11. Analýza částic Velikost částic. Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 11. Analýza částic Velikost částic Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Usazování Usazování je jednou z nejstarších metod pro určování velikosti farmaceutických pevných látek v suspenzích nebo v proudu vzduchu. Principem je rozdílná rychlost usazování částic podle jejich hmotnosti a velikosti v kapalném nebo plynném mediu. Tuto techniku lze použít také při zjišťování distribuce velikostí částic. Usazování sférické částice ve viskózním prostředí vlivem gravitace se řídí Stokesovým zákonem. Pro prostředí s malými Reynoldsovými čísly (laminární proudění) je rychlost usazování částic závislá na rozdílu hustoty prostředí a částic, na viskozitě prostředí a velikosti částic. 2

3 Usazování Na částici působí gravitační sila Fg a vztlaková síla Fd. Mezní rychlostí je označován stav, kdy jsou Fg a Fd v rovnováze. Pro sférické částice, které mají stejnou hustotu, lze odvodit následující vztah: d st je průměr částice S je hustota pevné látky f je hustota kapaliny Fg = πd st 3 6 ρ S ρ f g Podle Stokesova zákona je vztlaková síla dána vztahem F d = 3πμd st kde je viskozita prostředí a je relativní rychlost částice vzhledem k médiu. 3

4 Za předpokladu Fg = Fd platí: Usazování = t = d st 2 ρ 18μ S ρ f g Z tohoto vztahu plyne, že mezní rychlost je funkcí druhé mocniny průměru částice. Sedimentaci lze rozdělit na metody kumulativní a inkrementální techniky. Kumulativní techniky spočívají v měření rychlosti usazování částic, které je prováděno vážením částic v určité hloubce v průběhu času. Inkrementální technika slouží ke stanovení změny koncentrace nebo hustoty materiálu v určité hloubce v průběhu času. Při těchto měření se používají rentgenové paprsky. Z důvodů snazší automatizace, rychlosti a přesnosti měření jsou komerčně více rozšířeny inkrementální techniky měření. 4

5 Usazování Nejrozšířenější je RTG sedimentace (XGS). Tenký horizontální svazek RTG záření měří částice v dané hloubce v průběhu času a absorpce RTG záření je přímo úměrná koncentraci (hmotnosti) částic s průměrem menším než d st spočteným podle Stokesovy rovnice. Při sedimentaci je možné počítat pouze s jedinou hodnotou hustoty částic, což způsobuje chyby měření velikosti částic různého složení. Další chyby měření jsou způsobeny nepravidelným tvarem částic, který ovlivňuje rychlost usazování. U měření malých částic (ve vodě 1 m) se uplatňuje Brownův pohyb, což významně ovlivňuje měření. Dolní limit uváděný výrobci přístrojů je 0,2 m, avšak při měření částic pod 1 m jsou měření zatížená velkou nejistotou. Koncentrační rozsah měření XGS je 1 5 % (w/v). 5

6 Inerciální zaklínění Nejrozšířenější metoda pro určení velikostí aerodynamických částic. Schéma inerciálního zaklínění částic ve vznosu 6

7 Inerciální zaklínění Při průtoku částic zařízením působí na částici dvě síly. První je síla, která pohání částici kupředu a druhou silou je odpor okolního vzduchu. Větší částice jsou usazovány a menší částice pokračují v proudu vzduchu Pravděpodobnost dopadu částice na povrch je funkcí Stokesova čísla, které nabývá hodnot 0 až 1. Čím je vyšší, tím pravděpodobněji nastane depozice částice. StK = ρcvd2 9μD j kde StK je Stokesovo číslo, je hustota částic, C je Cunninghamův korekční faktor skluzu, V je rychlost, d je průměr částice, viskozita kapaliny, D j je průměr trysky. 7

8 Inerciální zaklínění Cunninghamův korekční faktor skluzu je dán vztahem: 1, C = 1 + d p Vyjadřuje snížení střední dráhy letu částice v plynu. V praxi se používá StK 50, což vyjadřuje 50% pravděpodobnost depozice částice. Hodnota d 50 odpovídá velikosti částic d 50 = 9μD j ρcv StK 50 Částice s velkým průměrem nebo vysoký průtok plynu zvyšují pravděpodobnost depozice částic. 8

9 Dynamický rozptyl světla Dynamický rozptyl světla (DLS) neboli fotonová korelační spektroskopie (PCS) neboli kvazielastický rozptyl světla (QELS). DLS je široce používanou technikou pro určení velikosti částic menších než 1 m. K měření je požíván rozptyl laserového záření dopadajícího na povrch částic pohybujících se Brownovým pohybem. Intenzita rozptýlené záření měřená pod určitým úhlem závisí na difuzní rychlosti částice, která souvisí s její velikostí. Difuzní koeficient (D) je popsaný Stokes-Einsteinovou rovnicí: D = k B T 3π d kde d je průměr částice, k B je Boltzmanova konstanta, T je teplota, je dynamická viskozita rozpouštědla. 9

10 Dynamický rozptyl světla Pomocí DLS se měří hydrodynamický průměr částice, který odpovídá průměru koule o stejném difuzním koeficientu jako má měřená částice. V konvenčních DLS se rozptýlené záření snímá pod úhlem 90. Rozptýlené záření je převedeno na elektrický signál. Konečný výsledek ovlivňují především dva faktory. Prvním je vzájemná interakce částic, která ovlivňuje jejich difuzní rychlost a druhým je vícenásobný rozptyl. Z těchto důvodů je nutné k měření používat vhodně zředěné vzorky. Tyto problémy lze částečně eliminovat snímáním rozptýleného záření v úhlu 173, což eliminuje vícenásobný rozptyl a umožňuje měření roztoků o vyšších koncentracích. Zetasizer Nano umožňuje měřit částice v rozmezí 0,6 nm do 6 m. 10

11 Čítač jednotlivých částic Čítač jednotlivých částic (SPC) používá rozptýlené záření pro určení počtu částic prošlých relativně malým objemem. Tyto čítače lze rozdělit na dva druhy, amplitudově závislé a nezávislé. Amplitudově závislé čítače měří absolutní intenzitu rozptýleného světla. Velikost částic se určí z Lorenz-Mieho teorie. Přístroj musí být kalibrován pomocí standardu. Používají se přístroje se dvěma štěrbinami různých šířek, přičemž užší umožňuje měřit částice v rozsahu 0,5 až 2 m a širší v rozsahu 3 m až několik set mikrometrů. Amplitudově nezávislé čítače měření velikosti částic nezávisí na intenzitě rozptýleného záření. Pro zjištění velikosti částic používají Dopplerovu metodu. Měří se fázový rozdíl v rozptylu světla v minimálně dvou místech. Tímto způsobem lze měřit částice o velikosti 0,3 m do 8 mm s přesností 5 %. 11

12 Měření velikosti povrchu Povrch pevných látek může být definován jako: a) viditelný nebo vnější povrch, b) součet vnějších ploch neporézních částí, c) celková plocha včetně pórů. Řada vlastností farmaceutických látek včetně biologické aktivity může záviset na vlastnostech povrchu. Pro stanovení povrchových vlastností se proto používá řada technik, například rtuťová porozimetrie, adsorpce plynu a permeace plynu. 12

13 Adsorpce plynu Pro zjištění velikosti povrchu lze použít adsorpci inertních plynů jako je dusík, helium nebo krypton, které vykazují BET izotermu. Principem metody je, že množství plynu absorbovaného na povrch částic je přímo úměrné velikosti povrchu částice podle následující rovnice kde V je objem plynu absorbovaného na povrch při tlaku P, V m objem plnu adsorbovaného v monovrstvě, P 0 je tlak nasycených par za experimentální teploty, C je konstanta související s entalpií adsorpce a kondenzace. 13

14 Adsorpce plynu Po vytvoření grafu závislosti P/V(P 0 -P) oproti P/P 0 lze ze součtu převrácené hodnoty směrnice této přímky a úseku vypočítat V m. Plochu vzorku lze spočítat podle následující rovnice: kde S t je celková plocha vzorku, N 0 je Avogadrovo číslo, A cs průřezová plocha adsorbované molekuly, M w je molekulová hmotnost adsorbované molekuly. Specifický povrch lze spočítat z rovnice S = S t / m, kde m je hmotnost vzorku. Použití této metody zahrnuje řadu aproximací, nicméně experimenty ukázaly, že touto metodou lze poměrně přesně charakterizovat povrch řady materiálů. Dusík je použitelný pro povrchy s velikostí větší než 1,0 m 2 g -1, zatímco krypton by měl být použit pro menší povrchy. 14

15 Permeační metody Principem této metody je permeace tekutiny přes vrstvu prášku. Velikost povrchu lze určit z odporu, který klade práškový materiál tekutině podle Kozenyovy-Carmanovy rovnice: S v je povrch, P ztráta tlaku při tloušťce prášku L, A je plocha vrstvy prášku kolmá na směr průtoku tekutiny, V je objem tekutiny prošlý za čas t, viskozita tekutiny, porozita práškové vrstvy, k je konstanta závisející na tvaru a drsnosti částic (pro sférické částice k = 5). Výhodou je jednoduchá aparatura a rychlé měření. Lze měřit průtok kapalin i plynů. Při použití plynů jsou výsledky o něco vyšší než v případě použití kapalin. 15

16 Rtuťová porozimetrie Patří mezi nejrozšířenější metody pro charakterizaci vnitřních dutin pevných látek. Výhodou je, že se rtuť chová jako nesmáčivá kapalina a neproniká tak skrz zkoumaný materiál. Měření využívá závislosti mezi aplikovaným tlakem a minimálním průměrem otevřených pórů, který může rtuť zaplnit. Pro kruhové póry lze vypočítat jejich poloměr na základě následujícího vztahu kde r je poloměr póru v m, P je použitý tlak v psi. Při měření velikosti větších pórů je tedy třeba aplikovat malý tlak a naopak. Při samotném měření se postupně zvyšuje tlak a sleduje se množství rtuti zachycené v pórech. 16

17 Rtuťová porozimetrie Při snižování tlaku se naopak rtuť z pórů dostává pryč, ale část v nich zůstává a výsledkem je proto hysterzní křivka. Z těchto měření lze odvodit řadu informací jako je poloměr pórů, plocha pórů a plocha povrchu částic a dokonce i velikost částic. Tato metoda má také ale řadu omezení. Například předpokládá, že póry jsou válcovitého tvaru. Dále může při vyšších tlacích docházet k deformaci částic. Pro dosažení potřebné přesnosti měření by měl být změřen kontaktní úhel rtuti se zkoumaným povrchem a povrchová tenze par rtuti. Mezi další nevýhody patří možnost měřit pouze otevřené póry. I přes zmíněné nevýhody poskytuje rtuťová porozimetrie v kombinaci s dalšími metodami cenné informace o povrchové struktuře farmaceutických látek. 17

18 Redukce velikosti částic Pro správnou funkci řady léčiv je důležitá velikost částic, která ovlivňuje jejich rozpustnost, ale také jejich případné použití (např. léčiva pro plicní použití musí mít vhodnou velikost částic). Metody zmenšování částic lze rozdělit na konvenční a mechanické. Konvenční metody zahrnují sušení rozprašováním a krystalizaci. Mechanické metody zahrnují mletí, drcení a rozmělňování. Ve farmacii lze provádět různá mletí, používanou technikou je např. mletí částic ve dvou navzájem protichůdných proudech plynu, kdy nárazy částic způsobí jejich zmenšení. Pro separaci požadovaných velikostí lze použít např. separace pomocí cyklonu. Nevýhodou mechanického zpracování je, že se vždy ve vzorku objevují po jeho provedení amorfní oblasti, které mají odlišné fyzikálně-chemické vlastnosti. 18

19 Redukce velikosti částic Sušení rozprašováním je ve farmaceutickém průmyslu používáno již dlouhou dobu. Vlastnosti vzniklých částic jsou ovlivněny mnoha faktory, jako je koncentrace léčiva, gradient teplot atd. Obecně lze říct, že tímto způsobem jsou připravovány sypké duté kulovité částice s nízkou hustotou (ve srovnání z původním materiálem). Tato metoda není vhodná pro tepelně nestálé látky. Vhodnou velikost částic lze zajistit také během krystalizace volbou krystalizačních podmínek. V praxi se často používá metoda přídavku vhodného srážedla. Nevýhodou krystalizace je energetická náročnost a tepelná závislost celého procesu, kontaminace dalšími látkami a malý výtěžek vzhledem k velkým objemům roztoků. Řadu těchto problémů lze odstranit superkritickou fluidní krystalizací, která používá stlačené kapalné plyny (typickým používaný plynem je např. dusík). 19

20 Hodnocení velikosti částic a farmaceutický vývoj Měření velikosti částic zahrnuje správný odběr a přípravu vzorků Vlastní měření velikosti částic musí splňovat následující předpoklady: o Získaný vzorek musí být dostatečně reprezentativní. o Příprava vzorku by neměla mít vliv na velikost částic. o Je třeba zvolit vhodnou metodu pro určování velikosti. o Přístroj musí být optimálně nastaven. o Při měření by nemělo docházet ke změně tvaru a velikosti částic. o Získána data je nutno správně interpretovat. 20

21 Vzorkování V praxi nelze měřit velké objemy vzorků, a proto je vždy nutné, aby byly vybrané vzorky dostatečně reprezentativní. Pro odběr vzorku existuje řada technik. Objemy sypkých vzorků lze redukovat metodou kvartace, kdy se z hromady sypkého materiálu odstraní vrchol. Zbytek prášku se rozdělí na čtvrtiny a protilehlé strany se oddělí (viz obr.). Celý postup lze opakovat až do získání optimálního množství prášku. 21

22 Vzorkování Po získání vhodného objemu vzorku musí být tento vzorek připraven podle podmínek nutných pro provedení analýzy. Např. pro laserovou difrakci musí být pevný vzorek rozptýlen ve vhodném rozpouštědle, ve kterém nedochází k rozpouštění částic. Při mikroskopických pozorováních musejí být částice vhodně zředěny, aby nedocházelo k jejich agregaci. V technikách jako je např. TOF, kdy jsou částice urychleny, může docházet k nežádoucím změnám velikosti v důsledku působení vysokých sil. Na druhou stranu vztah mezi velikostí částic a aplikovaným tlakem vzduchu může poskytnout cenné informace o soudržnosti původního materiálu. 22

23 Přístrojová kalibrace a instrumentace Pro správné provedení analýzy je nutné postupovat podle pokynů výrobce přístroje a tam, kde je to vyžadováno, provádět pravidelnou kalibraci. Kalibrace představuje ověřování správnosti měření pomoci řady standardů. Pro měření velikosti částic existují čtyři třídy referenčních materiálů. První třídou jsou mezinárodní standardy délky. Druhou třídou jsou certifikované nebo standardní materiály. Třetí třídou jsou sekundární standardní materiály, které se používají v metodách, jako je např. sítová analýza. Poslední typ představují terciální standardy, které jsou pro kalibraci připravovány in situ. 23

24 Výběr techniky pro určení velikosti částic Pro správný výběr techniky měření jsou rozhodující tyto parametry: účel měření, přesnost a preciznost měření, časová náročnost, reprodukovatelnost, snadnost provedení a cena. Účel měření Účel měření odpovídá druhu informace, který má měření poskytnout. Např. bude-li nás zajímat velikost a morfologie částic, použijeme mikroskopická měření a obrazovou analýzu. Bude-li nás zajímat aerodynamický průměr částic, použijeme TOF. Pokud nás bude zajímat rychlost a velikost částic v aerosolu, použijeme Dopplerovu fázovou analýzu, pro kontrolu kvality produktů použijeme laserovou difrakci. Neexistuje univerzální metoda. Běžně se pro charakterizaci využívají alespoň dvě různé metody. 24

25 Rozsah velikostí V ideálním případě by měla technika měření pokrýt celou škálu velikostí vzorku. V následující tabulce jsou uvedeny rozsahy měření jednotlivých technik. 25

26 Rozsah velikostí 26

27 Vyhodnocení výsledků Preciznost Těsnost shody mezi naměřenými hodnotami veličiny získanými opakovanými měřeními na stejném objektu. Přesnost Těsnost shody mezi naměřenou hodnotou veličiny a pravou hodnotou měřené veličiny. Reprodukovatelnost Preciznost měření za podmínek reprodukovatelnosti měření (tedy měřením různým způsobem - různými měřidly, personálem či na různém místě a v různém čase). Rozlišení Rozlišení metody: nejmenší změna veličiny, která způsobí rozeznatelnou změnu v odpovídající indikaci (zjednodušeně jde o nejmenší dílek na stupnici. Rozlišení přístroje: schopnost odlišit různé distribuce velikosti částic, například při bimodální distribuci. 27

28 Účinnost a cena Vyhodnocení výsledků Tyto faktory jsou zejména důležité při každodenním měření velkého množství vzorků. Některé techniky, jako je například obrazová analýza a sedimentace, jsou pomalé na provedení. Na druhou stranu techniky, jako je rozptyl světla, jsou rychlé. Dalším kritériem je univerzálnost metody, která zohledňuje omezení jednotlivých metod na určité typy částic. Například pro sedimentaci je zapotřebí velké množství vzorku, pro elektronovou mikroskopii nesmí vzorek za vakua sublimovat a pro analýzu Coulterovým čítačem nesmí být částice rozpustné ve vodě. Je třeba rozlišovat metody vhodné pro akademický výzkum a pro průmysl. Posledním faktorem, který je potřeba zohlednit, je pořizovací cena přístroje, provozní cena přístroje a náklady na jeho údržbu. 28

29 Metody vývoje a validace Důležitými parametry z hlediska použití metody jsou specifičnost, přesnost, opakovatelnost a robustnost metody. V následující tabulce jsou uvedeny definice těchto pojmů. 29

30 Metody vývoje a validace Validace dané metody musí být provedena s podobnými částicemi, které budou analyzovány. Podobnost musí být jak ve velikosti, tak při přípravě těchto částic. Pokud je validace provedena s částicemi připravenými krystalizací, je nevhodné používat metodu na analýzu částic připravených mletím. Reprodukovatelnost se provádí s minimálně 5 vzorky s 5 opakovanými měřeními každého vzorku. Výsledky velikostí se uvádí jako d 10, d 50 a d 90, což vyjadřuje, že 10 %, 50 % a 90 % částic má velikost nižší než uvádí dané číslo. Pro laserovou difrakci by pro velikost částic větších než 10 m mělo být (při reprodukovatelnosti výsledků průměru částic uvedených jako d 50 ) RSD 3 % a u d 10 a d 90 RSD 5 %. 30

31 Regulační směrnice Metody pro stanovení velikosti a distribuce částic, stejně jako finální farmaceutické produkty s určitou velikostí částic podléhají mezinárodním směrnicím, jako jsou: Mezinárodní konference pro harmonizaci technických požadavků na registraci farmaceutik pro humánní použití (ICH Q6A, ICH Q2A and Q2B) Lékopis Spojených států (USP) Evropský lékopis (Ph. Eur.) USA: Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) Evropa: Evropská agentura pro hodnocení léčivých přípravků (EMEA). 31

32 Regulační směrnice ICH Q6A se zabývá klasifikací částic podle specifických testů, které jsou řazeny podle API a podle finálního produktu. Studuje distribuci API, obsah nerozpuštěné API, rozpustnost, biologickou dostupnost, zpracovatelnost, stabilitu, jednotný obsah, vzhled konečného výrobku a další faktory. FDA navrhuje studie stejných parametrů jako ICH Q6A a doplňuje nutnost kontroly léčiva v průběhu skladování pro kontrolu, zda dochází ke změnám velikosti částic. Obdobné požadavky na charakterizaci materiálů jsou uvedeny také ve směrnici EMEA. 32

33 Příklad: medicinální aerosoly Jednou z možností podání léčivá je aplikace aerosolů do dýchacích cest. Částice se podle velikosti ukládají na různá místa dýchacího traktu. Obecně lze říct, že běžně používané částice z aerosolů s velikostí 15 m jsou ukládány v extratorakální oblasti, menší částice s velikostí 5 10 m jsou ukládány v tracheobronchiální oblasti. Částice s velikostí 1-3 m jsou ukládány v dolních cestách dýchacích. Inhalované částice mají nejčastěji průměr od 1 do 5 m. Při podávání léčiv pomocí inhalátoru suchého prášku (DPI) nebo pomocí inhalátoru pod tlakem (pmdi) je důležitým parametrem velikost částic. 33

34 Příklad: medicinální aerosoly Farmaceutické částice určené pro inhalace mají typicky rozmezí velikostí 0,5 10 m a pro jejich charakterizaci je nejvhodnější laserová difrakce. Další možností charakterizace prášků používaných při DPI je TOF, který lze použít i pro měření velikosti excipientů. Jedním z široce používaných excipientů je monohydrát -laktózy. Velikost částic -laktózy hraje roli při zajišťování uniformity podané látky. Velikost mikronizované -laktózy se obvykle pohybuje v rozmezí m a může být charakterizována mikroskopickými technikami, laserovou difrakcí nebo TOF. Výhodou je použití kombinace těchto technik, které poskytnou údaje o velikosti částic, jejich distribuci, ale také o povrchové struktuře a tvaru studovaných částic. 34

35 Příklad: medicinální aerosoly Aerodynamická velikost finálního farmaceutického produktu může být velmi odlišná od velikosti částic API, protože obsahuje také excipient. Pro hodnocení aerodynamické velikosti se podle úmluv USP a Ph. Eur. používají techniky uvedené v následující tabulce. 35

36 Příklad: medicinální aerosoly Obvykle nejsou sledovány všechny body distribuce velikosti částic. Obvykle se sleduje podíl jemné, průměrné a hrubé frakce. Průměrná velikost částice se vyjadřuje mediánem d 50, jemná frakce d 10 a hrubá d 90. Šíři distribuce velikosti částic lze vypočítat ze vzorce Span = d 90 d 10 d 50 Pro mikronizovaná léčiva určená pro inhalaci je třeba uvádět podíl částic velkých 0,5-3 m, 3-5 m a 5-10 m. 36

37 Závěr Analýza velikosti částic je nezbytnou součástí farmaceutického vývoje a kontroly farmaceutických produktů. Používané metody jsou do značné míry závislé na odběru a přípravě vzorků, technice analýzy a zpracování dat. Různé techniky měření poskytují různé charakteristiky velikosti částic. Neexistuje univerzální metoda pro měření velikosti farmaceutických částic. Existuje však řada přístrojů, které jsou komerčně dostupné a jsou široce používány. Pro měření farmaceutických produktů a vlastností finálních farmaceutických produktů byla publikována řada mezinárodně uznávaných směrnic. 37