MASARYKOVA UNIVERZITA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů ÚLOHA INTRACELULÁRNÍ REDOXNÍ ROVNOVÁHY V NEUROGENEZI EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK Diplomová práce Marcela Kohoutková Vedoucí práce: Mgr. Jiří Pacherník, PhD. Brno

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Bc. Marcela Kohoutková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Úloha intracelulární redoxní rovnováhy v neurogenezi embryonálních kmenových buněk Biologie Studijní obor: Obecná biologie Vedoucí práce: Mgr. Jiří Pacherník, PhD. Akademický rok: 2011/2012 Počet stran: 63 Klíčová slova: Neurogeneze, Redoxní rovnováha, Neurální kmenové buňky, Neurální progenitorové buňky, Reaktivní kyslíkové metabolity (ROS), Kináza p38 MAPK

3 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Bc. Marcela Kohoutková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology The role of intracellular redox balance in embryonic stem cells neurogenesis Biology Field of Study: General Biology Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, PhD. Academic Year: 2011/2012 Number of Pages: 63 Keyword: Neurogenesis, Redox Balance, Neural Stem Cells, Neural Progenitor Cells, Reactive Oxygen Species (ROS), Kinase p38 MAPK

4 Abstrakt Neurogeneze je proces, při kterém jsou generovány nové neurální buňky. Cílem této předkládané práce je snaha ověřit, jestli do procesu neurogeneze mohou zasahovat i látky, které mění intracelulární redoxní status buňky. Experimentální část práce je založena na kultivaci na myších neurálních progenitorových buněk in vitro a následné analýze pomocí různých metod, zejména Western Blottu. Mezi hlavní zkoumané markery patří neurálně specifické proteiny a to zejména N-CAM a β III tubulin. Abstract Neurogenesis is a process during which new neural structures are generated. The goal of this thesis is to explore the role of some substances, which can change intracellular redox status of the cell. An experimental part is based on cultivation of mouse neural progenitor cells in vitro and consequent analysis using various methods, such as Western Blott. The main researched markers are neural specific proteins, especially N-Cam and β III tubulin.

5

6

7 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému vedoucímu, Mgr. Jiřímu Pacherníkovi, PhD., za příkladné vedení, četné diskuze, cenné rady a připomínky, zejména čas mně věnovaný. Dále bych ráda poděkovala Mgr. Haně Kotasové, Mgr. Ivě Veselé, Mgr. Janu Kučerovi a Mgr. Jiřině Procházkové, PhD. za mnohé rady a také za pomoc během laboratorní práce. V neposlední řadě děkuji své rodině za zázemí, podporu a trpělivost. Děkuji! Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala zcela samostatně, pouze na základě rad vedoucího a s využitím literatury, kterou v práci řádně cituji. Brno 15. května 2012 Marcela Kohoutková

8 Obsah 1. Úvod Neurogeneze Původ nervového systému Embryonální indukce Neurogeneze in vivo Neurální kmenové buňky Úloha retinoidů v neurogenezi Evoluční teorie zaměřené na původ neurálních struktur Neurogeneze in vitro Úloha kinázy p Neurogeneze jako redoxně modulovatelný děj Vybrané látky modulující redoxní status buňky Cíle práce Materiál a metody Druhy použitých buněk a způsoby jejich kultivace Použitá kultivační média, roztoky a protilátky Transfekce buněk Reportérová analýza a ATP test viability Příprava lyzátů pro stanovení koncentrace proteinů Elektroforéza a Western Blott (WB) Výsledky Vliv vybraných redoxních modulátorů na neurogenezi Úloha NAC jako protektivního agens před buněčnou smrtí způsobovanou RA Úloha genetického pozadí kinázy p38 v neurogenezi Diskuze Vliv vybraných redoxních modulátorů na neurogenezi Úloha NAC jako protektivního agens před buněčnou smrtí způsobovanou RA Úloha genetického pozadí kinázy p38 v neurogenezi Závěr Seznam zkratek Seznam obrázků, grafů a tabulek Použitá literatura

9 1. Úvod Vznik mnohobuněčnosti znamenal pro organismy velký pokrok. Postupně se zvětšující tělo však bylo zapotřebí řídit. Proto se postupně vyvinuly buňky, které byly schopny různé signály analyzovat a reagovat na ně. Zpočátku se jednalo pouze o rozptýlenou nervovou soustavu, ale s postupující evolucí narůstal význam těchto struktur. Došlo ke vzniku funkčních celků, následné centralizaci, cephalizaci a progresivnímu zdokonalování jednotlivých funkcí. Až donedávna byla nervová soustava považována za systém, kde není možná regenerace ani produkce postnatálních neuronů. Předpokládalo se, že veškeré přítomné neurony se utvořily již během prenatálního vývoje. Prvním pádným důkazem chybnosti této teorie byly studie s kanáry, které vypovídaly jasný fakt a to, že během páření dochází k masivní neurogenezi. Důvodem byla skutečnost, že se ptáci v této době učí nové písně a jistá plasticita neurální tkáně je proto nezbytná. U savců k neurogenezi dochází v subventrikulání zóně (SVZ) a gyru dentatu. Některé studie poukazují na možnou přítomnost neurogeneze i v dalších místech adultního mozku, ale zatím nebyly předloženy dostatečné důkazy k potvrzení této domněnky (Zhu et al, 2005) Zdá se, že právě proces neurogeneze je citlivý k redoxní modulaci, které představuje změnu intracelulární redoxní rovnováhy pomocí celé řady molekul. Patří sem např. i reaktivní kyslíkové radikály, které během nepřirozených podmínek mohou poškozovat buňky. Na druhou stranu se jedná o látky, které jsou součástí i mnoha fyziologických dějů. Drobné nuance v množství modulátorů rozhodují o budoucnosti buňky; jestli bude proliferovat, diferencovat, nebo bude podrobena apoptóze (Yoneyama et al, 2009). Detailní pochopení principů neurogeneze a možností její regulace popř. modifikace, vykazuje obrovský léčebný potenciál. Právě nová fakta by mohla posunout medicínu mnohem dál. Bylo by možné lepší zacílení terapie v případech neurodegenerativních onemocnění, jako je Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba, nebo při poraněních míchy. Experimentální část této práce byla provedena na myších neurálních prekurzorových buňkách. Pomocí metody Western Blott byly stanoveny neurálně charakteristické markery jako N-CAM nebo β III tubulin, díky kterým mohly být porovnávány jednotlivé linie navzájem. 9

10 2. Neurogeneze 2.1. Původ nervového systému Kardiovaskulární a nervový systém jsou první struktury, které se vytváří v průběhu embryonálního vývoje. Zatímco srdce začíná fungovat 3. týden 1 po fertilizaci, vývoj nervové soustavy začíná ještě před započetím srdeční činnosti. K dynamickému rozvoji nervové soustavy je činnost srdce nezbytná, protože přivádí kyslík a živiny pro tento proces (Noback et al. 2005; Jelinek et al. 2007). Zhruba 18. den embryonálního vývoje člověka se z epiblastu vytváří ektoderm. Ve stejné době vcestují buňky pod svrchní ektoderm a formuje se mesoderm, který má určitý indukční význam pro vznik neurální ploténky (Viz kap. 2.2.). Buňky ektodermu vlivem těchto signálů postupně procházejí dělením a diferenciací a sérií morfologických pohybů. Dochází ke zmohutnění vrstvy ektodermu a formaci neurální ploténky 2 (Obr. 1 Tvarování) (Bottenstein 2003; Gilbert 2006). Vývoj vede k prodlužování neurální ploténky v předo-zadním směru a postupné elevaci postranních částí (Obr. 1 Skládání, Elevace). Valy se přibližují a buňky postupně splývají (Obr. 1 Uzavírání). Také se vytvářejí buňky neurálního hřebene, které dávají vznik např. periferním neuronům nebo pigmentovým buňkám (Gilbert 2006). Obr. 1: Vznik neurální trubice (upraveno dle Gilbert, S.F. 2006) 1 Jedná se o 3. týden zárodečného vývoje u člověka. 2 V této době se na formování ploténky podílí 50% ektodermu (Gilbert, S.F. 2006) 10

11 Přední část neurální ploténky se stane základem pro budoucí mozek; zadní část vytvoří neurální trubici, ze které vznikne mícha (Colas et al. 2001; Noback et al. 2005). Dochází ke zmnožení počtu progenitorů a jejich postupné diferenciaci. Vyvíjející se mozek má nejprve tři části, které se následně dále dělí na pět částí (Obr. 2). Postupnou diferenciací a maturací dochází ke vzniku specializovaných sektorů, které jsou rozděleny na základě svých funkcí (Gilbert 2006). Obr. 2 Vývoj mozku, vznikající struktury (Gilbert 2006), zdroj obr Embryonální indukce Neurální indukce představuje základní předpoklad pro vytvoření nervové soustavy. Dlouho se předpokládalo, že vznik nervové soustavy je indukován až po vzniku tzv. uzlíku (ekvivalent organizátor). Ektoderm je ale zřejmě vystaven nějakému neurodiferenciačnímu signálu ještě před vznikem uzlíku. Tento signál bude zřejmě velmi obecný. Proto je velmi pravděpodobné, že se do těchto procesů zapojuje i redoxní signalizace, které může buňky přimět diferencovat právě neurálním směrem (Wilson et al. 2001). Tzv. defaultní model předpokládá, že ektoderm je k neurálnímu vývoji přednastaven. Standardně je v ektodermu přítomno BMP (Bone Morfogenic Protein - kostní morfogenetický protein), které neurální vývoj blokuje (Weinstein et al. 1999). Inhibice BMP musí být přesně 11

12 načasována. Nejprve dojde k ustavení zóny bez BMP, ale tato blokace nesmí trvat příliš dlouho. Toto bylo dokázáno na kuřecím modelu, kdy při pozdní blokaci BMP4 nedocházelo k expresi pozdních neurálních markerů (Linker et al. 2004). Během gastrulace se vytváří uzlík. V prvních krocích není jeho přítomnost nezbytná, což bylo dokázáno mutací HNF3β, při které se uzlík nevytvoří (Harland 2000). S postupujícím vývojem narůstá jeho důležitost, postupně se mění a s ním se mění i jeho schopnost indukce. Pokud je ve stáří 3 dnů implantován do jiného embrya, je schopen vyvolat vznik kompletně nové neurální tkáně. Takto vzniklé embryo může mít dvě předo-zadní osy. Pokud je tento pokus opakován s šestidenním uzlíkem, dochází k rapidnímu snížení jeho indukčních schopností a je schopen indukovat vznik pouze zadní části (Storey et al. 1992). Jak již bylo zmíněno, důležitost uzlíku stoupá s probíhajícím vývojem, kdy začíná secernovat inhibitory BMP Noggin a Chordin, které se vážou na BMP s vyšší afinitou, než má BMP ke svému receptoru. Dalším známým inhibitorem je Follistatin, ale mechanismus jeho účinku není zcela jasný. Zřejmě interaguje pouze s BMP4 a BMP7 (Bottenstein 2003). Podle Wilsona, inhibitory BMP slouží pouze jako prevence před potenciální neurální supresí buněk, které již byly neurálně indukovány (Wilson et al. 2001). Následně dochází k aktivaci genů, které jsou zodpovědné za neurální vývoj a postupně se navyšuje množství neurálních progenitorových buněk Neurogeneze in vivo Vznik nervové soustavy je spojen s diferenciací buněk neurálním směrem. Pokud má vzniknout neurální prekurzor, je nutné, aby byl vystaven odpovídající kombinaci signálů, které dostává také od okolních buněk. Signály na buňky působí během několika stupňů. Zpočátku pluripotentní buňky prochází nejprve specifikací, kdy buňky dostanou signál, aby se staly neuroblasty. Zajímavé je, že neurální indukce stále ještě může být potlačena jinými přítomnými signály, takže je tento proces zvratný. Následuje tzv. determinace, kdy se vzniklé neuroblasty dělí a podstupují neurální diferenciaci. Tyto buňky již nereagují na jakoukoli inhibici. Poté neurální prekurzory postupně opouští mitotický cyklus a stávají se z nich postmitotické struktury (Gilbert 2006). Během vývoje savčího nervového systému se nejprve vytvoří jednovrstevný neuroepitel, který je také nazýván pseudovrstvou, protože zde dochází k pohybu jader během buněčného cyklu, čímž je vytvořen charakter vrstevnatého vzhledu (Zhong et al. 2008). Během migrace 12

13 neuroblastů, neurální trubice ztrácí charakter epitelu a její stěna se stává třívrstvou. Obsahuje 3 zóny ventrikulární, marginální a intermediální. V této době se také vytváří primitivní neurální kmenové buňky (NSC - Neural Stem Cells, viz kap ), které jsou koncentrovány právě ve ventrikulární zóně (Bottenstein 2003; Filip et al. 2006). Některé NSC se začínají dělit a stávají se z nich neurální prekurzorové buňky. Ty nejprve prochází mnohými symetrickými děleními, aby byl zajištěn jejich dostatečný počet, a posléze prochází i děleními asymetrickými (Stiles et al. 2010). Hlavní skupinou neurálních prekurzorových buněk jsou tzv. radiální glie. Název je odvozen od charakteristické radiální orientace, kdy si tyto buňky zároveň udržují kontakt s ventrikulární lumen i povrchem (Zhong et al. 2008). Jejich jádro prochází mitózou na apikální straně VZ a na bazální straně se nachází během S fáze (Obr. 3 Radiální glie). Na rozdíl od neuroepiteliálních buněk, radiální glie exprimují i některé markery, které jsou typické pro atroglie, např. glykogenové granule, nebo glutamátový transportér GLAST. Vedle radiálních glií existuje další skupina progenitorů tzv. bazální progenitory. Vznikají z neuroepiteliálních buněk nebo radiálních glií, ale na rozdíl od nich, jádra bazálních progenitorů podstupují mitózu na bazální straně, kde poté zvyšují počet neuronů (Obr. 3 Bazální progenitory) (Gotz et al. 2005). Obr. 3 Srovnání jednotlivých typů buněk a jejich pohyby jader během buněčného cyklu, (upraveno dle Gotz a Huttner, 2005) 13

14 Produkce neuronů u člověka začíná až 42. den post coitum, jelikož nejprve musí být přítomen dostatečný počet prekurzorových buněk, ze kterých se neurony diferencují. V této době začíná převažovat počet asymetrických dělení nad symetrickými. Nově vznikající buňky migrují na místa určení. Vývoj mozku pokračuje i po narození, kdy dochází zejména k diferenciaci podpůrných struktur oligodendrocytů. Právě oligodendrocyty působí inhibičně na nově vznikající neurony a axony, proto jsou velkou limitací možné terapie. V dospělém mozku neurogeneze probíhá jen velmi omezeně a to v subventrikulární zóně (SVZ) resp. v jejích pozůstatcích (někdy nazývá subependymální zónou), nebo v čichových lalocích (Mokry 1999; Stiles et al. 2010). Čichové vjemy jsou velmi důležité, a proto dochází k neustálému vzniku nových receptorů, což organismu poskytuje velkou výhodu v měnících se životních podmínkách. Díky tomu je schopen zaregistrovat nové čichové vjemy. Aby bylo možné signál zpracovat v CNS, musí tam být přenesen. Kvůli tomu se vytváří nové neuroblasty, které vcestují do čichového laloku, kde se diferencují v neurony (Filip et al. 2006) Neurální kmenové buňky Jak již bylo poznamenáno, během vývoje vznikají NSC. Nejprve vznikají primitivní NSC, které jsou závislé na přítomnosti LIF a po své disociaci jsou schopny produkovat definitivní NSC, které se in vivo nachází např. v mozku dospělého jedince. Definitivní NSC nejsou již závislé na LIF, ale nezbytností se jeví přítomnost FGF 2. U myších modelů in vitro jsou tyto struktury schopny diferencovat do nervů, astrocytů i oligodendrocytů (Hitoshi et al. 2004; Filip et al. 2006). Pro kmenové buňky je nezbytná přítomnost signalizace Notch, která je napomáhá udržet v nediferencovaném stavu. U in vivo modelů je jeho role intenzivně zkoumána. U embrya, které neobsahovalo funkční gen pro Notch, bylo množství jeho kmenových buněk výrazně sníženo, ale nebylo redukováno úplně. To nasvědčuje tomu, že Notch není jedinou signální drahou zodpovědnou za kmenové buňky. Zřejmě zde existuje jistý stupeň zástupnosti těchto drah (Hitoshi et al. 2004). 14

15 Úloha retinoidů v neurogenezi Kyselina retinová (RA) a retinoidy jsou deriváty vitamínu A. Hrají důležitou roli zejména v embryonálním vývoji, kdy se účastní se např. vývoje oka, srdce, dýchacího ústrojí nebo dokonce i pokožky. Jsou také hojně zastoupeny v nervové soustavě (Blumberg et al. 1997). Embrya, která jsou vystavena velkému nedostatku retinoidů, umírají z důvodu multiorgánového selhání (Luo et al. 2004). Kyselina retinová působí na buňky skrz jaderné receptory, které ovlivňují transkripci širokého spektra cílových genů. Bylo pozorováno, že existuje více jak 500 genů, které jsou k působení kyseliny retinové citlivé (Maden 2007). Existují dva typy receptorů, na které se kyselina retinová váže. Jsou to RAR a RXR, které nejčastěji reagují v podobě heterodimerických párů. Hlavní rozdíle mezi těmito receptory v jejich aktivaci. RAR je aktivován buď pomocí ATRA (All Trans Retinoic Acid) nebo 9-cis RA. RXR je aktivován pouze vazbou 9-cis RA (McCaffery et al. 1994). V poslední době bylo ale prokázáno, že RA se dokáže vázat i na další jaderné receptory, jako jsou např. PPAR (Peroxisome Proliferator- Activated Receptor). Spouští tak expresi genů, které jsou asociovány zejména se zánětem, nebo třeba také s metabolismem lipidů (van Neerven et al. 2008). Ačkoli RAR a RXR jsou typické jaderné receptory, u Schwannových buněk, kde k jejich expresi také dochází, je místem jejich exprese cytoplasma (Maden 2007). RA hraje významnou roli v ustavení dorzo-ventrální osy, což dokázaly experimenty na žábách rodu Xenopus. Pokud jsou receptory pro RA nějakým způsobem inaktivovány, dochází k defektnímu vývoji zadní části embrya. Z toho vyplývá, že přítomnost RA je nezbytná ke správnému vývoji předo-zadní osy tedy i pro neurální vývoj jako takový (Blumberg et al. 1997). U kuřecího embrya byl prokázán účinek RA na vývoj míchy a somatických motoneuronů (Maden 2007). Naproti tomu u savců není význam RA zcela znám. Morfologická studie mozku myši, která měla nefunkční receptory pro RA, prokázala, že vliv této blokace na morfologii byl zcela nulový. Je třeba dodat, že blokace receptorů nebyla provedena embryonálně, což může dokládat fakt, že po narození retiniody již nehrají tak důležitou roli (Luo et al. 2004). Protikladem jsou studie, kdy byly myší modely vystaveny nedostatku vitamínu A, které dokládají velký dopad na fyziologickou i patologickou funkci motoneuronů, bazálních ganglií, dokonce i vliv na kognitivní funkce (van Neerven et al. 2008). Retinoidy jsou signální molekuly, které působí v indukci neurální diferenciace, nebo růstu axonů. V kombinaci s dalšími induktory, dává RA vzniknout mnoha druhům neuronů 15

16 (Tab. 1.) (Maden 2007). Je zajímavé, že retinoidy jsou produkovány na různých místech organismu s různou intenzitou. Např. hypofýza, která obsahuje velké množství enzymu nezbytné pro syntézu RA, prakticky produkuje jen velmi malé množství této látky (McCaffery et al. 1994). Typ buněk Induktory Typy neuronů Lidské a myší ESC RA + SHH Cholinergní, Dopaminergní Myší ESC RA + CNTF Dopaminergní Lidské ESC RA + BDNF, RA + TGF α Dopaminergní Myší ESC RA Glutaminergní Adultní NSC RA + NT-3 RA + KCl Více typů GABAergní Lidské čich. nervové buňky RA + SHH Dopaminergní Haematopoetické bky z KD RA + SHH Glutaminergní Tab. 1 Způsoby indukce buněk a vznikající neurální typy. Upraveno dle (Maden 2007) ESC Embryonální kmenové buňky; NSC Neurální kmenové buňky; RA Kyselina Retinová; SHH Sonic hedgehog; CNTF Ciliární neutrofický faktor; BDNF Mozkově-derivovaný neutrofický faktor; TGF α Transformující růstový faktor α; NT-3 Neutrofin-3; KCl Chlorid draselný Jak již bylo poznamenáno, retinoidní receptory hrají důležitou roli i při zánětu a neurodegenerativních chorobách. Dokonalé pochopení principů jejich působení při těchto patofyziologických stavech by tedy mohlo vést k úspěšnější terapii. Byla dokonce zkoumána i role retinoidů u tzv. amyloidních plaků, jejichž formování by údajně měly potlačovat. Dalším z možných cílů biomedicínských oborů je přímo transkripce genů aktivovaných navázáním retinoidů na receptor při léčbě poranění míchy a periferních neuronů (van Neerven et al. 2008) Evoluční teorie zaměřené na původ neurálních struktur Z evolučního hlediska lze na původ mozku, jakož i všech neuronů aplikovat dvě vývojové teorie. První předpokládá, že vznik celé nervové soustavy je vyvolán pouze jednou prekurzorovou buňkou. Z té se postupným dělením a diferenciací stávají všechny ostatní buňky. Na druhé straně stojí teorie, která předpokládá, že jednotlivé typy neuronů vznikly nezávisle na ostatních v závislosti na různých podmínkách. Tato teorie lépe vystihuje přítomnost široké škály neuronů, jejich plasticitu, ale i například široké spektrum jednotlivých 16

17 neurotransmiterů. V mozku lze detekovat více jak 30 typů neuronů, které se vyprofilovaly na základě měnících se vnějších podmínek (Moroz 2009) Neurogeneze in vitro Snaha objevit mechanismy v rámci neurogeneze vedla k zavedení buněčných in vitro modelů. V současnosti se mezi nejpoužívanější modely řadí zejména kultivace pomocí embryonálních tělísek, kde právě sférická struktura tělíska navozuje podmínky, které jsou blízké fyziologickým. K indukci těchto buněk neurálním směrem je využívána RA (Filip, S. 2006). Dalším možným způsobem kultivace neurálních buněk je tvorba monovrstvy. Buňky jsou v tomto případě kultivovány dva dny v médiu obsahujícím sérum a poté jsou přeneseny do bezsérových podmínek a jsou kultivovány v ITS médiu (Tab. 1). Právě tento postup podporuje vývoj neurálních buněk (Pachernik, J. 2002) Úloha kinázy p38 P38 je členem rodiny mitogenně aktivovaných protein kináz (MAPK), které hrají důležitou roli v signálních transdukčních procesech indukovaných různými zánětlivými a stresovými stimuly. Rodina p38 je tvořena 4 členy (α δ), ale tato práce se zaměřuje zejména na p38α, který má významnou kontrolní úlohu v proliferaci, diferenciaci a apoptóze (Saklatvala 2004). Velký význam této kinázy dokládá i letalita p38α deficientních myší, které umírají již během embryonálního vývoje a to buď z důvodu různých placentálních defektů (Porras et al. 2003), nebo kvůli nefunkčnosti genu pro erytropoetin (Adams et al. 2000). V současnosti je studium role této kinázy cílem mnoha biomedicínských studií. P38α je zkoumána zejména v souvislosti s chronickými záněty např. u Crohnovy choroby, astmatu, nebo neurodegenerativních poruch. Nabízí jeden z možných terapeutických postupů pro budoucnost (Mayer et al. 2006). 17

18 2.5. Neurogeneze jako redoxně modulovatelný děj Nízké koncentrace kyslíku (hypoxie) 3 se vyskytují v některých fyziologických i patofyziologických buněčných dějích jako je např. při embryogenezi, nebo v místech, kde se nachází kmenové buňky 4, ale i při ischemii nebo rakovině (Vieira et al. 2011). Při těchto podmínkách v buňkách vznikají ROS (Reactive Oxygen Species), kterým jejich radikálové vlastnosti uděluje nepárový valenční elektron. Patří sem ale i látky neradikálové povahy. Na druhé straně jsou buňky schopny cíleného generovaní ROS, které slouží jako mediátory programované buněčné smrti nebo v zánětu. Hlavními zdroji ROS jsou NADPH (Nikotinamide Adenin Dinukleotide Phosphate) oxidáza a cytochrom p450, podílející se na metabolismu xenobiotik (Finkel 2011). Dále v buňce ROS unikají z mitochondriálního respiračního řetězce, konkrétně z komplexu III. Buňky ale obsahují celou řadu mechanismů, které přebytečné množství ROS odstraňují (Vieira et al. 2011). V neurogenezi se hypoxie vyskytuje jak během expanzivního embryonálního vývoje, kdy cévy nestíhají zásobovat dynamicky se rozvíjející strukturu, tak i v dospělém mozku. Zdá se, že změny v kyslíkových hladinách mohou být klíčovým faktorem pro vznik nových neuronů. Dokonce Burns a jeho spolupracovníci dokázali, že neurogeneze může být iniciována jako odpověď na hypoxii při ischemii a následné reperfúzi u některých hlodavců (Burns et al. 2009). V poslední době se in vitro kultury NSC dostaly do popředí zájmu mnoha výzkumných skupin. Snaha objasnit jaké principy spojují ROS a neurogenezi je jedním z významných cílů současné doby. Právě ROS zřejmě hrají velmi důležitou roli v neurální diferenciaci (Zhu et al. 2005; Clarke et al. 2009; Vieira et al. 2011). Jsou např. schopné zprostředkovat diferenciaci skrz aktivaci p38 MAPK (Ito et al. 2006). Mnoho studií poskytuje informace, že in vitro kultury vystavené nižším hladinám kyslíku lépe proliferují a diferencují neurálním směrem. Právě schopnost proliferace ve snížených kyslíkových hladinách zřejmě evokuje podmínky, kterým jsou buňky vystaveny v neurogenních zónách. Např. u adultních buněk SVZ pískomila ischemie signifikantně zvyšuje neurogenezi (Zhu et al. 2005). 3 Za hypoxické prostředí je považováno to, kde koncentrace kyslíku je nízká. Je to 1,5% u opic, 2,4% u člověka, 3,5% u králíka a 5,3% u křečka (Vieira 2011). 4 Toto prostředí jim zřejmě udílí jejich charakteristiku a zabraňuje jejich předčasné diferenciaci (Vieira 2011) 18

19 Ačkoli hypoxie zřejmě podporuje neurogenezi, vysoké hladiny ROS spojené s neurální diferenciací a buněčným stresem rozhodně nepůsobí na buňky pouze pozitivně. Právě tento stres vede buňky spíše směrem apoptózy. Je nutné upravit hladinu kyslíku tak, aby byly využity všechny výhody pro neurogenezi. Na druhé straně je nutné přebytečné množství kyslíkových radikálů odstranit, aby nedocházelo ke smrti buněk Vybrané látky modulující redoxní status buňky Jedná se o látky, které jsou schopny zabránit oxidativnímu poškození molekul, a to několika způsoby. Antioxidanty jsou schopny působit jako prevence vzniku kyslíkových radikálů. Jedná se o látky, které vážou redoxně aktivní ionty např. na železo, jako je tomu u transferinu. Další skupina těchto látek napomáhá degradaci ROS, nebo jejich substituci za méně reaktivní. Mezi nejvýznamnější členy této skupiny se řadí glutation peroxidáza a reduktáza. V neposlední řadě jsou zde přítomny tzv. scavengerové molekuly, které jsou schopny radikály vychytávat. Řadí se sem celá řada vitamínů, např. vitamin C a mnoho dalších látek (Valko et al. 2007; Mates et al. 2008) Apocynin Apoc (4-hydroxy-3-methixyacetophenone) je látka rostlinného původu, která v buňce působí několika mechanismy. Jeho nejdůležitější funkcí je její inhibice NADPH oxidázy. Zabraňuje formování aktivního komplexu NADPH oxidázy, který produkuje superoxid (Obr. 4). Podle Vejražky apocynin nepůsobí jako scavenger (Vejrazka et al. 2005), ale novější práce tento fakt vyvracejí a tvrdí, že v některých případech Apoc skutečně působí jako scavengerová molekula (Heumuller et al. 2008) DPI DPI (Diphenyleneiodonium) působí jako blokant NADPH oxidázy (Obr. 4). Jedná se o flavoproteinovou molekulu, která v buňce ovlivňuje celou řadu funkcí (např. funkci cytochromu p450 apod.). DPI zřejmě vstupuje do reakce s radikály, s nimiž vytváří komplexy (Riganti et al. 2004). 19

20 NAC NAC (N-acetyle cystein) je prekurzorem glutationu a potenciálním scavengerem volných radikálů (Obr. 4). V poslední době byl prokázán jeho významný vliv jako neuroprotektantu při různých patofyziologických stavech jako je ischemie nebo neurodegenerativní choroby (Qian et al. 2009; Welin et al. 2009). NADPH oxidáza DPI APO O 2 O 2 - superoxid dismutáza H 2 O 2 kataláza H 2 O NAC GSH peroxidáza GSH GSSG GSH reduktáza Dýchací řetězec mitochondrií NADP + NADPH Obr. 4 Místa působení jednotlivých látek (Kucera 2009). 20

21 3. Cíle práce Cílem této diplomové práce je především poodhalení principů neurogeneze, poznání jakými způsoby probíhá a jaké jsou možnosti regulace tohoto procesu. Dílčími cíli této práce je také najít odpovědi na následující otázky: Modifikuje změna v redoxní rovnováze skutečně průběh neurogeneze u časných neurálních progenitorových buněk? Je tento efekt závislý na linii použitých buněk? Jakou úlohu hraje kináza p38α v neurogenezi. Je její aktivita modifikovatelná pomocí změn v redoxní rovnováze u embryonálních kmenových buněk? Promítá se produkce ROS do probíhající neurogeneze? 21

22 4. Materiál a metody 4.1. Druhy použitých buněk a způsoby jejich kultivace Experimenty byly realizovány s mes buňkami D3, pocházejícími z blastocyst myší 129/Sv + / + (Doetschman et al. 1985); (Pachernik et al. 2002), získány z European Collection of Cell Culture, Wiltshire, UK. Další použitou linií byla W17 (p38 + / + ) a její modifikovaná varianta 0 (p38 - / - ) (Allen et al. 2000); (Berenson et al. 2006). Poslední linií byla R1 (HIF1α + / + ) a její varianta (HIF1α - / - ) (Carmeliet et al. 1998). K buňkám byly přidávány látky ovlivňující redoxní stav buňky (Tab. 3) Pokusy jsou rozřazeny do 3 celků: Vliv vybraných redoxních modulátorů na neurogenezi Nejprve byly provedeny pokusy, které zjišťovaly rozdíl citlivostí buněk na dobu, ve které došlo k ovlivnění redoxními modulátory. K experimentu byly použity buňky ve formě embryonálních tělísek (embryoid body, EB), která byla kultivována v LIF médiu. Jedna skupina buněk byla ovlivněna ve stáří 48 hodin od začátku experimentu (Obr. 5). Druhá skupina byla po 96 hodinách vyseta do bezsérového média, aby buňky mohly adherovat a na začátku 6. dne došlo k ovlivnění těchto buněk (Obr. 6). Buňky, které byly ovlivněny po 48 hodinách od začátku kultivace, byly 3. a 4. den kultivovány v přítomnosti modulátorů v ES médiu. Po 96 hodinách od počátku pokusu bylo médium vyměněno za bezsérové. Buňky jsou v bezsérovém médiu kultivovány proto, že toto médium zvyšuje citlivost k neurální diferenciaci. Na konci 5. dne byla k oběma skupinám přidána RA jako neurální induktor. Celková doba kultivace byla 12 dní, během kterých probíhala výměna média každé 2 dny (neuvedeno v obrázku). 22

23 Obr. 5 - Schéma diferenciačního protokolu u buněk ovlivněných 2. den Obr. 6 - Schéma diferenciačního protokolu u buněk ovlivněných 4. den V dalším experimentu byly testovány různé koncentrace NAC a jejich efekty na jimi ovlivněné buňky. Po 48 hodinách byly k buňkám ve formě EB dodány 3 různé koncetrace 23

24 NAC. Po 4 dnech bylo buňkám vyměněno médium za bezsérové a na konci 5.dne byla přidána RA. Každé další 2 dny bylo buňkám vyměňováno médium až do konce experimentu 12.den (Obr. 7) Obr. 7 Znázornění protokolu diferenciace pro různé koncentrace NAC 24

25 Následujícím pokusem v tomto bloku bylo porovnání účinnosti působení redoxních modulátorů Trolox a DPI a na 4 různých liniích D3, R1, w17 a 0. Opět byly použity buňky ve formě embryonálních tělísek, které byly kultivovány první 2 dny v ES médiu a následující 2 dny v ITS médiu. Na konci 4. dne se buňky nechaly den adherovat a následně k nim bylo přidáno DPI, Trolox a RA. Indukce probíhala 2 dny a poté bylo každé 2 dny vyměněno médium. Pokus byl ukončen 12. den (Obr. 8) Obr. 8 Nákres protokolu pro testování účinku DPI a Trolox na jednotlivých liniích 25

26 Úloha NAC jako protektivního agens před buněčnou smrtí způsobovanou RA Buňky R1 a w17 byly kultivovány 1. a 2. den v monovrstvě (Pachernik et al. 2002) v ES médiu. 3. den pokusu bylo médium vyměněno za ITS a buňky byly ovlivněny do jedné skupiny buněk byl přidán NAC společně s RA, do druhé pouze NAC a do 3. skupiny byla přidána pouze RA. Takto ovlivněné buňky byly kultivovány společně s přidanými látkami 2 dny. 5. den bylo vyměněno médium a do 2. a 3. skupiny byla přidána 2. látka v případě 2. skupiny to byla RA, do 3. skupiny byl dodán NAC. Celková délka kultivace činila 12 dní, během kterých bylo každý druhý den vyměňováno médium (Obr. 9) Obr. 9 Znázornění průběhu kultivace u testování protektivního účinku NAC 26

27 Rovněž bylo zjišťováno, jestli má NAC vliv na senzitivitu buněk k RA. Pro tuto analýzu byl použit reportérový vektor pro RA s luciferázovou koncovkou. K pokusu byly využity buňky linie D3 a R1 (Obr. 10). Na začátku experimentu byly buňky transfekovány pomocí zmíněného vektoru (viz kap. 4.5). Po 24 hodinách byly buňky ovlivněny přídavkem NAC a RA. Inkubace s těmito látkami trvala 8 hodin a následně byly buňky zlyzovány. Obr. 10 Schéma provedeného pokusu s transfekcí buněk 27

28 Úloha genetického pozadí kinázy p38 v neurogenezi V tomto pokusu byly porovnávány buňky w17 s funkční kinázou p38 a 0, které tuto kinázu nemají. Buňky byly kultivovány ve formě EB, které byly nejprve první 2 dny v ES médiu a následující 2 dny v ITS médiu. Na konci 4. dne se buňky nechaly adherovat a následující den byly ovlivněny látkami DPI, Trolox a NAC. Dále byla přidána RA a buňky byly 2 dny kultivovány v přítomnosti těchto látek. Celková doba pokusu činila 12 dní (Obr. 11). Obr. 11 Nákres kultivace buněk v experimentu sledování kinázy p38 28

29 Byla zkoumána se i role kinázy p38. Byly kultivovány tzv. neurosféry (Obr. 12) (Chaichana et al. 2006). Jak je poznamenáno ve článku, existuje více postupů ke kultivaci neurosfér. V našem případě byly buňky 4 dny kultivovány ve formě EB. Po uplynutí této doby byly buňky 2x opláchnuty PBS a trypsinizovány po dobu cca 5 minut při teplotě 37 C. Následně byl trypsin zneutralizován přídavkem média se sérem a buňky byly pomocí pipety převedeny na suspenzi, která byla centrifugována 5 minut při 200 G. Po centrifugaci bylo vyměněno médium za ITS a buňky byly vysety na nepoželatinované 24 jamkové desky. K buňkám se přidalo FGF (4 μg/μl), EGF (10 μg/μl), LIF (10 μg/μl), N2 100x (Invitrogen) a B27 200x (Invitrogen). Na konci 5. dne pokusu byl k buňkám přidán: Apoc (0,1 mm a 0,5 mm), NAC (0,5 mm, 1 mm, 3mM a 10 mm) a Trolox (2 mm, 7mM a 20 mm). Obr. 12 Znázornění kultivace neurosfér 29

30 4.2. Použitá kultivační média, roztoky a protilátky Název Složení ES médium DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, high Glucose, Invitrogene), již obsahující glukózu (4,5g/l) a NaHCO 3 (3,7g/l). Toto médium bylo obohaceno o: - 1x NEAA neesenciální aminokyseliny (Invitrogene), - L-glutamin (2mM, PAA), - 15% fetální bovinní sérum (PAN) - Antibiotika - Streptomycin (100μg/ml, Sigma-Aldrich), Penicilin (100U/ml, PAN) - β-merkaptoethanol (100mM, Sigma-Aldrich) LIF médium DMEM kompletní médium, které bylo připraveno podle výše uvedeného popisu, přidán LIF (5ng/ml, Invitrogene) ITS médium Bezsérové médium, s přídavkem inzulinu, transferinu a selenu (1x1000 ITS supplement, Gibco) Tab. 2 Seznam použitých kultivačních médií Přidané látky Apoc Apocynin (4-hydroxy-3-methixyacetophenon) DPI Diphenyleneiodonium H 2 O 2 Peroxid vodíku NAC N-acetyl cystein Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina Tab. 3 Látky ovlivňující redoxní status buňky PBS (phosphate-buffered saline) 1l 8,0 g NaCl 0,2 g KCl 2,9 g Na2HPO4*12H2O 0,2 g KH2PO4 doplnit do 1000 ml H2O Tab. 4 Složení PBS SDS lyzační pufr 100 mm Tris-HCl - ph 7,5 1% SDS 10% glycerol Tab. 5 Složení lyzačního pufru 30

31 Elektroforetický pufr 14,42 g glycin 3,00 g Tris 1,00 g SDS doplnit do 1000 ml H2O Tab. 6 Složení elektroforetického pufru Přenosový pufr 14,42 g glycin 3,00 g Tris 200 ml methanol doplnit do 1000 ml H2O Tab. 7 Složení přenosového pufru Omývací pufr 13 g NaCl 10 ml 1 M Tris, ph 7,6 1ml Tween 20 doplnit do 2000 ml H2O Tab. 8 Složení omývacího pufru Separační gel 10% (10ml) 4,000 ml H2O 3,300 ml Acrylamide Bis (30% - w/v - Serva) 2,500 ml 1,5 M Tris (ph 8,8) 0,100 ml 10% Ammonium persulfate 0,004 ml Temed (Tetramethylethylenediamine) Tab. 9 Složení separačního gelu Zaostřovací gel 4% (10ml) 6,800 ml H2O 1,700 ml Acrylamide - Bis (30% - w/v - Serva) 1,250 ml 1,0M Tris (ph 6,8) 0,100 ml 10% Ammonium persulfate 0,010 ml Temed Tab. 10 Složení zaostřovacího gelu 31

32 Mol. hm (kda) Protilátka Výrobce, číslo Ředění N-CAM , 145, 170 Myší IgM SIGMA-Aldrich, A0657 1:4000 N-catherin 130 Myší IgG BD, (21) 1:2500 β III tubulin Myší IgG Exbio, C1 1:500 γ enoláza 55 Myší IgG Exbio, G3 1:500 p38 38 Myší IgG SantaCruz, sc :1000 GAPDH Králičí IgG BD, (43) 1:500 GAP Myší IgG Santa Cruz, sc7457 P 1:1000 cdk 5 30 Myší IgG Santa Cruz, sc :1000 Tab Použité primární protilátky Název Proti myší IgM s křenovou peroxidásou Proti myší IgG s křenovou peroxidásou Proti králičí IgG s křenovou peroxidásou Výrobce, číslo SIGMA-Aldrich, A7630 SIGMA-Aldrich, A9044 SIGMA-Aldrich, A6154 Tab. 12 Použité sekundární protilátky 4.3. Transfekce buněk Transfekční směs byla připravena z bezsérového média bez antibiotik, do kterého následně bylo přidáno PEI (polyethyleimin; Sigma Aldrich) a vektoru reportérového genu pro RA, konkrétně se jednalo o prareβ2-tk-luc plasmid (Pachernik et al. 2005; Kotasova et al. 2011). Finální koncentrace zmíněného vektoru byla 0,67 μg/ml. Takto připravená směs byla ponechána při pokojové teplotě 20 minut. Po inkubaci byly do směsi přidány buňky a takto vzniklá substance byla ponechána při pokojové teplotě zhruba 15 minut. Poté byly buňky vysety na poželatinované 12 jamkové desky. Druhý den se k buňkám přidal NAC a RA. Inkubace trvala 8 hodin a po uplynutí této doby došlo k lýzi a byla stanovena aktivita reportérového genu Reportérová analýza a ATP test viability Aktivita reportérového genu byla stanovena společně s testem viability. Buňky byly zlyzovány směsí lyzačních pufrů v poměru 1 : 1 - Somatic Cell ATP Releasing Reagent (Sigma Aldrich, ČR) k detekci ATP a Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega). 32

33 Buňky byly zamrazeny na doby 15 minut při teplotě -70 C. Po rozmrazení došlo k samotné detekci. Nejprve bylo ke směsi lyzačních pufrů a buněk o objemu 40 μl přidáno 40 μl luciferázového substrátu ze zásobního roztoku (lyofilizovaný substrát byl rozpuštěn v 10 μl Luciferase assay buffer ) a ihned byla stanovena hodnota chemiluminiscence na luminometru (Dynex). Následně byl stanoven počet buněk pomocí testu viability. Lyofilizovaný ATP reagent Stable Light (Biothema) byl rozpuštěn v 10 ml Diluent C (Biothema) a byl vytvořen zásobní roztok. Zlyzované buňky a ATP reagent byly naředěny v poměru 1 : 1 (25 μl : 25 μl) a ihned byla stanovena hodnota chemiluminiscence Příprava lyzátů pro stanovení koncentrace proteinů Samotnou přípravu vzorků předcházel oplach buněk PBS. Následně byl k buňkám přidán SDS lyzační pufr. Vzorky byly sonikovány ultrazvukovou sondou (Brandson) a uloženy na led. Byla změřena koncentrace proteinů pomocí soupravy DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA). K vyhodnocení byla použita kalibrace standardy z hovězího sérového albuminu. Následně byly vzorky naředěny na stejnou koncentraci (obvykle 0,5 mg/ml). Do vzorku byla přidána Bromfenolová modř (0,01%) a merkaptoethanol (1%) a vzorky byly 5 minut povařeny Elektroforéza a Western blot (WB) Gelová elektroforéza (SDS-PAGE) byla prováděna na 10% akrylamidovém gelu za přítomnosti elektroforetického pufru a při napětí 140V. Pro srovnání molekulových hmotností bylo použito proteinových standardů (SDH-6, Sigma-Aldrich). Přenos na polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu (Millipore, USA) byl uskutečněn v přítomnosti přenosového pufru při napětí 100V. Celková doba přenosu byla 70minut. Membrány byly předem aktivovány methanolem. Po vlastním přenosu byla membrána opláchnuta promývacím pufrem. Následovala blokace nespecifických reakcí v 5% roztoku sušeného mléka a promývacího roztoku. Poté byla membrána přes noc inkubována s jednotlivými primárními protilátkami při teplotě 4 C 33

34 (Tab. 11). Oplach membrán byl proveden v omývacím pufru, 5x10min. Poté byly membrány inkubovány se sekundární protilátkou při pokojové teplotě (Tab. 12). Po dalším opakovaném oplachu membrán (5x10min), byly proteiny vizualizovány chemoluminiscenčním substrátem (Millipore, USA) a vyvolány na fotografickém papíře (AGFA, Belgie). Pro kontrolu stejné kvantity proteinu byly membrány obarveny 0,1% amidovou černí. 34

35 5. Výsledky 5.1. Vliv vybraných redoxních modulátorů na neurogenezi Během neurogeneze, stejně jako během ostatních procesů (proliferace, diferenciace), působí na buňky stres, který vyúsťuje v únik elektronů z mitochondriálního dýchacího řetězce. Následkem tohoto stresu vznikají v buňkách volné radikály. Ty jsou schopny pozměňovat biologické funkce některých molekul. Pokud k těmto buňkám přidáme látky, které jsou schopny radikály vychytávat, můžeme tím snížit dopad stresu na tyto buňky. Mezi látky, které působí na redoxní status buňky, se řadí např. Apocynin (Yoneyama et al. 2009), DPI nebo NAC (Qian et al. 2009). Cílem tohoto bloku experimentů bylo určit, jestli mají vybrané látky vliv na probíhající neurogenezi. Jako induktor neurální diferenciace byla použita RA, ke které byly přidány látky, které upravují redoxní stav buňky. Nejprve bylo zjišťováno, zdali je přítomen rozdíl mezi buňkami, které byly ovlivněny stejnými modulátory, ale v jinou dobu. K buňkám bylo přidáno: Apoc 0,5 mm, DPI 50 nm, EtOH 0,25%, H 2 O 2 20 mm, NAC 10 mm a RA 0,5 μm (Obr. 13 dole, Obr. 14 dole) Jedna skupina buněk byla těmito modulátory ovlivněna po 48 hodinách od počátku experimentu, druhá skupina až na začátku 6. dne od začátku pokusu. Po ukončení pokusu 12. den, byla provedena analýza proteinů pomocí metody Western blot. 35

36 Obr. 13 Výsledek detekce proteinů u buněk ovlivněných po 48 hodinách, schéma ovlivnění 36

37 Obr. 14 Výsledek detekce proteinů u buněk ovlivněných po 120 hodinách, schéma ovlivnění Z obrázků je patrné, že buňky, které byly ovlivněny začátkem 3. dne po počátku experimentu, jsou k indukci pomocí RA mnohem citlivější a exprimují více proteinů charakteristických pro neurální diferenciaci. Vliv jednotlivých modulátorů bez RA není příliš patrný. Na druhou stranu u buněk ovlivněných 6. den je zjevné, že reagují méně na neurální indukci vyvolanou RA, ale odpovídají na ovlivnění pomocí jednotlivých modulátorů, které je zřejmě chrání před buněčnou smrtí způsobovanou stresem z diferenciace. Jako pozitivní kontrola byly použity buňky z myšího mozku (na obrázcích zcela vpravo). U detekovaného proteinu N-CAM (Neural Cell Adhesion Molecule), který se účastní tvorby nervové soustavy je například zodpovědný za mezibuněčnou komunikaci, nebo růst neuritu (Jensen et al. 2007). U buněk, které byly ovlivněny po 48 hodinách, je patrný vliv jednotlivých látek na jeho expresi a to zejména u buněk indukovaných RA. Je nutné poznamenat, že nezanedbatelný vliv na tvorbu tohoto proteinu má i NAC samostatně bez RA a to jako jediný z použitých látek (Obr. 13). Na druhé straně, u buněk které byly ovlivněny 6. den, je vliv těchto modulátorů zcela zřejmý. Buňky opět nejlépe reagovaly na ovlivnění 37

38 pomocí NAC. V buňkách, které nebyly indukovány RA, bylo dokonce tohoto proteinu více. Za povšimnutí stojí, že indukce pětidenních buněk pomocí Apoc společně s RA nevyvolává téměř žádnou odpověď ve formě exprese proteinu N-CAM, což je naprosto rozdílný výsledek v porovnání s buňkami indukovanými začátkem 3. dne. Účinek na produkci β III tubulinu je viditelný zejména u buněk, které byly ovlivněny RA a je navíc značně rozdílný v porovnání obou linií. Buňky ovlivněné 3. den produkují tohoto proteinu mnohem více, zejména Apoc s RA. U buněk ovlivněných 6. den, je patrný slabě pozitivní signál u kontroly s RA, dále pak DPI s RA a samostatný NAC. Dalším stanovovaným proteinem byl Gap 43, který je vysoce exprimován v růstovém kónu axonů během vývoje nebo regenerace (Spencer et al. 1992). Je zřejmé, že byl více indukován u buněk ovlivněných RA. Navíc buňky ovlivněné 3. den byly k tomuto zásahu mnohem citlivější. Zajímavá je slabá pozitivita signálu u EtOH. Ten byl použit pouze jako kontrola k Apoc, protože ethalon je rozpouštědlem této látky. Cdk 5, která je nezbytná pro správný vývoj mozku jako celku (Paglini et al. 2001), u 3. den ovlivněných buněk neprokázala žádné rozdíly. Mírné rozdíly v přítomnosti této kinázy, byly detekovány u buněk indukovaných 6. den, kde byla ve slabém nadbytku po ovlivnění pomocí DPI. Vhledem k předešlým nadějným výsledkům s NAC se zkoušelo, jak buňky reagují na jednotlivé koncentrace této látky. Cílem tohoto pokusu bylo stanovit, jaká koncentrace této látky je nejvíce indukční. Z výsledků je jasné, že nejnižší použitá koncentrace - 5 mm NAC, je v tom případě nejvíce indukční. Bohužel výsledek u N-CAM je patrný pouze v přítomnosti RA, ačkoliv byl očekáván i u buněk ovlivněných pouze samotným NAC. U Cdk 5 není zřejmý žádný velký rozdíl mezi jednotlivými koncentracemi NAC a přítomností RA (Obr. 15) 38

39 Obr. 15 Výsledek detekce proteinů u zjišťování citlivosti k jednotlivým koncentracím NAC, schéma ovlivnění Dále byl zjišťován vliv NAC společně s dalším redoxním modulátorem Trolox na různé buněčné linie. K pokusu byly použity linie D3, R1, w17 a 0. Z obrázku (Obr. 16) je patrné, že linie D3 a R1 exprimují více sledovaných neurálních znaků než linie w17 a 0. Kontrola správného nanesení vzorku na gel je přítomna v podobě detekce GAPDH, což je enzym, který katalyzuje glykolýzu (Barber et al. 2005). Je patrné, že je všude exprimován ve stejném množství. V případě N-catherinu je očividné, že je nejvíce exprimován u linie R1. Není ale viditelný žádný rozdíl mezi neovlivněnou kontrolou a ovlivněným zbytkem vzorků. U β III tubulinu je rozdíl mezi neovlivněnou kontrolou a ovlivněnými vzorky daleko markantnější. V případě linie D3, je tento protein více exprimován po vystavení buněk působení látky Trolox. Po působení NAC, je u linie D3 viditelné zvýšení produkce tohoto proteinu. V případě linie R1 je znatelný pouze rozdíl mezi ovlivněnými a neovlivněnými látkami. Buňky w17 produkovaly β III tubulinu více, pokud došlo k jejich indukci pomocí NAC. Jestliže porovnáme linie w17 a 0 podle těchto výsledků, vyplývá z toho, že linie 0 lépe 39

40 reaguje na ovlivnění redoxními modulátory a tvoří více neurálních znaků (srovnání genetického pozadí těchto linií se věnuje kapitola 5.3.). Obr. 16 Výsledek detekce proteinů u jednotlivých linií, schéma ovlivnění Podobný výsledek se nabízí i u porovnání tvorby γ-enolázy, kdy je viditelný pouze rozdíl mezi buňkami w17 a 0. Linie w17 produkuje výrazně méně tohoto enzymu. Za povšimnutí stojí pozitivita mozku, která ale spíše vypadá jako velmi nespecifická, protože se nenachází ve stejné linii se vzorky. Pokud sledujeme znak Cdk 5, nejsou znatelné žádné významné rozdíly. Je ovšem zajímavé, že buňky linie R1 mají této kinázy trochu více než ostatní linie Úloha NAC jako protektivního agens před buněčnou smrtí způsobovanou RA Během diferenciace nebo jiného buněčného stresu vznikají volné radikály, které mohou aktivovat apoptotickou kaskádu. N-acetyl cystein (NAC) je prekurzor glutationu, který buňce slouží jako silný antioxidant a je schopen podporovat buněčné přežití. NAC dokonce dokáže 40

41 projít před krevně-mozkovou bariéru a chránit neurony před oxidativním stresem přímo v mozku (Welin et al. 2009), což by mohla být jedna z potenciálních možností jak regulovat neurodegenerativní onemocnění (Qian et al. 2009). V předcházející části, byl testován nejen NAC a jeho indukční vliv na neurogenezi. V této kapitole bude zkoumán vliv NAC jako protektantu, chránicího před buněčnou smrtí, kterou působí diferenciace, v tomto případě indukovaná RA. V případě tohoto experimentu nebyly použity buňky ve formě embryonálních tělísek, ale buňky byly vysety v monovrstvě (Pachernik et al. 2002). V případě této kultivace již RA není tak silným induktorem neurální diferenciace jako je tomu u EB. Obr. 17 Výsledek testování vlivu doby a přidaných látek NAC a RA, schéma ovlivnění Z obrázku (Obr. 17) je patrné, že pokud byly NAC a RA přidány k buňkám ve stejnou dobu a působili na buňky společně, došlo k masivní diferenciaci do neurální linie, což je viditelné i u obou použitých linií. Účinek samotného NAC je patrný, ale pouze při detekci β III tubulinu u buněk R1. 41

42 Hodnota luciferázové aktivity Dále byla stanovena reportérová analýza pro gen RA. Aby mohl být výsledek správně kvantifikován, byl na buňkách současně proveden ATP test viability, díky němuž byly stanoveny počty buněk. Graf znázorňuje podíl chemiluminiscencí stanovených při reportérové analýze a počtu buněk stanovených ATP testem. Následně byly výsledky normalizovány na kontrolu, jejíž hodnota byla ode všech skupin odečtena (Graf 1) Reportérová analýza * R1 D Kontrola NAC RA 1mM NAC+RA 3mM NAC+RA 10 mm NAC+RA -10 Graf 1 Výsledek reportérové analýzy pro RA. Pomocí T-testu byla stanovena statistická významnost, p < 0,05. * Přítomen statisticky významný rozdíl mezi kontrolou a RA u obou použitých linií, čímž byla ověřena funkčnost analýzy. Přítomen statisticky významný rozdíl mezi RA a 1 mm NAC + RA. Z grafu je zřejmé, že nejvyšší transkripční aktivita genu pro RA byla v případě, kdy byl k buňkám současně přidán i 1 mm NAC. NAC zřejmě napomáhá udržovat vyšší expresi RA, ale samotný nepůsobí povzbudivě na aktivitu reportérového genu. Jeho vliv je dokonce mírně inhibiční Úloha genetického pozadí kinázy p38 v neurogenezi Neurogeneze je řízena celou řadou faktorů a zřejmě nemalou měrou se do redoxně senzitivních dějů zapojuje i kináza p38, která patří do rodiny MAPK (Mitogenně aktivované protein kinázy) subrodiny stresem aktivovaných kináz (Zarubin et al. 2005). Kináza p38 je 42

43 provázána s aktivitou ERK1/2, která je nezbytná pro některé neurální funkce, jako je například diferenciace nebo přežití neurálních buněk během vývoje. Role p38 v neurogenezi není zcela objasněna a rozdíly mezi linií obsahující a neobsahující p38 budou diskutovány dále. Porovnání linií w17 a 0 pomocí metody Western blot poskytuje zajímavé výsledky. Z obrázku (Obr. 18) je patrné, že linie 0 skutečně neobsahuje funkční kinázu p38, což poskytuje důležitý výsledek, že v tomto případě je skutečně zkoumána úloha přítomnosti p38 a vlivu jejího genetického pozadí na probíhající neurogenezi. Ze sledování celého rázu pokusu vyplývá, že linie, na p38 deficientní, exprimuje více neurálních proteinových znaků. Konkrétně u N-catherinu je patrné, že jeho produkce je vyšší u buněk linie 0. Jeho tvorba se také zvyšuje po ovlivnění modulátory měnícími redoxní status buňky. Vliv na buňky má zejména 10 μm Trolox, následuje 5 mm DPI. Exprese N-catherinu u 3 mm NAC nedosáhla očekávaných výsledků. U β III tubulinu nejsou patrné žádné markantní změny v jeho produkci. Není ani přítomen rozdíl mezi liniemi. Naopak u γ-enolázy jsou rozdíly mezi liniemi velmi zjevné. Buňky, které nemají funkční kinázu p38, tvoří γ-enolázu ve větším množství, ale nejsou zřejmé rozdíly mezi neovlivněnými a ovlivněnými buňkami; pouze 3 mm NAC zřejmě produkuje daného proteinu méně. Celkové množství proteinů lze zkontrolovat podle GAPDH, jehož produkce by měla být všude stejná. Z obrázku je patrné, že GAPDH je všude přítomen ve stejné míře a změny v expresi jednotlivých proteinů nejsou způsobeny nanesením nestejného množství jednotlivých vzorků na gel. 43

44 Obr. 18 Výsledek detekce proteinů u porovnání linií w17 a 0, schéma ovlivnění jednotlivými modulátory Také bylo testováno, jestli je přítomnost kinázy p38 nezbytná pro vznikající neurální prekurzory. Buňky byly kultivovány v ITS s přídavkem LIF, protože pnsc jsou na LIF závislé. Dále byly přidány neurální přídavky N2 a B27. Vzniklé neurosféry jsou sférické útvary, ve kterých se předpokládá přítomnost neurálních kmenových buněk (NSC). Byla pozorována morfologie vznikajících neurosfér a neurální sítě (Obr ) 44