Virtuální svět genetiky 1

Transkript

1 Chromozomy obshují mnoho genů pokud nejsou rozděleny crossing-overem, pk lely přítomné n mnoh lokusech kždého homologního chromozomu segregují jko jednotk během gmetogeneze. Rekombinntní gmety jsou důsledkem crossing-overu zvyšují genetickou vribilitu v druhu slouží tké pro konstrukci chromozomových mp. Dosud jsme se zbývli jen volnou kombinovtelností genů, tzn. že geny jsou loklizovány v různých nehomologních chromozomech při procesu meiózy se náhodně kombinují. Počet genů jednotlivých orgnizmů je všk vždy několiknásobně vyšší, než je počet chromozomů. Proto nemohou být všechny geny volně kombinovtelné. Ty geny, které jsou uloženy v jednom témže chromozomu (neboli ty páry lel, které jsou neseny jedním týmž párem homologních chromozomů) jsou vázné jejich soubor tvoří vzbovou skupinu. Vzbou genů tedy rozumíme, že dv nebo více sledovných genů je složkou téže vzbové skupiny. Dále se rozlišuje syntenní skupin, kdy geny n jednom chromozomu jsou tk vzdáleny, že se chovjí jko volně segregující. T. H. Morgn v roce 1926 n zákldě svých výzkumů definovl prvidl, která jsou oznčován jko Morgnovy zákony: 1. Geny jsou loklizovány n chromozomech jsou n nich uspořádány lineárně. 2. Geny jednoho chromozomu tvoří vzbovou skupinu. Orgnizmus má tolik vzbových skupin, kolik má párů homologních chromozomů. 3. Mezi geny homologních párů chromozomů může proběhnout výměn genetického mteriálu (crossing-over), jejichž frekvence je přímo úměrná vzdálenosti genů. Vzdálenost mezi geny n jednom chromozomu je úměrná počtu rekombincí (crossing-overů) mezi těmito geny. Pokud bude vzdálenost větší, je větší prvděpodobnost vzniku zlomu crossing-overu než při jejich menší vzdálenosti. Sílou vzby mezi dvěm geny rozumíme prvděpodobnost vzniku crossing-overu v oblsti, která je vymezen těmito geny. Čímž jsou geny umístěny k sobě blíže, tím je vzb silnější, protože prvděpodobnost vzniku crossing-overu v dné oblsti klesá se zmenšováním její délky. TGU /11

2 Vzbové fáze ) Vzbová fáze cis (strší oznčení coupling) Při křížení rodičů o genotypech AABB bb, kde páry lel A/ B/b jsou vázány, oznčujeme z křížení ve vzbové fázi cis. V této vzbové fázi je jeden z rodičů homozygotně dominntní v obou párech lel druhý z rodičů v obou párech lel homozygotně recesivní: P AB AB x b b F 1 AB b Dihybrid bude ve větším počtu produkovt gmety s rodičovskou sestvou lel AB b, v menším podílu gmety s nerodičovskou, tj. rekombinovnou sestvou lel Ab B. ) Vzbová fáze trns (strší oznčení repulsion) Vzbou fází trns rozumíme situci, kdy jen z rodičů je v jednom páru lel homozygotně dominntní v druhém homozygotně recesivní (AAbb), přičemž druhý je svým genotypem vůči prvému reciproký (BB): P Ab Ab x B B F 1 Ab B Dihybrid bude produkovt větší podíl gmet s rodičovskou sestvou Ab B menší podíl gmet s nerodičovskou sestvou (rekombinovné) AB b. Je třeb si uvědomit, že ne mezi všemi geny n jednom chromozomu musí dojít ke crosing-overu. Obrázek níže zznmenává tkovou situci. TGU /11

3 Pokud nedojde ke crossing-overu mezi geny, tvoří se pouze dv typy různých gmet. Kždá gmet získl lely, které jsou n jednom nebo n druhém homologu. Lze zde hovořit o úplné vzbě. Jejím důsledkem vznikjí pouze rodičovské nerekombinovné (necrosovné) gmety. Ob typy gmet jsou tvořeny ve stejném poměru 1:1. Zde dochází k překřížením dvou nesesterských chromtid ze čtyř ke crossing-overu. Tto výměn tvoří dvě nové kombince lel v gmetách. Ty se pk nzývjí rekombinntní (crosovné) gmety. Hodnocení síly vzby genů Prvděpodobnost, že dv geny v dné kombinci se nepřenesou do dlší generce se rovná prvděpodobnosti výskytu crossing-overu. Tto prvděpodobnost se oznčuje θ (thet): - úplná vzb θ = 0,00 - těsná vzb θ = 0,01-0,20 - středně těsná vzb θ = 0,21-0,35 - volná vzb θ = 0,36-0,49 - volná kombinovtelnost θ = 0,50 Vzdálenost mezi geny se vyjdřuje v centimorgnech (cm), které vycházejí z rekombinčních frekvencí: 1 cm = 1 % prvděpodobnosti vzniku crossing-overů. Tto hodnot předstvuje mpovou vzdálenost dvou genů n chromozomu. Lze ji použít i k určení velikosti genomu nebo délky chromozomu. Poměrnou četnost gmet rozdílných genotypů zjišťujeme hybridologickou nlýzou z pomocí zpětného křížení dihybrid s recesivně homozygotním rodičem: TGU /11

4 Gmety rodičů ABb AB Ab B b bb b b b b Genotypy zygot ABb Abb Bb bb Četnosti Symboly 1 ž 4 oznčují počet zygot tím i jedinců jednotlivých fenotypových tříd (AB, Ab, B, b), zároveň i počet gmet příslušných čtyř různých genotypů. Při křížení rodičů ve vzbové fázi cis mjí větší četnost třídy 1 4, při křížení rodičů ve vzbové fázi trns třídy 2 3. Vzbu můžeme chrkterizovt pomocí: Btesonovo číslo (c) udává, kolikrát čstěji vznikjí gmety s nerekombinovným uspořádáním lel oproti rekombinntním. Toto číslo všk nevyjdřuje vzdálenost genů neumožňuje jejich detekci. Proto se v součsné době nepoužívá. Hodnotu c vypočítáme podle vzorce: fáze cis c 1 4 = fáze trns c = Morgnovo číslo (p) je mnohem vhodnější pro kvntifikci síly vzby. Udává se v rekombinčních jednotkách nzvných morgny - M (po T.H. Morgnovi). Hodnot 1 centimorgn vyjdřuje, že dihybrid tvoří 1 % gmet s rekombinovnou sestvou lel; jinými slovy tzn., že v dné oblsti, vymezené sledovnými geny, je prvděpodobnost vzniku crossing-overu 1 % (0,01). Morgnovo číslo lze rovněž stnovit zpětným křížením vypočítt ve vzthu k vzbovým fázím tkto: fáze cis p 2 3 = fáze trns p = Při volné kombinovtelnosti bude hodnot p rovn 50 % (0,50). Nebudou-li vznikt gmety s rekombinovnou sestvou lel, bude p rovno 0. Vzthy mezi Btesonovým Morgnovým číslem lze zpst: p c = 1 1 nebo p = p c + 1 Pomocí χ 2 testu lze zse jen zjistit, zd štěpné poměry odpovídjí hypotéze volné kombinovtelnosti. V posledních desetiletích se k vyjádření vzdálenosti genů (síly vzby) používá metod Lod skóre. (L ~ logritmus; od ~ odds, ngl. šnce, pro převhu prvděpodobnosti; skóre ~ poměru rekombinnt ku nerekombinntám). Vyjdřuje logritmus poměru prvděpodobnosti rekombinnt ku nerekombinntám. Z Pθ = log P 0,5 Pθ - prvděpodobnost existence vzby P 0,5 - prvděpodobnost neexistence vzby Skóre z potomstev se vypočítává v sérii rekombinčních frkcí výsledky jednotlivých prvděpodobností θ se převedou n dekdický logritmus, což je vlstní Lod skóre - Z. Z různých potomstev se pk počítá jejich součet Σ Ζ. Je-li ΣZ +3 pk je prvděpodobnost 1000:1 pro přítomnost vzby nopk ΣZ -2 svědčí o volné kombinovtelnosti genů. Výhody Lod skóre jsou: není nutná znlost vzbové fáze; prvděpodobnost je vyjádřen v logritmech, lze je sčítt; rekombinční frkce, v které se vypočítá mximální hodnot Z předstvuje vzdálenost genů. TGU /11

5 Nejmenší lidský chromozom č. 21 je veliký 0,5 M (~50 cm) nejdelší č. 1 má 2 M (~200 cm). Hploidní genom člověk má si 30 M (~3000 cm) 1 cm obshuje kolem 1-2 milióny bp předstvuje informční kpcitu stovek ž tisíců genů. Porovnání vzby genů volné kombinovtelnosti: 1. pokud jsou geny n jednom chromozomu vzdáleny od sebe 50 cm, mluvíme o volné kombinovtelností; při 50 % hrnici rekombince buď nstne nebo ne, n zákldě hybridologické nlýzy nelze tuto vzbu odlišit od volné kombinovtelnosti, 2. jsou-li geny umístěny n jednom chromozomu ve vzdálenosti menší než 50 cm, jsou předány potomstvu společně, dědí se pk společně, jko blok, tzn. jsou n sebe vázány. Společné dědění genů uložených n jednom chromozomu ve vzdálenosti menší jk 50 cm způsobuje v potomstvu společnou expresi vlstností determinovných n sebe vázných genů. Dochází tk k omezení nebo vyloučení volné kombinovtelnosti. Neúplná vzb crossing-over Jestliže vybereme náhodně dv geny vázné n jednom chromozomu, je vysoce prvděpodobné, že budou tk blízko jeden druhému podél chromozomu, že předstvují úplnou vzbu. Při úplné vzbě nedochází při meióze mezi geny ke crossing-overu. Pokud budeme křížit dv náhodně vybrné geny vázné n jednom chromozomu, budou téměř vždy produkovt určitý podíl potomstv, vzniklého z rekombinntních gmet. Jejich podíl je proměnlivý závisí n vzdálenosti mezi dvěm geny n chromozomu. Pokud jsou genové páry jednoho chromozomu umístěny dále jeden od druhého, pk hovoříme o neúplné (částečné) vzbě. Při neúplné vzbě dochází při meióze k výměně genetického mteriálu mezi nesesterskými chromtidmi homologů. Obecně se tento proces nzývá genetická rekombince. Meiotický zákld rekombincí Ve stádiu pchytene může dojít ke zlomu chromtid s následnou fůzí sesterských nebo nesesterských chromtid. Při reciprokých výměnách mezi sesterskými chromtidmi nedochází ke genetické vribilitě výměn není detekovtelná. Klíčová je výměn u nesesterských chromtid. 1. Při crossing-overu nedochází ke ztrátě nebo k přidání chromtinu. 2. Překříží se vždy pouze dvě chromtidy. 3. Může se vyskytnout i vícenásobný crossing-over mezi nesesterskými chromtidmi. 4. Může nstt jkákoliv crossoverová konfigurce výsledek může být velmi odlišný od původní kombince lel n chromtidě. 5. Ke crossing-overu dochází ž po replikci chromozomu. Mechnizmus crossing-overu Při crossing-overu dochází k fyzické výměně mezi molekulmi DNA dvou homologních chromozomů. Zásdní význm má chizm pozorovné během profáze I meiózy zlom s opětným sjednocením. Sledují se dvě teorie zložené n tvorbě chizm, le zcel různými způsoby. TGU /11

6 Klsická teorie Crossing-over je výsledkem nhodilé fyzické výměny v chizm. Překřížení v chizm je zodpovědné z crossing-over zcel jsně jej předchází. Tto teorie předpovídá, že ke crossingoveru dochází po stádiu diplotene, le před oddělením chromozomů v nfázi I. Chizmtická teorie předpovídá, že crossing-over předchází formování chizm dochází k němu v rném stádiu pchytene profáze I. Jko výsledek je, že chizmt jsou tvořen místy genetické výměny, tkže jsou důsledkem crossing-overu ve stádiu diplotene dochází k projevu chromozomové výměny. Typy crossing-overů Rekombinční procesy se dějí náhodně po celé délce tetrády. Čím blíže jsou umístěné lokusy podél chromozomu, tím méně prvděpodobné je, že mezi nimi proběhne jednoduchý crossing-over. Nopk čím vzdálenější lokusy, tím větší prvděpodobnost crossing-overu. Když dochází k jednoduchému crossingoveru mezi dvěm nesesterskými chromtidmi, druhé dvě chromtidy tetrády jsou neovlivněny vstupují do gmet nezměněny. I kdyby vždy (u 100 %) došlo k jednoduchému crossing-overu mezi dvěm váznými geny, mohou být rekombince pozorovány postupně u 50 procent potenciálně tvořených gmet. Vícenásobné crossing-overy Dochází tké k tomu, že v jedné tetrádě se vymění genetický mteriál mezi dvěm, třemi i více místy nesesterských chromtid, jko důsledek více crossing-overů. Dvojité výměny genetického mteriálu vyplývjí z dvojitých crossing-overů. Pro jejich studium je třeb sledovt tři vázné geny. TGU /11

7 Výsledek dvojité výměny probíhjící mezi nesesterskými chromtidmi. Protože k výměně došlo pouze mezi dvěm chromtidmi, tvoří se dvě necrosovné gmety (rodičovské) dvě dvojitě crosovné (rekombinntní). TGU /11

8 Síl vzby genů mpování Příkld výpočtu c p U kukuřice (Ze mys) je pár lel C/c řídící zbrvení leuronové vrstvy obilek ve vzbě s párem lel S/s, řídící tvr obilek. Mezi lelmi jednotlivých genů pltí vzth dominnce. C filové zbrvení lleuronu, c - nezbrvený leuron S hldké obilky, s svrsklé obilky Provede-li se klsický genetický pokus pro vznik hybridní generce její testování zpětným křížením získáme všechny možné kombince lel fenotypů, jko by šlo o volnou kombinovtelnost. Ob geny jsou všk n jednom chromozomu. Podíl jednotlivých fenotypů není roven poměru 1:1:1:1, jko při volné kombinovtelnosti. Křížené rodičovské komponenty jsou ve fázi cis. Dihybrid F 1 generce tvoří nerekombinovné gmety CS cs s větším podílem s menším podílem gmety rekombinovné Cs cs. Po zpětném křížení s recesivním homozygotem ccss byly zjištěny tyto hodnoty: Genotypy gmet F 1 generce (CcSs) CS Cs cs cs Genotypy gmet rodiče (ccss) cs cs cs cs Genotypy obilek BC 1 CcSs Ccss ccss ccss Fenotypy obilek BC 1 CS Cs cs cs Počet Oznčení fenotypové třídy Btesonovo číslo: c = ( )/( ) = ( )/( ) = 8 067/301 = 26,8 Gmety s rodičovskou sestvou vznikjí 26,8krát čstěji než rekombinovné gmety. Morgnovo číslo: p = ( )/( ) = ( )/( ) = 301/8 368 = 0,035 M = 3,5 cm Podíl rekombinovných gmet je 3,5 % vzdálenost mezi lokusy C S je tedy 3,5 cm. TGU /11

9 Při mpování dvou genů můžeme zjistit jejich vzájemnou vzdálenost, jko v tomto příkldě (3,5 cm mezi geny C S). Nelze všk určit v jkém pořdí se geny vyskytují od centromery. Nevíme tedy, zd jejich pořdí je S-C () nebo C-S (b). Konstrukce genetických mp Genetická mp vyjdřuje: vzbou skupinu, symboly mutntních genů, vzdálenost genů v centimorgnech z jednoho konce chromozomu, který je povžovný z nulový bod, oznčení centromery. Genetická mp 6. chromozomu u skotu prsete. Genetická mp 1. chromozomu octomilk. Cílem genetického mpování je určit pořdí genů jejich vzdálenosti n chromozomech. Kromě genetických (rekombinčních) mp, využívjící rekombinční frekvence popisující vzdálenosti genů v cm, se konstruují i fyzické mpy zložené n sekvencování jednotkmi jsou přímo nukleotidy (lidský genom byl osekvencován n jře roku 2001). Jejich informce se sjednocují v nejpřesnějším mpování genů ve spojení s cytogenetickými technikmi. Pro genetické mpovní je výhodnější použít tříbodový test, kdy součsně sledujeme dílčí vzbové vzthy (rekombinční frekvence) 3 různých genů, npř. A, B, C. ABC x TGU /11

10 Gmety F 1 Genotypy zygot Počet jedinců ABC nerekombinovné (rodičovské) AB/ c jednoduchý c.-o. mezi B C b/ C A/ bc jednoduchý c.-o. mezi A B / BC A / b/ C dvojitý c.-o. / B/ c ABC ABc bc Abc BC AbC Bc celkem celkem celkem celkem 8 Počet jedinců v % 80,94 5,87 12,64 0,55 Celkem % Postup: 1. Určíme rodičovské genotypy. Jsou to vždy ty, s největší frekvencí. Zde se jedná o genotypy ABC. 2. Určíme pořdí genů. Vycházíme ze znlosti dvojitého crossing-overu, který určíme z nejnižší frekvence genotypů - zde AbC Bc. Je nutné si uvědomit, že dvojitý crossing-over přesunuje prostřední lelu mezi nesesterskými chromtidmi. Můžeme vidět, že gen B musí být uprostřed, protože recesivní lel b je nyní n stejném chromozomu jko lely A C dominntní lel B je n stejném chromozomu jko recesivní lely c. Pořdí genů n chromozomu je ABC. 3. Určíme vzbové vzdálenosti mezi geny. Určíme vzbové vzdálenosti mezi geny A-C C-B. Vzb se vypočítá jko podíl celkového počtu rekombinntních gmet k celkovému počtu gmet (~ Morgnovo číslo p). Je třeb vzít v úvhu dvojitý crossing-over. Do obou výpočtů vzdálenosti se proto zčlení jeho hodnot. A-B vzdálenost: ( )/1448 = 0,1319 ~ 13,19 cm B-C vzdálenost: ( )/1448 = 0,0642 ~ 6,42 cm Jestliže je správné konsttování, že překřížení je funkcí vzdálenosti mezi geny, pk můžeme stnovit mezi geny A C, jko součet dvou frekvencí jednoduchých c.-o.: 13,19 + 6,42 = 19,61 cm. V dném přípdě všk celkový počet jednotlivých c.o. mezi geny A C činí ( )/1448 = 0,1851 ~ 18,51 cm. Vzdálenost mezi geny A C vyjádřen součtem jednotlivých c.o. je větší o 1,1 cm než celá vzdálenost A-C. Určení vzdálenosti mezi geny A C: 18,51 + 2x0,55 = 19,61 cm. Zdvojení procent dvojitých c.o. je nutné proto, že kždý dvojitý c.o. vzniká n zákldě dvou nezávislých jednoduchých zlomů ve dvou bodech. TGU /11

11 4. Nkreslení mpy. Proč se hodnot celého úseku AC nerovná součtu dílčích úseků AB BC? Interference koeficient koincidence Mpování genů je tím přesnější, čím jsou vzájemně v silnější vzbě čím méně se upltňuje tzv. interference. Do si cm je mpová vzdálenost shodná s rekombinční frekvencí. Nd cm se vzdálenosti "prodlužují" (vzrůstá počet vícenásobných rekombincí) sčítání dílčích mpových vzdáleností je více nepřesné nd 0,35 cm nespolehlivé. Interference (I) se měří mezi crossing-overy v dné oblsti chromozomu. Vyskytneli se dvojitý crossing-over, lze uvžovt o interferenci. Dné specifické rekombinční poměry ve dvou sousedních chromozomových vzdáleností, pk poměr dvojitých crossingoverů je v této oblsti roven součinu jednoduchých crossing-overů: (0,1319 x 0,0642)*100 = 0,847 % dvojitých rekombincí. V nšem přípdě by se jednlo o 12,3 dvojitých rekombinntů (1448 * 0,00847). Ve skutečnosti jich bylo odhleno jen 8. K měření interference je nutné nejdříve vypočítt koeficient koincidence (c.o.c.), který je dán poměrem pozorovných k očekávným dvojitým crossing-overům (2c.o.). Interference je pk rovn 1- c.o.c. Pro náš přípd je hodnot interference 33 % [(1-8/12)*100]. Vzbová nerovnováh Při neúplné vzbě dvou genů n homologních chromozomech se předpokládá jejich rovnoměrné rozložení v populci - frekvence všech 4 kombincí ve stejném poměru (AB, Ab, B, b). Čsto dochází k odchylkám nerovnoměrnému rozložení - určité kombince se vyskytují čstěji než jiné. Tomuto stvu nerovnoměrné frekvenci lel vázných genů se říká vzbová nerovnováh. Vysvětlení možných příčin: populce se vyvíjí v izolci s Inbridingem náhodným genetickým driftem socice více lel je dán jejich evoluční výhodností od vzniku lel neuplynul delší dob, by dosáhly rovnováhy Využití vzbové nerovnováhy se v součsné době hledá v mpování lokusů kvntittivních vlstností (QTL) pomocí genetických mrkerů její možné využití ve šlechtění. TGU /11