Molekulární diagnostika Chlamydia trachomatis

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta Molekulární diagnostika Chlamydia trachomatis Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Miloš Dendis Autor: Petra Doleželová Brno, duben 2010

2 Jméno a příjmení autora: Petra Doleţelová Název bakalářské práce: Molekulární diagnostika Chlamydia trachomatis Pracoviště: RNDr. Zdeněk Čecháček, s.r.o., sérologická laboratoř, Brno GeneProof a.s., Brno Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Miloš Dendis Rok obhajoby bakalářské práce: 2010 Souhrn Chlamydia trachomatis je nejvýznamnějším a nejčastějším původcem sexuálně přenosných onemocnění ve vyspělých zemích, hlavní příčinou slepoty (trachom) a venerického onemocnění lymfogranuloma venerum. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Klíčovým krokem diagnostického procesu je účinná izolace DNA. Bakalářská práce si klade za cíl srovnat účinnost, sensitivitu a variabilitu manuální izolace nukleových kyselin s izolací automatickou. Obě metody byly testovány na sériově ředěné koncentrační řadě pozitivního vzorku s následnou detekcí DNA C. trachomatis metodou real-time PCR. Přestoţe automatická izolace vykazovala niţší účinnost izolace DNA z klinického materiálu, umoţňovala především z důvodu většího zakoncentrování vzorku během izolačního procesu, srovnatelnou sensitivitu vyšetření. Klíčová slova Chlamydia trachomatis, infekce, diagnostika, izolace DNA, real-time PCR Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Miloše Dendise a v seznamu literatury jsem uvedla všechny pouţité literární a odborné zdroje. V Brně dne Petra Doleželová

4 Děkuji RNDr. Miloši Dendisovi za odborné vedení, cenné informace a pomoc při vypracování bakalářské práce. Děkuji Ing. Josefu Bednářovi, Ph.D. z Fakulty strojního inţenýrství VUT v Brně za statistické zpracování experimentálních dat, MUDr. Zuzaně Medkové, Ph.D. za zapůjčení odborné literatury. Dále děkuji RNDr. Zdeňku Čecháčkovi a celému týmu jeho laboratoře za podporu a trpělivost. Velký dík patří mým rodičům, mému synovi a partnerovi, kteří mi byli velkou oporou a zdrojem energie.

5 I. TEORETICKÁ ČÁST 1 Úvod Mikrobiologie Taxonomie Chlamydia trachomatis Morfologie Ţivotní cyklus Charakteristika antigenních struktur Sérotypy a patogenita Struktura genomu Patogeneze a klinický význam onemocnění Infekce vyvolané sérotypy D-K Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u ţen Peripatální přenos infekce z matky na dítě Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u muţů Konjuktivitida u dospělých Riziko vzniku karcinomu děloţního hrdla Endemické nákazy Trachom Lymfogranuloma venerum Epidemiologie a prevalence sérotypy D-K Imunologie Imunitní odpověď hostitelského organismu Imunopatologie Individuální imunitní reakce Prevence a terapie Primární a sekundární prevence Volba vhodné diagnostiky Otázka vakcinace Terapie Laboratorní diagnostika Nepřímá diagnostika Nepřímá imunofluorescence... 24

6 7.1.2 ELISA Western blot Přímá diagnostika Kultivace na tkáňové kultuře Metody detekce antigenu Molekulárně biologické metody Metody bez amplifikace Amplifikační metody LCR (Ligase Chain Reaction) PCR (Polymerase Chain Reaction) Správná laboratorní diagnostika PCR C. trachomatis Preanalytická fáze Typy klinických materiálů a technika odběru Analytická fáze Kontrola kvality diagnostického procesu Vnitřní kontrola kvality (VKK) Kontrola falešně pozitivních výsledků Kontrola falešně negativních výsledků Externí kontrola kvality (EKK) Cíl bakalářské práce II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 10 Materiál a metody Struktura experimentu Účel testu Schéma experimentu Příprava koncentrační řady pozitivního vzorku Izolace DNA Manuální izolace DNA Automatická izolace DNA Detekce DNA C. trachomatis metodou real-time PCR Kvantifikace DNA C. trachomatis Příprava kalibrační řady Stanovení koncentrace DNA Statistické vyhodnocení Výsledky a diskuse Porovnání účinnosti manuální a automatické izolace... 41

7 11.2 Srovnání celkové sensitivity vyšetření Srovnání variability izolací Kříţová kontaminace izolačního procesu Závěr Seznam zkratek Seznam použité literatury... 55

8 I. TEORETICKÁ ČÁST 1 Úvod Chlamydia trachomatis je obligátní lidský patogen s unikátním ţivotním cyklem. Jedná se o intracelulárního parazita, který je energeticky závislý na hostitelských buňkách. Je schopen infikovat epitel urogenitálního traktu, rekta, nasopharyngu a očních spojivek. Infekce jsou příčinou celé řady onemocnění (uretritida, cervicitida, lymfogranuloma venerum, konjuktivitida, prostatitida a trachom). C. trachomatis se svými sérotypy D-K patří na celém světě k nejčastějším sexuálně přenášeným agens, které způsobuje infekce urogenitálního traktu a očí. Infekce jsou charakterizovány převáţně asymptomatickým průběhem a klinicky se manifestují aţ v období těţkého zánětlivého procesu. Závaţná jsou zejména postiţení reprodukčních orgánů s následkem infertility u obou pohlaví. Prevence infekcí je moţná zavedením screeningu s přesně stanovenými kriterii u ţen a muţů v rizikových skupinách. Správná diagnostika je základním předpokladem účinné terapie. Laboratorní diagnostika akutních chlamydiových infekcí je obtíţná, především pro nízkou citlivost kultivačních metod nebo detekce antigenu. Sérologická diagnostika má malou výpovědní hodnotu. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Pro svou vysokou citlivost a specificitu jsou preferovány především amplifikační metody průkazu nukleových kyselin C. trachomatis zaloţené na polymerázové řetězové reakci (PCR). 7

9 2 Mikrobiologie Chlamydie jsou výjimečné mikroorganismy dříve povaţované za prvoky či velké viry. Po průkazu buněčné stěny byly zařazeny ke gramnegativním bakteriím s tím rozdílem, ţe jejich buněčná stěna neobsahuje peptidoglykan (kyselinu muramovou), ale lipidy. Jedná se o intracelulární parazity, kteří ke svým metabolickým procesům vyuţívají energii z napadené hostitelské buňky (Greenwood, et al., 1999; Mašata et al., 2001). 2.1 Taxonomie Do r čeleď Chlamydiaceae zahrnovala jediný rod Chlamydia se čtyřmi klasifikovanými druhy: Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Chlamydia pecorum Na základě molekulárně biologické analýzy 16sRNA a 23sRNA byla čeled Chlamydiaceae přerozdělena na dva rody (Obr. 1) Chlamydia a Chlamydophila (Mahony et al., 2003; Bush a Everett, 2001). V humánní medicíně jsou významné Chlamydia trachomatis a Chlamydophila pneumoniae (Tab. 1). Chlamydia trachomatis je nejvýznamnější a nejčastější původce sexuálně přenosných onemocnění, trachomu a klasického venerického onemocnění lymfogranuloma venerum. Chlamydophila pneumoniae má primární afinitu k respiračnímu traktu. Chlamydophila psittaci je zvířecí patogen (původce orntiózy) přenosný na člověka (Bednář et al., 1996; Votava et al., 2003). 8

10 Obr. 1. Schéma nové a původní klasifikace chlamýdií (Bush a Everett, 2001). 9

11 Tab. 1. Charakteristika jednotlivých species chlamýdií (upraveno dle Jarčuška et al., 2009). Charakteristika C. pneumoniae C. trachomatis C. psittaci Přirozený hostitel člověk člověk ptáci a drobní savci Hlavní onemocnění pneumonie trachom psitakóza, ornitóza bronchitida lymfogranuloma venerum placentitida STD infekce novorozenců Počet sérovarů 1 18 méně neţ 10 Tvar EB v elektronovém nepravidelně oválný kulatý kulatý mikroskopu Druhově specifické nepřítomny přítomny přítomny antigeny v MOMP Inaktivace specifických ANO NE NE antigenů metanolem Potřeba lyzinu pro NE ANO ANO ţivotní cyklus DNA homologie s % méně neţ 5% méně neţ 10% C.pneumoniae AR39 Citlivost na makrolidy a ANO ANO ANO tetracykliny Citlivost na sulfonamidy NE ANO NE 2.2 Chlamydia trachomatis Byla pozorována mikroskopicky I. Halbestaedterem a S. von Prowazekem v r jako buněčná inkluze ve stěru ze spojivkového vaku u trachomu. V r Fritsch, Hofstetter a Linder prokázali sexuální přenos mezi muţem a ţenou a mezi infikovanou matkou a novorozencem (Šimko et al., 1999). Vyizolovat C. trachomatis z uretry se podařilo Jonesovi et al., r Jako původce STD (pohlavně přenosných chorob) ve vyspělých zemích, byla C. trachomatis označena v r J. T. Graystonem a S.T.Wangem a v r.1978 J.Schachterem (Matoušková a Hanuš, 2009). Její sérotypy D-K představují více neţ 50% všech urogenitálních nákaz (Votava et al., 2003). C. trachomatis je obligátně intracelulární parazit patogenní pouze pro člověka. Obsahuje DNA i RNA. Jako prokaryotický organismus syntetizuje bílkoviny a nukleové kyseliny vlastními ribozomy a enzymy. Není vybaven vlastním systémem pro tvorbu ATP (adenosintrifosfát) a proto k metabolickým procesům vyuţívá ATP napadené hostitelské buňky (Mašata et al., 2001). 10

12 2.2.1 Morfologie Chlamydie v závislosti na růstovém cyklu existují ve dvou rozdílných morfologických formách. Malé infekční EB (elementární tělísko, nm) a větší neinfekční RB (retikulární tělísko, nm)(förstl et al., 2004). Elementární tělíska Jádro EB tvoří kondenzovaná DNA. Před negativními vlivy extracelulárního prostředí je EB chráněno rigidní buněčnou stěnou s četnými disulfidickými vazbami v hlavním komplexu vnějších membránových proteinů (Major Outer Membrane Protein MOMP), který je základním druhově specifickým antigenem a vyuţívá se v metodách laboratorní diagnostiky (Medková et al., 2001; Mašata, 2001). Retikulární tělíska RB je neinfekční, osmoticky fragilní a intenzivně dělící se struktura s difúzně rozptýlenou DNA (usnadnění transkripce a translace). Cylindrické struktury v buněčné membráně RB v místě styku s endosomem umoţňují příjem ţivin z cytoplazmy hostitelské buňky (Votava et al., 2003) Životní cyklus Ţivotní cyklus s rozmnoţováním je unikátní a zcela odlišný od jiných mikroorganismů (Obr. 2)(Bednář et al., 1996). Extracelulárně se chlamydie vyskytují ve formě infekčního, metabolicky inaktivního EB (elementárního tělíska). Průnik EB do buňky je zprostředkován přes receptor endocytosou. Schopnost zamezit fúzi endosomu s lysosomem chrání intracelulární chlamydie před baktericidními účinky lysosomů hostitelské buňky. Za několik hodin po infikování buňky se EBs přemění v metabolicky aktivní neinfekční RBs (retikulární tělíska), která se v endosomu binárně dělí v následujících hodinách, přičemţ energeticky vyčerpávají hostitelské buňky. Endosom se zvětšuje a můţe být viditelný ve světelném mikroskopu jako intracelulární inkluse (inklusní tělísko). Nově vzniklá RBs zpět kondenzují na EBs, která se uvolní do okolí rozpadem infikované hostitelské buňky. Tímto končí růstový cyklus chlamydií, jehoţ délka je hodin. Vyloučená EBs infikují další vnímavé buňky (Votava et al., 2003). Pokud vypuzuje napadená buňka dlouhodobě EBs exocytosou do okolí 11

13 a nedojde k apoptóze, je moţný rozvoj permanentní buněčné infekce (tzv. perzistentní formy). Tyto formy přeţívají intracelulárně aţ několik let a nedochází k jejich dělení. Mají schopnost se přeměnit zpět do aktivních RBs (Pinkavová a Koliba, 2007). Obr. 2. Vývojový cyklus C.trachomatis v ideálních podmínkách (převzato z ) Charakteristika antigenních struktur Antigenní struktura chlamydií je sloţitá. Společným znakem je rodově specifický povrchový lipopolysacharidový antigen (LPS). Proteinové antigeny vnější membrány (MOMP) reprezentují základní druhově a typově specifické antigeny (Mahony et al., 2003). LPS povrchový lipopolysacharid patří k endotoxinům gramnegativních bakterií. Specifická chemická struktura molekuly, která je sloţena z hydrofobní, lipidové a hydrofilní polysacharidové části, odlišuje LPS chlamydií od LPS jiných gramnegativních bakterií. Proto má niţší endotoxinovou aktivitu, která vede k mírnému, ale trvalému zánětu. LPS je významným aktivátorem makrofágů a lymfocytů (Greenwood et al., 1999; Tobias, et al., 1999). MOMP (Major Outer Membrane Protein) je komplex druhově specifických imunologicky dominantních antigenů vnější membrány. Plní funkci chlamydiového adhesinu a můţe ovlivnit propustnost buněčné stěny. Protilátky proti tomuto komplexu se povaţují za 12

14 protektivní a jsou diagnosticky významné (Bednář et al., 1996; Teislerová a Ţampachová 2007). MIP (Macrofage Infectivity Potentiator) je typický faktor virulence intracelulárních patogenů. Jde o membránový protein, který je přítomen na RBs i EBs, umoţňuje chlamydiím přeţívat v makrofázích a podpořit vznik perzistentní infekce (Lundemose et al., 1992; Teislerová a Ţampachová 2007). chsp60 (chlamydiový protein tepelného šoku) je imunogenní, má vliv na poškození tkáně při chronické infekci (autoimunitní zánět, navozený mechanismem zkříţené reaktivity s hhsp, protoţe chsp vykazuje 48% homologii s lidským hhsp). Přítomnost lokálních endocervikálních protilátek proti chsp a hhsp souvisí s poruchami reprodukce u ţen (Medková, 2004). Obecně HSP (Heat Shock Protein-protein tepelného šoku) patří k fylogeneticky starým proteinům s fyziologickou funkcí chaperonů, exprimovaných prokaryoty i eukaryotickými organismy ve stresových podmínkách (Teislerová a Ţampachová, 2007) Sérotypy a patogenita Typově specifické proteinové antigeny na povrchu EBs rozdělují C. trachomatis na 18 sérotypů s různou patogenitou. Sérotypy A, B, Ba a C jsou příčinou trachomu. Sérotypy L1, L2, L2a a L3 způsobují lymfogranuloma venerum. Sérotypy D-K jsou původci očních a urogenitálních infekcí (Bednář et al., 1996; Votava et al., 2003) Struktura genomu Genom chlamydií patří k nejmenším v říši bakterií. DNA Chlamydia trachomatis je tvořena nukleoidem o molekulové hmotnosti 7 x Bakteriální chromosom čítá 1,042,519 bp a kóduje cca 875 proteinů (Kalman et al., 1999). 98% kmenů C. trachomatis obsahuje extrachromosomální DNA, tzv. kryptický plasmid. Byly však také popsány vzácné kmeny bez plasmidů a to u sérotypů L2, D a E (Peterson et al., 1990). Kryptický plasmid nese geny pouze pro svoji existenci, má velikost 7,493 bp a vyskytuje se v počtu aţ 10 kopií na genom (Pickett et al., 2005). Analýza polymorfismu genomové a plasmidové DNA různých kmenů C. trachomatis ukázala, ţe fylogeneze genomu je velmi pevně vázána s fylogenezí kryptického plasmidu. 13

15 Tento jev ukazuje, ţe kryptický plasmid se nechová jako mobilní element a jeho horizontální přenos mezi kmeny je velmi vzácný (Seth-Smith et al., 2009). Kryptický plasmid je oblíbeným cílem molekulárně diagnostických metod. Větší počet plasmidů v přepočtu na 1 genom umoţňuje, v porovnání s diagnostickými metodami zacílenými na genomovou DNA, mnohem vyšší sensitivitu vyšetření. Diagnostika infekce C. trachomatis zaloţené na detekci kryptického plasmidu nese riziko falešně negativních výsledků v případě infekcí kmeny bez plasmidů. Proto některé diagnostické soupravy (Qiagen, GeneProof) vyuţívají simultánní detekce kryptického plasmidu a genomové DNA. Dalším problémem je zacílení detekce DNA plasmidu do vhodné sekvence. Např. CDS2 kódující sekvence kryptického plasmidu je vysoce konzervativní a tudíţ vhodná pro detekci (Seth-Smith et al., 2009). Zacílení diagnostické metody do variabilní oblasti plasmidu můţe vést k falešně negativním výsledkům a rozšíření takto unikajícího kmene v populaci. V roce 2006 byl ve Švédsku popsán nový kmen C. trachomatis patřící k sérotypu E (Ripa et al., 2006; Herrmann et al., 2008). Tento kmen nese kryptický plasmid s charakteristickou delecí o velikosti 377 bp (Ripa et al., 2007). Selhání diagnostických metod zacílených do této deletované oblasti kryptického plasmidu vedlo k signifikantnímu rozšíření tohoto nového kmene C. trachomatis, přičemţ v některých oblastech Švédska infekce tímto kmenem dosahuje 20 64% všech infekcí C. trachomatis (Herrmann et al., 2008). 14

16 3 Patogeneze a klinický význam onemocnění 3.1 Infekce vyvolané sérotypy D-K Antigenní výbava chlamydií a schopnost intracelulárního přeţívání v napadených buňkách má za následek často bezpříznakový průběh urogenitální infekce, s kolísavou zánětlivou aktivitou a významnou fibroprodukcí. Klinická manifestace bývá opoţděná a dostaví se aţ v důsledku morfologické a funkční změny orgánové tkáně (Tab. 2)(Medková, 2004; Pinkavová a Koliba, 2007). Výsledkem jsou mnohdy závaţná postiţení reprodukčních orgánů u obou pohlaví (Toršová, 2004). Tab. 2. Projevy infekce C. trachomatis v dospělosti (Medková, 2004). Muži Ženy uretritis prostatitis epididymitis proctitis perihepatitis (Fitz-Hugh-Curtisův syndrom) cervicitis endometritis salpingitis periadnexitis uretritis perihepatitis(fitz-hugh-curtisův syndrom) arthritis: Reiterův syndrom infekční arthritis reaktivní postinfekční arthritis conjuktivitis arthritis: infekční arthritis reaktivní postinfekční arthritis (Reiterův syndrom zřídka) conjuktivitis proctitis Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u žen U ţen chlamydie infikují buňky jednořadého cylindrického epitelu děloţního čípku. Dochází k rozvoji mukopurulentní cervicitidy (Pinkavová a Koliba, 2007). Aţ 10% neléčených infekcí vyústí v endometritidu nebo salpingitidu, které se manifestují nepravidelným děloţním krvácením, abdominálními a pánevními bolestmi (PID). Tyto symptomy vedou k závaţným komplikacím v reprodukci, mimoděloţnímu těhotenství i k tubární sterilitě (Toršová, 2004) % chlamydiových infekcí děloţního hrdla je vysoce rizikovým faktorem pro vyvolání předčasného porodu. Intracelulární zánět stimuluje lokální tvorbu prostaglandinů E 15

17 a F, které ovlivňují mechanismus vedoucí k předčasným kontrakcím dělohy. Moţnost přechodu infekce na plodové obaly je rizikem ruptury s odtokem plodové vody. Matkám s chlamydiovou infekcí se aţ v 60% mohou narodit děti s nízkou porodní hmotností (Toršová, 2004) Peripatální přenos infekce z matky na dítě Infekce v oblasti čípku se cca v 50-70% přenáší během porodu na novorozence. U 18-50% dětí se vyvine konjuktivitida, u 15-20% je kolonizován nosohltan a v 5-20% vzniká atypická pneumonie (Pinkavová a Koliba, 2007). Chlamydiová infekce oka se u novorozence vyvíjí nejčastěji den po porodu. Závaţné komplikace (zjizvení spojivky či rohovky) jsou vzácné. K rozvoji chlamydiové pneumonie dojde mezi týdnem ţivota s nespecifickými klinickými symptomy. U neléčených dětí můţe infekce dlouhodobě perzistovat a vyústit v chronickou obstrukční pulmonální nemoc nebo v astma. Novorozenci infikovaných matek mají často kolonizován i genitální trakt (Pinkavová a Koliba, 2007). Byla popsána i těţká diseminovaná infekce novorozence s pozitivní DNA C. trachomatis v moči a v likvoru (Medková et al., 2001) Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u mužů U muţů chlamydie infikují epitel močové trubice se vznikem uretritidy a dysurie. Ve 30-50% probíhá zánět asymptomaticky (Pinkavová a Koliba, 2007). Průnikem do oblasti varlete a nadvarlete mohou chlamydie způsobit obstrukci chámovodů (Black, 1997). Při postiţení parenchymu varlat jsou pozorovány změny spermiogramu. Prodělaná epididymoorchitis můţe být příčinou obstrukční azoospermie s následnou sterilitou. Je prokázána souvislost mezi hladinou antichlamydiálních protilátek ve spermatu a tubární sterilitou ţeny (Mašata et al., 2001). Infekce uretry můţe být provázena konjuktivitidou a reaktivním zánětem synovie velkých kloubů (Reiterův syndrom)(pinkavová a Koliba, 2007) Konjuktivitida u dospělých Onemocnění se vyskytuje u sexuálně aktivních osob a přenáší se z genitálu do oka. Akutně probíhá jako inkluzní konjuktivitida, která se většinou vyhojuje bez následků (Votava et al., 2003). 16

18 3.1.5 Riziko vzniku karcinomu děložního hrdla Cervikální chlamydiová infekce je v současnosti povaţována za jeden z faktorů zvyšujících riziko vzniku karcinomu děloţního hrdla ze skvamózních buněk (SCC- Squamous Cell Carcinoma). C. trachomatis inhibuje apoptózu hostitelských buněk a vzniká chronická perzistentní infekce, která by mohla zahájit a podporovat karcinogenezi. Asociace s SCC je sérotypově specifická, pravděpodobně jde o sérotyp G. S větším počtem prodělaných infekcí během ţivota, stoupá i riziko pravděpodobnosti SCC (Moss, 2006). 3.2 Endemické nákazy Trachom Sérotypy A, B, B a, C C. trachomatis vyvolávající trachom (Obr. 3) jsou v hyperendemických oblastech nejčastější příčinou slepoty (Greenwood et al., 1999; Bednář et al., 1996), která se vyvíjí pomalu let. Rezervoárem akutní infekce bývají děti. Přenos je moţný přímým kontaktem nebo přes infikované mouchy, které nasedají na oči. Jde o chronickou keratokonjuktivitidu vedoucí k loţiskovým nekrózám a jizvám na spojivce. Důsledkem je stočení víčka s abrazí rohovky řasami, takţe dochází k jejímu zakalení a slepotě. (Greenwood et al., 1999; Votava et al., 2003). Obr. 3. Oko postižené trachomem (převzato z 17

19 3.2.2 Lymfogranuloma venerum Sérotypy L 1, L 2, L 2a, L 3 C. trachomatis jsou brány jako invazivní samostatný biotyp (LGV). Způsobují klasickou venerickou nákazu lymphogranuloma venerum s výskytem v hyperendemických oblastech. Onemocnění začíná vředem na genitálu s regionální lymfadenopatií a vznikem bubonů. Důsledkem je destruktivní zánět s následným zjizvením tkáně genitálu a recta (Greenwood et al., 1999; Votava et al., 2003). Venerický lymfogranulom a trachom se v našich podmínkách prakticky nevyskytují, endemické jsou v tropech a subtropech (Votava et al., 2003). 18

20 4 Epidemiologie a prevalence sérotypy D-K Nejvyšší výskyt infekce je u mladých lidí ve věku let. Ročně se nakazí v Evropě 3 miliony, v USA aţ 4 miliony lidí (Obr. 4; Obr. 5). Cena jejich léčby je odhadována na více neţ 2 miliardy dolarů. Dle WHO vzniká kaţdoročně přibliţně 90 milionů infekcí C. trachomatis. Vyskytuje se 4krát častěji neţ kapavka a 30krát častěji neţ syfilis (Jarčuška et al., 2009). V ČR není v současnosti prevalence infekce přesně známa. Nákazy nepodléhají povinnému hlášení a systematický screening se neprovádí (Medková et al., 2001) na rozdíl od jiných vyspělých států (USA, Velká Británie, Švédsko) (Pinkavová a Koliba, 2007). Obr. 4. Případy pohlavně přenosných chorob v USA ( ) (převzato z Obr. 5. Případy pohlavně přenosných chorob ve Velké Británii ( ) (převzato 19

21 5 Imunologie Chlamydie jsou adaptované na ţivot v eukaryotických buňkách včetně monocytů, makrofágů, dendritických buněk a jiných buněk spolupracujících s imunitním systémem. Po invazi chlamydií do organismu proběhne humorální a buněčná imunitní odpověď (Jarčuška et al., 2009). 5.1 Imunitní odpověď hostitelského organismu V první fázi infekce se zapojují mechanismy nespecifické buněčné i humorální imunity (komplementový systém, MBL, cytokiny, NK-buňky, neutrofily, monocyty a makrofágy). MBL (sérový lektin vázající manózu) zabraňuje vazbě infekčního EB na hostitelskou buňku a tím invazi patogena. Makrofágy fagocytují EBs a mohou být jimi i infikovány. Makrofágy (APC - Antigen Present Cells ) prezentují zpracované antigeny chlamydií prostřednictvím HLA (antigeny lidských leukocytů) komplexu II. třídy Th lymfocytům CD4+ (Medková 2004a). Tak je zahájena humorální specifická (protilátková) imunitní odpověď, s následnou tvorbou slizničního IgA, cirkulujícího IgM a IgG (Jarčuška et al., 2009). Protilátky jsou tvořeny jak proti LPS (lipopolysacharid), tak proti komplexu hlavních membránových proteinů (MOMP). IgG protilátky jsou schopny neutralizace infekčních forem (EBs), ale vzhledem k sérotypové specifitě nezaručí ochranu před reinfekcí jiným kmenem (Šimko, 1999; Toršová, 2004). Výkonnými efektorovými buňkami buněčné imunitní odpovědi jsou aktivované makrofágy a CD8+ lymfocyty. INFγ (interferon gama, produkt Th1 lymfoctů) aktivuje infikované i neinfikované makrofágy k intracelulární mikrobicidii. Nízká hladina tohoto působku můţe souviset s perzistentními formami (Medková et al., 2001; Medková, 2004a; Jarčuška et al., 2009). 5.2 Imunopatologie Nejsou-li imunitní pochody optimálně vyváţeny, můţe dojít k přechodu fyziologické obranné reakce v patologický proces, kterým je chronický zánět. Vazivovatění tkáně a moţnost autoimunitního onemocnění jsou jeho hlavním rysem (Medková et al., 2001; Medková, 2004; Pinkavová a Koliba, 2007). Antigenní výbava chlamydií je riziková a souvisí s indukcí autoimunitního zánětu proti hhsp (lidský protein tepelného šoku) v důsledku zkříţené reakce s chsp (chlamydiový protein tepelného šoku), který má schopnost 20

22 protahované prozánětlivé reakce. Tento imunopatologický proces souvisí i s poruchami reprodukce u ţen. Polyklonální aktivátor makrofágů a lymfocytů LPS (chlamydiový lipopolysacharid) je schopen vazby na CD14 receptor makrofágů. Receptor CD14 je i součástí membrány fibroblastů (buňky chronického fibroproduktivního zánětu). LPS stimuluje fibroblasty k produkci TGFβ (transformující růstový faktor β ) a následkem tohoto procesu dochází k nadměrné tvorbě vaziva ve tkáni (Medková, 2004). 5.3 Individuální imunitní reakce Průběh chlamydiové infekce ovlivňuje i individuální imunitní reakce hostitele. Primárně je určena geneticky. U konkrétního jedince je její aktuální stav výsledkem interakce genetické dispozice a jiných (negenetických) vlivů. Předmětem výzkumu je asociace určitých typů alel HLA s jednotlivými klinickými projevy chlamydiových infekcí. Známý je vztah mezi pozitivitou znaku HLA-B27 a reaktivní chlamydiovou artritidou. HLA-DQ lokusy (DQA*0102, DQB*0602 ) jsou zkoumány u ţen s tubární infertilitou (Medková et al., 2001). 21

23 6 Prevence a terapie 6.1 Primární a sekundární prevence Primárně se prevence týká zábrany přenosu infekčního agens na zdravou osobu a sekundárně brání přechodu infekce do chronického stadia (Medková et al., 2001). Vyhledání a včasná léčba nakaţených osob je nejrychlejší způsob, který vede ke sníţení moţnosti dalšího přenosu (Pinkavová a Koliba, 2007). Nezastupitelnou roli má zdravotní a sexuální výchova mladých lidí (Medková, 2004). Jednou z moţností prevence dle odborníků z Velké Británie (1998) je tzv. oportunní screening, který doporučuje k vyhledávání tyto skupiny (Tab. 3)(Medková, 2004). Tab. 3. Kategorie osob pro oportunní screening (upraveno podle Medková, 2004). Osoby trpící příznaky chlamydiové infekce ţeny se zánětlivým pánevním onemocněním (PID) muţi s nespecifickou uretritidou kojenci s konjuktivitidou a jejich rodiče pacienti s STD ţeny před interrupcí sexuální partneři infikovaných osob Asymptomatické osoby sexuálně aktivní ţeny do 25 let ţeny nad 25 let s novým sexuálním partnerem, nebo více partnery pozitivní případy předat gynekologovi či urologovi za účelem dohledání a léčby asymptomatických případů u muţů 6.2 Volba vhodné diagnostiky Vhodně zvolená diagnostika je důleţitou součástí prevence. Molekulárně biologickými metodami, detekujícími specifický úsek DNA C. trachomatis, je odhaleno 92-99% akutních převáţně asymptomatických infekcí. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena (Medková et al., 2001; Toršová, 2004). 6.3 Otázka vakcinace Vývoj efektivních očkovacích látek je ve fázi intenzivního výzkumu. Dekódováním genomu C. trachomatis se otevřely nové moţnosti pro vývoj účinné vakcíny (Pospíšil a Zralý, 2000). Perspektivně se jeví moderní typy očkovacích látek (např. DNA vakcíny či vakcíny 22

24 antiidiotypové)(medková, 2004). Problémem zůstává odlišnost jednotlivých chlamydiových sérotypů a také individualita v imunitní odpovědi jedinců (Pinkavová a Koliba, 2007). 6.4 Terapie Základem léčby je včasná identifikace osob s akutní chlamydiovou infekcí, jejich správné přeléčení včetně všech sexuálních partnerů. Nevyhnutelné je se zdrţet veškerých sexuálních aktivit. Metoda PCR (polymerázová řetězová rekce) je doporučována ke kontrole efektivity léčby (Jarčuška et al., 2009). Antibiotickými preparáty první volby v léčbě onemocnění jsou makrolidy, tetracykliny nebo systémové chinolony. Důleţitá jsou farmakokinetická a farmakodynamická kritéria (velmi nízká minimální inhibiční koncentrace - účinná na chlamydie a vysoké koncentrace antibiotika přímo v buňkách infikované tkáně). Preparáty působí jen na RBs (replikace DNA), proto je důleţité, aby účinná koncentrace přetrvávala v infikované buňce po dobu několika vývojových cyklů (Toršová, 2004). Např. makrolidy jsou v infikované tkáni fagocytovány makrofágy, které jsou chemotakticky přitahovány k místu infekce, kde se projeví jejich účinnost i imunomodulační schopnosti (Medková et al., 2001; Jarčuška et al., 2009). Délka léčby makrolidy u nekomplikovaných infekcí je u ţen 7 dní u muţů 10 dní. Závaţným problémem zůstává léčba chronických infekcí. Přítomnost srůstů ve tkáních nebo opouzdřených abscesů, vyţaduje mnohdy chirurgický zákrok. Univerzální indikace na podávání antibiotik neexistuje. Platí, ţe léčba ţen by měla trvat dní a muţů aţ 21 dní, častá je kombinace antibiotik doporučená specialistou (Medková et al., 2001; Miller, 2006). 23

25 7 Laboratorní diagnostika 7.1 Nepřímá diagnostika Zahrnuje detekci protilátek proti rodově i druhově specifickým antigenům C. trachomatis. Jedná se o tzv. nepřímý průkaz (průkaz protilátek, sérologické testy), které mají v případě lokalizované urogenitální infekce nízkou výpovědní hodnotu (Votava et al., 2003). Z krevního séra se vyšetřují izotopy IgA a IgG, IgM (Medková et al., 2001). Při průkazu specifických protilátek je vţdy nutné si uvědomit: tzv. diagnostické okno, tj. dobu uběhlou od nákazy do vytvoření detekovatelného mnoţství sérových protilátek, kdy se u lokálního zánětu protilátková odpověď vůbec nemusí dostavit. anamnestické protilátky IgG mají informativní charakter; vyjadřují, zda se pacient s infekcí setkal a nevylučují ani nepotvrzují aktivní infekci. pozitivita IgM nebo sérových IgA informuje o primoinfekci, reinfekci nebo chronické infekci; jejich negativita nikdy nevylučuje akutní lokální infekci; dlouhodobé přetrvávání protilátek je interpretačním problémem (Förstl et al., 2004). sérologie má význam při detekci chlamydiové pneumonie u primoinfekce novorozenců, kde prokazujeme IgM (Votava et al., 2003) Nepřímá imunofluorescence Jde o sérologickou reakci k průkazu druhově specifických protilátek v séru. Antigenním substrátem jsou purifikované EBs. Přítomná protilátka v séru se naváţe na antigenní strukturu a vytvoří se imunokomplex AgxAb (antigen-protilátka). Po aplikaci konjugátu značeného fluorochromem dojde k vazbě na antigenní struktury, které ve fluorescenčním mikroskopu fluoreskují (Mahony et al., 2003) ELISA Jedná se o imunoanalytickou metodu. Antigen je imobilizován na pevném nosiči (jamka mikrotitrační destičky). Pokud jsou v testovaném séru přítomny specifické protilátky, vytvoří se imunokoplex AgxAb. Po aplikaci konjugátu značeného enzymem, inkubaci a přidání 24

26 substrátu dojde k enzymatické reakci. Substrát je přeměněn na barevný produkt, jehoţ intenzita se detekuje spektrofotometricky (ELISA reader) Western blot Proteinové antigeny chlamydií jsou rozděleny elektroforeticky na SDS-PAGE podle molekulové hmotnosti a poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu v tzv. elektroblotu. Nitrocelululozový prouţek je ponořen do pufrem ředěného vyšetřovaného séra. Po inkubaci se místa s navázanými protilátkami proti jednotlivým rodovým i druhovým antigenům (MOMP, chsp, MIP) vizualizují prostřednictvím konjugátu (zvířecí protilátky proti lidskému Ig) značené enzymem. Po přidání substrátu dojde k enzymatické reakci a v místech, kde došlo ke specifické vazbě AgxAb je patrná barevná zóna pozitivní reakce. Podle přiloţené šablony lze odečíst přítomnost protilátek. WB (western blot) se vyuţívá k průkazu chronických a perzistujících infekcí jako konfirmační test (Litzman et al., 2003; Teislerová a Ţampachová, 2007). 7.2 Přímá diagnostika Infekční agens se detekuje přímo z klinického materiálu. Hlavní podmínkou je správně provedený odběr. Druh klinického materiálu a typ odběrového setu musí být kompatibilní s daným laboratorním testem. Vzhledem k nitrobuněčné lokalizaci C. trachomatis, musí být stěr proveden tak, aby došlo k abrazi buněk sliznice (Mahony et al., 2003) Kultivace na tkáňové kultuře Klinické vzorky se kultivují na tkáňové kultuře (Hep-2 a HeLa buňky) ošetřené cykloheximidem, který eliminuje metabolismus hostitelských buněk (Mahony et al., 2003). Centrifugací se dosáhne adheze chlamydií na buňky tkáňové kultury. Po inkubaci (48-72h) dojde k vytvoření intraplasmatických inkluzí, které lze detekovat fluorescenčně značenými monoklonálními protilátkami, barvením Lugolovým roztokem či Giemsou. Metoda je technicky i časově náročná, obtíţně standardizovatelná a finančně nákladná. Klade vysoké nároky na transportní podmínky. Z těchto důvodů se v rutinní diagnostice nevyuţívá (Mahony et al., 2003; Votava et al., 2003). 25

27 7.2.2 Metody detekce antigenu Přímá mikroimunofluorescence MIF Po aplikaci a fixaci vzorku na podloţní sklo se přidá monoklonální protilátka proti hledanému antigenu C. trachomatis značená fluoresceinem. Pokud je antigen ve vzorku přítomen, dojde k fluorescenci, kterou lze pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu (Black, 1997; Mahony et al., 2003). Metoda EIA Monoklonální protilátka proti LPS chlamydiovému antigenu je navázána na pevnou fázi. V přítomnosti hledaného antigenu ve vzorku se vytvoří komplex AbxAg. Vazbou konjugátu a následně substrátu, dojde k vytvoření barevného produktu, jehoţ intenzitu lze změřit např. spektrofotometricky. Konfirmace monoklonálními protilátkami proti specifickému epitopu LPS C. trachomatis bývá nutná k vyloučení falešně pozitivních výsledků (zkříţená reaktivita s jinými gramnegativními bakteriemi)(barnes, 1989). 7.3 Molekulárně biologické metody Metody přímého průkazu popsané v předchozí části (viz. 7.2) jsou charakteristické svými nároky na transport, uchování vzorku, techniku zpracování a standardizaci. Vykazují pouze % citlivost, proto jsou nahrazovány vysoce specifickými metodami molekulárně biologickými, které umoţňují přímý průkaz DNA patogena (Mahony et al., 2003). Dělí se na metody bez amplifikace (namnoţení) úseku nukleové kyseliny a metody amplifikační Metody bez amplifikace Příkladem je metoda tzv. hybridizace se sondami. Hybridizační sondy jsou krátké úseky nukleových kyselin (20-50 nukleotidů) schopné specifické vazby s komplementární sekvencí úseku nukleové kyseliny patogena za tvorby stabilního dvouřetězcového komlpexu tzv. hybridu. Sensitivita testu je cca 10 4 molekul nukleové kyseliny na 1 ml vzorku a postačuje pouze k ozřejmění genetické příslušnosti vykultivovaného mikroba. K průkazu infekčního agens v klinickém materiálu je tato detekční mez nedostatečná, proto je vhodné pouţívat metody s amplifikací úseku nukleové kyseliny (Pavlík, 2. část). 26

28 7.3.2 Amplifikační metody Amplifikační metody (NAATs -Nucleic Acid Amplification Tests), např. LCR (Ligázová řetezová reakce) a PCR (Polymerázová řetězová reakce) jsou preferovány pro svou vysokou citlivost (92-99%) a specificitu (Mahony et al., 2003; Van Der Pol, 2006). Jedinečný úsek nukleové kyseliny patogena je exponenciálně amplifikován aţ do dosaţení potřebného mnoţství kopií, které jsou detekovatelné zvoleným systémem (Šmarda et al., 2008) LCR (Ligase Chain Reaction) Ligázová řetezová reakce (LCR) byla prvně popsána v roce 1989 Wuem a Walacem (Pavlík, 7. část). Jde o metodu amplifikace sondy zaloţené na ligaci oligonukleotidových sond v závislosti na jejich vazbě na cílovou DNA. LCR vyţaduje čtyři oligonukleotidy (LCRprimery). Dva sousední, které specificky hybridizují k jednomu řetězci cílové DNA a další komplementární dvojici sousedních oligonukleotidů (Šmarda et al., 2008). Komerční soupravy na podkladě LCR uvedla na český trh firma Abbott Laboratories,s.r.o. v r K detekci byl pouţit adaptovaný systém MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay), vyuţívající mikročástice s magnetickým jádrem a sond značených hapteny. Starší evaluační studie diagnostických LCR souprav pro STD deklarovaly jako hlavní výhodu LCR oproti PCR niţší výskyt inhibic. Tento závěr je diskutabilní. Systém LCR neobsahoval IS (interní standard), proto nemohla být inhibice DNA polymerasy prokázána (Pavlík, 7část). Nemoţnost kvantifikace produktů reakce, absence interního standardu a obtíţná inaktivace postamplifikačních produktů tento systém vyřadila z rutinní klinické diagnostiky (Hayden, 2004) PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR byla koncipována v r Kary B. Mullisem (Nobelova cena za chemii v r. 1993). Podstatou reakce je opakující se enzymová syntéza nových řetězců specifických úseků DNA ve směru 5 3 prostřednictvím DNA polymerasy. Inkriminovaný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů, které se váţou na protilehlé řetězce DNA tak, ţe jejich 3 konce směřují proti sobě. Jde o proces, při kterém se v závislosti na teplotě reakční směsi pravidelně střídají tři cyklicky se opakující kroky (Obr. 6), v průběhu kterých probíhají tři odlišné děje s odlišnými nároky na teplotu. Konečným produktem PCR jsou amplikony (fragmenty DNA) definované délky (desítky aţ tisíce bp) (Šmarda et al., 2008). 27

29 Obr. 6. Schéma standardní PCR (upraveno podle 1. denaturace DNA (94-98 C) rozdělení řetězců DNA 2. anealing (30-65 C) připojení primerů k odděleným řetězcům DNA 3. extense (72 C) syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA polymerasy Real-time PCR Nejpouţívanější aplikace PCR v současné době. Umoţňuje průběţné sledování reakce tzv. v reálném čase" pomocí fluorescenčních sond (TaqMan TM sondy, sondy molecular beacons, sondy Scorpions aj.). V kaţdém cyklu reakce je fluorescence detekována a hodnoty se zaznamenávají do grafu. Výsledkem pozitivní amplifikace je typická amplifikační křivka (Obr. 7). K hlavním výhodám oproti konvenční PCR patří moţnost přesného stanovení výchozího počtu kopií sekvence DNA, vysoká specifita, reprodukovatelnost, niţší časová náročnost a niţší pravděpodobnost kontaminace amplifikačními produkty (Wittwer a Kusukawa,2004). Amplifikační křivka Čím dříve amplifikační křivka dosáhne exponenciální fáze, popř. překročí určitý fluorescenční práh umístěný do této fáze, tím více startovních templátových molekul bylo přítomno ve vzorku na počátku reakce (Wittwer a Kusukawa, 2004). 28

30 Obr. 7. Model amplifikační křivky (upraveno podle 1. background" fluorescence ještě nedosahuje měřitelných hodnot 2. exponenciální fáze nárůst produktu 3. fáze plató mnoţství amplifikovaného produktu se z důvodu vysycení reakčních sloţek jiţ nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní Ct treshold cycle "(fluorescenční práh) Možnost kvantifikace metodou real time PCR Absolutní kvantifikace (Obr. 8), která se pouţívá např. při detekci DNA mikroorganismů, přímo determinuje výchozí počet kopií cílových molekul. Existuje lineární vztah mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a C t (treshold cycle-fluorescenční práh) příslušné amplifikační křivky. Amplifikujeme-li vzorek o neznámé koncentraci společně s naředěnou sérií standardů o známé koncentraci, získáme kalibrační přímku, ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku (Wittwer a Kusukawa, 2004). A) B) Obr. 8. Modelové křivky absolutní kvantifikace (upraveno podle A) ukázka amplifikace 3 kontrol o různých koncentracích vstupní DNA B) kalibrační křivka s vynesenými hodnotami Ct pro jednotlivé vzorky proti jejich koncentracím 29

31 8 Správná laboratorní diagnostika PCR C. trachomatis Metodika provádění PCR klade extrémní nároky na dodrţování správné laboratorní práce. Počínaje preanalytickou fází, která je prezentována správnou indikací a samotným odběrem klinického materiálu za pouţití vhodné odběrové soupravy (Black, 1997; Mahony et al., 2003). 8.1 Preanalytická fáze Správně provedený odběr je klíčovým momentem v preanalytické fázi a výrazně ovlivňuje validitu výsledku vyšetření. K průkazu DNA C. trachomatis se nehodí bakteriologické transportní media (obsahují inhibitory) (Votava, 2001). Vzhledem k nitrobuněčné lokalizaci chlamydií, je nutné odběry provádět razantně, aby došlo k abrazi slizničních buněk (Black, 1997) Typy klinických materiálů a technika odběru výtěr z cervixu - po odstranění exocervikálního hlenu se provede výtěr z endocervixu abrazivním tamponem nebo kartáčkem rotačním pohybem po dobu 20 sekund výtěr z uretry (ženy i muži) - odběr z uretry se provádí abrazivním tamponem, šroubovitým vsunutím do hloubky 3-4 cm (před odběrem 2 hodiny nemočit) stěry ze spojivky - pro diagnostiku očních infekcí se odebere tekutina nebo se provede stěr ze spojivkového vaku či z rohovky moč - pro vyšetření moče se odebírá ml první porce (nejlépe první ranní) moče do sterilní nádobky bez transportního media sperma - pro stanovení chlamydiové kontaminace spermatu je třeba vyšetřit 200 μl ejakulátu; odběr se provede do sterilní zkumavky bez transportního media a spermicidů za 2-3 dny po poslední ejakulaci rektální výtěr - stěr se provede do sterilní zkumavky bez transportního media nazofaryngeální výtěr- stěr se provede do sterilní zkumavky bez transportního media 30

32 8.2 Analytická fáze První částí analytické fáze je izolace nukleové kyseliny z primárního vzorku. Laboratoř má moţnost pro izolaci DNA za účelem vyšetření C. trachomatis vyuţít komerčních souprav, které mohou být manuální nebo automatické. Manuální soupravy jsou obecně levnější, ale manipulace s nimi je pracnější, tudíţ nesou vyšší riziko nevalidních výsledků (falešně negativní výsledky, kříţová kontaminace). Automatické izolační systémy přináší výhodu niţší pracnosti a standardnějších výsledků, ale jsou vykoupeny vyšší cenou. Vlastní PCR je další částí diagnostického procesu. Některé laboratoře si pro průkaz C. trachomatis připravují vlastní PCR reakce, tzv. home made metody. Tento přístup přináší výhodu velmi nízké ceny, ale je náročný na vysokou odbornost personálu, pracnost a náročnou kontrolu kvality celého procesu (Friedecký et al., 2004). Z toho důvodu většina laboratoří přechází na vyuţívání komerčních CE IVD certifikovaných souprav Kontrola kvality diagnostického procesu Vnitřní kontrola kvality (VKK) Diagnostický proces musí obsahovat systém kontrol (VKK), který umoţní vyloučit falešně pozitivní a falešně negativní výsledky. Hlavní příčinou těchto nevalidních výsledků bývá kontaminace či inhibice diagnostického systému Kontrola falešně pozitivních výsledků Kontaminace reakce Vysoká specifita a senzitivita metody způsobuje, ţe kontaminace i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA je výsledkem falešně pozitivní reakce. Bývá nejčastěji způsobena kontaminací vzorků amplikony z předchozích reakcí, které jsou ideálními cílovými strukturami pro primery. Pro minimalizaci tohoto problému jsou doporučeny standardní postupy (uspořádání laboratoře, práce v laminárním boxu, pravidelná dekontaminace, vyhrazené sady pomůcek, kvalitní mikrozkumavky, pouţívání špiček s filtrem, minimalizace pipetovacích kroků, častá výměna rukavic, přidávání UDG do vzorku, apod.)(hayden, 2004). K vyloučení falešné pozitivity výsledku z výše uvedených důvodů je doporučeno provádět tyto typy kontrol: 31

33 negativní kontrolu izolace (negativní vzorek, ukazatel moţné kontaminace v průběhu izolace). negativní kontrolu amplifikace (např. destilovaná voda upravená pro PCR, ukazatel moţné kontaminace v průběhu amplifikace, prochází jen druhou analytickou fází) Kontrola falešně negativních výsledků Metodika provádění PCR je citlivá na účinnost izolace DNA a přítomnost inhibitorů DNA polymerasy, které způsobují falešně negativní výsledky. Do diagnostického procesu je nutné zařadit systémy kontrol, které tyto vlivy mohou odhalit. Inhibice reakce interní kontrola inhibice (amplifikace interní kontroly probíhá v jedné zkumavce s testovanou DNA, v případě inhibice DNA polymerasy, vykazuje negativní signál) Neúčinná izolace pozitivní kontrola izolace (pozitivní vzorek, kontroluje správnost provedení celého procesu, neumoţňuje kontrolovat účinnost izolace konkrétního vzorku) interní kontrola izolace (můţe zároveň slouţit jako interní kontrola inhibice, přidává se ke vzorku před izolací, umoţňuje kontrolu účinnosti izolace konkrétního vzorku) Nízká sensitivita PCR reakce pozitivní kontrola (koncentrace kontroly se blíţí prahu detekce pouţité PCR metody) Externí kontrola kvality (EKK) Diagnostické laboratoře mají moţnost ověření kvality svého analytického procesu na panelech EKK (INSTAND e.v-německo; QCMD-Velká Británie). Jedná se o neznámé vzorky s přidaným patogenem. V rámci tohoto systému, tak laboratoře mají jednak moţnost kontroly nad svými postupy a moţnost porovnání kvality výsledků s jinými laboratořemi. 32

34 9 Cíl bakalářské práce Výběr vhodné diagnostiky je základním předpokladem prevence a účinné terapie chlamydiových infekcí. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Pro svou vysokou citlivost a specificitu jsou preferovány především amplifikační metody průkazu nukleových kyselin C. trachomatis zaloţené na polymerázové řetězové reakci (PCR). Klíčovým krokem diagnostického procesu je účinná a sensitivní izolace DNA. V diagnostických laboratořích se především kvůli ceně běţně vyuţívá manuálních metod izolace nukleových kyselin. Stále vyšší poţadavky na standardizaci a kvalitu výsledků poskytovaných diagnostickými laboratořemi vedou k zavádění automatických provozů. Bakalářská práce si z těchto důvodů dává za cíl srovnat účinnost, sensitivitu a variabilitu manuální kolonkové izolace zaloţené na principu vazby uvolněné DNA na ionexovou membránu s automatickou izolací zaloţenou na purifikaci DNA s vyuţitím magnetických částic. 33

35 II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 10 Materiál a metody 10.1 Struktura experimentu Účel testu Srovnání účinnosti a sensitivity manuální kolonkové izolace DNA (Pathogen Free DNA Kit; GeneProof) a automatické izolace zaloţené na purifikaci nukleových kyselin na magnetických částicích (Arrow BUGS n BEADS TM ; NorDiag) Schéma experimentu 1. Sériovým ředěním přirozeně infikovaného vzorku byla připravena koncentrační řada vzorků od nejkoncentrovanějšího nad detekčním limitem po nejméně koncentrovaný pod detekční limit PCR detekční metody. 2. DNA kaţdého takto připraveného vzorku byla izolována 6 krát manuální kolonkovou soupravou GeneProof (M) a 6 krát automatickým izolačním procesem firmy NorDiag (A). 3. Kaţdý izolovaný vzorek byl vyšetřen ve 3 opakováních na přítomnost DNA C. trachomatis metodou real-time PCR certifikovanou soupravou pro in vitro diagnostiku (CE IVD) (Chlamydia trachomatis PCR Kit; GeneProof) (Tab. 4). 4. Hodnocena byla shoda rozloţení pozitivních záchytů u jednotlivých typů izolací. Tab. 4. Schéma experimentu. Ředění pozitivní moče 30x 90x 270x 810x 2430x 7290x Celkový počet izolací Typ izolace* M A M A M A M A M A M A M A Počet opakování izolace pro každé ředění Počet opakování PCR vyšetření každého izolovaného vzorku Celkový počet PCR vyšetření pro každý typ izolace a ředění Celkový počet PCR vyšetření

36 10.2 Příprava koncentrační řady pozitivního vzorku Sériovým ředěním přirozeně infikovaného vzorku byla připravena koncentrační řada vzorků od nejkoncentrovanějšího vzorku nad detekčním limitem po nejméně koncentrovaný pod detekčním limitem pouţité PCR diagnostické metody (Tab. 5). Tab. 5. Příprava koncentrační řady sériovým ředěním pozitivního vzorku. Faktor ředění 30x 90x 270x 810x 2430x 7290x Moč negativní Moč pozitivní Pozitivního Vzorku č. Vzorku č. Vzorku č. Vzorku č. Vzorku č. vzorku pacienta Konečný objem vzorku Interní standard Alikvotace 6x700 6x700 6x700 6x700 6x700 6x700 6x200 6x200 6x200 6x200 6x200 6x200 Pozn. Objemy jsou uvedeny v µl. Pro přípravu koncentrační řady byl pouţit přirozeně pozitivní vzorek moče pacienta odeslaného na PCR vyšetření na přítomnost DNA C. trachomatis. Tento vzorek byl sériově ředěn v negativní moči zdravého dárce. Ke kaţdému takto připravenému ředění byl přidán interní standard (IS) v poměru 1 µl na 10 µl. vzorku. Interní standard je součástí komerční diagnostické soupravy pro PCR detekci C. trachomatis (Chlamydia trachomatis PCR Kit, kat. č. CHT/ISEX/100, GeneProof a.s.). Jedná se o uměle připravený genetický konstrukt plasmidu a insertu obsahující sekvence komplementární k primerům pouţitým pro PCR detekci DNA C. trachomatis uvedenou komerční diagnostickou soupravou. Kopurifikace interního standardu společně s DNA vyšetřovaného vzorku umoţňuje kontrolu účinnosti izolačního procesu a průběhu PCR reakce. Umoţňuje tedy kontrolovat falešně negativní výsledky z důvodu neúčinné izolace DNA nebo inhibice PCR reakce. Alikvotace a uchování Z kaţdého takto připraveného ředění bylo připraveno 6 alikvotů o objemu 700 µl pro účely automatické izolace nukleových kyselin a 6 alikvotů o objemu 200 µl pro účely manuální izolace DNA. Vzorky byly do zpracování uchovávány při -70 C. 35

37 10.3 Izolace DNA Kaţdé ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku bylo podrobeno 6 opakováním manuální izolace DNA (PathogenFree DNA Isolation Kit; GeneProof) a 6 opakováním automatické izolace nukleových kyselin (Arrow BUGS n BEADS TM ; NorDiag) Tab. 6. Schéma izolačního experimentu. AUTOMATICKÁ IZOLACE Arrow BUGS n BEADS TM Ředění pozitivního vzorku 30x 90x 270x 810x 2439x 7290x Počet opakování izolace Celkem izolací 36 Iniciální objem vzorku 700 µl Eluční objem vzorku 100 µl MANUÁLNÍ IZOLACE PathogenFree DNA Isolation Kit Ředění pozitivního vzorku 30x 90x 270x 810x 2439x 7290x Počet opakování izolace Celkem izolací 36 Iniciální objem vzorku 200 µl Eluční objem vzorku 100 µl Manuální izolace DNA Kaţdé ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku bylo podrobeno 6 opakováním manuální izolace nukleových kyselin komerční soupravou PathogenFree DNA Isolation Kit (GeneProof). Iniciální objem vzorku vstupující do izolace byl 200 µl a purifikovaná DNA byla rozpuštěna ve 100 µl elučního pufru (Tab. 6). Vzorky byly izolovány ve 3 izolačních cyklech po 12 kusech a to tak, ţe v rámci 1 izolačního cyklu byly provedeny 2 izolace kaţdého ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku. Takto zvolený postup umoţňuje sledovat moţnou kříţovou kontaminaci negativních vzorků ze vzorků pozitivních. Princip Kolonková manuální izolace nukleových kyselin soupravou GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit je zaloţena na lýze buněk v prostředí chaotropních iontů a proteinasy K s následnou vazbou uvolněné DNA na ionexovou membránu ve speciální purifikační kolonce, vyčištění vázané nukleové kyseliny promývacími pufry a uvolnění purifikované DNA do elučního pufru (Obr. 9). 36

38 1. Lýza buněk v prostředí chaotropních iontů a proteinasy K při 70 C. 2. Vazba uvolněné DNA na silika membránu v purifikační kolonce. 3. Promytí purifikační kolonky s navázanou DNA promývacími pufry centrifufigací při rpm. 4. Vysušení prázdné kolonky centrifugací při rpm 5. Uvolnění purifikované DNA z ionexové membrány do elučního pufru. Obr. 9. Princip manuální kolonkové izolace Automatická izolace DNA Stejným způsobem bylo kaţdé ředění připravené koncentrační řady podrobeno 6 opakováním automatické izolace nukleových kyselin komerční izolační soupravou Arrow BUGS n BEADS TM (NorDiag) na automatické pipetovací stanici NorDiag Arrow (NorDiag). Iniciální objem vzorku vstupující do izolace byl 700 µl a purifikovaná DNA byla uvolněna do 100 µl elučního pufru (Tab. 6). Automatická pipetovací stanice umoţňuje maximálně 12 izolací v jednom izolačním cyklu. Vzorky byly (stejně jako v případě manuální izolace) zpracovávány ve 3 izolačních cyklech. V rámci 1 izolačního cyklu byly provedeny vţdy 2 izolace kaţdého ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku. Princip Izolační souprava vyuţívá patentované BUGS n BEADS TM technologie. Princip izolace je zaloţen na vyuţití paramagnetických částic k vyvázání mikroorganismů z roztoku, purifikaci jejich nukleových kyselin na těchto částicích a uvolnění vyčištěné DNA do elučního pufru (Obr. 10). Souprava je určena pro automatickou izolaci nukleových kyselin z moče na automatické izolační pipetovací stanici NorDiag Arrow (NorDiag). 37