METODA RLB (REVERSE LINE BLOT) V DETEKCI ARBOVIRŮ

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "METODA RLB (REVERSE LINE BLOT) V DETEKCI ARBOVIRŮ"

Šimon Šimek
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 METODA RLB (REVERSE LINE BLOT) V DETEKCI ARBOVIRŮ MVDr. Petra Drzewnioková; MVDr. Tomáš Csank, PhD.; prof. MVDr. Juraj Pistl, PhD. Katedra mikrobiológie a imunológie Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach Komenského 73, Košice, Slovensko

2 Úvod Název arbovirus je akronymem anglického ARthropod BOrne VIRus členovci přenášený virus. Po celém světě je známo více než 500 arbovirů, které většinou způsobují zoonózy. Některé infikují člověka pouze příležitostně, nebo způsobují mírné onemocnění, zatímco jiné mají velký medicínský význam a způsobují rozsáhlé epidemie se závažnou mortalitou. Mezi nejvýznamnější zástupce arbovirů ve střední Evropě patří viry z čeledě Flaviviridae, avšak v Evropě se zaznamenal výskyt i dalších, mnohdy opomíjených arbovirů. V naši práci jsme se zaměřili na flaviviry vyskytující se ve střední Evropě, a to na virus klíšťové encefalitidy (Tick-borne encephalitis virus; TBEV), virus západonilské horečky (West Nile virus; WNV) a Usutu virus (USUV). Reverse Line Blot (RLB) neboli reverzní hybridizace je hybridizační metoda, která umožňuje detekovat v relativně krátkém časovém úseku poměrně velké množství vzorků najednou na přítomnost hned několika virů, respektive jejich genů.

3 Materiál a metody V metodě reverzní hybridizace (RLB) jsou nezbytné tyto kroky: IZOLACE RNA Reverzní transkripce PCR. RLB

4 Vzorky Při standardizaci metody RLB nám posloužili tyto 3 referenční kmeny: kmen WNV 578/10 (Dr. Bakonyi Tamás; Oddělení mikrobiologie a infekčních onemocnění, Univerzita Szent István, Maďarsko) kmen TBEV Hypr (RNDr. Boris Klempa, DrSc., Virologický ústav BMC SAV, Slovensko) kmen USUV 939/01 (Prof. Nowotny Norbert, Dr.phil. Virologický ústav, UVM, Vídeň)

5 Izolace RNA Izolace RNA byla provedena za pomocí komerčně vyráběné soupravy QIAamp cador Pathogen Mini Kit (QIAGEN) dle manuálu výrobce. Koncentrace RNA byla změřena na Nanodropu ND Celý NS5 gen referenčních kmenů WNV, USUV a TBEV byl amplifikovaný, vyřezaný z gelu, izolovaný a naředěný na koncentrace kopií/µl.

6 Reverzní transkripce a PCR Maximálně 5µg extrahované RNA bylo použito na reverzní transkripci, která proběhla dle podmínek udaných výrobcem. Z výsledné cdna jsme použili 1 µl, který nám sloužil jako templát do PCR reakce. Biotinylované primery označují úsek 599 bp, který je konzervativní pro rod Flavivirus a nachází se v rámci jeho genu NS5.

Výsledek jsme si ověřili na 1,5% agarozovém gelu La W5 W0 U5 U0 T5 T0 100 bp lader WNV 10 5-10 0 kopií/µl USUV 10 5-10 0

7 Výsledek jsme si ověřili na 1,5% agarozovém gelu La W5 W0 U5 U0 T5 T0 100 bp lader WNV kopií/µl USUV kopií/µl TBEV kopií/µl Vyhodnocení: Senzitivita PCR reakce je 10 3 kopií/µl pro USUV a WNV a 10 4 kopií/µl pro TBEV.

8 Reverzní hybridizace (RLB) 1. Aktivace membrány a navazování sond Nylonovou membránu Biodyne C jsme aktivovali 16% roztokem EDAC a následně ji opláchli v deionizované vodě. Námi navrhnuté sondy WNVinNS5-Probe4, USUVinNS5-Probe1 a TBEVinNS5-Probe1 byly navrhnuté jako specifické sondy pro detekci jednotlivých flavivirů v rámci vymezeného úseku genu NS5. Sondy, které jsou 5 konci modifikované s C6 aminolinkerem, jsme naředili v 0,5 M NaHCO 3 na koncentraci 5, 2.5 a 1.25 µm a následně jsme je navázali na aktivovanou membránu duplicitně v klesajících koncentracích. Do první a poslední jamky jsme napipetovali čistý roztok 0,5 M NaHCO 3. Membránu s napipetovanými sondami jsme nechali inkubovat. Následovali promývací kroky pomocí roztoků v následujícím pořadí: 0,1 M NaOH, 2x SSPE a na závěr 2x SSPE/0,1% SDS.

9 Reverzní hybridizace (RLB) 2. Hybridizace K 20µl z každého PCR produktu značeného biotinem jsme přidali 150µl 2x SSPE/0,1% SDS a následně jsme je dali denaturovat. Takto denaturované PCR produkty jsme navázali na membránu, kolmo na navázané sondy. Do první jamky a posledních jamek jsme navázali čisté 2x SSPE/0,1% SDS, do ostatních vzorky a kontroly. Následně jsme nechali inkubovat. Po hybridizaci následovalo dvojí promývání s 2x SSPE/0,5% SDS. Po promývání se membrána inkubovala se streptavidínem značeným peroxidázou, který má silnou afinitu k biotinu navázanému na PCR produktech. Následovalo promývání s 2x SSPE/0,5% SDS a s 2x SSPE.

10 Reverzní hybridizace (RLB) 2. Vizualizace Reakce se vizualizovala pomocí chemiluminiscenčního roztoku Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences), který byl přidaný k membráně. Vizualizačný roztok se vylil, membránu jsme vložili do plastikového sáčku a přenesli do tmavé komory, kde jsme jiumístili do kazety s fotocitlivým RTG filmem. Po expozici se film v tmavé komoře vybral a vyvolal za pomocí vývojky (Fomadon P, FOMA) a ustalovače (Fomafix P, FOMA).

11 Reverzní hybridizace (RLB) 3. Výsledek Název sondy Konc. Sond (µm) A-G: WNV kopií/µl; H-N: USUV kopií/µl; O-U: TBEV kopií/µl; V: Negativní kontrola 1,2 5 7,8 5 13,14 5 3,4 WNVinNS5- Probe4 2,5 5,6 1 9,10 USUVinNS5- Probe1 2,5 11, ,16 TBEVinNS5- Probe1 2,5 17,18 1

12 Reverzní hybridizace (RLB) 3. Závěr Slabší signál v případě WNV kopií/µl byl pravděpodobně způsobený zlým navázáním vizualizačního roztoku nebo přesycením vazebných míst vysokým množstvím PCR produktu. Citlivost PCR reakce a metody reverzní hybridizace na základě NS5 genu je pro WNV a USUV kopií/µl a pro TBEV kopií/µl. Nespecifické skvrny (malé tečky mimo místa navázaných sond) vznikly pravděpodobně nevhodným vymýváním. Jako vhodná koncentrace sondy byla vybraná koncentrace 2.5 µm. Sonda WNVinNS5-Probe4 zachytí jak WNV tak i USUV, ale na základě sondy USUVinNS5-Probe1 jsme schopni tyto dva viry odlišit.

13 Vyšetření klinických vzorek metodou reverzní hybridizace Stejný postup byl zopakovaný na klinických vzorcích použitých bylo 16 klinických vzorek (ptačí výtěry), kontrola izolace (WNV) a kontrola PCR (USUV). Pro kontrolu správně provedené reverzní hybridizace a snadnější orientaci na membráně byly použité všechny 3 referenční kmeny v koncentraci 10 6 kopií/µl (WNV, USUV a TBEV). 2.5 µm sondy byly na membránu navázané duplicitně, do prvních linií a mezi sondy bylo pipetované NaHCO 3. Abychom se zbavili nespecifických skvrn byly přidané promývací kroky a prodloužený čas v případě některých promývání.

Výsledek Vzorky vyšli negativně. Sonda WNVinNS5-Probe4 zachytila kontroly WNV 10 6 kopií/µl, USUV 10 6 kopií/µl, WNV (kontrola izolace) a USUV (kontrola PCR).

14 Výsledek Vzorky vyšli negativně. Sonda WNVinNS5-Probe4 zachytila kontroly WNV 10 6 kopií/µl, USUV 10 6 kopií/µl, WNV (kontrola izolace) a USUV (kontrola PCR). Pomocí sondy USUVinNS5-Probe1 jsme zachytili USUV 10 6 kopií/µl a USUV (kontrola PCR). Sondou TBEVinNS5-Probe1 jsme detekovali pouze kontrolu TBEV 10 6 kopií/µl. Negativní kontroly vyšli negativně. 1 2xSSPE/ 2 2xSSPE/ 3 WNV xSSPE/ 5 USUV xSSPE/ 7 TBEV xSSPE/ 9 Vzorka 1 10 Vzorka 2 11 Vzorka 3 12 Vzorka 4 13 Vzorka 5 14 Vzorka 6 15 Vzorka 7 16 Vzorka 8 17 Vzorka 9 18 Vzorka Vzorka Vzorka Vzorka Vzorka Vzorka xSSPE/ 26 PK izol. - WNV 27 2xSSPE/ 28 PK PCR - USUV 29 2xSSPE/ 30 NK (izol) 31 2xSSPE/ 32 NTC (RT) 33 2xSSPE/ 34 NK PCR xSSPE/

15 Závěr Metoda RLB je vhodnou metodou k vyšetření většího množství patogenů najednou na přítomnost nukleové sekvence několika vybraných virů. My jsme se zaměřili na detekci flavivirů vyskytujících se ve střední Evropě a podařilo se nám navrhnout specifické sondy pro WNV, USUV a TBEV. Citlivost PCR reakce a metody reverzní hybridizace na základě NS5 genu je pro WNV a USUV kopií/µl a pro TBEV kopií/µl. Zvýšení citlivosti máme v plánu pomocí nested PCR.

16 Závěr Na počátku standardizace metody RLB jsme měli problém s nečistotami na membráně, avšak přidáním promývacích kroků a prodloužením některých promývacích časů jsme dosáhli lepší čistoty membrány. Vyšetřené vzorky vyšli negativně, avšak k definitivnímu vyhodnocení (ne)přítomnosti virů ve vzorkách nebylo doposud vyšetřené dostatečné množství vzorek.

17 Následující kroky 1. Stanovení senzitivity metody vyjádřené v TCID 50, anebo PFU počínající od izolace RNA. 2. Druhově specifické sondy nacházející se v jiném genu jsou již navrženy a budou otestovány. 3. Navrhnout sondy, za pomocí kterých bychom byli schopni odlišit jednotlivé podtypy, resp. linie. 4. Navrhnout sondy vhodné na detekci ostatních arbovirů vyskytující se ve střední Evropě.

18 Děkuji za pozornost! Studie byla podpořena grantem VEGA 1/0729/16 a ITMS (INFEKTZOON).

Podobné dokumenty

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Charakteristika testu: Set AMPLICOR HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských