8 Hz), (d, 1H, J = 6.0 Hz), 9.61 (d, 1H, J = 6.1 Hz), 9.11 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 8.73 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.38 (t, 1H, J = 8.1 Hz, Chin H-7), 8.19 (d, J = 5.9 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 8.3 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 2H), 7.51 (t, 1H, J = 7.6 Hz), (m, 2H), 7.14 (d, 1H, J = 7.5 Hz), (m, 4H, N + - CH 2 ), (m, 6H, Ph-CH 2, N + -CH 2 -CH 2 ), (m, 8H, N + -CH 2 -CH 2 - (CH 2 ) 4 ). 13 C NMR (75 MHz, CDCl 3 d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , , , , , , , , , 61.71, 61.10, 60.58, 50.38, 41.49, 31.53, 31.32, 31.23, 27.41, ESI-MS: m/z 567 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 29 H 33 Br 2 N 2 ] ). EA: neměřena (amorfní sloučenina) 47

48 (13) non-1,9-diyl-1-(4-benzylpyridinium)-1 -(2-isochinolinium)-dibromid Reakční doba h Výtěţek 32 % T. t. neměřena (amorfní sloučenina) 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) (s, 1H, Chin H-1), 9.02 (d, 2H, J = 6.7 Hz, Pyr H-2, 6), (m, 1H, Chin H-3), 8.63 (d, 1H, J = 6.8 Hz, Chin H-4), 8.51 (d, 1H, J = 8.2 Hz, Chin H-8), 8.37 (d, 1H, J = 8.3 Hz, Chin H-5), 8.26 (t, 1H, J = 7.6 Hz, Chin H-7), 8.08 (t, 1H, J = 7.6 Hz, Chin H-6), 8.03 (d, 2H, J = 6.6 Hz, Pyr H-3, 5), (m, 4H, Ph H-2, 3, 5, 6), (m, 1H, Ph H- 4), (m, 2H, Chin N + -CH 2 ), 4.53 (t, 2H, J = 7.5 Hz, Pyr N + -CH 2 ), 4.28 (s, 2H, Ph -CH 2 -), (m, 2H, Chin N + -CH 2 -CH 2 ), 1.87 (m, 2H, Pyr N + - CH 2 -CH 2 ), (m, 10H, N + -CH 2 -CH 2 -(CH 2 ) 5 ). 13 C NMR (75 MHz, DMSO d 6 ): δ (ppm) , , , , , , , , , , , , , , , , 60.54, 59.82, 30.58, 30.41, 30.33, 28.39, 28.19, 28.14, 25.33, ESI-MS: m/z 581 [M-H + ] (kalkulováno pro [C 30 H 35 Br 2 N 2 ] ). EA: neměřena (amorfní sloučenina) 48