Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Agronomická fakulta. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Analýza asociací polymorfizmů lokusů C-MYC, GH1 a GH2 s ukazateli jatečné hodnoty u prasat plemene české bílé ušlechtilé Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Dr. Tomáš Urban Vypracovala: Lucie Václavková Brno 2007

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma analýza asociací polymorfismů lokusů C-MYC, GH1 a GH2 s ukazateli jatečné hodnoty u prasat plemene české bílé ušlechtilé vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

3 Děkuji všem, kteří se podíleli na vzniku této práce. Především však děkuji: Dr. Ing. Tomášovi Urbanovi za odborné vedení, které mi ochotně poskytoval v průběhu zpracovávání diplomové práce, svým rodičů a všem blízkým za pochopení, veškerou psychickou podporu a důvěru v dokončení této práce.

4 ABSTRAKT Cílem diplomové práce byla analýza asociací lokusů C-MYC, GH1 a GH2 k ukazatelům jatečné hodnoty. Studie byla provedena na souboru 271 jedinců plemene české bílé ušlechtilé. V letech byly u těchto zvířat zjištěny ukazatele jatečné hodnoty dle normy CSN Vyhodnocovány byly kvantitativní a kvalitativní ukazatele jatečné hodnoty. Charakteristiky kvality svaloviny byly určeny ze vzorku musculus longissimus lumborum et thoracis (MLLT) a genotypy byly stanoveny metodou PCR RFLP z DNA izolované z krve nebo MLLT. Frekvence alel sledovaných lokusů byly: C-MYC A = 0,7193, GH1 + = 0,6894, GH2 + = 0,7556. Asociační analýza byla provedena GLM metodou v programu S.A.S Pro zjištění průkazných rozdílů mezi genotypy byl použit odhad nejmenších čtverců LSM ± S E. Byla nalezena průkazná asociace lokusu C-MYC pouze s ukazatelem živé hmotnosti na jatkách ZIVHM, (P = 0,0307). Vliv lokusu GH1 nedosahoval hranice statistické průkaznosti P 0,05 u žádné proměnné. Lokus GH2 byl statisticky průkazný pouze s ukazatelem hmotnosti JOT za studena HMSC (P = 0,0044). Výsledky ukazují na možnost využití lokusů s průkazným vlivem na jatečné znaky. Klíčová slova: české bílé ušlechtilé prase, asociace genů, jatečná hodnota, C- MYC, GH1, GH2 ABSTRACT The aim of the presented diploma thesis was the analysis of relationship between C-MYC, GH1 and GH2 loci with meat performance traits in pigs. The study was performed on the set of 271 individuals of Czech Large White pig breed. In years , these animals were detected for meat parameters by the norm CSN Quantitative and qualitative traits of carcass were analyzed. The parameters of musculature quality were determined from samples of musculus longissimus lumborum et thoracis (MLLT) and using PCR RFLP method, author determined genotypes from DNA isolated from blood or MLLT. The allele frequencies of studied loci were: C-MYC A = 0,7193, GH1 + = 0,6894, GH2 + = 0,7556. The association analysis was performed by GLM in S.A.S program. For the determination of significant performance differences between genotypes, the estimation of least square means - LSM ± S E

5 was used. The evidential association of locus C-MYC was determined only with live weight animal (P = 0,0307). The influence of GH1 locus did not achieved the significant level P 0,05 is none of variables. Locus of GH2 gene was statistically evidential only with carcass weight. The results demonstrate the possibility of usage of loci with significant influence on the carcass value. Key words: Czech Large White pig, gene association, carcass traits, C-MYC, GH1, GH2

6 SEZNAM ZKRATEK C-MYC Cyst ČBU ČSN D DFD DNA EDTA GH GLM GPD1 HMCKG HMSC HMTC H-W IGF JOT JUT KRK KYTA LA LSM Lys ME lokus myc-protoonkogenu aminokyselina cystin - cystine české bílé ušlechtilé Česká státní norma durok dark firm dry - tmavý, tuhý, suchý deoxyribonukleová kyselina chelaton 3-ethylendiamintetraoctová kyselina lokus růstového hormonu general linear model - zobecněný lineární model glycerolfosfátdehydrogenáza hmotnost hlavních masitých částí hmotnost JOT za studena celkem hmotnost JOT za tepla celkem rovnovážný stav podle Hardy - Weinberga insulinu podobný růstový faktor insulin like growth factor jatečně opracované tělo jatečně upravené tělo krkovička kýta s kostí landrase least square mean - průměr nejmenších čtverců aminokyselina lyzin - lysine metabolizovatelná energie

7 Met MLLT MYO PCR PEC PLEC PSE QTL RFLP RIA RNA SAS SEUROP SSC STH TAE TE TPRUM TRUP VHJ VSŽ ZIVHM aminokyselina methionin - methionine musculus longissimus lumborum et thoracis myoglobin polymerázová řetězová reakce kotleta plec s kostí bez kolínka pale, soft, exudative - bledé, měkké, vodnaté quantitative trait loci - lokus kvantitativních znaků polymorfismus délky restrikčních fragmentů radioimunologická analýza ribonukleová kyselina program pro statistickou analýzu hodnocení jakosti poražených prasat sus scrofa chromozom somatotropin růstový hormon trisacetátový - EDTA elektroforetický pufr tris - EDTA pufr průměrná výška hřbetního tuku délka trupu výkrmnost a jatečná hodnota veškeré stravitelné živiny živá hmotnost na jatkách v kg

8 OBSAH 1 ÚVOD 12 2 CÍL PRÁCE 13 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Plemeno prasat české bílé ušlechtilé Užitkové vlastnosti u prasat Ukazatele výkrmnosti Ukazatele jatečné hodnoty Výtěžnost Jakostní odchylky kvalita masa Kandidátní geny pro masnou užitkovost u prasat Gen MYC proto - onkogen (C-MYC) Genetický polymorfismus GH Asociace genu s užitkovostí u prasat MATERIÁL A METODIKA Zvířata Užitkové vlastnosti Testační stanice Jatečné ukazatele Ukazatele kvality svaloviny Detekce genotypů Izolace DNA DNA test Statistické vyhodnocení Výpočet relativních četností a genotypů alel Hodnocení genetické rovnováhy dle H W zákona Asociační studie 32

9 5. VÝSLEDKY A DISKUZE Frekvence alel a genotypů Frekvence alel a genotypů genu C-MYC Frekvence alel a genotypů genu GH1 (HaeII) Frekvence alel a genotypů genu GH2 (MspI) Asociace vybraných lokusů s jatečnou hodnotou Vztahy s kvantitativními ukazateli Vztahy s kvalitativními ukazateli SHRNUTÍ A ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY 43 SEZNAM TABULEK 47 SEZNAM OBRÁZKŮ 47

10 1 ÚVOD Hlavním hospodářským účelem chovu prasat je produkce vepřového masa pro lidskou výživu. Spotřeba vepřového masa se v různých částech světa značně liší, přesto je ze všech mas z celosvětového pohledu nejoblíbenější. Pro rozvoj chovu prasat je nezbytné, aby po vepřovém mase byla poptávka, která vychází především z jeho bezpečné konzumace a je spojována s naplněním požadavků kvality a cenové dostupnosti. Ve stále vyšší míře však musí produkce masa splňovat další kritéria. Jedná se např. o metody chovu a zacházení se zvířaty během dopravy na jatky a při porážkách podle požadavků welfare a etiky. Naplnění poptávky po kvalitním vepřovém mase bylo v Evropě dosaženo zvýšenou výkonností prasat v ukazatelích reprodukce, výkrmnosti a jatečné hodnoty, včetně kvality masa. Byly při tom uplatněny výsledky výzkumu v genetice a šlechtění, reprodukci, výživě, jatečné hodnotě a v dalších oborech. Cílem těchto opatření není jen biologická odezva, která se projevuje zvyšováním ukazatelů užitkovosti, ale i celková efektivita produkce. Konkurenceschopná produkce bude vyžadovat těsnou integraci mezi šlechtiteli, producenty, výrobci krmných směsí, zpracovateli masa a obchodníky. Pokud mají naši chovatelé obstát v silné konkurenci, musejí produkovat jatečná prasata, která jakožto surovina pro masný průmysl splní požadavky kladené zpracovatelským průmyslem. Mezi ně patří vyrovnaná jatečná hmotnost a optimální a standardní podíl jednotlivých tělesných partií včetně dosažení vysoké kvality. Zároveň se ale musí zaměřit na zlepšení ekonomiky produkce masa, tj. na výrazné snížení nákladů. Toho lze dosáhnout spojením kvalitního managementu a špičkové technologie s moderními principy, ve kterých klíčové postavení zaujímají nové poznatky z oblasti genetiky a šlechtění zvířat. 12

11 2 CÍL PRÁCE Cílem práce byla analýza asociací polymorfismů lokusů C-MYC, GH1, GH2 s ukazateli jatečné hodnoty u prasat plemene české bílé ušlechtilé. 13

12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Plemeno prasat české bílé ušlechtilé Prasata české bílé ušlechtilé mají velmi dobré reprodukční vlastnosti, vynikající růstovou schopnost při velmi dobré konverzi živin a velmi dobrou masnou užitkovost. Kvalita masa je dobrá. Vyznačující se větším tělesným rámcem, lehčí hlavou se vzpřímeným uchem, jemnější, ale pevnou kostrou, pevnou konstitucí s vysokým stupněm odolnosti vůči stresům. Barva štětin i kůže je bílá (PULKRÁBEK, 2005). Plemeno vzniklo z původního klapouchého prasete křížením s dovezenými plemeny z Anglie a Německa. Roku 1927 byla zahájena tvorba bílého ušlechtilého plemene převodným křížením s německým ušlechtilým plemenem, využívalo se též velké bílé anglické plemeno pro osvěžení krve. Již v meziválečném období se přešlo k čistokrevné plemenitbě, kontrole užitkovosti, k výběru a licentaci kanců. V poválečném období byl rozvoj plemene spíše kvantitativní, později byly snahy o zlepšení vlastností využitím importu landrase. V 70. až 90. letech 20. století bylo plemeno zapojeno do hybridizačního programu, ve kterém se uplatňuje v mateřské pozici. Intenzivní šlechtění masného typu dalo vznik otcovských linií, které vytvořily samostatné plemeno bílé otcovské (SAMRAUS, 2006). Obr. č. 1 : České bílé ušlechtilé ( 14

13 3.2 Užitkové vlastnosti u prasat Ukazatele výkrmnosti Výkrmnost vyjadřuje schopnost prasete vytvářet z přijaté potravy jatečné produkty - maso a tuk. Schopnost produkovat z přijatých živin tělesnou hmotu posuzujeme dvěma ukazateli: průměrnými denními přírůstky spotřebou krmiva První je ukazatelem růstu a druhý vyjadřuje efektivnost výkrmu (PULKRÁBEK, 2005) Ukazatele jatečné hodnoty Jatečnou hodnotou rozumíme podíl masa a tuku, který se vyjadřuje podílem hlavních masitých částí v procentech z hmotnosti půlky prasete za studena, hmotností kýty s kostmi v procentech z hmotnosti půlky prasete za studena, plochou příčného řezu musculus longissimus lumborum et thoracis (MLLT) a schopností masa vázat vodu. Jatečnou hodnotu určují tyto ukazatele: jatečná výtěžnost, poměr masitých, tučných a méněcenných částí, kvalita jednotlivých partií. Pro plemenářské účely lze jatečnou hodnotu u prasat posuzovat dvěma způsoby: staniční metodou - klasické zkoušky (v ČR se nevyužívají), zkouškou vlastní užitkovosti. Klasické zkoušky potomstva dávají informaci o jedincích, kteří již působí v plemenitbě. Zkoušky vlastní užitkovosti mají velký význam při zjišťování jatečné hodnoty na živých zvířatech, zejména na těch, která mají být plemenářsky využívána (PULKRÁBEK, 2005). Jatečnou hodnotu posuzujeme z hlediska kvantitativního a kvalitativního. 15

14 Kvantitativními ukazateli jsou: podíl libového masa v % - SEUROP - systém, podíl libového masa v % - zkoušky vlastní užitkovosti, průměrná výška hřbetního tuku v mm. Při detailních jatečných rozborech jsou sledovány: cenné části - kýta, pečeně, krkovička, plec v kg, méněcenné části - bok, paždík, lalok, kolínka v kg, tučné části - tukové krytí hlavních masitých částí (hřbetní sádlo), plstní sádlo v kg, poměr masa a tuku v jatečné půlce v %, poměr masa a kostí v %. Kvalitativními znaky jsou: světlost barvy masa, šťavnatost, křehkost, mramorování, tloušťka svalových vláken, vaznost, chuť a vůně masa. Mezi tyto vzájemně se podmiňující činitele patří například věk zvířat, způsob výkrmu a složení krmné dávky, plemeno, pohlaví, říje, pohyb, léky a látky přecházející do svaloviny a tuku, nemoci a zdravotní stav, druh a způsob přepravy, před porážkové ošetření jatečných zvířat, omráčení, vykrvení aj. Jak velký je vliv podmínek vnějšího prostředí, dokazuje, že např. rychlé zchlazení jatečných půlek po poražení má za následek zpomalení glykolýzy, a tím zlepšení kvalitativních vlastností masa (PULKRÁBEK, 2005). 16

15 Obr. č.2: Hlavní masité části JUT ( Výtěžnost Výtěžnost je poměr jatečně upraveného těla za tepla k porážkové hmotnosti. Pohybuje se v závislosti na hmotnosti prasat v rozmezí od 72 do 84 %. Po porážce se prase rozdělí na dvě půlky. Přitom se musí postupovat tak, aby půlící řez procházel páteří, takže na obou půlkách musí být viditelné obratle. Porážková hmotnost je hmotnost jatečně upraveného těla (JUT), tj. hmotnost dvou k sobě náležejících půlek s hlavou a kůží, bez štětin, bez výkrojků očních a ušních, orgánů dutiny hrudní, břišní a pánevní vyňatých i s přirostlým tukem. Zjišťuje se vážením do 45 minut po porážce. Výtěžnost jatečných půlek ve vychladlém stavu (za studena), tj. 24 hodin po porážce, bývá obyčejně o 2 % nižší (PULKRÁBEK, 2005). 17

16 3.4 Jakostní odchylky kvalita masa Intenzivní selekce prasat na maximální podíl svaloviny v jatečné půlce bývá v menší či větší míře provázena zvýšenou citlivostí zvířat ke stresu, což se projevuje výskytem vad masa označovaných jako maso PSE (pale - soft - exudative, bledé - měkké - vodnaté) nebo DFD (dark - firm - dry, tmavé - tuhé - suché). Nejde o maso nemocných zvířat, ale o jakostní vadu masa, což je podmíněno již uvedenými faktory. PSE maso se vyznačuje vodnatou konzistencí, nízkou vazností vody, což je provázeno hmotnostními ztrátami při chladírenském ošetření a technologickém opracování masa. DFD maso má tmavou barvu, tuhou konzistenci, je suché, tj. neuvolňuje šťávu, má často lepivý povrch. I když se toto maso vyznačuje dobrou vazností vody, jeho udržitelnost je velmi nízká, protože velmi rychle podléhá mikrobiálnímu rozkladu (STEINHAUSER et al., 2000). Obr.č. 3: Maso bez jakostních odchylek (zdroj: FAO) Obr. č. 4: PSE maso (zdroj: FAO) Obr.č. 5: DFD maso (zdroj: FAO) 18

17 3.5 Kandidátní geny pro masnou užitkovost u prasat Kandidátní geny jsou geny (úseky molekul DNA), u nichž je znám polymorfismus (výskyt různých alel v populacích prasat) a jejichž primární produkt (protein, enzym, hormon) se nějakým způsobem podílí na projevu užitkového znaku. Např. o růstovém hormonu (GH) se již dlouho ví, že ovlivňuje růst zvířat. Proto gen GH se po odhalení polymorfismu stal kandidátním genem (DVOŘÁK, 1999) Gen MYC proto-onkogen (C-MYC) Základní charakteristika, struktura a lokalizace C-MYC genu C-MYC protoonkogen je všudypřítomný fosfoprotein a esenciální faktor pro spojení proliferace, diferenciace a apoptosy (AMATI et al., 1998). C-MYC sám je regulován početnými hormony, růstovými faktory, cytokininy, lymfokininy a řadou dalších mediátorů (BUSH et al., 1997) a jeho exprese je tak spojena s velkým počtem fyziologických procesů. REINER et al. (1999) izolovali a sekvenovali úsek DNA dlouhý 6,4 kbp, který kóduje C-MYC protoonkogen prasat. Gen ukázal typickou C-MYC strukturu se 3 exony, 3 promotory a vyvozuje se z něho protein složený ze 439 aminokyselin. Hranice exonů a intronů, stejně jako funkční domény promotorů, byly určeny srovnáním zjištěné sekvence nukleotidů se sekvencemi lidskými, krysími a myšími. Kódující oblast začíná kodonem TAA na pozici C-MYC gen má 3 domnělé aktivační startovní signály: PO (pozice ), P1 ( ) a P2 ( ) a 2 TATA - boxy na pozicích a , jak uvádí MIKOLÁŠOVÁ, (2005). Statistickým vyhodnocením informací ze somatické hybridizace provedené v souladu s CHEVALET et al. (1996) ukázali, že C-MYC gen je lokalizován na čtvrtém chromozomu prasat. Odhadnutá korelace mezi přítomností C-MYC a chromozómem 4 u prasat měla hodnotu 1,0 a v rámci čtvrtého chromozomu u prasat ukázal region p13 pravděpodobnost 0,89 a korelaci 1,0 značící, že C-MYC gen je mapován na SSC 4p13. C-MYC je tedy ve stejné synténní skupině jako F13B, ATP1B1, GBA, ATP1A1, IVL a mikrosatelity jako S0001 či S0067 (MARKLUND et al., 1993). Tento úkol chromozómu SSC4 s QTL pro tučnost a 19

18 růst prasat (ANDERSSON et al., 1994) dělá z C-MYC genu kandidátní gen pro další výzkum. Podobných výsledků dosáhly analýzy MUSILOVÁ et al. (2000), které zmapovaly C-MYC gen na chromozómu 4p14 u prasat. Obr. č. 6: Fyzická mapa prasete chromozomu č. 4 (SSC 4) ( Funkce C-MYC genu na buněčné úrovni Rodina MYC protoonkogenů byla zahrnuta do regulace genové transkripce. Všechny MYC proteiny obsahují ve své struktuře několik motivů charakteristických pro známé transkripční faktory a společně s dalším jaderným proteinem, Max, se váží na specifické DNA sekvence (OBAYA, 1999). Přestože mechanismy jakými C-MYC indukuje buněčné procesy nejsou zcela objasněny, byly určeny geny, u nichž je předpoklad přímého ovlivnění MYC protoonkogenem (BEN-YOSEF et al., 1998, LEE et al., 1997). Tyto geny určil například SCHLOSER et al. (2003). REINER et al. (1999) uvádí: protoonkogen MYC kóduje jaderný fosfoprotein, jehož funkce jako transkripčního faktoru je vázána na mnoho fyziologických procesů a regulována různými hormony, růstovými faktory a výživovým stavem. Jeho klíčová role byla popsána u vývoje tukové tkáně, svalové tkáně a folikulogeneze. Strukturními a funkčními analýzami byl C-MYC gen identifikován jako transkripční faktor a esenciální činitel pro průběh i návaznost proliferace, diferenciace a apoptosy (AMATI et al., 1998). C-MYC se také účastní adipogeneze (FREYTAG a GEDDES, 1992; NINOMIYA et al., 1993), mytogeneze 20

19 (MINER a WOLD, 1991; WHITELAW a HESKETH, 1992; LA ROCCA et al., 1994) a folikulogeneze. CORTNER et al. (1997) uvádí, že C-MYC onkogen a jeho aktivace přes mechanismy zahrnující chromozómovou translokaci, genovou amplifikaci, inzerci či mutaci se může spolupodílet na vzniku nádoru. Regulace spodní hladinou C-MYC genu umožňuje dle REINER et al. (1999) buňkám opouštět buněčný cyklus a nastartovat tak buněčně specifický diferenciační program, který v závislosti na tkáňově specifických faktorech vede k morfologicky a funkčně dospělé buňce. C-MYC hraje klíčovou roli nejen v organogenezi, ale rovněž v růstových procesech už diferenciovaných tkání a orgánů. Vyšší hladina C-MYC genu zabraňuje adipogenezi uzamknutím adipoblastů ve stádiu proliferace. C-MYC gen tak zastavuje aktivaci normální diferenciace a inhibuje expresi adipocytárně - specifických genů jako glycerolfosfátdehydrogenáza (GPD1), nasycený kyselý protein (ap2) nebo inzulín jako transportér vnímavý na glukózu (GLUT4). Způsob činnosti C-MYC genu spočívá v potlačení CCAAT, který má za úkol vystupňovat vázaný protein alpha (odtud označení C/EBP alpha) a který tak náleží k jednomu z hlavních transkripčních aktivátorů adipocytárního diferenciačního programu (ROSENWALD et al., 1995). Exprese C/EBP alpha stoupá během adipogeneze a jeho předčasná exprese u proliferujících adipoblastů zapříčiňuje zastavení mitotického růstu, přičemž C/EBP alpha je regulován C-MYC genem (BUSH et al., 1998)). Důležité vlastnosti a úkoly C-MYC genu v adipogenezi si lze snadno velmi dobře demonstrovat a popsat rovněž in vivo, kde dochází ke zrychlenému zvyšování exprese C-MYC RNA v tukové tkáni a kde je úroveň C-MYC genu negativně ovlivňována hladinou sérové glukózy, triglyceridů a inzulínu jako růstového faktoru (KIM et al., 1991). V myogenezi potom C-MYC určuje počet myotubulů, a to regulací doby držení myoblastů v buněčném cyklu. Regulace spodní hladinou C-MYC genu vede k zastavení proliferace a k aktivaci diferenciačního programu, založeného na genové rodině MyoD (KONIECZNY a EMERSON, 1984). Jakmile je hladina C-MYC genu dostatečně vysoká, protein váže MyoD, zabraňující začátku diferenciace (MINOR a WOLD, 1991). 21

20 Byly nalezeny dva druhotné sdělovací systémy, které jsou zahrnuty a zapojeny do aktivace C-MYC genu: vápník a camt. WHITELAW a HESKETH (1992) dokázali, že efekt beta-sympathomimetického clenbuterolu na růst kosterních svalů je uskutečňován právě přes C-MYC gen. V podrážděných tkáních je tato signální kaskáda modifikována vápníkovými ionty (THOMPSON et al., 1995). 22

21 Genetický polymorfismus GH Gen GH je lokalizován na 12. chromozomu. Jeho kódující část zahrnuje 5 exonů a celková transkribovaná oblast DNA je přibližně 1,7 kbp. Od roku 1991 bylo u genu GH popsáno několik jednoduchých polymorfismů, detekovaných PCR - RFLP s různými restrikčními enzymy (YERLE et al., 1993). Obr. č. 7: Fyzická mapa prasete chromozomu č. 12 (SSC 12) ( Biologická funkce Růstový hormon, peptid syntetizovaný a uvolňovaný z předního laloku hypofýzy, je důležitým endogenním faktorem stimulujícím růst a vývin zvířat (URBAN, 2006). Pro efekt GH jsou důležité jeho receptory v buňkách cílových orgánů a jejich gen je označen GHR = GH receptor. Uvolňování GH v adenohypofýze: stimuluje uvolňovací faktor pro GH označený zkratkou GRF = growth hormone releasing factor inhibuje GRIF = growth hormone releasing inhibiting factor (DVOŘÁK, 2001). Sekrece GH je inhibována glukózou, kortizonem, mastnými kyselinami atd. Stimulujícími faktory jsou stres, spánek, hypoglykémie a některé aminokyseliny. Sekrece GH podléhá dennímu kolísání hodnot. Nejvyšší hodnoty dosahuje během noci. Kolísání během dne je méně výrazné. 23

22 GH hraje významnou úlohu při stimulaci růstu měkkých tkání a kostí a to jak přímo, tak prostřednictvím somatomedinu C (IGF - 1). GH má také význam z pohledu dalších metabolických efektů (anabolický, hyperglykemický a lipolytický) a také má význam při retenci sodíku, draslíku a fosfátů. Růstový hormon je také známý pro jeho stimulační efekt na somatické buňky. Je potřebný během celého života pro své metabolické efekty (BROUKAL, 2002) Fyziologie růstu Základem růstu a vývinu je dědičné založení, které je více nebo méně ovlivňováno úrovní přeměny látek v organismu a zevními činiteli, z nichž nejvýznamnější je výživa. Růst a vývin je řízen nervovou soustavou a hormony. Nejdůležitější z nich je růstový hormon (STH - somatotropin). STH podporuje celkový růst organismu, zvyšuje zejména hmotu kosterního svalstva a podporuje odbouráváni tuků v organismu. Zvyšuje využití dusíkatých látek z krmiva pro tvorbu bílkovinných produktů těla. Injekčním podáváním STH můžeme u prasat regulovat intenzitu růstu a poměr maso : tuk ve prospěch masa (BROUKAL, 2002) Asociace genu s užitkovostí u prasat WINSTON et al. (2000) zjišťovali vliv GH RFLP TaqI (HaeII) a DraI (MspI) u prasat plemen tao yuan (29 kanečků a 52 prasniček), landrase (16 kanečků a 44 prasniček) a durok (11 kanečků a 37 prasniček) na růstovou schopnost, respektive koncentraci GH v krvi. Test probíhal ve věku prasat týdnů, krmení ad libitum, vážení a přijaté krmivo zaznamenáváno každé 2 týdny stejně jako hladina GH v krvi pomocí RIA analýzy. Statisticky byla data vyhodnocena GLM analýzou v programu SAS. Bylo prokázáno, že plemeno tao yuan mělo oproti ostatním dvěma testovaným plemenům asi poloviční koncentraci GH, a zvířata vykazující v genotypu GH RFLP TaqI (HaeII) alelu A měla o 57 % sníženou koncentraci GH než jedinci nesoucí v tomto polymorfním místě D alelu. Průkazné asociace sledovaných genotypů s denním přírůstkem a konverzí krmiva byly zjištěny u plemene tao yuan, tyto asociace nebyly průkazné u plemen durok a landrase. 24

23 Vztah polymorfismu HhaI, lokalizovaném ve 2. exonu genu růstového hormonu prasat, k ukazatelům růstu a jatečné hodnoty u plemene durok a iberian hodnotil FERNANDEZ et al. (2002). Celkem bylo použito 199 prasat 2 linií plemene iberian, z nichž jedna byla tradiční linie a druhou tvořili jedinci průkazně odlišní v ukazatelích užitkovosti. Ke statistickému vyhodnocení použili Animal model s fixním efektem. Autoři nezjistili průkazné asociace s užitkovými znaky. 25

24 4. MATERIÁL A METODIKA 4.1 Zvířata Studie analyzuje údaje získané od zvířat zahrnutých do zkoušky výkrmnosti a jatečné hodnoty (VHJ) čistokrevného potomstva v rámci zkoušek VJH prasat v letech 2000 až 2002 stanicí v Grygově. Byla zpracována databáze obsahující jedince plemene české bílé ušlechtilé (ČBU, n = 271). 4.2 Užitkové vlastnosti Testační stanice Zkouška VHJ byla prováděna dle ČSN Kontrola výkrmnosti a jatečné hodnoty prasat, tzn.: dvojice prasat, vepřík a prasnice, ustájena vždy v samostatném kotci, krmená krmnou směsí GENT (živinové složení: N látky 18 %, VSŽ 74 %, ME 12 MJ/kg, vláknina 3,3 %, Lys 1,1 1,3 %, Met + Cyst 0,6 %, Ca 0,85 %, P 0,65 %, surovinová skladba: pšenice %, ječmen %, sojový extrahovaný šrot %, rybí moučka 6 %, registrovaný premix faktorů určený pro testační výkrm prasat a registrovaný minerální premix), vážení zvířat 1x měsíčně, test probíhal od 30 do 100 kg živé hmotnosti prasat Jatečné ukazatele Na testačních jatkách byla zvířata poražena v rozmezí hmotnosti kg. Zjišťovala se: 1. hmotnost půlek za tepla (jatečná půlka bez mozku, orgánů dutin hrudní, břišní a pánevní, ledvina s plstním tukem ponechána), zváženo do 30 minut od poražení s přesností 0,5 kg, 2. ph stanoveno v nejdelším hřbetním svalu (MLLT) na úrovni posledního žebra, 45 minut a 24 hodin po poražení, 3. hmotnost jatečných půlek za studena, zváženo cca 24 hodin po poražení s přesností 0,5 kg, 4. délka trupu (TRUP), 5. bouráním pravé půlky bez ocásku se zjišťuje: 26

25 výška hřbetního tuku nejkratší spojnice od vnějšího okraje kůže po horní okraj povázky oddělující tuk od svaloviny ke středu druhého horního obratle míra č. 1, posledního hrudního obratle míra č. 2, prvního křížového obratle míra č. 3. Ze tří měření se zjistí průměrná výška hřbetního tuku (TPRUM). hmotnost hlavních masitých částí v kg (HMCKG) (krkovička + plec + pečeně + kýta) bourána pravá půlka za studena. Jatečné ukazatele byly stanoveny v souladu s výše uvedenou normou pracovníky stanice kontroly VJH v Grygově Ukazatele kvality svaloviny Hodnoty kvalitativních ukazatelů byly stanoveny ze vzorků musculus longissimus lumborum et thoracis (MLLT) v laboratoři Ústavu technologie potravin MZLU v Brně dle metodik uváděných INGREM et al. (1993). ph - charakterizuje v mase průběh autolytických a proteolytických procesů. Pro interpretaci je nezbytná znalost časového intervalu mezi poražením zvířete a měřením ph. 4.3 Detekce genotypů Genotypy byly stanoveny laboratoří Ústavu genetiky MZLU Brno užitím metody polymerázové řetězové reakce a polymorfismu délky restrikčních fragmentů (polymerase chain reaction restriction fragment lenght polymorphism) PCR RFLP Izolace DNA Krev - ošetřena proti srážení (150 µl 0,5M EDTA / 5 ml krve) modifikovaná proteinázová metoda, promýváním TE pufrem (NEBOLA et al., 1994) QIAamp kit (QIAGEN) Svalovina vzorek (MLLT) 27

26 NucleoSpin Tissue kit (MACHERY NAGEL) Kvalita lyzátů byla kontrolována elektroforeticky na 1,2 % agarozovém gelu obarveném ethidiumbromidem, v 50x TAE pufru DNA test Polymerázová řetězová reakce (PCR) literární zdroje pro podmínky dle jednotlivých lokusů a sekvence primerů v Tab. 1 provedeno v termocykleru PTC 100 MJ Research s výhřevem víka DNA vstupující do reakce množství obsažené v 5 10 µl lyzátu (izolace promytím TE pufrem) nebo množství obsažené v 5 10 µl lyzátu izolace ze svaloviny) počáteční denaturace u všech amplifikací - 98 C po dobu 8 minut závěrečná extense při 72 C po dobu 10 minut celkový objem reakční směsi µl koncentrace jednotlivých složek reakce a teplotní podmínky Tab. 2, Tab. 3 kontrola amplifikovaných úseků na 1,5 % agarozovém gelu Polymorfismus délek restrikčních fragmentů (RFLP) provedeno v termostatu při 37 C objem restrikčních směsí 20 µl z toho 8-12 µl PCR produktu použité restrikční enzymy a délky produktů RFLP určení genotypů-viz. foto- obr.8, obr.9, obr

27 Tab. 1 Literární zdroje PCR vybraných polymorfních míst Gen Primery GenBank RE Délka PCR prod. Zdroj C- MYC for.ttgggtgatttctctttcctttc rev.cattctcctccgttccga X97040 MspI 322bp Reiner, G. a kol., 2000 GH for.gccaagttttaaatgtccctg rev.ctgtccctccgggatgtag M17704 MspI+HaeII 506bp Schellander, a kol., 1994 Tab. 2 Podmínky PCR amplifikací za použití Taq polymerázy Finální koncentrace Teplotní podmínky jednotlivých PCR Gen 10x Pufr Mg 2+ dntp Mgcl 2 Primer 1/2 Taq pol. denaturace annealing extense C- MYC 0,99 x 1,47 mm 198 µm 0,47/0,47 µm 2,89U/100µl 95 C / 40sec 58 C / 60sec 72 C / 60sec GH 0,98 x 1,21 mm 197 µm 0,45/0,45 µm 3,85U/100µl 95 C / 40sec 60 C / 60sec 72 C / 90sec Tab. 3 Určení genotypů na základě RFLP GEN RE RFLP produkt Genotyp 322 AA C-MYC MspI 322, 201, 121 AB 201, 121 BB 333, 173 +/+ HaeII 506, 333, 173 +/- GH , 147, 137 -/- +/+ MspI 282, 222, 147, 137 +/- 282, 222 -/- 29

28 Obr. č. 8: Produkty C-MYC-MspI RFLP na 3% agarozovém gelu Obr. č.9: Produkty GH-HaeII RFLP na 3% agarozovém gelu Obr. č. 10: Produkty GH-MspI RFLP na 3% agarozovém gelu 30

29 4.4 Statistické vyhodnocení Výpočet relativních četností a genotypů alel Frekvence jednotlivých genotypů byly vypočteny ze zjištěných absolutních hodnot jako prosté procentické zastoupení. Četnosti výskytu alel byly vypočteny dle vzorce (HRUBAN et al., 2000): p = d + ½ h q = r + ½ h, kde : p = relativní četnost dominantní alely q = relativní četnost recesivní alely d = relativní četnost homozygotně dominantního genotypu h = relativní četnost heterozygotního genotypu r = relativní četnost homozygotně recesivního genotypu Hodnocení genetické rovnováhy dle Hardy Weinbergova zákona Skutečnost, zda zjištěné frekvence genotypů odpovídají geneticky rovnovážnému stavu dle H W (p2 + 2pq + q2 = 1), byla posouzena pomocí χ2 testu (HARTL a CLARK, 1997): χ 2 (α; n p-1) = Σ (f-f) 2 / F, kde f = zjištěná četnost genotypů F = očekávaná četnost genotypů α = hladina významnosti n p 1 = stupně volnosti 31

30 4.4.3 Asociační studie Byly provedeny asociační analýzy kandidátních genů s vybranými fenotypovými znaky ZIVHM (živá hmotnost na jatkách v kg), HMTC (hmotnost JOT za tepla celkem v kg), HMSC (hmotnost JOT za studena celkem v kg), TRUP (délka trupu JOT celkem v cm), TPRUM (průměrná výška hřbetního tuku v mm), KRK (krkovička v kg), PEC (kotleta v kg), PLEC (plec s kostí bez kolínka v kg), KYTA (kýta s kostí v kg). V analýze byl použit zobecněný lineární model (GLM) s pevnými efekty: genotyp nebo genotypy v interakci, pohlaví, rok a měsíc porážky. Pro tyto analýzy bylo použito programové prostředí SAS Pro zjištění průkazných rozdílů v užitkovosti mezi genotypy byl použit odhad nejmenších čtverců LSM ± S E (least squares means ± standart error). Použitá GLM rovnice: Y ijklmn = µ + CMYC i + GH1 j + GH2 k + SEX l + MES ROK m + e ijklmn, kde Y ijklmn - proměnná µ - konstanta CMYC i - efekt genu CMYC (i = 1, 2, 3) GH1 j - efekt genu GH1 (j = 1, 2, 3) GH2 k - efekt genu GH2 (k = 1, 2, 3) SEX l -efekt pohlaví (l = 1, 2) MES ROK m - efekt měsíce a roku porážky (m = 1-12) e ijklmn - reziduum Hladiny významnosti statistických rozdílů použitých ve studii: P 0,08 blíží se statistické průkaznosti P 0,05 statistická průkaznost P 0,01 statisticky vysoce průkazné 32

31 5. VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Frekvence alel a genotypů Frekvence alel a genotypů genu CMYC Analýzu genotypových frekvencí plemene české bílé ušlechtilé v předložené práci uvádí Tab. 4. Ve sledované populaci prasat plemene ČBU byla zjištěna vyšší frekvence alely A (0,72) ve srovnání s alelou B (0,28). Jedinců s genotypem BB bylo zjištěno nejméně (6,6 %), nejvýrazněji byl zastoupen genotyp AA (Tab. 4). Zjištěné genotypové četnosti C-MYC v hodnoceném souboru prasat jsou v H-W rovnováze. MIKOLÁŠOVÁ (2005) uvádí při hodnocení polymorfismu lokusu C-MYC bez ohledu na plemeno, že se nejčastěji vyskytoval genotyp AA (0,57), jedinci genotypu BB tvořili pouze necelých pět procent (0,048) a z toho vyplývá vyšší genové zastoupení alely A (0,76). Obdobné výsledky uvádí ve své studii URBAN et al. (2002) u populace plemene durok, které detekovali frekvenci alely A v podobné výši (0,82). Také REINIER et al. (2000), kteří studovali polymorfismus tohoto genu u několika komerčně využívaných plemen prasat (pietrain, belgická landrase, duroc, hampshire, large white a meishan) dospěli k velmi podobným výsledkům. U všech jmenovaných plemen vyjma plemene meishan detekovali četnost alely A v rozmezí 0,9 0,78. Tab. 4 Frekvence genotypů a alel genu C-MYC u plemene ČBU Genotyp AA AB BB Celkem Pozorované četnosti genotypů Relativní frekvence genotypů 0,5044 0,4298 0,0658 1,0000 Alela A B Pozorované četnosti alel Relativní frekvence alel 0,7193 0,2807 1,0000 Očekávané relativní frekvence genotypů 0,5174 0,4038 0, Očekávaný počet genotypů 117, , , χ 2 0,0745 0,3819 0,4893 0,9458 Pozn.: tabulková hodnota pro χ2 (1;0,05) = 3,84 a χ2 (1;0,01) = 6,64 33

32 5.1.2 Frekvence alel a genotypů genu GH1 (HaeII) Ve sledované populaci prasat ČBU byla zjištěna vyšší frekvence alely + = 0,69 ve srovnání s alelou = 0,31 jak uvádí Tab. 5 a přibližně stejné zastoupení genotypů +/+ a -/-. (0,45). Obdobné výsledky získala ve své práci MIKOLÁŠOVÁ (2005) při detekci polymorfismu souboru plemen ČBU, BO, LA, D, kde uvádí polymorfismus GH HaeII a zasoupení genotypů +/+ a +/- (0,39) bez ohledu na plemeno, četnost alely (+) (0,59). Zajímavé je srovnání s výsledky frekvencí alel plemene durok v práci URBAN et al., 2002, kteří uvádí frekvenci alel polymorfismu lokusu GH HpaII pro alelu + = 0,85, a = 0,15. Při H W analýze nebyla zjištěna odchylka od rovnovážného stavu. Tab. 5 Frekvence genotypů a alel genu GH1 u plemene ČBU Genotyp +/+ +/- -/- Celkem Pozorované četnosti genotypů Relativní frekvence genotypů ,4802 0,4185 0, Alela + - Pozorované četnosti alel Relativní frekvence alel 0,6894 0, Očekávané relativní frekvence genotypů 0,4753 0,4282 0, Očekávaný počet genotypů 107, , , χ 2 0,0113 0,0502 0,0557 0, Pozn.: tabulková hodnota pro χ2 (1;0,05) = 3,84 a χ2 (1;0,01) = 6, Frekvence alel a genotypů genu GH2 (MspI) MIKOLÁŠOVÁ (2005) hodnotila vybraný polymorfismus lokusu GH u čtyř plemen a to ČBU, BO, LA, D. V genovém založení +/+ byl nejčastěji (0,62) oproti tomu jedinců s genotypem -/- se vyskytovalo pouze pět procent (0,053). Četnost alely (+) byla stanovena (0,79). Z výsledků v Tab. 6 je patrné, že se hodnoty frekvencí výrazně neliší jak v souboru plemen, tak pouze u plemene 34

33 ČBU, kde frekvence alely + byla stanovena (0, 76) a frekvence genotypů +/+ (0,58). Zjištěné genotypové četnosti GH2 v hodnoceném souboru prasat jsou v H-W rovnováze. Tab. 6 Frekvence genotypů a alel genu GH2 u plemene ČBU Genotyp +/+ +/- -/- Celkem Pozorované četnosti genotypů Relativní frekvence genotypů ,5830 0,3453 0, Alela + - Pozorované četnosti alel Relativní frekvence alel 0,7556 0, Očekávané relativní frekvence genotypů 0,5709 0,3693 0, Očekávaný počet genotypů 127, , , χ 2 0,0564 0,3490 0,5394 0, Pozn.: tabulková hodnota pro χ2 (1;0,05) = 3,84 a χ2 (1;0,01) = 6,64 35

34 5.2 Asociace vybraných lokusů s jatečnou hodnotou Vztahy s kvantitativními ukazateli Asociace genotypů vybraných lokusů byla hodnocena pro následující znaky jatečné hodnoty: živá hmotnost na jatkách (ZIVHM), hmotnost JOT za tepla (HMTC), hmotnost JOT za studena (HMSC), délka trupu JOT (TRUP), průměrná výška hřbetního tuku (TPRUM), krkovička (KRK), kotleta (PEC), plec s kostí bez kolínka (PLEC), kýta s kostí (KYTA) Vztahy polymorfismu genu C-MYC GLM analýzou uvedených kvantitativních znaků v asociaci s genem C-MYC byla statisticky průkazná hodnota pouze u živé hmotnosti (ZIVHM), kde průkazný vliv měl genotyp BB v porovnání s genotypem AA. Pozitivní vliv genotypu BB na živou hmotnost prokázala ve své práci také BOBROVÁ (2003) a dále uvádí, že při realizaci prasat na jatkách byla zvířata s genotypem BB hodnocena nejlépe a to právě pro celkově vyšší hmotnost. Dále uvádí, že měla signifikatně nejvyšší výšku hřbetního tuku, což se v této práci statisticky nepotvrdilo. Z celkového počtu 228 testovaných jedinců plemene ČBU bylo detekováno celkem 15 jedinců s genotypem BB, to odpovídá frekveci 0,0658. Statistické průkaznosti se blížil ukazatel hmotnosti JOT za tepla (HMTC). Výsledky a asociace jsou uvedeny v Tab. 7. Nejlepší výsledky měl opět genotyp BB a pro absenci obdobných analýz není tento výsledek diskutován s jinými autory. Ostatní sledované znaky nebyly s lokusem C-MYC signifikatní. 36

35 Tab. 7 Asociace polymorfismu genu C-MYC s kvantitativními znaky plemene ČBU (LSM ± S E ) Genotyp AA LSM ± S E AB LSM ± S E BB LSM ± S E n ZIVHM [kg] 99,48** ± 0,37 100,03 ± 0,40 101,09** ± 0,76 HMTC [kg] 79,97 a ± 0,49 80,04 b ± 0,53 81,85 ab ± 0,99 HMSC [kg] ± ± ± 1.24 TRUP [cm] ± ± ± 0.56 TPRUM [mm] 14,63 ± 0,39 14,33 ± 0,42 14,11 ± 0,77 KRK [kg] 3.78 ± ± ± 0.09 PEC [kg] 4.64 ± ± ± 0.12 PLEC [kg] 4.17 ± ± ± 0.09 KYTA [kg] 8.42 ± ± ± 0.17 Pozn.: ZIVHM živá hmotnost na jatkách; HMTC hmotnost JOT za tepla celkem; HMSC hmotnost JOT za studena; TRUP délka trupu JOT; TPRUM průměrná výška hřbetního tuku; KRK krkovička; PEC kotleta; PLEC plec s kostí bez kolínka; KYTA kýta s kostí; hodnoty se stejnými exponenty vykazují následující statisticky významné rozdíly: ab P 0,08; **P 0,05; ***P 0,001; LSM least square means; S E standard error Vztahy polymorfismu genu GH1 V této práci se blížily průkaznosti asociace GH1 genotypů s živou hmotností, průměrnou výškou hřbetního tuku a krkovičkou. Nejvyšší váhy dosáhly prasata genotypu +/- v porovnání s genotypem -/-. Genotyp +/- měl vliv na nejvyšší hodnoty TPRUM a nejpříznivějších hodnot dosahoval genotyp +/+, což potvrzuje i práce KŘENKOVÁ (1999), která uvádí průkazný vliv GH na výšku špeku, ovšem nad posledním hrudním obratlem. Hmotnost krkovičky byla u genotypu -/- 3,90 a u genotypu +/+ 3,75, tyto hodnoty se blíží statistické průkaznosti. Ostatní hlavní masité části nevykazovaly s genem GH1 statistickou průkaznost a ani se ke statistické průkaznosti neblížily. 37

36 Tab. 8 Asociace polymorfismu genu GH1 s kvantitativními znaky plemene ČBU (LSM ± S E ) Genotyp +/+ +/- -/- LSM ± S E LSM ± S E LSM ± S E n ZIVHM [kg] 100,22 ± 0,35 100,84* ± 0,40 99,55* ± 0,73 HMTC [kg] 80,79 ± 0,46 81,26 ± 0,54 79,81 ± 0,97 HMSC [kg] ± ± ± 1.22 TRUP [cm] ± ± ± 0.53 TPRUM [mm] 13,88* ± 0,36 14,61* ± 0,42 14,58 ± 0,76 KRK [kg] 3.75* ± ± * ± 0.09 PEC [kg] 4.68 ± ± ± 0.12 PLEC [kg] 4.24 ± ± ± 0.09 KYTA [kg] 8.50 ± ± ± 0.17 Pozn.: ZIVHM živá hmotnost na jatkách; HMTC hmotnost JOT za tepla celkem; HMSC hmotnost JOT za studena; TRUP délka trupu JOT; TPRUM průměrná výška hřbetního tuku; KRK krkovička; PEC kotleta; PLEC plec s kostí bez kolínka; KYTA kýta s kostí; exponenty vykazují následující statisticky významné rozdíly: *P 0,08; **P 0,05; ***P 0,001; LSM least square means; S E standard error Vztahy polymorfismu genu GH2 Tab. 9 popisuje průměry nejmenších čtverců ukazatelů jatečné hodnoty u jednotlivých genotypů GH2 genu. Jedinci genotypu +/+ měli statisticky průkazně vyšší hmotnost JOT za studena, než prasata s genotypem -/-. Rozdíly v hmotnostech jatečně opracovaného těla byly u některých jedinců s genotypem +/+ téměř 4 kg ve srovnání s jedinci -/-. U většiny ostatních sledovaných ukazatelů jatečné hodnoty měla skupina genotypů -/- nejméně příznivé hodnoty oproti genotypům +/+ a +/-, ale rozdíly nedosahovaly hranice průkaznosti. Přestože je gen růstového hormonu na základě fyziologické funkce jeho produktu považován za kandidátní gen pro QTL růstu a jatečné hodnoty, literární zdroje se v jeho hodnocení efektů rozcházejí. Zjištěné asociace haplotypů HaeII a MspI částečně podporují výsledky KNORRA et al. (1997), kteří prokázali asociace ApaI a HinPI haplotypů s několika ukazateli tučnosti u kříženců meishan x pietrain. LARSEN et al. (1995) nepotvrdili asociace polymorfismu genu GH (TATA 38

37 boxu) s protučněním prasat. CASAS VARIOLO et al. (1997), kteří sledovali efekt genu GH na masnou užitkovost nezjistili žádné asociace a pokládají úlohu genu GH v projevu jatečné hodnoty prasat ze bezvýznamnou. Tab. 9 Asociace polymorfismu genu GH2 s kvantitativními znaky plemene ČBU (LSM ± S E ) Genotyp +/+ +/- -/- LSM ± S E LSM ± S E LSM ± S E n ZIVHM [kg] ± 0, ± 0, ± 0,74 HMTC [kg] ± 0,46 81,52 ± 0, ± 0,98 HMSC [kg] A ± B ± AB ± 1.22 TRUP [cm] ± ± ± 0.55 TPRUM [mm] ± 0,36 14,16 ± 0,43 14,31 ± 0,77 KRK [kg] 3.80 ± ± ± 0.09 PEC [kg] 4.67 ± ± ± 0.12 PLEC [kg] 4.22 ± ± ± 0.09 KYTA [kg] 8.47 ± ± ± 0.17 Pozn.: ZIVHM živá hmotnost na jatkách; HMTC hmotnost JOT za tepla celkem; HMSC hmotnost JOT za studena; TRUP délka trupu JOT; TPRUM průměrná výška hřbetního tuku; KRK krkovička; PEC kotleta; PLEC plec s kostí bez kolínka; KYTA kýta s kostí; hodnoty se stejnými exponenty vykazují následující statisticky významné rozdíly: *P 0,08; A,B P 0,05; ***P 0,001; LSM least square means; S E standard error Vztahy s kvalitativními ukazateli Vztah vybraných lokusů C-MYC, GH1 a GH2 ke kvalitativním ukazatelům ph 1 a ph 24 nebyl prokázán. Výsledky uvádí Tab. 10. Ke stejnému závěru dospěla i MIKOLÁŠOVÁ (2005), která analyzovala hodnoty souboru čtyř plemen ČBU, BO, LA, D. Pro absenci ostatních analýz nejsou výsledky diskutovány s jinými autory. 39

38 Tab. 10 Hodnoty LSM ± S E ph 1 a ph 24 podle genotypů Gen C-MYC GH1 GH2 Genotyp Pozn.: LSM least square means; S E standard error ph 1 LSM ± S E ph 24 LSM ± S E AA 6.03 ± ±0.02 AB 6.05 ± ± 0.02 BB 6.08 ± ± / ± ± / ± ± / ± ± / ± ± / ± ± / ± ±

39 6. SHRNUTÍ A ZÁVĚR Cílem této diplomové práce bylo vyhodnotit asociace polymorfizmů lokusů C- MYC, GH1 a GH2 s ukazateli jatečné hodnoty u prasat plemene české bílé ušlechtilé. Studie byla provedena na souboru jedinců plemene české bílé ušlechtilé n = 271, u kterého byly v letech zjištěny ukazatele výkrmnosti jatečné hodnoty dle normy CSN Vyhodnocovány byly hodnoty znaku ph 1, ph 24, živá hmotnost na jatkách (ZIVHM), hmotnost JOT za tepla celkem (HMTC, kg), hmotnost JOT za studena celkem (HMSC, kg), délka trupu JOT celkem (TRUP, cm), výška hřbetního tuku (TPRUM, mm), krkovička (KRK, kg), kotleta (PEC, kg), plec s kostí bez kolínka (PLEC, kg) a kýta (KYTA, kg). Charakteristiky kvality svaloviny byly určeny ze vzorku musculus longissimus lumborum et thoracis (MLLT). Genotypy byly stanoveny metodou PCR RFLP z DNA izolované z krve nebo MLLT. Frekvence alel sledovaných lokusů byly následující: C-MYC A = 0,7193, B = 0,2807; GH1 (+) = 0,6894, (-) = 0,3106; GH2 (+) = 0,7556, (-) = 0,2444. Asociační analýza byla provedena metodou GLM v programu SAS Pevné efekty byly lokusy, pohlaví, měsíc a rok porážky. Odhadován byl vliv jednotlivých lokusů na uvedené ukazatele jatečné hodnoty proměnné. Pro zjištění průkazných rozdílů byl použit odhad nejmenších čtverců LSM ± S E. Průkazná asociace byla u lokusu C-MYC s ZIVHM (P = 0,0307), kde genotyp BB měl nejvyšší ukazatel hmotnosti (101,09 ± 0,76 ) a nejmenší genotyp AA (99,48 ± 0,37). Vliv lokusu GH1 nedosahoval hranice statistické průkaznosti P 0,05 u žádné proměnné. Lokus GH2 byl asociován s HMSC. Mezi genotypy +/+ a -/- byl statistický rozdíl (P = 0,0044) a mezi genotypy +/- a -/- byl statistický rozdíl (P = 0,0225). Nejvyšší hodnoty tedy prokázal genotyp +/+ (79.18 ± 0.58) a nejnižší -/- (75.77 ± 1.22). Vybrané výsledky práce: C-MYC byla zjištěna vyšší frekvence alely A (0,7193) než alely B (0,2807) prasata genotypu BB dosáhla statisticky průkazně vyšší hmotnosti na jatkách než prasata genotypu AA 41

40 genotyp BB byl statisticky neprůkazně asociován s vyšší hmotností JOT za tepla nelze hodnotit jako faktor samostatně ovlivňující jatečné hodnoty a tím ani doporučit ke šlechtění GH1 ve sledované populaci prasat ČBU byla zjištěna vyšší frekvence alely + = 0,69 ve srovnání s alelou = 0,31 prasata heterozygotního genotypu +/- měla statisticky neprůkazně vyšší hmotnost na jatkách a vyšší průměrnou výšku hřbetního tuku než homozygoti genotypu -/- prasat s genotypem -/- bylo ve sledovaném souboru pouze 10 % (10,13 %) prasata genotypu -/- měla statisticky neprůkazně větší hmotnost krkovičky než genotyp +/+ nelze potvrdit jako kandidátní gen pro jatečnou hodnotu GH2 u tohoto polymorfismu byl zjištěn statisticky průkazný vliv genotypu +/+ (P = 0,0044) na hmotnost jatečně opracovaného těla za studena genotyp -/- měl u většiny sledovaných ukazatelů jatečné hodnoty nejméně příznivé výsledky Výsledky ukazují na možnost využití lokusů s průkazným vlivem na jatečné znaky. Avšak zobecnit pozitivní vliv jednotlivých alel vybraných lokusů by bylo možné až po rozsáhlejší studii. 42

41 7. SEZNAM LITERATURY AMATI, B., ALEVIZOPOULOS, K., VLACH, J. (1998): Myc and The cell cycle. Front. Bioscience 3: BEN-YOSEF, T., EDEN, A., BENVENISTY, N. (1998): Characterization of murine BCAT genes: Bcat1, a c-myc target, and its homolog, Bcat2. Mam. Genomme 9: BOBROVÁ, O. (2003): Vyhodnocení asociací genetických markerů s užitkovostí v komerční populaci prasat. Brno. 76 s. Disertační práce na Mendelově zemědělské a lesnické universitě, Ústav genetiky zvířat. Centrální plemenná kniha prasat (1994): Metodické pokyny k ČSN Kontrola užitkovosti a dědičnosti prasat. FERNÁNDEZ, A., ÓVILO, C., RODRIGUEZ, C., SILIÓ, L. (2002): HhalI polymorphism of The growth hormone gene in Iberian pigs: relation with productive traits. Pig News and Information 23 (3): 345. FRANCO, M. et al. (2005): Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs. J. Appl. Gen. 46 (2): HARTL, D. L., CLARK G. (1997): Principles of population Genetics. Sinauer Associates, Inc., 3rd edition, 542 s. HRUBAN, V. (1999): Principy a aplikace molekulární genetiky ve šlechtění (skriptum). ČZU Praha, ISBN , s CHENG, Y. et al. (2000): Growth hormone gene polymorphism and growth performance traits in duroc, landrace and tao - yuan pigs. Theriogenelogy 54: CHOWDHARY, B. P. et al. (1994): Precise localization of The genes for glucose phosphate isomerase (GPI), calcium channel (CRC), hormone - sensitive lipase (LIPE), and growth hormone (GH) in pigs, using nonradioactive in situ hybridization. Cytogen. Cell Gen. 67(3):

42 INGR, I. et al.(1993): Hodnocení živočišných výrobků - cvičení: s vyd., Brno. ISBN KŘENKOVÁ, L. (1999): Vztah polymorfismu kandidátních genů k proměnlivosti produkce a kvality masa prasat. Brno. 141 s. Disertační práce na Mendelově zemědělské a lesnické universitě, Ústav genetiky zvířat. KURYL, J., KAPELANSKI, W., PIERZCHALA, M., BOCIAN, M., GRAJEWSKA, S. (2003): A relation ship between genotypes at The GH and LEP loci and carcass meat and fat deposition in pigs. Anim. Sci. Pap. Report. 21(1): LEWIS, A. J., WESTER, T. J., BURRIN, D. G., DAUNCEY, M. J. (2000): Exogenous growth hormone induces somatothrophic gene expression in neonatal liver and skeletal muscle. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp Physiol. 278: LI, J., RAN X. Q., WANG, J. F. (2006): Identification and function of The growth hormone gene in Rongjiang pig of China.Anim. Gen. 58(3): MACHERY-NAGEL (2001): NucleoSpin Tissue - manuál. MIKOLÁŠOVÁ, R. (2005): Perspektivní polymorfní kandidátní geny a jejich využití ke zlepšení masné produkce. Brno.110 s. Disertační práce na Mendelově zemědělské a lesnické univerzitě, Ústav genetiky zvířat. MILAN, D., BIDANEL, J.P., IANNUCCELLI, N., RIQUET, J. (2002): Detection of quantitative trait loci for carcass composition in pigs. Genet. Sel. Evol. 34: NEBOLA, M., DVOŘÁK, J., KUCIEL, J. (1994): Stanovení citlivosti prasat ke stresu DNA testem. Živ. Výr. 39: PENG, X. D., PARK, S., GADELHA, M. R., COSCHIGANO, K. T. (2001): The Growth Hormone (GH) - Axis of GH Receptor/Binding Protein Gene-Disrupted and Metallothionein-Human GH-Releasing Hormone Transgenic Mice: Hypotalamic Neuropeptide and Pituitary Receptor Expresion in The Absence and Presence of GH Feedback Endokrinology 142:

43 OBAYA, J. et al. (1999): The relationship between c-myc and The cell cycle. J. Oncogene 8(16): PULKRÁBEK, J.et al. (2005): Chov prasat. Profi Press. Praha.s vyd. ISBN QIAGEN (2001): QIAmp DNA Blood Mini Kit manuál. REINER, G., HECHT, W., LEEB, T., BRENIG, B., ROBIC, A., DZAPO, V. (1999): Isolation and characterization of The porcine c-myc proto-oncogene and chromosomal assignment to SSC 4p13. Animal Genetics 30 (3): REINER, G., WILLEMS, H., GELDERMANN, H., DZAPO, V. (2000): Four PCR-RFLP and a sequence polymorphism in The porcine c-myc proto-oncogene and confirmation of The chromosomal locatization on SSC4 by linkage mapping. Anim.Gen. 31 (2): SAMRAUS, H. H., (2006): Atlas plemen hospodářských zvířat. Brázda.Praha. s vyd. ISBN SCHELLANDER, K., PELI, J., KNEISSI, F., SCHOLL, F., MAYR, B. (1994): Variation of The growth hormone in RYR1 genotyped Austrian pigs breče. J. Anim. Bree. Gen. 111: SCHLOSSER, I., HÖLZET, M., MÜRNSEER, M., BURTSCHER, H., WEIDLE, U. H., EICK, D. (2003): A role for c.myc in The regulation of ribosomal RNA processing. Nucleic Acids Research 31: STEINHAUSER, L. et al. (2000): Produkce masa. Brno. ISBN URBAN, T., KUCIEL, J., MIKOLÁŠOVÁ, R. (2002): Polymorhism of genes encoding for ryanodine receptor, growth hormone, leptin and MYC protooncogene protein and meat production Duric pigs. Czech J. Anim. Sci. 47 (10): YERLE, M. (1993): Localization of The porcine growth hormone gene to chromosome 12p1.2-->p1.5.. Anim Genet. 2(24):