MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE KRISTÝNA CHYBOVÁ BRNO 2017

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Mikrobiologická rizika u farmářských sýrů vyráběných z kozího mléka Bakalářská práce Vedoucí práce: Vypracovala: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D Kristýna Chybová BRNO 2017

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Mikrobiologická rizika u farmářských sýrů vyráběných z kozího mléka vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:... podpis

4 PODĚKOVÁNÍ Chci poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace, cenné rady a připomínky při vypracování závěrečné práce. Dále chci poděkovat svým rodičům a přátelům za materiální a psychickou podporu při studiu na Mendelově univerzitě. Velké díky patří rovněž prof. Ing. Jaroslavu Hluškovi, CSc., dr. h. c. za jeho cenné rady a připomínky k mé bakalářské práci.

5 ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá mikrobiologickými riziky u farmářských sýrů vyrobených z kozího mléka. Teoretická část pojednává o kozím mléku, farmářské výrobě sýrů a v neposlední řadě také o mikroorganismech, které mohou způsobovat onemocnění spotřebitele, nebo působit vady sýrů. V této části jsou zahrnuty i prostředky, jak se před nežádoucími a nebezpečnými mikroorganismy bránit. Praktická část zahrnuje mikrobiologické stanovení u 6 vzorků sýrů zakoupených ve specializovaných prodejnách. Stanovovaly se tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kvašení, kvasinky a plísně, enterokoky a koliformní bakterie. Výsledky analýzy byly vyhodnoceny a porovnány s legislativou. Klíčová slova: mléko, kozí sýr, mikroorganismy, patogenní organismy, farmářská výroba SUMMARY This bachelor thesis talks about microbiological risks that can be caused by farm cheese made of goat milk. Theoretical part is focused on goat milk, farm-style cheese making and microorganisms, which can cause illnesses of consumers. In this part, there are also ways to defend against these dangerous microorganisms. Practical part includes assesment of 6 kinds of cheese bought in specialized stores. I determined these groups of microorganisms: their quantity, lactic acid bacteria, yeasts and molds, enterococcus and coliform bacteria. Results of these assesments were evaluated and compared to the legislation. Key words: milk, goat cheese, microorganisms, pathogenic organisms, farm making

6 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Mléko Složení mléka Mléko kozí Požadavky na mléko k výrobě sýrů Mikrobiologie sýrů Hygienicky a technologicky významné druhy mikroorganismů Celkový počet mikroorganismů (CPM) Psychrotrofní bakterie Koliformní bakterie Termorezistentní bakterie Bakterie mléčného kvašení Kvasinky a plísně Patogenní mikroorganismy Biogenní aminy Mykotoxiny Mikroorganismy uplatňující se při zrání sýrů Mikroorganismy způsobující vady sýrů Prevence a zabráněni výskytu nežádoucích organismů M ATERIÁL A METODIKA Použitý materiál Použité přístroje Metodika Příprava živných půd Příprava vzorku sýrů Vyhodnocení mikrobiologického rozboru VÝSLEDKY A DISKUSE ZÁVĚR POUŽITA LITERATURA... 42

7 1 ÚVOD Téma mé bakalářské práce je velmi zajímavé a v současné době i aktuálně řešeným tématem, z důvodu údržnosti potravin a zdravotní nezávadnosti. Je kladem důraz na výrobu kvalitních potravin, které splňuji legislativní limity od získání mléka až po hotový výrobek. Mlékem se rozumí bílá tekutina charakteristického mléčného pachu, bez cizích pachů, která je produkovaná mléčnou žlázou savců. Obsahuje všechny výživné a nutriční látky, které člověk potřebuje pro stavbu a výživu svého těla, zastoupené v optimálním poměru. Skládá se z přibližně 86 % vody, dále z mléčného cukru, tuku, bílkovin, minerálních látek (hlavní zastoupení má fosfor a vápník), stopových prvků, vitamínů a enzymů. Složení se liší podle původu mléka, zdravotního stavu zvířete a krmení. Sýr je velmi úzce spojen s produkcí mléka. Mléko je hlavní surovinou pro sýrařskou výrobu. Člověk vyráběl sýry od pradávna. Na začátku docházelo k velmi primitivní výrobě. Mléko se nechalo stát v klidu na teplém místě, docházelo k samovolnému srážení mléka, od sraženiny se oddělila syrovátka a získal se tak tvaroh. Tuto výrobu přirovnáváme k počátkům výroby kyselých sýrů. Výrobní postupy lidí byly často střeženy a dědily se z generace na generaci. Výroba sýrů se stávala rodinným majetkem, a každá rodina si chtěla svoje tajemství na výrobu vynikajících sýrů ponechat. Postupem času byla výroba v různých oblastech přizpůsobena místním podmínkám, mezi které řadíme podnebí, druhy mléka, způsob zpracování a technologii. Proto dnes známe tolik druhů sýrů. Sýry patří k nejhodnotnějším potravinám, díky svému složení. Jsou zdrojem významných a plnohodnotných bílkovin. Kozí sýry mohou konzumovat lidé i s intolerancí laktózy, protože je laktóza obsažena v malém a nepatrném množství. Velký význam mají minerální látky, nejvíce vápník a fosfor, které řadíme mezi stavební materiál kostí. Ve všech druzích sýrů jsou přítomny vitamíny skupiny B, u tučných sýrů, jako jsou sýry typu niva, rokfór, gouda se vyskytuji vitamíny D, A. Sýry vyráběné z kozího mléka mají řidší konzistenci a to z důvodu, že neobsahuji α S1 kasein. Výroba sýrů patří k velmi obtížným mlékárenským technologiím, kdy všechny složky podléhají řadě fyzikálně chemických a biologických změn. Tyto změny jsou závislé na druhu sýrů. Svým složením a obsahem živin jsou sýry plnohodnotnou potravinou. Obsahují téměř vše, co lidský organismus potřebuje k udržení života. Sýry mají oproti jiným potravinám lehkou stravitelnost. 7

8 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce na téma Mikrobiologická rizika u farmářských sýrů vyrobených z kozího mléka je zpracovat literární přehled, ve kterém jsou shrnuty poznatky mikrobiologie kozích sýrů. V teoretické části se práce zaměřuje na mléko, farmářskou výrobu sýrů a v neposlední řadě na mikrobiologii kozích sýrů spojenou s mikroorganismy, které jsou důležité jak z technologického tak také ze zdravotního hlediska. Tato část zahrnuje i opatření, jak bojovat proti nežádoucím mikroorganismům. V praktické části je cílem stanovit vybrané skupiny mikroorganismů v 6 vzorcích sýrů (kozí čerstvý sýr Buche de chévre Mon Sire, kozí riccota syrovátkový sýr, kozí čerstvý sýr, pomazánkový kozí sýr bílý, Caprottino Fresco, kozí čerstvý sýr Bettine), které byly zakoupeny ve specializovaných prodejnách v Brně. 8

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mléko Syrovým mlékem se rozumí tekutina vylučovaná mléčnou žlázou hospodářských zvířat, získaná dojením, splňující požadavky zákona o veterinární péči a příslušných prováděcích předpisů. Mlékem se rozumí syrové mléko ošetřené podle zákona o veterinární péči a k němu prováděných předpisů (Vyhláška č. 328/1997 Sb.). Podle zákona č. 110/1997 Sb. je mléko surovinou živočišného původu, mléko a mléčné výrobky jsou potravinami, tj. látkami určenými k výživě člověka v nezměněném nebo upraveném stavu jako jídlo nebo nápoj. Mléko je definováno jako sekret mléčné žlázy, které je primárně určeno k výživě mláďat. Jedná se o bílou tekutinu, složenou z vody a sušiny. Z fyzikálního hlediska je mléko polydisperzní systém. To znamená, že jeho složky jsou v mléce zastoupeny v různých stupních disperze a to jako suspenze (VLKOVÁ, 2009). Mléko můžeme podle zastoupení hlavních druhů bílkovin rozdělit do dvou skupin: 1. Mléka kaseinová - obsahují více než 75 % kaseinu z celkového obsahu bílkovin, jsou produkována přežvýkavci (kravské, kozí, ovčí, buvolí, velbloudí). 2. Mléka albuminová - obsahují méně než 75% kaseinu z celkového obsahu bílkovin, jsou produkována masožravci, všežravci, býložravci s jednoduchým žaludkem, patří sem mléko mateřské (ženské), kobylí, oslí, mléko od prasnic, mléko psů a koček (ŠUSTOVÁ, 2010) Složení mléka Mléko je složeno z vody a sušiny, voda tvoří průměrně 87,5 % a sušina okolo 12,5 %. Sušina se skládá z tuku a tukuprosté sušiny (TPS). Mléko dále obsahuje bílkoviny, jako jsou kasein, albumin, globulin, mléčný cukr - laktózu. Součástí složení mléka jsou minerální soli, popeloviny, enzymy, nebílkovinné dusíkaté látky, organické kyseliny, aminocukry a vitamíny (BAGÍNOVÁ, 2011). Bílkoviny obsažené v mléku obsahují esenciální aminokyseliny, které mají vliv na syřitelnost. Do mléčné žlázy jsou aminokyseliny přiváděny krví. Bílkoviny jsou syntetizovány v sekrečních buňkách mléčné žlázy. Aminokyseliny jsou spojeny pomocí peptidické vazby. Podle významu ve výživě člověka se základní jednotky bílkovin, aminokyseliny, rozdělují do tří skupin: 9

10 1. Esenciální člověk si tento druh aminokyselin není schopný vytvořit sám, musí jej přijímat v potravě. Patří sem aminokyseliny: valin, leucin, isoleucin, threonin, methionin, lysin, fenylalanin, tryptofan Semiesenciální Patří sem arginin a histidin. Semiesenciální znamená, že jejich syntéza není dostatečná pro růst, díky tomu jsou esenciální pouze pro mláďata a děti. Pro dospělé jedince jsou neesenciální Neesenciální Mezi neesenciální aminokyseliny patří alanin, asparagin a asparagová kyselina, glutamin a glutamová kyselina, glycin, prolin, serin, tyrosin (ŠUSTOVÁ, 2010). Tuk je důležitou energetickou zásobárnou. V chladných oblastech produkují zvířata mléko, které obsahuje vyšší obsah tuku, z důvodu větší spotřeby energie (ŠUSTOVÁ, 2010). Lipidy jsou jednoduché nebo složené estery mastných kyselin doprovázené alkoholy (ŠUSTOVÁ, 2010). Lipidy obsahují několik doprovodných látek, jako jsou například vitamíny, fosfolipidy. Dávají mléku příjemnou chuť. Jedná se o látky, které nejsou rozpustné ve vodě. K jejich rozpuštění dochází pouze pomocí organických rozpouštědel, mezi které řadíme například diethylether, benzen, aj. (ŠUSTOVÁ, 2010). Nejznámějším sacharidem v mléce je laktóza. Jedná se o disacharid, který je složený ze dvou hexóz: D - galaktózy a D glukózy. Jejím typickým znakem je, že se jedná o redukující cukr, to znamená, že má volnou aldehydickou skupinu na 1 uhlíku glukózy. Mléčný cukr je obsažen ve všech druzích mléka (ŠUSTOVÁ, 2010). Zastoupení bílkovin, tuku a mléčného cukru je rozdílné. Podrobně to znázorňuje Tab.1. Tab 1: Složení mléka vybraných přežvýkavců (RUBÁŠOVÁ, 2015). Mléko Bílkoviny Tuky Laktóza Kravské 2,8 3,6 3,2-6 4,5 5 mléko Ovčí 5,4 7,1 7,2 10,6 3,5 4,5 mléko Kozí mléko 3,6 3,8 3,8 4,2 4,2 4,6 10

11 Obr 1: Složení mléka (ŠUSTOVÁ, 2010) Mléko kozí Kozy se chovají prakticky po celém světě. V České republice se chová převážně plemeno kozy bílé krátkosrsté (GAJDŮŠEK, 2000). Mléko pocházející od koz má bílou barvu, jelikož jejich organismus nedokáže vstřebat a vyloučit do mléka beta karoten. Oproti mléku kravskému má typický pach, který je způsobený obsahem kyseliny kaprinové. Obsah kyseliny je ovlivněn hygienou a další manipulací s mlékem. Intenzita pachu se podle způsobu hygieny může měnit, může také vyprchat úplně (ŠUSTOVÁ, 2010). Kaseinové micely kozího mléka obsahují velké množství minerálních látek, nejvíce vápníku a fosforu. Z frakcí kaseinu je výrazně nižší koncentrace αs1 kaseinu oproti kravskému mléku (GAJDŮŠEK, 2002). Kozí mléko se od kravského liší lepší stravitelností, alkalitou, vyšší pufrační kapacitou a obsahem základních složek mléka (CARROL, 1996). Mléko kozí je oproti mléku kravském velmi sladké. Sýry z kozího mléka mají výraznou chuť a vůni (CARROL, 1996). Mražení kozího mléka má vliv na výrobu sýrů. CARROL (1996) zjistil, že mléko, které produkují kozy, vydrží zmražené po dobu 30 dní a poté je vhodné k výrobě. Mléčný tuk je v mléce rozptýlen ve formě tukových kapének. Tukové kapénky v kozím mléce jsou menší oproti mléku kravskému. Tento rozdíl je příčinnou jemnější textury, kterou kozí sýr má. Velikost tukových kapének zlepšuje vstřebávání (PARK, 2007). Kozí mléko je bohatým zdrojem bílkovin. Obsahuje všechny aminokyseliny, které jsou nezbytné pro lidský organismus (KVASNIČKOVÁ, 2008). Laktóza je označována jako mléčný cukr. Kozí mléko v porovnání s kravským mlékem 11

12 jí obsahuje méně (SILANKOVE, 2010). Osoby mohou trpět intolerancí laktózy, která je přirozeně obsažena v mléku (kozí, ovčí a kravské), neboť jim chybí enzym laktáza. Tento enzym je důležitý pro trávení laktózy. Mezi projevy laktózové intolerance patří problémy s trávením, doprovázené žaludečními nevolnostmi, průjmy, bolesti břicha, aj. Osoby trpící touto poruchou mohou konzumovat sýry, které pošli procesem zrání, přičemž dochází ke snížení nebo úplnému odstranění laktózy (KVASNIČKOVÁ, 2008) Požadavky na mléko k výrobě sýrů První velice důležitou vlastností je hustota mléka. Tato veličina závisí na obsahu základních složek v mléce. Jedná se zejména o obsah bílkovin, tuků, laktózy a minerálních látek. Standardní rozmezí, ve kterém by se měla pohybovat, je 1,028 1,032 g/cm3. Na vyšší hodnotě hustoty se podílí bílkoviny, laktóza a minerální látky. Naopak za nízkou hustotu může zvýšený obsah tuků. Pokud dojde ke zvodnění mléka, projeví se to výrazným poklesem hustoty. Mezi další faktory, které mají za následek snížení hustoty, jsou zdravotní stav zvířete (přítomnost zánětu vemene, mastitis) a stádium laktace. (ŠUSTOVÁ, SÝKORA, 2013). Dalším požadavkem je kyselost mléka. Kyselost mléka se vyjadřuje titrační kyselostí. Ta by se měla pohybovat v rozmezí 6,2 7,8 S (ČSN ). Také se kyselost může udávat jako aktivní, ta představuje hodnotu ph. U čerstvého mléka by rozmezí mělo být 6,4 6,8. Jakost mléka je závislá na chemickém složení mléka, které se působením celé řady faktorů neustále mění. Mezi tyto faktory můžeme zahrnout krmení, plemeno, laktaci a zdravotní stav dojnice. Jeden z hlavních faktorů je bezpodmínečně složení krmiva, s tímto souvisí i sezónní změny ve složení a vlastnostech mléka (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Se sezónností souvisí zejména obsah tuku a bílkovin. V létě obsah bílkovin klesá, to je způsobené přechodem na jiné krmné dávky na jaře a v létě. Nižší obsah bílkovin je také na vrcholu laktace. Ke konci laktačního období dochází k nárůstu. Tučnost sýra se upravuje podle toho, jestli je léto nebo zima. Čím více mléka se nadojí, tím menší je obsah tuku negativní korelace. Na vrcholu laktace je obsah tuku nízký, je to stejné jako s obsahem bílkovin, ale ke konci laktace tučnost stoupá. Nejstabilnější složkou v mléce je laktóza (ŠUSTOVÁ, 2010). V průběhu získávání syrového mléka se musí dbát na správnou hygienu. Pro získání zdravotně nezávadného mléka je nutné dodržovat hygienu ustájení, krmení a dojení, ale 12

13 také správné manipulace s mlékem během zpracování. Co se týká ustájení, musí se dbát na to, aby kozy byly čisté, měly čisté stáje. Krmení během dojení není vhodné umísťovat do žlabu. Musí se brát i vysoký ohled na sanitaci dojícího zařízení, aby byla provedena správně a do mléka se nám nedostala rezidua inhibičních látek (ŠUSTOVÁ, SÝKORA, 2013). V potravinářství se používá pouze syrové mléko, které musí pocházet od zvířat nevykazujících příznaky onemocnění, které je přenosné na člověka. Zvířata nesmí být chovaná v prostředí, kde se vyskytuje onemocnění brucelóza a tuberkulóza. Mléko se nesmí získávat od zvířat, která mají infekci pohlavního ústrojí, která je doprovázena výtokem nebo zánětem vemene. Dále mléko nesmí být získáno od zvířat, kterým byly podávány nepovolené látky, například antibiotika (NAVRÁTILOVÁ, 2012). 3.3 Mikrobiologie sýrů Mléko je vhodným prostředím pro výskyt mikroorganismů, a to z hlediska vysokého obsahu vody a živin (ŠUSTOVÁ, 2010). Mléko je ve vemeni téměř sterilní a ke kontaminaci mléka dochází při jeho manipulaci a zpracování. Je potřeba mléko ihned po nadojení zchladit nebo nechat pasterovat. Manipulace a zpracování souvisí také s hygienou. Mezi základní ukazatele mikrobiální jakosti patří stanovení celkového počtu mikroorganismů (ŠUSTOVÁ, SÝKORA, 2013). Ze zdravotního hlediska je nutné zajistit nepřítomnost patogenních mikroorganismů. V mléce se nesmí vyskytovat žádný patogen. Z hlediska zpracovatelského jsou stanoveny požadavky na maximální počty mikroorganismů. Přítomnost škodlivých mikroorganismů může mít za následek zhoršení metabolických činností, nebo mohou znehodnotit mlékárenské výrobky. Do této skupiny mikroorganismů řadíme koliformní bakterie, psychrotrofní mikroorganismy, termorezistentní mikroorganismy, sporotvorné anaerobní bakterie. Celkový počet jednotlivých skupin mikroorganismů se liší v 1 ml. Tyto limity jsou uvedené v následující tabulce č. 2. (GAJDŮŠEK, 2003). 13

14 Tab. č. 2: Jednotlivé skupiny mikroorganismů obsažené v 1 ml vzorku (GAJDŮŠEK, 2003) Skupina mikroorganismů Celkový počet/1ml Koliformní bakterie Psychrotrofní mikroorganismy Termorezistentní mikroorganismy Sporotvorné anaerobní bakterie Negativní v 0,1 ml Snížení počtu mikroorganismů je podmíněno dobrým zdravotním stavem dojnice, vysokou hygienou (pracovníků i prostředí), ošetřením mléka, uskladněním a svozem (ŠROUBKOVÁ, 1996). Mezi hlavní zdroje kontaminace syrového mléka patří povrch mléčné žlázy, která se znečišťuje z podestýlky a výkalů. Dalším znečišťujícím faktorem je vzduch, kdy dochází ke kontaminaci zejména sporotvornými mikroorganismy, mikrokoky, korynebakterií. Vodou se do mléka dostávají pseudomonády, koliformní bakterie, sporotvorné bakterie. Krmivem se mohou dostat plísně, spory, koliformní bakterie. Pracovníci jsou také nositeli kontaminace a mohou přenést střevní patogeny, mezi které řadíme salmonely a kampylobaktery. Z kůže pracovníků se do mléka může přenést Stafylococcus aureus, a to zejména z hnisavých ložisek na rukou (SKŘIVANOVÁ, 2015) Mléko může být kontaminováno dvěma způsoby primárním a sekundárním (GÖRNER, VALÍK, 2004). Primární kontaminací se do mléka dostávají některé mikroorganismy před dojením krevním oběhem nebo strukovým kanálkem. Těmito způsoby se mohou do mléka dostat patogeny (stafylokoky a klostrídia). Ve vemeni zdravých dojnic je obsah celkového počtu mikroorganismů velmi nízký. Hodnoty se udávají do 10 2 /ml. Pokud je zvíře nemocné, mikroorganismy putují do bachoru. Z bachoru přechází do střev a následně do vemene. Může se jednat o tyto mikroorganismy: Salmonela, Staphylococcus aureus. U zdravých koz se mikroorganismy ve vemeni nevyskytují, do mléčné žlázy se dostanou pouze krví patogenní mikroorganismy. V tomto případě se jedná o Mycobacterium tuberculosis (způsobuje tuberkulózu), Brucella abortus nebo Brucella melitensis (u lidské populace vyvolávají onemocnění brucelózu) a další patogenem je Staphylococcus aureus, který může za mastitidu (ŠUSTOVÁ, 2010). Při krmení nekvalitní siláží mohou být v mléčné žláze objeveny i sporulující bacily 14

15 a klostridia (GAJDŮŠEK, 2003). Sekundární kontaminace - tento druh kontaminace nastává během dojení a při manipulaci s mlékem, jeho skladování a zpracování. Zdrojem sekundární kontaminace jsou krmivo, stelivo, výkaly, povrch těla dojnic, dojící zařízení, chladící zařízení, úschovné tanky, potrubí na mléko, voda, vzduch, špatná osobní hygiena dojiče, nádobí používané při zpracování mléka (ŠUSTOVÁ, 2010). Sekundární kontaminace je mnohem častější a rozsáhlejší. Výkaly, podestýlka jsou bohaté zejména na Escherichia coli. Při špatné hygieně pracovníků, dojičů, se s jejich rukou mohou do mléka dostat patogenními mikroorganismy (GAJDŮŠEKL, KLÍČNÍK, 1993) Hygienicky a technologicky významné druhy mikroorganismů V syrovém mléce je počet a zastoupení jednotlivých mikroorganismů různý, kolísá v závislosti na úrovni hygieny, ročním období, krmivu a manipulaci s mlékem. V 1 ml čerstvě nadojeného mléka, pocházejícího od zdravých zvířat, je obsah mikroorganismů Přítomné mikroorganismy v mléce můžeme rozdělit do tří skupin. První skupina zahrnuje patogenní a toxinogenní mikroorganismy. Druhá skupina obsahuje mikroorganismy, které se podílejí na kažení mléka a poslední skupinou jsou mikroorganismy, které se využívají při výrobě fermentovaných výrobků. Hlavním kritériem kvalitního syrového mléka je nízký obsah mikrobů, které způsobují kažení mléka a onemocnění. (NAVRÁTILOVÁ, 2012) Celkový počet mikroorganismů (CPM) Je to označení pro všechny mezofilní aerobní a fakultitavně anaerobní mikroorganismy, které rostou za podmínek metody kultivace při 30 C po dobu 72 hodin. Celkový počet mikroorganismů je hygienickým ukazatelem mléka (SAMKOVÁ, 2012). Hodnoty CPM nejsou ukazatelem přítomnosti patogenních mikroorganismů, ale pouze dávají informaci o tom, jak s mlékem bylo zacházeno od dojení až po jeho zpracování, včetně skladování. Pokud je hodnota vyšší, může se jednat o kontaminaci mléka z mléčné žlázy, nedostatečnou sanitaci výrobního zařízení (ŠUSTOVÁ, SÝKORA, 2013). 15

16 Psychrotrofní bakterie Jedná se mikroorganismy, které jsou schopné růstu a množení při teplotách pod 7 C. Většinu mikroorganismů, které se objevují v syrovém mléce, řadíme do čeledi Pseudomonas. Tato čeleď je tvořená gramnegativními nesporotvornými tyčinkami. Nejčastěji se v mléce vyskytují Pseudomonas fluorescens, méně zastoupené jsou Pseudomonaceae fragi, P. putida nebo P. aeruginosa. Dále jsou z mléka izolovány gramnegativní tyčinky rodů Psychrobacter, Flavobacterium, Achromobacter. V malém zastoupeni se mohou vyskytovat i psychrotrofní kmeny rodu Bacillus a to druhy B. coagulans, B. circulans, B. cereus a B. substilis (ŠUSTOVÁ, 2010). Tato skupina mikroorganismů se do syrového mléka dostává z půdy, vody, krmiva, ale zdrojem kontaminace jsou také samy kozy. Do mléka se nejčastěji dostávají z nedostatečně vyčištěného dojícího zařízení. Dostatečná a účinná sanitace je ničí (ŠUSTOVÁ, 2010). Produkují termostabilní proteolytické a lipolytické enzymy, které se podílejí na kažení mléka. Při kontaminaci těmito druhy mikroorganismů dochází k nežádoucím senzorickým změnám mléka, mezi které řadíme hořkou a ovocnou chuť a vůni (ŠUSTOVÁ, 2010). Maximální limit psychrotrofních mikroorganismů je v 1 ml mléka. V teplotním rozhraní od 0 4 C prakticky tyto mikroorganismy nerostou. Pochází li mléko z dobrých podmínek, obsahuje méně než 10 % mikroflóry. Je-li mléko ze špatných podmínek obsah psychrotrofních mikroorganismů dosahuje až 75 % (SEYDLOVÁ, 2012). Pro eliminaci psychrotrofních mikroorganismů je důležité rychlé zchlazení mléka, dodržování teplot úchovy mléka (optimální teplota okolo 4 C), zkrácení doby zpracování mléka (SEYDLOVÁ, 2012) Koliformní bakterie Koliformní bakterie jsou gramnegativní, nesporotvorné tyčinky, které rostou za aerobních a fakultitavně anaerobních podmínek (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Tyto bakterie jsou podskupinou čeledi Enterobacteriaceae, což vypovídá o velmi podobných biochemických vlastnostech, jako je tomu u E coli. (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Koliformní bakterie se podílejí na fermantaci laktózy, při které vznikají kyseliny a plyny. V mléce se vyskytují ve velkém množství tyto rody Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, 16

17 Proteus, Serratia a Citrobacte (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Přirozeným zdrojem koliformů je střevní trakt zvířat. Jedná se o indikátory úrovně hygieny při získávání mléka. Označují se také jako indikátory fekálního znečištění, či kontaminace. Za zdroje kontaminace syrového mléka se považují hnůj, půda a voda (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Bakterie nepřežívají pasteraci. Způsobují kažení mléčných výrobků. Mohou způsobovat i časné duření sýrů a to při počtech 10 7 KTJ/g. Způsobují senzorické vady mléčných výrobků, mezi které se mohou řadit hořká chuť, nebo pach, který může být nečistý nebo fekální. U zrajících sýrů způsobují produkci biogenních aminů, např. tyraminu (NAVRÁTILOVÁ, 2012) Termorezistentní bakterie Řadíme je mezi mikroorganismy, které přežívají teplotu pasterace. Do této skupiny řadíme sporotvorné i nesporotvorné bakterie. Jedná se zejména o druhy rodu Micrococcus, které mohou způsobovat kažení mléčných výrobků (např. nafouknutí UHT mléka), či senzorické změny sýrů. Mezi nesporotvorné mikroorganismy řadíme Microbacterium spp., Enterococcus spp. Jejich zdrojem je především dojící zařízení (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Ke sporotvorným bakteriím objevujícím se v mléku patří Bacillus a Clostridium. Zástupci obou rodů vytváří vysoce termorezistentní spory. Mají možnost růst v poměrně vysokém rozmezí teplot (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Hlavním zdrojem kontaminace mléka je voda, vzduch a krmivo (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Bacillus spp. Bacily jsou grampozitivní, aerobní, peritrichní bakterie, které vytváří spory. Jejich spory klíčí za přístupu kyslíku. Mezi nejvýznamnější zástupce patří Bacillus cereus, který produkuje enzymy, které se využívají u sladkého srážení mléka. Kažení mléka se účastní také druhy Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus circilans, Bacillus stearothermophillus a Bacillus macerans. Dokáží způsobovat kažení pasterovaného mléka. Vytváří spory, které jsou úzce spjaty se životním prostředím (NAVRÁTILOVÁ, 2012, BOTTONE E. J., 2010). 17

18 Clostridium spp. Jedná se o grampozitivní, peritrichní tyčinku. Vyskytuje se v půdě, vodě a trávicím traktu člověka i živočichů. Dokáže růst i bez přítomnosti kyslíku. Buňky klostrídií jsou odolné vůči teplu, vysušení a toxickým chemikáliím. Klostridie mohou produkovat toxiny například C. botulinum a C. perfingens (ENCYKLOPEDIE BRITANNICA, 2009). Klostridia mají za svůj zdroj rostliny, půdu a hnůj. Syrové mléko je kontaminováno zejména krmivem. V souvislosti s mlékem můžeme hovořit o druzích Clostridium tyrobutyricum, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes. Vyjmenované druhy patří mezi bakterie máselného kvašení. Způsobují pozdní duření sýrů, které je spojeno s produkcí CO 2, H 2, kyseliny máselné a octové (ŠUSTOVÁ, 2010) Bakterie mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení jsou také charakterizovány jako heterogenní skupina mikroorganismů, které mohou fermentovat různé cukry za vzniku kyseliny mléčné. Ve většině případů se jedná především o grampozitivní, aerotoleratní nebo anaerobní bakterie (KLEANHAMMER A KOL. 2005). Běžně se vyskytují v přírodě, v mléce jsou nejvíce zastoupeny tyto rody Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus a Enterococcus. Bakterie mléčného kvašení způsobují fermentaci laktózy, při které vzniká kyselina mléčná a další produkty, mezi které patří kyselina octová, oxid uhličitý. Tyto bakterie jsou využívány jako startovací kultury při výrobě fermentovaných mléčných výrobků. Jejich využití je zejména v potravinářském průmyslu, kdy se podílejí na tvorbě chuti a vůně hotového výrobku, kterému zároveň prodlužují trvanlivost (ŠPÁNOVÁ a kol, 2009, NAVRÁTILOVÁ, 2012). Do bakterií mléčného kvašení se začleňují homofermentativní i heterofermentativní druhy. Mezi skupinu homofermentativních bakterií řadíme Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus,které mají schopnost primárně produkovat kyselinu mléčnou. Druhá skupina heterofermantativních bakterií mléčného kvašení produkuje ekvimolární množství kyseliny mléčné, kyseliny octové, oxidu uhličitého a etanolu. Do této skupiny řadíme následující druhy Leuconostoc, Weisella (CAPLICE E, FITZEGARALD G. F., 1999). 18

19 Kvasinky a plísně Způsobují kažení mléčných výrobků. Pokud se vyskytují v syrovém mléce, dochází k jejich usmrcení pasterací. Zdrojem kvasinek jsou kontaminované výrobní zařízení a nepasterované ovocné složky. Pro jejich množení jsou vhodné fermentované a slazené mléčné výrobky, kde mohou způsobovat senzorické změny. Během jejich růstu dochází na povrchu sýra ke tvorbě slizu a barevným změnám. Nejvíce zastoupenými rody v mléčných výrobcích jsou Sacharomyces, Kluyveromyces a Candida (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Hlavním zdrojem pro výskyt plísní je půda, odtud se dostávají do vzduchu a na organické materiály. Mají široké enzymové vybavení sacharolytické, proteolytické, lipolytické. Využívají vzdušnou vlhkost, snáší nízké teploty, nízké ph. Některé tvoří mykotoxiny, některé produkují látky pro výrobu antibiotik. Některé druhy jsou termotolerantní. Mohou mít pozitivní i negativní význam. Mezi pozitivní významy patří již zmíněná výroba antibiotik, dále také enzymů a organických kyselin. Využívají sed k výrobě potravin výroba sýrů s plísní uvnitř a na povrchu (Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti). Využívají se k čistění odpadních vod (KALHOTKA, 2015). V mléčných produktech se projevují tvorbou charakteristických kolonií. U sýrů byly identifikovány rody Geotrichum ssp (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Při výrobě sýrů mají plísně pozitivní vliv, a to zejména plíseň rodu Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti (ŠUSTOVÁ, 2010) Patogenní mikroorganismy Patogenní mikroorganismus je takový organismus, který má schopnost vyvolávat onemocnění a to buď přímo svojí přítomností nebo produkcí toxických látek (ROTTENBORNOVÁ). Mléko je díky svému složení vhodným prostředím pro růst většiny patogenních mikroorganismů, které vyvolávají alimentární infekce nebo intoxikace (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Mezi patogenní mikroorganismy řadíme bakterie, viry, prvoky i houby, které mohou vyvolávat onemocnění. Jsou příčinnou velkého množství nemocí, ale také mají za následek mnoho úmrtí po celém světě. Proto, aby došlo k rozvoji onemocnění je nezbytné, to aby patogen v potravě přežil (HYŽÁKOVÁ, 2013). Růst patogenu v mléce a mléčných výrobcích je individuální, některé mikroorganismy se pomnožují rychle, některé velmi pomalu (Macobacterium tuberculosis, 19

20 Brucella spp.) a některé se nemusí množit vůbec, například viry (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Z patogenů, které se vyskytují v mléce a mléčných produktech jsou to především Bacillus cereus, Camphylobacter jejuni, Escherichia coli, Listerie monocytogenes, Salmonella spp, Staphylococcus a mnoho dalších (HYŽÁKOVÁ, 2013). Staphylococcus aureus Jedná se o grampozitivní fakultitavně anaerobní bakterii. Teplota růstu je 7 až 48 C, ale za optimální teplotu se považuje 37 C. Nejedná se o termorezistentní bakterii, nevytváří spory. Teplota pasterace by bakterii měla zničit (HYŽÁKOVÁ, 2013). Příčinou výskytu patogenu Staphylococcus aureus v sýrech je jejich výroba ze syrového mléka nebo postpasterační kontaminace. Přežijí-li mikroorganismy proces výroby sýrů, mohou se vyskytnout ve finálních výrobcích (KURÁKOVÁ, 2013). Vyskytuje se na kůži živočichů a lidí. Lidská populace je považována za % nosiče. Do mléka se může dostat z těla zvířat, zejména od zvířat trpící mastitidou. Dalším zdrojem nákazy je přenos od personálu, který může kontaminovat mléko nebo různé vybavení využívané v celé technologii. Do mléka a mléčných výrobků se může bakterie dostat z prostředí, například půdy, vody, prachu (HYŽÁKOVÁ, 2013). Způsobuje infekci u zvířat a lidí. Jedná se o různě závažné infekce, které mohou být od vřídků na kůži, zánětů tkání, nebo může způsobit sepsi nebo syndrom toxického šoku. Některé kmeny mohou produkovat a vytvářet enterotoxiny. Enterotoxiny jsou bílkoviny, které odolávají vysoké teplotě a proteolytickým enzymům (trypsin, pepsin). Díky tomu přetrvají enterotoxiny i po průchodu žaludkem, pasteraci nebo vaření (BHUNIA, 2008). Bacillus cereus Řadíme jej mezi grampozitivní, aerobní, sporolující mikroorganismy. Roste při teplotách 8 55 C. Vyskytuje se ve vodě a v půdě. U potravin se vyskytuje zejména v suchých potravinách, jako jsou obiloviny, mouka, těstoviny, aj. Bacillus cereus způsobuje průjmový a emetický syndrom. Toto onemocnění doprovází zvracení, které se objevuje zřídka, dále křečovité bolesti břicha a vodnatý průjem. Inkubační doba se pohybuje od 1 6 hodin. Projevuje se obvykle mezi hodinou nakažení (VLKOVÁ, 2009). Jedná se o rozšířenou bakterii, která se objevuje v půdě nebo podestýlce, odtud přechází do mléka, v případě, že nebyly struky dostatečně umyté. Vyskytuje se na technologických zařízeních (HYŽÁKOVÁ, 2013). 20

21 Salmonella Patří mezi gramnegativní, fakultitavně anaerobní mikroorganismy. Jejich výskyt je kromě potravin také ve vodě. V potravinách salmonely přežívají i několik měsíců, zejména pokud se jedná o suché potraviny. Zdrojem nákazy bývají divoká zvířata zejména ptáci a hlodavci. Na člověka se přenáší zejména potravinami, které mají živočišný původ. Může se vyskytovat i u nedostatečně tepelně upravených potravin (maso, vejce), jejichž původ je od nemocných zvířat. Způsobuje onemocnění salmonelózu, která je doprovázena záněty střevní sliznice, průjmy, intenzivními bolestmi břicha, zvracením, bolením hlavy nebo vysokou teplotou (VLKOVÁ, 2009). Běžný výskyt salmonely je v trávicím traktu zvířat a lidí. K nákaze lidí dochází předchozí konzumaci kontaminované potraviny obvykle živočišného původu (mléko, maso, vejce). Může také dojít ke kontaminaci potravin rostlinného původu (salát nebo rajčata). K přenosu také dochází ze zvířete na člověka nebo z člověka na člověka (BHUNIA, 2008). Salmonela je patogenní pro člověka, zvířata i ptáky. Vyvolává bakteriální otravy, které jsou vyvolané produkcí enterotoxinu. Za normálních podmínek dochází k rychlému rozmnožení. Je rezistentní vůči chladu a mrazu. Varem dochází k odstranění tohoto patogenu ze syrových potravin (AMBROŽ, 1991). Escherichia coli V roce 1885 německý pediatr Theodor Escherich poprvé popsal organismus, který nese jeho jméno. Její výzkum je spojen se studií fekální flóry u novorozených dětí a dětí v mateřských školkách (DONNENBERG, 2002). Tento druh řadíme mezi grampozitivní, fakultitavně anaerobní tyčinky. Je běžnou součástí zažívacího traktu živočichů, včetně člověka. Do vody se dostává fekálním znečištěním, kde přežívá delší dobu a zároveň kontaminuje prostředí a potraviny. V zažívacím traktu se některé druhy chovají jako patogenní. K nákaze dochází konzumací hotových jídel, která nebyla zpracována hygienicky. Častý výskyt je zejména v mletém mase, mléce a mléčných výrobcích (VLKOVÁ, 2009). Podle AMBROŽE (1991), se jedná o krátké tyčinky, které se vyskytuji v tlustém střevě. Escherichia coli je významným producentem některých vitamínů, a to zejména vitamínu K. Její další vlastností je, že dokáže zkvašovat glycidy za tvorby kyselin a plynu. 21

22 Escherichia coli má několik rozdílných kmenů: enteropatogenní EPEC, enterotoxigenní ETEC, enteroinvaznivní EIEC, enterohemoragické EHEC, enteroagregační EAEC. Escherichia coli může produkovat shiga toxin, proto ji označujeme jako STEC. Také může produkovat toxin verocytotoxin, bývá tedy označována i jako VTEC (BHUNIA, 2008). V současnosti způsobují nejvíce onemocnění kmeny 0157:H7 (STEK). Jedná se o enterohemoragické kmeny Escherichia coli. Jejich výskyt je převážně v tlustém střevě a je doprovázen produkcí toxinů. Tento kmen způsobuje závažné onemocnění zvané hemoragická kolitida. Onemocnění se může vyskytnout jak u dětí, tak u dospělého jedince (VLKOVÁ, 2009). Listeria monocytogenes Její výskyt je zejména na povrchu potravin. Je izolována z camembertu, romadúru nebo olomouckých tvarůžků. Byla zjištěna také v čedarech. Ostatní patogenní mikroorganismy se v sýrech vyskytují vzácně. K onemocnění člověka dochází po konzumaci kontaminovaných sýrů, které jsou vyrobeny z nepasterovaného mléka a to podle Vyhlášky č. 328/1997 Sb. Listerie náleží do fakultitativně anerobních mikroorganismů, nesporulující grampozitivní tyčinka. Je rezistentní vůči vnějšímu prostředá, snese teploty okolo 5 45 C, hodnota ph je 5 10 (RYSER, 2011). L. monocytogenes je široce rošířená bakterie, která se vyskytuje ve vodě, půdě, na rostlinách a také v zažívacím traktu zvířat a lidí. Mezi hlavní způsob nákazy patří konzumace kontaminovaných potravin. Rizikovými potravinami jsou zelenina, maso a mléčné výrobky. Přežvýkavci, kteří jsou krmeni nedostatečně fermentovanou siláží se mohou stát zdrojem nákazy. Listerie se poté dostanou fekálním znečištěním do mléka (BLAŽKOVÁ a kol. 2009). Kontaminace mléka a mléčných výrobků probíhá zejména sekundárně po pasterizaci (RYSER, 2011). Jedná se o patogen, který způsobuje alimentární onemocnění. Rizikovými skupinami jsou těhotné ženy, novorozenci a lidé s oslabenou imunitou. Inkubační doba trvá 2-7 dní. Onemocnění vyvolává bolesti hlavy, závratě, poruchy koordinace a další. V pozdější době se může objevit meningitida a sepse (RYSER, 2011). Do střeva se listerie dostává společně s potravou. Ze střeva proniká do krevního řečiště nebo lymfatického systému. Může dojít také k šíření pomocí bílých krvinek. 22

23 Bakterie se následně dostávají do jater, sleziny, lymfatických uzlin a mozku (BHUNIA, 2008) Biogenní aminy Jedná se o látky, které jsou tvořeny skupinami alifatických, aromatických nebo heterocyklických bází, které jsou odvozené od aminokyselin, a mají různé biologické účinky. Některé druhy biogenních aminů mají významné biologické vlastnosti, mohou být tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) nebo stavebními látkami, které se účastní biosyntéz dalších hormonů živočichů (fenylethylamin), fytohormonů nebo auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin (VELÍŠEK, 1999). Jsou obsažené v potravinách, jako jsou ryby, maso, sýry, pivo, víno nebo kysané zelí. (KOLÁŘOVÁ, 2012). V potravinách, které nebyly připravené fermentační cestou, jsou biogenní aminy především indikátorem nežádoucích mikrobiálních činností. Biogenní aminy vznikají dekarboxylázou aminokyselin. Dekarboxylázy aminokyselin nejsou u bakterií zcela běžné, ale mohou se vyskytovat u rodů, například Shigella, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Bacillus, Clostridium, Escherichia a některé bakterie mléčného kvašení, jako jsou Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus a Pediococcus (KOLÁŘOVÁ, 2012). Mezi nejvíce sledované biogenní aminy patří histamin, tyramin, trypamin, spermin, spermidin, kadaverin a putrescin. (KOLÁŘOVÁ, 2012). Histamin způsobuje rozšíření cév a snížení krevního tlaku. Biogenní amin tyramin je příčinou zvýšeného krevního tlaku a srdeční frekvence a mimo jiné i migrén (KOLÁŘOVÁ, 2012). Histamin a tyramin patří mezi velice významné biogenní aminy, které se vyskytují v mléčných výrobcích. Způsobují otravy, které se projeví do pár hodin od pozření příslušné potraviny (FOX, 2000). Pro identifikaci producentů biogenních aminů ve fermentovaných výrobcích je vhodné použít metodu PCR (KOLÁŘOVÁ, 2012). Mikroorganismy se využívají jako zákysové kultury při výrobě mléčných výrobků, kde mají schopnost dekarboxylovat aminokyseliny. Činností enzymů dekarboxyláz vznikají v potravinách právě výše zmíněné biogenní aminy. Dekarboxylací se rozumí chemická reakce, při které se z aminokyseliny odstraní karboxylová skupina a dojde k 23

24 uvolnění oxidu uhličitého. Mezi symptomy vysokého množství biogenních aminů se řadí zvracení, potíže s dýcháním, pocení, bušení srdce a migrény. Dalšími příznaky mohou být hypotenze, která je způsobená velkým množstvím histaminu, nebo hypertenze, kterou způsobuje tyramin. Velmi významným biogenním aminem je tyramin. Jeho výskyt je ve velkém množství v sýrech. V těchto potravinách se mohou objevovat významné koncentrace tyraminu. V čedaru byla detekována množství tyraminu 1500 mg/kg. Tyramin způsobuje zúžení cév, zvýšenou respiraci, slinění, migrény a zvýšení hladiny krevního cukru, glukózy (KALHOTKA, 2012). Prakticky nelze vyrobit potravinu, která by biogenní aminy neobsahovala. Při výrobě fermentovaných výrobků, jako jsou mléčné či masné výrobky, se musí sledovat výběr startovací a zákysové kultury a musí se zároveň vyloučit mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou (KALHOTKA, 2012). V sýrech se vyskytují následující biogenní aminy - histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, trypamin. Vznikají aktivitou těchto mikroorganismů Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. arabinosae, Streptococcus faecium, S. mitis, Bacillus macerans, Propinibacterium sp. (BRÁZDOVÁ, 2011). Na tvorbě biogenních aminů v sýrech se podílí spotánní mikroflóra mléka, zejména enterokoky (BRÁZDOVÁ, 2011) Mykotoxiny V současné době existuje přes 500 druhů mykotoxinů, které mají zjištěnou chemickou strukturu. Pouze dvacetina z nich ohrožuje zdraví zvířat a lidí, a to prostřednictvím potravy, kterou mohou způsobit o otravu (BETINA, 1990). Mykotoxiny jsou různé látky, mohou mít mutagenní, karcinogenní, nebo také účinek estrogenní i imunotoxický. Pokud dojde ke kombinaci dvou různých mykotoxinů, může to vést k zesílení jejich účinků. Rozhodující je dávka a doba jejich působení. Akutní otravy u člověka bývají výjimkou, zato chronické intoxikace jsou časté a vedou k poškození zdraví, snížení užitkovosti, případně mohou vést až k smrti. Problém mykotoxinů ve výživě se stává aktuálním při zkrmování mikrobiálně závadných krmiv, plesnivého sena a siláží. Toto vede k poškození zdraví, snížení užitkovosti, případně až k úhynu. Protože vedou ke značným hospodářským ztrátám, zaslouží si zvláštní pozornost. (KALAČ, 1997). 24

25 Mezi mykotoxiny, které se objevují v potravinách, patří aflatoxin B1 (produkovaný Aspergillus flavus), citrinin (Penicillium citrinum), fumonisin (Fusarium sp.), ochratoxin (Aspergillus ochraceus) a vomitoxin (Fusarium sp.) (VLKOVÁ, 2009). V sýrech se vyskytují aflatoxiny, citrinin z plísní, využívající se k výrobě sýrů Penicillium camemberti (VLKOVÁ, 2009). Tab. 3: Přehled mykotoxinů (VLKOVÁ, 2004) Mykotoxin aflatoxiny B1, B2, G1, G2 Potravina mandle, burské oříšky, vlašské ořechy, sušené ovoce, koření, sója aflatoxin M1 ochratoxin A Zearalenon Fumonisiny mléko, jogurty, sýry, máslo pšenice, ječmen, oves, rýže, pivo, káva pšenice, ječmen, rýže kukuřice, popcorn, müsli obilniny Mikroorganismy uplatňující se při zrání sýrů Zrání sýrů je označováno jako proces kvašení, během kterého sýr získává příslušnou barvu a svůj charakteristický pach a chuť (LAXA, 1924). Průběh zrání ovlivňují bakterie rodu Lactococcus, Streptococcus a Lactobacillus. (ŠUSTOVÁ, 2013). Úkolem bakterií mléčného kvašení je tvorba příjemného aroma. Dále řídí pochod zrání všech druhů sýrů. Mezi další mikroorganismy zúčastňujících se zrání sýrů patří propionové bakterie, některé plísně a kvasinky a bakterie sýrového mazu (GÖRNER, VALÍK, 2004). 25

26 Zákysové bakterie mléčného kvašení Úkolem tohoto druhu bakterií při zrání je produkce kyselin, zejména kyseliny mléčné z laktózy a jejich složek glukózy a galaktózy. Účastní se vlastního zrání a pomocí proteolytických enzymů dochází ke štěpení bílkovin. Při tomto štěpení dochází ke vzniku chuťových a aromatických látek. Za zákysové bakterie mléčného kvašení považujeme takové, které dokáží produkovat takové množství kyseliny mléčné, které dokáže snížit kyselost mléka z původní hodnoty ph, okolo 6,8 na hodnotu ph <5,3. Mezi mezofilní kultury BMK, patří druhy rodu Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc a Enterococcus. (KURÁKOVÁ, 2013). Nezákysové bakterie mléčného kysání Tuto skupinu bakterií tvoří zejména mezofilní druhy lactobacilů a pediokoků. Ty tvoří značné množství mikrobiální flóry mnohých sýrů v průběhu jejich zrání a obyčejně nejsou složkou zákysových kultur. Do mezofilních lactobacilů, které byly izolovány ze sýrů, řadíme L. casei, L. paracasei, L. plantarum, L. rhamnosus a L. curvatus. Ze skupiny pediokoků byly nejčastěji izolované P. acidilactici a P. pentosaceus (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nejvhodnějším zdrojem energie pro nezákysové bakterie mléčného kysání je laktóza, která se v mladém sýru v průběhu zrání nenachází. Proto jako zdroj energie nezákysových bakterií nemůže sloužit. Proto přichází v úvahu jako zdroj kyselina citronová nebo citráty z mléka, které mají zdroj uhlíku. Dalším vhodným zdrojem pro bakterie mohou být uhlíkaté produkty, které vznikají při autolýze buněk zákysových bakterií, ale i membrány tukových kuliček (GÖRNER, VALÍK, 2004). Plísně významné u zrajících sýrů Plísněmi se rozumí mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy, patřící mezi houby. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Jejich významnou úlohou je zrání sýrů. Sýry zrají působením kulturních druhů plísní, které se dělí na dvě skupiny. První skupinou sýrů je skupina, která zraje působením plísně Penicillium roqueforti, která roste a fermentuje ve vnitřní hmotě sýra a potřebuje k tomu dostatečný přísun vzdušného kyslíku. Její růst se vyznačuje tvorbou 26

27 modrozelených žilek plísní v sýru. Druhou samostatnou skupinou sýrů, které zrají pod vlivem plísně Penicillium camemberti, tvoří měkké sýry s bílou sametovou plísní na jejich povrchu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Plíseň Penicillium roqueforti jsou kolonie, které vytváří modrozelený vzhled a používá se k výrobě modrých žilek ve vnitřní straně sýra (LAW, 2010) Kvasinky Kvasinky jsou první mikroorganismy, kterými začíná aerobní fáze zrání. Ze sýrů byly izolovány a identifikovány kvasinky rodů Candida, Cryptococcus, Debaryomyces. Nejvýznamnější pro zrání sýrů jsou ovšem druhy kvasinek Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Debaryomyces hanseni, Sacccharomyces cerevisiae, Geotrichum candidum, Cryptococcus catenulata a Yarovia lipolytica (GÖRNER, VALÍK, 2004). Obvykle nejsou nutričně náročné a jsou větší a mají pomalejší růst než bakterie. Kolonie kvasinek mají obvykle měkkou konzistenci. Kolonie jsou velkého rozsahu a vykazují několik různých barev (FOX, 2000) Mikroorganismy způsobující vady sýrů Vady sýrů mohou být příčinou velkých hospodářských ztrát. Ovlivňuji také zájem spotřebitelů o sýr, jako výsledný produkt. Proto je nutné, aby sýrař včas odhalil každou vadu a provedl technologická opatření, aby vady utlumil, nebo zcela eliminoval. Mezi příčiny vad sýrů můžeme zařadit nevhodnou i méně vhodnou jakost mléka, nedodržení technologického procesu, nedostatečné ošetřování sýrů během zrání, mikrobiální či jiná kontaminace. (KOPÁČEK, 2013) Mezi nejčastější vady sýrů, způsobené mikrobiální kontaminací, řadíme: duření sýrů, bílou mazovitost, roztékání těsta. (KOPÁČEK, 2013) Duření sýrů má za následek přítomnost bakterií rodu Escherichia a Acetobacter, popřípadě za to mohou i kvasinky, které vytváří plyn. Za bílou mazovitost mohou porosty plísní Geotrichium candidum, které na povrchu vytvoří bílý maz. Tomuto můžeme předejít silnějším solením. (KOPÁČEK, 2013). Duření sýrů, také známé pod názvem bubření či nadouvání, je nejobávanější vadou sýrů. Je zapříčiněna výskytem zejména bakterií rodu Bacterium coli commune a Bacillus aerogenes. (LAXA, 1924). 27

28 3.4 Prevence a zabráněni výskytu nežádoucích organismů V souvislosti s mlékem je důležitá prevence již u zvířete v našem případě u koz. Koza by měla být krmená suchými a vyzrálými plodinami. Tato krmiva by neměla být zaplísněna, kdy hrozí napadení mykotoxiny (KOMPRDA, 2007). Před začátkem dojení musí být proveden první odstřik mléka. Může jich býti i více. První odstřik obsahuje okolo 10 4 mikroorganismů. V dalších odstřicích tento počet klesá. Mikroorganismy se do vemen mohou dostat strukovým kanálkem, proto je důležité po každém dojení struk vydesinfikovat (ŠUSTOVÁ, 2010). Při nákupu musíme vybírat nezávadné kozí mléko, pokud tedy ovšem nevlastníme chov koz, a tento problém si nejsme schopni pohlídat sami. Již při nákupu mléka může být tato surovina zkažena, může zapáchat, může mít jinou konzistenci než obvykle. Pokud vyrábíme sýry, důležitá je také dokonalá tepelná úprava potravin. U mléka je důležitá pasterace. Doporučená pasterace je 72 C po dobu 15 vteřin. Při manipulaci s mlékem a výrobě sýra je důležité nástroje a zařízení, které s mlékem a sýrem přijdou do styku, mít dokonale čisté a vydezinfikované. Dalším problémem, který způsobuje výskyt nežádoucích organismů, je hmyz a hlodavci. Potraviny je proto vhodné, aby nedošlo k jejich kontaminaci, uchovávat v nádobách či obalech. Při manipulaci s potravinami používáme pouze zdravotně nezávadnou vodu pitnou. Pokud využíváme studniční vodu, musíme mít doložené pravidelné mikrobiologické kontroly a vyšetření. Hygiena je důležitá také z pohledu lidí, kteří si musí důkladně umýt ruce před začátkem práce s potravinami, po jakémkoliv přerušení práce s potravinou, po použití toalety (KOMPRDA, 2007). Další prevenci, která se zabývá potravinářskou výrobou je systém HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points). Tento systém je jedním z nejúčinnějších nástrojů pro zabezpečení zdravotní nezávadnosti potravin. Povinností každého výrobce je zavést a udržovat systém kritických bodů v technologii výroby. Tato skutečnost vyplývá také ze zákona č. 110/1997 Sb., ve znění zákona č. 306/2000 Sb., a vyhlášky Ministerstva zemědělství č. 147/1998 Sb. Jedná se o několik částí, kterými se HACCP zabývá: analýza alimentárního nebezpečí, kritické ochranné body, ochrana zdraví konzumenta před alimentárním nebezpečím. Celý systém je možno popsat pomocí sedmi základních principů (bodů), které na sebe logicky navazují: 28

29 analýza nebezpečí, identifikace kritických ochranných bodů (CCP), zavedení kritérií pro zvládnutí situace na CCP, monitoring zavedených kritérií, stanovení nápravných opatření, verifikace správné funkce systému HACCP, dokumentace (KOMPRDA, 2007). 29

30 4 M ATERIÁL A METODIKA V rámci experimentální části bakalářské práce byl proveden mikrobiologický rozbor šesti vzorků kozích sýrů. Tímto rozborem se zjišťovala přítomnost různých druhů technologicky významných mikroorganismů. 4.1 Použitý materiál V brněnských specializovaných prodejnách bylo zakoupeno šest vzorků sýrů z kozího mléka. Charakteristika jednotlivých vzorků sýrů je uveden v tab. 4. Fotografie vzorků jsou na obr. 2. Obr. 2: Fotografie analyzovaných vzorků sýrů 30

31 Tab. 4: Charakteristika analyzovaných vzorků sýrů Číslo Vzorku Druh sýra Charakteristika Sýru Mléko Prodejna 1. Kozí čerstvý sýr Čerstvý kozí MyFoodMArket, Buche de chévre Mon s.r.o Sire 2 Kozí ricotta Čerstvý kozí Zahrada zdraví syrovátkový sýr 3. Kozí sýr čistý Čerstvý kozí Zahrada zdraví 4. Pomazánkový kozí sýr Čerstvý kozí Zahrada zdraví Bílý 5. Caprottino Fresco Zrající kozí Orrero Litovel Grand Moravia 6. Kozí čerstvý sýr Čerstvý kozí Boutique Gurmán Bettine OD Vichr 4.2 Použité přístroje homogenizátor typ Stomacher, váha Kern ec, vortex V-1 plus, BIOSAN, parní sterilizátor automatické pipety, Thermoscientific. 4.3 Metodika 50 zkumavek bylo naplněno 9,0 ml fyziologického roztoku (8,5 g NaCl na 1000 ml destilované vody). Dále byla připravena 1 uzavíratelná láhev s 90 ml fyziologického roztoku a krabička se špičkami pro automatické pipety. Byly také připraveny alobalové váženky. Vše bylo vysterilizováno v parním sterilizátoru (autoklávu) 20 minut při teplotě 121 C. Byly rovněž připraveny a vysterilizovány živné půdy pro kultivaci mikroorganismů. 31

32 4.3.1 Příprava živných půd MRS agar pro stanovení bakterií mléčného kvašení Složení: Polypepton 10g Masový extrakt... 10g Kvasičný extrakt....5g Glukóza... 20g Tween ,08g Fosforečnan draselný...2g Octan sodný...5g Citronan amonný...2g Síran hořečnatý...0,2g Síran manganatý...0,05g Agar...15g ph se v této půdě upravuje na 5,7±0,1. Navážka je 70,3 g a byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody. Poté se nechala půda vysterilizovat 15 minut při 121 C. Výrobce MRS agaru je Bioakar Diagnostics, Francie. VRBL agar pro stanovení koliformních bakterií složení: Masový extrakt...7g Kvasniční extrakt...3g Laktóza...10g Žlučové soli...1,5g Chlorid sodný...5g Neutrální červeň...0,03g Krystalová violeť...0,002g Agar...12g ph se v této půdě upravuje na 7,4±0,2. Navážka je 38,5 g a byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody. Toto medium musí být spotřebováno do 4 hodin od jeho přípravy. Výrobce VRBL agaru je Bioakar Diagnostics, Francie. Příprava: půda se rozvaří 32

33 na vodní lázní, nesterilizuje se v autoklávu. Chloramphenicol glucose agar pro stanovení plísní a kvasinek složení: Výtažek z kvasnic...5g Glukóza...20g Chloramfenikol...0,1g Agar...15g ph se v této půdě upravuje na 6,6±0,2. Navážka půdy je 40,1 g a byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody. Sterilizace 15 minut při 121 C. Výrobce Chloramphenicolu glucose agaru je Bioakar Diagnostics, Francie. PCAM (Plate count agar with skimmed milk) pro stanovení celkového počtu mikroorganismů a psychrotrofních mikroorganismů. složení: Trypton...5g Výtažek z kvasnic...2,5g Glukóza...1g Sušené odstředěné mléko...1g Agar...12g ph se v této půdě upravuje na 7,0±0,2. Navážka je 21,5 g a byla rozpuštěná v 1000 ml destilované vody. Sterilizace 15 minut při 121 C. Výrobce PCAM je Bioakar Diagnostics, Francie. COMPASS Enterococcus agar pro stanovení enterokoků složení: Pepton...27,5g Selektivní látky....5g Chlorid sodný...5g Tween g Kvasniční extrakt...0,3g X - glucoside...0,1g 33

34 Agar....14g ph se upravuje na hodnotu 7,5±0,2. Navážka půdy činila 52,9 g a byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody. Sterilizace probíhala v homogenizátoru (autoklávu) při teplotě 121 C po dobu 15 minut. Výrobce COMPASS Enterococcus agaru je Bioakar Diagnostics, Francie Příprava vzorků sýrů Ze zakoupených sýrů byly odebrány vzorky o hmotnosti 10 g, který byl spolu s 90 ml sterilního fyziologického roztoku v PE sáčku 1 minutu homogenizován v homogenizátoru typu Stomacher. Následně byla připravena řada desítkového ředění. 1 ml příslušného ředění vzorku byl následně inokulován do Petriho misek a zalit příslušnou živnou půdou Stanovovaly se tyto skupiny mikroorganismů: Celkový počet mikroorganismů, koliformní bakterie, enterokoky, bakterie mléčného kysání, psychotrofní bakterie, plísně a kvasinky. Parametry kultivace jsou uvedeny v Tab Vyhodnocení mikrobiologického rozboru Tab. 5: Parametry kultivace mikroorganismů Skupina mikroorganismů živná půda teplota doba kultivace Psychrotrofní mikroorganismy PCAM 6 C 10 dní Enterokoky Enterococcus compass agar 45 C 1 den Plísně a kvasinky Chloramphenicol glucose agar 25 C 5 dní Koliformní bakterie VRBL 37 C 1 den Celkový mikroorganismů počet PCAM 30 C 3 dny Bakterie mléčného kvašení MRS 30 C 3 dny Vysvětlivky: PCAM Plate count agar skimmed milk, VRBL -, MRS použité živné půdy (Výrobce Bioagar Diagnostics, Francie). 34

35 kolonie. Po uplynutí doby kultivace byly na Petriho miskách odečteny narostlé typické K výpočtu skutečného obsahu mikroorganismů v 1 gramu vzorku bylo použito následujícího přepočítávacího vzorce. Výsledek pak byl vyjádřen v KTJ na 1 g vzorku. V objem inokula, odpovídá 1 ml, n1 počet misek v 1. ředění, n2 počet misek v 2. ředění d faktor ředění, KTJ/g počet kolonií tvořících jednotek v 1 gramu vzorku, také označováno jako CFU. 35

36 5 VÝSLEDKY A DISKUSE Mikrobiologická analýza vzorků sýrů, která je jedním z cílů bakalářské práce, měla stanovit mikrobiální zastoupení vybraných mikroorganismů. Výsledky z měření jsou uvedeny v KTJ/g v tab. 6. Tab. 6: Počty mikroorganismů ve vzorcích sýrů v KTJ/g číslo vzorku Koliformní bakterie [KTJ/g] Enterokoky [KTJ/g] CPM [KTJ/g] BMK [KTJ/g] Psychrotrofní mikrooganismy [KTJ/g] Plísně [KTJ/g] Kvasinky [KTJ/g] , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , Vysvětlivky: CPM Celkový počet mikroorganismů, BMK bakterie mléčného kysání. 1 Kozí čerstvý sýr Buche de chevré Mon Sire, 2- Kozí ricotta syrovátkový sýr, 3 Kozí sýr čistý, 4 Pomazánkový kozí sýr bílý, 5 Caprottino fresco, 6 Kozí čerstvý sýr Bettine 36

37 Z následujícího obr. 3 můžeme vidět porovnání koliformních bakterií a enterokoků. Jedná se o kontaminanty vyskytující se v mléčných výrobcích. Jejich obsah je spojen s hygienou dojení, zpracování mléka a výrobou sýrů. Obr. 3: Přehled počtu koliformních bakterií a enterokoků Nařízení komise (ES) 1441/2007 uvádí u sýrů z pasterizovaného mléka kromě limitů pro koaguláza pozitivní stafylokoky (10 KTJ/g, respektive 10 4 KTJ/g), Listeria monocytogenes (pod 10 2 KTJ/g) pouze limity pro E. coli (100 KTJ/g). Počty mikroorganismů v sýrech se dají srovnat s doporučenými hodnotami dle Robinsona, 2002 a dle ČSN Tab. 7: Doporučená mikrobiologická kvalita různých mléčných výrobků Sýr zrající (Robinson, 2002) mikroorganismy Limit (KTJ/g) Koliformní bakterie <10 E. coli 0 Sporulující bakterie <10 Plísně a kvasinky <10 Sýry ze syrového mléka (ČSN ) E. coli 10 3 Tvrdé sýry (ČSN ) E. coli 10 Plísně 10 3 Čerstvé tvarohové a nezrající sýry (ČSN ) Koliformní bakterie Potraviny určené k přímé spotřebě s výjimkou potravin, kde jsou součástí kulturní mikroflóry (ČSN ) kvasinky

38 CPM udává přehled o počtech přítomných aerobních a fakultitavně anaerobních mikroorganismů, které mají optimální teplotu růstu 30 C. CPM je v případě sýrů ovlivněn přítomností bakterií mléčného kvašení. Ze všech vzorků, které byly analyzovány, vykazoval vzorek číslo 4 (Pomazánkový kozí sýr bílý) nejvyšší počty mikroorganismů. Hodnota celkového počtu mikroorganismů byla 3,2 x Na obr. 4. jsou Petriho misky s narostlými koloniemi narostlými na půdách pro stanovení CPM. Obr. 4: Celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kvašení Bakterie mléčného kysání slouží k okyselování mléka, jejich činnost se projevuje gelovatěním. Velmi rychle produkují kyselinu mléčnou a jsou hlavní složkou startovací kultury (COGAN a kol., 1997). Ze všech vzorků obsahoval nejvíce bakterií mléčného kvašení vzorek 1 a 4, to svědčí o dobré vitalitě mikroorganismů, které udržují trvanlivost sýrů. Počty se pohybovaly v řádech Naopak nejnižší počet bakterií mléčného kvašení byl stanoven ve vzorku číslo 2 (Kozí ricotta syrovátkový sýr), kde počty dosahovaly 10 6 KTJ/g. Enterokoky vstupují do syrového mléka a výrobků sním spojených již během výroby. Patří mezi indikátory hygieny výroby mléčných výrobků (GARG, MITAL, 1991). Bakterie rodu Enterococcus mohou přežít pasterizaci (FRANZ et al., 1999; GIRAFFA, 2002; MARTINEZ et al., 2003). Nejvíce enterokoků obsahoval pomazánkový kozí sýr bílý (vzorek číslo 4) a Caprottino fresco (vzorek číslo 5), kde počty dosahovaly 10 2 KTJ/g. To může svědčit o nižší úrovni hygieny výroby a zpracování sýru. V kozím čerstvém 38

39 sýru Buche de chevré Mon Sire a v kozím čerstvém sýru Bettine enterokoky nebyly vůbec detekovány. Kolonie enterokoků ukazuje obr. 5. Obr. 5: Petriho miska s koloniemi enterokoků Kvasinky jsou důležitými mikroorganismy společně s plísněmi, které jsou využívány v potravinářském průmyslu. Kvasinky ale mohou způsobovat kažení potravin, plísně mohou navíc produkovat řadu nebezpečných mykotoxinů. V kysaných mléčných výrobcích nahrazují jako indikátorové mikroorganismy koliformní bakterie, které při nízké hodnotě ph nerostou (VLKOVÁ, 2009). Kvasinky hrají velmi důležitou roli v přípravě určitých výrobků, jako jsou například kefír nebo fermentovaná syrovátka (MARTH, 1987). Výskyt kvasinek je velmi důležitý v sýrech, jako jsou například Gorgonzola, Camembert, nebo známá Niva. Na povrchu sýrů můžeme nalézt například Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii atd. (DEÁK, 2007). Počty kvasinek v analyzovaných sýrech se pohybovaly od 10 2 do 10 5 KTJ/g. Vzorek číslo 3 (Kozí sýr čistý) obsahoval kvasinek nejvíce. Je to pravděpodobně dáno povahou sýra. Nejnižší počty kvasinek byly detekovány ve vzorku číslo 6 (Kozí čerstvý sýr Bettine), u nějž počty dosahovaly 10 2 KTJ/g. Žádný vzorek nepřesahoval doporučení pro počty kvasinek dle ČSN , kde je uveden limit 10 7 KTJ/g. Plísně, které jsou využívány k výrobě sýrů, můžeme nalézt zejména na povrchu sýru Camembert, kde se využívá Penicillium camemberti (ROBINSON, 2002). Plísně, které 39

40 nejsou využívány přímo k výrobě a zrání sýra jsou nežádoucí. Mohou produkovat mykotoxiny. Ve vzorcích je výskyt plísní způsoben například kontaminací z prostředí, nebo kontaminaci při výrobě. Narostlé kolonie plísní a kvasinek z měření můžeme vidět na obr. 6. Psychotrofní bakterie jsou schopné růst při teplotách od 1 7 C. Množení při těchto teplotách je velmi pomalé a k nárůstu na Petriho miskách dochází až po 10 dnech. Tyto mikroorganismy jsou indikátory mikrobiálního kažení potravin. (VLKOVÁ, 2009). Hlavními bakteriemi jsou gramnegativní bakterie čeledi Pseudomonada a Enterobacteriaceae, plísně a kvasinky (GÖRNER, VALÍK, 2004). Obr. 6: Kvasinky a plísně Koliformní bakterie jsou společně s enterokoky indikátory nedostatečné hygieny při výrobě, skladování a manipulaci se sýry (CHRISTEN a kol., 1993). Nejvýznamnějšími zástupci jsou Escherichia, Enterobacter a Klebsiella. Nejčastěji se podle ROBINSONA (2002) v sýrech vyskytují koliformní bakterie způsobující tzv. časné duření sýrů. To je způsobeno nežádoucí produkcí plynů, při které vznikají v sýru štěrbiny nebo malé otvory. Nastává jeden až dva dny po výrobě sýrů (MARTH, STEELE, 2001). Ve vzorcích 1, 4 a 6 se koliformní bakterie neobjevily, bylo to pravděpodobně způsobeno nízkým ph sýrů a dobrou hygienou výroby. Na druhé straně nejvíce bakterií obsahoval vzorek číslo 5, kde jejich počty dosáhly 10 2 KTJ/g. 40