Monolisa Total Anti-HAV PLUS 2 destičky

Transkript

1 Monolisa Total Anti-HAV PLUS 2 destičky SOUPRAVA PRO DETEKCI A KVANTIFIKACI CELKOVÝCH PROTILÁTEK PROTI HAV V SÉRU NEBO PLAZMĚ ENZYMOVOU IMUNOANALÝZOU /02

2 OBSAH 1 - POUŽITÍ 2 - PRINCIP TESTU 3 - OBSAH SOUPRAVY 4 - MATERIÁL NUTNÝ K PROVEDENÍ TESTU, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY 5 - BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, OCHRANA ZDRAVÍ 6 - POKYNY A UPOZORĚNÍ 7 - VZORKY 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ - VALIDITA - UCHOVÁVÁNÍ 9 - PRACOVNÍ POSTUP 10 - ADAPTACE SYSTÉMU 11 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ - KVALITATIVNÍ METODA 12 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ - KVANTITATIVNÍ METODA 13 - SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDEL (VOLITELNÉ) 14 - ÚČINNOST TESTU 15 - OMEZENÍ TESTU 16 - LITERATURA 2 [CZ]

3 1 - POUŽITÍ Monolisa Total Anti-HAV PLUS je kit enzymové imunoanalýzy pro detekci a kvantifikaci celkových anti-hav protilátek v lidském séru nebo plazmě. Tuto soupravu lze použít jako pomoc při diagnostice opakované a současné infekce virem hepatitidy A (HAV). Soupravu lze rovněž použít pro stanovení imunitního stavu před vakcinací a k vyhodnocení stupně ochrany po vakcinaci proti HAV. Po anti-hav vakcinaci lze anti-hav protilátky detekovat zhruba po 2 týdnech a obvykle po dobu několika let. Stanovení hladin anti-hav protilátek bylo standardizováno používáním standardu WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2 nd International Standard, Hodnoty prostředku jsou vyjadřovány v milimezinárodních jednotkách na mililitr (miu/ml). Koncentrace 20 miu/ml je obecně považována za prahovou, která zaručuje pacientovi imunitu proti HAV infekci. Hodnota 20 miu/ml standardní průměrné absorbance (kterou uvádí mezinárodní norma World Health Organization Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2 nd International Standard, 1998) se používá jako hodnota cut-off. 2 - PRINCIP TESTU Tato analýza je inhibiční enzymová imunoanalýza založená na použití mikrodestiček pokrytých monoklonální protilátkou proti HAV, HAV antigenu a vzorku, a také enzymového identifikátoru obsahujícího křenovou, peroxidázou značenou myší monoklonální protilátku proti HAV. 1. Během první inkubace se vzorky (nebo kontroly) a HAV antigen inkubují společně 1 hodinu při teplotě 37 C. Pokud jsou ve vzorku přítomny protilátky proti HAV, tyto protilátky vytváří komplex s činidlem HAV antigenu a brání tak navázání antigenu s protilátkami na pevnou fázi (mikrodestička). 2. Promývání odstraní nenavázaný vzorek, nenavázaný HAV antigen a rozpustné HAV/anti- HAV komplexy na konci první inkubace. 3. Enzymový indikátor obsahující křenovou, peroxidázou značenou myší monoklonální protilátku proti HAV, se přidá do každé jamky a inkubuje jednu hodinu při teplotě 37 C. Množství enzymového indikátoru, který se váže na pevnou fázi prostřednictvím HAV antigenu a následná enzymová aktivita jsou nepřímo úměrné anti-hav protilátkám přítomným ve vzorku nebo kontrole. 4. Přebytečný enzymový indikátor se odstraní vymytím a do každé jamky se přidá TMB chromogen/substrátový roztok. 5. Po 30 minutách inkubace při pokojové teplotě se reakce zastaví a provede se spektrofotometrický odečet při 450/ nm. Naměřená absorbance jednoho vzorku umožní stanovení přítomnosti nebo kvantifikaci celkových anti-hav protilátek v testovaném vzorku. 3 [CZ]

4 3 - OBSAH SOUPRAVY Označení na štítku R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Positive cut-off R5 Positive control R6 Specimen diluent R7 HAV viral antigen R8 Substrate buffer R9 Chomogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Popis Mikrotitrační destička 12 stripů po 8 jamkách potažených polyklonálními anti-hav protilátkami Koncentrovaný promývací roztok (20X) Pufr Tris NaCl, ph 7,4 Konzervant: ProClin 300 (0,04 %) Negativní kontrola Lidské sérum, negativní na anti-hav protilátky, na HBs antigen, na anti-hcv protilátky a na anti-hiv 1-2 protilátky Konzervační látka: Azid sodný (< 0,1 %) Pozitivní standard 20 miu/ml Lidské sérum, na anti-hav protilátky a negativní na HBs antigen, na anti-hcv protilátky a na anti-hiv 1-2 protilátky, naředěné ve směsi lidského séra negativního na anti-hav protilátky Konzervační látka: Azid sodný (< 0,1 %) Pozitivní kontrola 80 miu/ml Lidské sérum, na anti-hav protilátky a negativní na HBs antigen, na anti-hcv protilátky a na anti-hiv 1-2 protilátky, naředěné ve směsi lidského séra negativního na anti-hav protilátky Konzervační látka: Azid sodný (< 0,1 %) HAV virový antigen Tento pufr obsahuje bílkovinu, inaktivovaný HAV virus a indikační barvivo vzorku Konzervační činidlo: ProClin 300 (0,1 %) Konjugát Tento pufr obsahuje bílkoviny, anti-hav konjugát potažený peroxidázou a indikační barvivo vzorku Konzervační činidlo: ProClin 300 (0,1 %) Substrát Roztok kyseliny citronové a octanu sodného, ph 4,0, obsahující H 2 O 2 (0,015 %) a 4 % dimethylsulfoxidu Provedení Příprava destičky 1 lahvička 235 ml 1 lahvička 1,5 ml 1 lahvička 3 ml 1 lahvička 1 ml 1 lahvička 28 ml 1 lahvička 26 ml 1 lahvička 60 ml Chromogen: Roztok TMB 1 lahvička Roztok obsahující 3.3, 5.5 tetramethylbenzidin (TMB) 5 ml Zastavovací roztok Roztok kyseliny sírové (H 2 SO 4 1N) 1 lahvička 28 ml 4 [CZ]

5 4 - MATERIÁL NUTNÝ K PROVEDENÍ TESTU, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Destilovaná nebo deionizovaná voda. Chlornan sodný a bikarbonát sodný. Savý papír. Ochranné rukavice. Ochranné brýle. Zkumavky pro jednorázové použití. Automatické nebo poloautomatické nastavitelné nebo fixní pipety o objemu 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl a 1 ml. Odměrné válce opatřené stupnicí o objemu 10 ml, 200 ml a 1000 ml. Třepačka Vortex. Automatická*, poloautomatická* nebo ruční promývačka pro mikrotitrační destičky. Vodní lázeň nebo inkubátor s termostatickou regulací nastavitelnou na 37 C ± 1 C. Nádoba na infekční odpad. Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky (vybavený filtry 490, 620, 450/ nm). (*) Kontaktujte reprezentanta firmy pro další informace týkající se přístrojů, validovaných naším technickým servisem. 5 - BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, OCHRANA ZDRAVÍ Všechny reagencie obsažené v soupravě jsou určeny pro diagnostiku in vitro. Název testovací soupravy, stejně jako specifické identifikační číslo testu, jsou vyznačeny na rámečku každé mikrotitrační destičky. Specifické identifikační číslo je rovněž umístěno na každém stripu. Monolisa Total Anti-HAV PLUS : Specifické identifikační číslo = 59 Před použitím si ověřte specifické identifikační číslo. Jestliže identifikační číslo chybí, nebo se liší od čísla uvedeného výše, nesmí být strip použit Během manipulace s reagenciemi a vzorky používejte ochranné rukavice určené pro jednorázové použití a po ukončení práce si důkladně umyjte ruce. Nepipetujte ústy. Materiál lidského původu materiál použitý při přípravě negativní kontroly (R3), kontroly (R5) a ho cut-off (R4) byl testován a shledán nereaktivním pro povrchový antigen proti hepatitidě B (HBs Ag), protilátky proti viru hepatitidy C (HCV) a protilátky proti virům lidské imunodeficience (HIV-1 a HIV-2 Ab). Protože žádná testovací metoda nemůže nabídnout úplnou záruku absence infekčních agens, zacházejte s činidly a vzorky od pacientů jako s materiály, které mohou přenášet infekční onemocnění. Veškerý materiál a promývací roztok, který přišel do přímého kontaktu se vzorky a reagenciemi lidského původu, považujte za infekční. Vyvarujte se rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Potřísněné plochy musí být opláchnuty chlornanem sodným, naředěným na 10 %. Místa potřísněná kyselinou musí být napřed neutralizována hydrogen uhličitanem sodným, potom vyčištěna chlornanem sodným a vysušena pomocí savého papíru. Materiál použitý k očištění musí být odložen do nádoby pro infekční odpad. Vzorky, reagencie lidského původu a kontaminované materiály musí být před odložením dekontaminovány 5 [CZ]

6 - buď ponořením do roztoku chlornanu sodného o konečné koncentraci 5 % chlornanu sodného (1 objem chlornanu sodného na 10 objemů kontaminované tekutiny nebo vody) po dobu 30 min. - nebo autoklávováním při 121 C minimálně po dobu 2 hod. UPOZORNĚNÍ: ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ NESMÍ BÝT AUTOKLÁVOVÁNY. Vyvarujte se potřísnění kůží a sliznic substrátovým pufrem, chromogenem a zastavovacím roztokem. Nezapomeňte neutralizovat nebo autoklávovat odpadní roztoky nebo jakékoliv tekutiny obsahující biologické vzorky před jejich vylitím do výlevky. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese POKYNY A UPOZORĚNÍ Kvalita výsledků závisí na dodržování správné laboratorní praxe: Nepoužívejte exspirované reagencie. Nekombinujte reagencie z různých šarží během jednoho běhu testu. POZNÁMKA: pro promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 20X, zelené zabarvení), peroxidázový substrátový pufr (R8, identifikace na štítku: TMB buf, modré zbarvení), chromogen (R9, identifikace na štítku: TMB 11X, purpurové zbarvení) a zastavovací roztok (R10, identifikace na štítku: 1N, červené zbarvení) je možno použít jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě za předpokladu, že stejná šarže se použije pro daný běh testu. Tyto reagencie mohou být použity s některými jinými výrobky naší společnosti. Dále je možno promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 20X zelené zabarvení) míchat se dvěmi dalšími promývacími roztoky, které jsou součástí některých dalších testovacích souprav firmy Bio-Rad (R2, identifikace na štítku: 10X modré zabarvení, 10X oranžové zabarvení) a jsou-li správně rekonstituovány a pokud je použita jedna směs během jednoho testu. Pro podrobné informace kontaktujte naši firmu. Před použitím ponechte reagencie ustálit po dobu 30 min. při pokojové teplotě. Reagencie pečlivě připravte a zabraňte jejich jakékoliv kontaminaci. Neprovádějte test v prostředí s reaktivními výpary (výpary kyselin, zásad, aldehydů) nebo v prašném prostředí, které by mohlo měnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Používejte laboratorní sklo pečlivě umyté o opláchnuté deionizovanou vodou nebo přednostně materiál pro jednorázové použití. Mezi koncem promývacího cyklu a přidáním reagencie nenechte mikrotitrační destičku zaschnout. Enzymová reakce je velmi citlivá na kovové ionty. Zabraňte proto kontaktu iontů kovů s roztoky konjugátu nebo substrátu. Substrátový roztok (substrátový pufr + chromogen) musí být zabarven růžově. Změna růžového zbarvení během několika minut po přípravě znamená, že reagencie nesmí být použita a musí být vyměněna. Příprava substrátového roztoku může být provedena v čisté plastové nádobce na jednorázové použití nebo ve skleněné nádobce, která byla umyta v 1N HCl a pečlivě opláchnuta v destilované vodě a osušena. Tato reagencie musí být uchovávána ve tmě. Pro každé sérum použijte novou pipetovací špičku. 6 [CZ]

7 Správné promývání jamek je kritický krok při tomto pracovním postupu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a přesvědčte se, zdali jsou všechny jamky zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promývání může vést k nepřesným výsledkům. Nikdy nepoužívejte stejnou nádobku pro konjugát a substrátový roztok. 7 - VZORKY Krevní vzorky odeberte obvyklým způsobem. Test by měl být proveden s neředěným sérem nebo plazmou, (odebraných do EDTA, citrátu, nebo protisrážlivých prostředků na bázi ACD nebo heparinu). Vzorky, obsahující částice, musí být před testováním vyčeřeny centrifugací. Suspendované fibrinové sraženiny nebo částice by mohly zapříčinit falešně výsledky. Pokud budou vzorky testovány do 7 dnů po odběru, mohou být skladovány při +2-8 C nebo mohou být zmrazené při -20 C. Vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazování. Při přepravě musí být vzorky zabaleny podle platných předpisů pro transport etiologických agens a zasílejte je nejvhodněji zmrazené. NEPOUŽÍVEJTE KONTAMINOVANÁ, HYPERLIPEMICKÁ NEBO ZNAČNĚ HEMOLYZOVANÁ SÉRA. POZNÁMKA: u vzorků s obsahem do 60 g/l albuminu, 100 mg/l bilirubinu, lipemických vzorků s obsahem do ekvivalentu 36 g/l trioleinu a hemolyzovaných vzorků, obsahujících do 5 g/l hemoglobinu, není ovlivněn výsledek. Negativní vzorky a vzorky na protilátky anti-hav byly testovány před a po opakovaném trojnásobném zamrazení a rozmrazení. Toto zacházení nemělo vliv na detekci protilátek. 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ - VALIDITA - UCHOVÁVÁNÍ Před použitím ponechte reagencie soupravy Monolisa Total Anti-HAV PLUS ustálit po dobu 30 min. při teplotě místnosti. 1) Reagencie hotové k použití Mikrotitrační destička (R1) Každá destička obsahuje 12 stripů a je zabalena v zataveném fóliovém sáčku. Sáček ořízněte nůžkami nebo pomocí skalpelu cm nad čárou. Otevřete sáček a vyjměte rámeček se stripy. Stripy, které nepoužijete, vraťte do sáčku. Sáček uzavřete a uchovávejte opět při +2-8 C. Negativní kontrola (R3) Pozitivní standard 20 miu/ml (R4) Pozitivní kontrola (R5) Virový antigen (R6) Konjugát (R7) Činidlo před použitím homogenizujte. 2) Reagencie, které musí být připraveny Promývací roztok (20X): R2 Nařeďte 1:20 v destilované vodě, abyste získali pracovní koncentraci promývacího roztoku. Připravte 800 ml pro jednu destičku s 12 stripy. Substrátový roztok (R8 + R9) Nařeďte reagencii (R9) reagencií R8 v poměru 1:11 (např. 1 ml reagencie R9 nařeďte 10 ml reagencie R8). Na 1-12 stripů je zapotřebí a dostačuje 10 ml. Promíchejte. 7 [CZ]

8 3) Rozpouštěná činidla pro kvantitativní test Pro kvantitativní test připravte rozsah hodnot 40 a 10 miu/ml naředěním R4 a R5 v R3 v poměru 1:2. Kalibrační rozsah sestává z následujících hodnot: Cal 80 = 80 miu/ml kalibrátor = R5 Cal 40 = 40 miu/ml kalibrátor = R5 ½ naředěný v R3 ( µl) Cal 20 = standard 20 miu/ml = R4 Cal 10 = 10 miu/ml kalibrátor = R4 ½ naředěný v R3 ( µl) Cal 0 = 0 miu/ml kalibrátor = R3 4) Validita - uchovávání Soupravu uchovávejte při teplotě +2-8 C. Při této teplotě jsou všechny reagencie stabilní až do data exspirace, vyznačeném na obalu soupravy (s výjimkou zvláštních pokynů). R1: Po rozbalení vakuového balení jsou stripy mikrotitrační destičky použitelné po dobu 4 týdnů, jestliže jsou znovu pečlivě zabaleny a uloženy při +2-8 C. R2: Naředěný promývací roztok může být uchován při C po dobu 2 týdnů. Koncentrovaný promývací roztok (R2) může být skladován při teplotě C. R8 + R9: Naředěný substrátový roztok skladovaný ve tmě je použitelný 6 hodin při pokojové teplotě (18-30 C). 9 - PRACOVNÍ POSTUP Dodržujte přesně předepsaný pracovní postup. Při každém testu vždy použijte a negativní kontroly, které jsou nezbytné pro validaci testu. Dodržujte zásady správné laboratorní praxe. Metody 1) Pečlivě definujte plán nanášení vzorku a identifikace. 2) Připravte naředěný promývací roztok (naředěný R2). 3) Vyjměte rámeček mikrodestičky a stripy (R1) z ochranného obalu. 4) Přidejte postupně přímo, bez předchozího promytí mikrodestičky: µl virového antigenu (R6) do každé jamky. Pro kvalitativní analýzu 50 µl negativní kontroly (R3) do jamky A1, 50 µl ho standardu 20 miu/ml (R4) do jamky B1, C1, D1, 50 µl ho kalibrátoru (R5) do jamky E1, 50 µl vzorku 1 do jamky F1, 50 µl vzorku 2 do jamky G1, atd Pro kvantitativní analýzu 50 µl CAL 0 do jamky A1, B1 50 µl CAL 10 miu/ml do jamky C1, D1 50 µl CAL 20 miu/ml do jamky E1, F1 50 µl CAL 40 miu/ml do jamky G1, H1 50 µl CAL 80 miu/ml do jamky A2, B2 50 µl vzorku 1, čistého nebo zředěného, do jamky C2 50 µl vzorku 2 do jamky D2, atd Vzorky lze zředit negativní kontrolou R3 (Cal 0 miu/ml). Pokud pipetování vzorků překročí 10 minut, doporučujeme pipetovat negativní a kontroly až po vzorcích. V závislosti na použitém systému, je možné upravit umístění kontrol. 8 [CZ]

9 POZNÁMKA: Po přidání vzorku se jamky obsahující roztok virového antigenu (R6) a vzorek nebo kontroly zbarví z červené barvy na oranžovou. Přítomnost vzorku v jamkách je možné ověřit spektrofotometrickým odečtem při 490 nm (jedna vlnová délka). (viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDEL). 5) Je-li to možné, mikrodestičku přikryjte adhezívní fólií. Pevně natlačte po celé destičce, aby se zajistila těsnost. 6) Mikrodestičku inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v inkubátoru mikrodestiček po dobu 60 ± 5 minut při teplotě 37 C ± 1 C. 7) Odstraňte adhezívní fólii. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad. Do každé jamky přidejte minimálně 370 µl promývacího roztoku. 30 vteřin počkejte, aby se jamky provlhčily. Opět odsajte. Opakujte tento postup alespoň dvakrát (tj. celkem minimálně 3 promytí). Zbytkový objem musí být menší než 10 µl (v případě potřeby vysušte destičku tím, že jí obrátíte a položíte na savý papír). Při použití automatické promývačky postupujte stejně. 8) Do všech jamek rychle přeneste 100 µl roztoku konjugátu (R7). Konjugát je nutno před použitím zatřepat. Jamky přikryjte novou adhezívní fólií (je-li to možné) a inkubujte po dobu 60 ± 5 minut při teplotě 37 C ± 1 C. POZNÁMKA: Distribuci roztoku konjugátu, který je fialově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace spektrofotometrickým odečtem při 620 nm (Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDEL). 9) Odstraňte adhezívní fólii, odsajte obsah všech jamek a promyjte minimálně 4- krát postupem popsaným výše. 10) Připravte vyvíjecí roztok (R8 + R9) (Viz část 8: REKONSTITUCE ČINIDEL). 11) Do všech jamek rychle přeneste 80 µl připraveného substrátového roztoku (R8 + R9). Umožněte vznik reakce v temnu po dobu 30 ± 5 minut při pokojové teplotě (18-30 C). Během této inkubace nepoužívejte adhezívní film. POZNÁMKA: Distribuci vyvíjecího roztoku, který je růžově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace: Mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující růžový substrátový roztok je jasný rozdíl ve zbarvení (Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDEL). 12) Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku (R10) použitím stejného sledu a rychlosti nanášení, které byly použity pro substrátový roztok. POZNÁMKA: Distribuci zastavovacího roztoku, který není zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Po přidání zastavovacího roztoku se růžový substrát odbarví u negativních vzorků, modře zbarvený substrát se změní na žlutý u ch vzorků. 13) Spodek destičky opatrně otřete. Pomocí čtečky destiček proveďte odečet optické hustoty při 450/ nm nejdříve 4 minuty po přidání zastavovacího roztoku a nejdéle 30 minut po zastavení reakce. 14) Před zaznamenáním výsledků zkontrolujte shodu mezi odečtem a mikrotitrační destičkou a plánem nanášení vzorku a identifikace ADAPTACE SYSTÉMU PROMÝVÁNÍ: Pečlivě dodržujte předepsané promývací postupy, aby bylo dosaženo maximální účinnosti testu. Pro některé přístroje je nutno zvýšit počet promývacích cyklů, aby bylo dosaženo akceptovatelné negativní pozadí. 9 [CZ]

10 11 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ - KVALITATIVNÍ METODA Přítomnost nebo nepřítomnost detekovatelných HAV protilátek se stanoví porovnáním naměřené absorbance jednotlivých vzorků s vypočítanou hodnotou cutoff. 1. Vypočítejte průměr absorbancí ho standardu 20 miu/ml (R4): Příklad: Pozitivní standard 20 miu/ml (R4) Jamka Optická denzita B1 0,689 C1 0,673 D1 0,680 Celkem OD 2,042 celková optická denzita 2,042 průměr OD R4 = = = 0, Vypočítejte poměr pro každý vzorek Poměr vzorku = průměr OD R4 / OD vzorku 3. Podmínky validity jsou následující a) Pro negativní kontrolu R3: Hodnota naměřené absorbance musí být vyšší než 1,0. b) Pro standard 20 miu/ml R4 : Hodnota naměřené absorbance pro každý R4 musí být vyšší než 0,350. Pokud se jedna z individuálních hodnot ho standardu 20 miu/ml cut-off liší o více než 30 % od průměrné hodnoty, ignorujte tuto hodnotu a proveďte nový výpočet se dvěma zbylými hodnotami ho standardu 20 miu/ml. Průměrná hodnota naměřených absorbancí ho standardu 20 miu/ml dělena naměřenou absorbancí negativní kontroly (průměrná OD R4 / R3 OD) musí být menší než 0,6. c) Pro kontrolu R5: Hodnota naměřené absorbance musí být menší než 0,300. Hodnota poměru kontroly (R5 poměr = průměrná OD R4 / R5 OD) musí být vyšší než 1,5. Pokud jedno z těchto kritérií není splněno, test je neplatný. 4. Interpretace výsledků Vzorky s hodnotou poměru nižší než 0,9 jsou považovány za negativní pro test Monolisa Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s hodnotou poměru vyšší nebo rovnou 1,1 jsou považovány za pro test Monolisa Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s hodnotou poměru větší nebo rovnou 0,9 a menší než 1,1 je třeba před finální interpretací opakovaně testovat. Po opakování analýzy jsou vzorky považovány za pro test Monolisa Total Anti-HAV PLUS, pokud je hodnota poměru vyšší nebo rovna 1,1. Vzorek je považován za negativní, pokud je hodnota poměru nižší než 0,9. Pokud je hodnota poměru vyšší nebo rovna 0,9 a nižší než 1,1, interpretaci vzorku nelze provést a následný vzorek se musí otestovat. 10 [CZ]

11 12 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ - KVANTITATIVNÍ METODA 1. Vypočítejte průměrnou absorbanci každého kalibrátoru Příklad: CAL 40 miu/ml Jamka Optická denzita G1 0,295 H1 0,292 Celkem OD 0,587 celková optická denzita 0,587 průměr OD CAL 40 miu/ml = = = 0, Podmínky validity jsou následující a) Pro negativní kontrolu R3 (Cal 0 miu/ml): Hodnota naměřené absorbance musí být vyšší než 1,0. b) Pro kalibrátor R4 (Cal 20 miu/ml): Hodnota naměřené absorbance pro každý R4 musí být vyšší než 0,350. Průměrná hodnota naměřených absorbancí ho standardu 20 miu/ml dělena naměřenou absorbancí negativní kontroly (průměrná OD R4 / R3 OD) musí být menší než 0,6. c) Pro kontrolu R5 (Cal 80 miu/ml): Hodnota naměřené absorbance musí být menší než 0,300. Hodnota poměru kontroly (R5) (průměrná OD R4 / průměrná OD R5) musí být vyšší než 1,5. d) Průměrná OD Cal 0 > průměrná OD Cal 10 miu /ml Průměrná OD Cal 10 > průměrná OD Cal 20 miu /ml Průměrná OD Cal 20 > průměrná OD Cal 40 miu /ml Průměrná OD Cal 40 > průměrná OD Cal 80 miu/ml Pokud jedno z těchto kritérií není splněno, test je neplatný. 3. Interpretace výsledků Optická hustota každého bodu rozsahu se bod po bodu vynese do grafu na osu x a na osu y se vynese přiřazená koncentrace protilátek proti HAV vyjádřena v miu/ml. Koncentraci protilátek proti HAV (miu/ml) každého vzorku lze určit zaznamenáním optické hustoty (OD) vzorku na osu x a vyznačením průsečíku na ose y. Z grafu odečtěte koncentrace testovaných vzorků. Pokud byl vzorek zředěný, vynásobte získanou koncentraci faktorem zředění. Vzorky s koncentrací nižší než 18 miu/ml jsou považovány za negativní pro test Monolisa Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s koncentrací vyšší nebo rovnou 22 miu/ml jsou považovány za pro test Monolisa Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s koncentrací vyšší nebo rovnou 18 miu/ml a nižší než 22 miu/ml je třeba před finální interpretací jednotlivě testovat. Po opakovaném testování je vzorek považován za negativní pro test Monolisa Total Anti-HAV PLUS, pokud je koncentrace nižší než 18 miu/ml. Vzorek je považován za, pokud je koncentrace vyšší nebo rovna 22 miu/ml. Pokud je koncentrace retestovaného vzorku vyšší nebo rovna 18 miu/ml a nižší než 22 miu/ml, interpretaci vzorku nelze provést a následný vzorek se musí otestovat. 11 [CZ]

12 13 - SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDEL (VOLITELNÉ) VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VIROVÉHO ANTIGENU (R6) A VZORKU Přítomnost vzorku a roztoku virového antigenu (R6) v jamce lze ověřit spektrofotometrickým odečtem při 490 nm: Hodnota OD každé jamky obsahující roztok virového antigenu (R6) musí být vyšší nebo rovna 0,500. Po přidání vzorku se musí hodnota OD každé jamky zvýšit alespoň na 0,100. Verifikaci pipetování vzorku nelze použít v případě homogenizace R6 se vzorkem. POZNÁMKA: Po přidání vzorku se roztok virového antigenu R6 zbarví z červené barvy na oranžovou. VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ KONJUGÁTU (R7) Přítomnost konjugátu (R7) v jamce lze ověřit spektrofotometrickým odečtem při 620 nm: Hodnota OD každé jamky musí být větší nebo rovna 0,500. POZNÁMKA: Konjugát R7 je fialově zbarven. VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VYVÍJECÍHO ROZTOKU (R8 + R9) Přítomnost vyvíjecího roztoku (R8 + R9) v jamce lze ověřit spektrofotometrickým odečtem při 490 nm: Hodnota OD každé jamky musí být vyšší nebo rovna 0,100 (nižší hodnota OD znamená nedostatečné rozpuštění vyvíjecího roztoku). POZNÁMKA: Po přidání vyvíjecího roztoku dochází k významné změně barvy prázdných jamek od bezbarvé po růžovou ÚČINNOST TESTU Účinnost testu Monolisa Total Anti-HAV PLUS byla určena na 3 místech (pracovištích) testováním vzorků od náhodných dárců krve, pacientů s infekcí HAV, komerčními panely, sérokonverzními panely a následnými vakcinačními panely. A - Specificita Zjištěná specificita v sérii 561 náhodně vybraných vzorků od dárců krve byla 100 % [99,47 % %] (IC 95), 561/561. Kromě toho se testovalo 700 vzorků od pacientů (zmražených nebo nezmražených). Zjištěná specificita byla 100 % [99,57 % %] (IC 95), 700/700. V sérii 192 pacientů s různými patologickými stavy nebo stavy nesouvisejícími s hepatitidou A (těhotné ženy, revmatoidní faktor, antinukleární protilátky, protimyší Ig nebo jiné virové nebo bakteriální infekce) se provedlo testování souběžně s komerčním EIA testem. Zjištěná shoda mezi těmito 2 testy byla 99,48 % (191/192). Zjištěná specificita byla 100 % (95/95). Jeden vzorek chřipkové vakcíny byl při použití alternativního komerčního EIA testu a negativní při použití testu Monolisa Total Anti HAV PLUS. B - Citlivost Studie citlivosti byly provedeny u 424 ch vzorků od dárců krve a 1274 ch vzorků ze 3 různých míst (pracovišť). Pomocí testu Monolisa Total Anti-HAV PLUS se testovalo 1698 vzorků a porovnalo s komerčním EIA testem. Zjištěná citlivost byla 100 % u vzorků od dárců krve nebo u vzorků od pacientů. 3 komerční HAV sérokonverzní panely a 12 následných vakcinačních panelů bylo rovněž studováno a porovnáváno s EIA testem. Zjištěná shoda mezi těmito 2 testy byla 100 %. 12 [CZ]

13 C - Přesnost Kvantitativní výsledky jsou vydávány v miu/ml a jsou kalibrovány podle standardu WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2 nd International Standard Korelační studie byla provedena testováním vzorků o koncentracích 0, 10, 20, 40 a 80 miu/ml získaných z mezinárodního standardu WHO proti kalibrátorům soupravy. Korelační koeficient a směrnice získané korelační přímky jsou 0,98 a 1,04. D Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost testu Monolisa Total Anti-HAV PLUS byla určena analýzou 4 vzorků: 1 negativní vzorek a 3 HAV Ab vzorky (nízký, střední, vysoký). Reprodukovatelnost "intra-assay" (v rámci testu) byla vyhodnocena testováním 4 vzorků 30-krát ve stejném cyklu. Reprodukovatelnost "inter-assay" (mezi testy) byla vyhodnocena testováním 4 vzorků v dubletu pod dobu 20 dní s frekvencí 2 nezávislých cyklů za den. Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách: Tabulka 1: Reprodukovatelnost Vzorek Průměrná hodnota poměrů Směrodatná odchylka (SD) Variační koeficient (CV) % Negativní Slabě Středně Vysoce 0,43 2,25 3,08 4,29 0,02 0,15 0,19 0,19 4,87 6,50 6,29 4,47 Vzorek Negativní Slabě Středně Vysoce Průměrný titr 2,78 39,96 67,33 >80 Směrodatná odchylka (SD) 1,21 2,69 5,26 ND Variační koeficient (CV) % 43,53 6,72 7,81 ND Tabulka 2: Opakovatelnost Vzorek Negativní Slabě Průměrná hodnota poměrů Směrodatná odchylka (SD) Variační koeficient (CV) % Středně Vysoce 0,45 2,13 3,43 4,80 0,03 0,29 0,33 0,49 6,31 13,68 9,61 10,23 13 [CZ]

14 Vzorek Negativní Slabě Středně Vysoce Průměrný titr 3,10 38,91 71,88 >80 Směrodatná odchylka (SD) Variační koeficient (CV) % 1,24 3,65 4,13 NA 39,96 9,38 5,75 NA 15 - OMEZENÍ TESTU Diagnóza infekčního onemocnění se nesmí určovat na základě výsledku jednoho testu. K přesné diagnóze je třeba vzít do úvahy klinický stav a anamnézu pacienta, symptomy a výsledky sérologických vyšetření. Bakteriální kontaminace vzorků může ovlivnit hodnoty absorbance vzorků LITERATURA Costa-Mattioli Mauro, Di Napoli A, Ferré V, Billaudel S, Perez-Bercoff R, Cristina J : Genetic variability of hepatitis A virus. Journal of General Virology (2003), 84, Normann A, Jung C, Vallbracht A, Flehmig B : Time course of Hepatitis A Viremia and Viral Load in the Blood of Human Hepatitis A Patients. Journal of Medical Virology 9999 :1-7 (2003) Lutz G. Guertler : Virus safety of human blood, plasma, derived products. Thrombosis Research 107 (2002)S39-S45 Jennifer A. Cuthbert : Hepatitis A : Old and New. Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2001, p Morag Ferguson, Dawn Sands, Nico Lelie : Hepatitis A Immunoglobin : An International Collaborative Study to Establish the Second Intertional Standard. Biologicals Vol. 28, Issue 4, December 2000, p World Health Organization, departement of communicable Disease Surveillance and Response : Hepatitis A. Who/cds/csr/edc/ ( Centers for Disease Control and Prevention (CDC) : Prevention of hepatitis A through active or passive immunization, recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP). MMWR october 01, 1999 /48(RR12) ;1-37 Rosa M. Pinto, Juan F. Gonzalez-Dankaart, Gloria Sanchez, Susana Guix, M. Jose Gomara, Monica Garcia, Isabel Haro, Albert Bosch : Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bearing a VP3 epitope of hepatitis A virus. FEBS Letters 438 (1998) Stanley M. Lemon : Type A viral hepatitis : epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistry 43 :8(B) (1997) Stanley M. Lemon and Leonard N. Binn : Serum neutralizing antibody response to hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseseases Vol. 148, no. 6 December 1983 Bertram Flehmig, Michael Ranke, Hans Berthold, Hans-Joachim Gerth : A Solid- Phase Radioimmunoassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseases Vol. 140, no. 2 August [CZ]

15 15 [CZ]

16 16 [CZ]

17 17 [CZ]

18 18 [CZ]

19 19 [CZ]